6

Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

������������ ����������� ���������� ���

����������� ���������� ����� � �� ���� ��� � �

������������� ��������� ��� ��������

���� ��� ! ����� "��#�� $�����! ���� ������! ���� %���� �����&���

���������� �� ������� � ��������� �������� � ������������ �� ������� ������������ ���������� ���������� ���� ���� �� ������

��� ������ �� � !"" ����� ��#

�����'�� ( $������� ))*+ ��'���� ����� ))*+ �������� , ����� ))*

��������

� ��������� ��� ����� �&�� ��� ������� ��� ������������ ������� ����������� ���������� ��� ����������� ����������

������� -�� ��'����� � ��'� �� ����������� ����� ����� � �&� ����������� � �� ���� ���� �������! ������� � ���&

�������! ��� � ��������� ��&��������� ���� ������� ������� � ����������� ���������� �������.

$�#%����& ����������� ���������� + ����������� ���������� + /�������� ������������+ ��������� �&��� �������+ ��� ����

�� ���� ����

����������� ���������� ��� ����������� �������'

��� ��� �������� ������ ���� �������� 0%�/1 ��'�'��

�� ������� �������� �� ����! '�������� ��� ����� ���

�������� ������� �&������������ 2�'�� �&�����! ���

��'��� &������� 3������ ��� ��������� �&� �&�� ���

��'���� �������. 4&��� �- ������� ���� �� ���

������ ��� �� � ��������'����! �������� ���

&������ ������� ��5� ����������� 6 7. �( ������'

���� ��� �( ���������� ������ �������� �������� 0�!

�� 8��9! %:;1 -&��& ��� ����'� ������� � ����

�������� "���������'� ��������! ��������� )���'

��� �����#������! ��� #������� ������! �������'

�� ���*������� ��� ��������� ������� 6<!=7.

������� �&� -��� ��� %�/ �� �&� � ��������!

�&�� ��� ��������� ��>���������� �� �&� ������������

������� ����������! �&��� "?� ������ ���!

-��& ��� ��@�����! �� �&��������� �&�����������

���! �� -&��& ��� ������ ���������� ����� � ��

������������ 6,!:7. �� � ������ �&� �������������

������ ���������� �������� ��� �&������� �����

����! �� �&�� -�5 -� ������� � ����� ���&� � �&�

������������ �( ���������� ��� �( ����������

����� � �� ���� ������������� ���. 4&�� 5���

������&! �� -&��& ������� ��� ����� � ����

���� ����� � '������� ������ �� � <=� ����

��� ����! &�� ��� ���� ������� �� �&�� ���&�� �

�&� �������� ��>����� �������� 6�!*7. ��'���&�����!

�� ���� � ����� � ������ ��� �������� ��� �����

�������� �������������! �&� ��� ��� �&��

�� ������� ������ ������ ��� �� �- ����������

6(7. �� �&�� ������ -� &�'� �������� � �����

������� � �&� ��3����� ��������� ��&���������

0��%�91 �� ����������� ���������� -��& �&� ���

;=*(� ;)* 8 )* 8 A *.;; B ))* $�������� C������ ������������ ��������. ������&�� �� C���'��� ������� /.D.

��� � ; = * ( � ; ) * 0 ) * 1 ; ; � : �

����������� ���&�. 4��. E ?=) 0<1 <=�*=,,+$��E ?=) 0<1 *;�=;(<).

$C�� ��������� %������ : 0 ))*1 <= F<=�

Page 2: Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

�� ����� �� �� � ���� �� ��� � �������� ��� ��

������������ �� ���� � ���� ���� � ����� ��� ��

�������� ���� ���� �� ������� �� �����������

��� ��� ������� �� ������ � ��� �� ���������

����� ������ ����� � ! "#$�

�� �������� �� ��� ��

� ��� ����� � ����� ��� ��� ��� ����� ����

%������ �� �������� �������� �� &'� ����

������ �� ���� � ��� � ����� ��� �( �� (&

� �� )�% �� �� )�* +���� ,-����.� /�� ��������

��������0 ����1 ������� �� ����� �� (23 ,�4�.

�������0 �23 ,�4�. )�% �� �(2'� ��� ��2'��

�� ������� �� � ! ��� �� ���� ���1 ��� ����

������ �� ����� �� ��+� ��

�� ��� ������� ���

���� ��� �� ������ -5 �� ����� ���� ��

���������� �����+� +� /������ � ��� "�2$� /�� ��

��������� �� -5 0 �� ��1���� ������ �����+�

+� ������ ��� )�6�� "��$ ��� ���0 ������� ��

��1���� ����������� �� �

�� ����������� ����

�� �7% ��5 �8���� �� � �������� ���0 � ����

������� ��� ���� ������������� ������ �����

� ! �� �+����� ��� �� 9)!� ����+�� ���

��+� �

%������ ����0 ��� ������ ��� ������� �� +����� ����� -5 ���� � ���� ����� ��+

%����� <����� ��� ������ ������� ���� �������� �� /��� �

��+ ������� �

� ��� ������� -%) (2(�2 = � � ��

� ��� ������� -%) (2(27 = � � �(

� ��� ������� -%) (2(�; = � � �;

� ��� ������� -%) (2(�� = � � �&

� ��� ������� ��� ;;;�7 = � � �:

� ��� ������� ��� �2�� = � � �7

� ��� ������� ��� �2*#� = � � �*

� ��� ������� ��� (:*&: = � � ��

� ��� ������� ��� ;;;�& = � � +�

� �������� ��� -%) (2(;� = = = +(

� �������� ��� -%) (2(�& = = = +;

� �������� ��� ��� �2&( = = = +&

� �������� ��� ��� �(7#* = = = +:

� �������� ��� ��� (:*&2 = = = +7

� �������� ��� ��� �� = = = +*

� �������� -%) (2;;�� � � � +�

� �������� -%) (2;;( � � � ��

� �������� ���� �&� � � � �(

��� ��������� ��� ���� -%) (2;�&� � � � �;

��� ��������� ����� �� ������ -%) (22��� � � � �&

��� ��������� ��������� ��� �� � � � �:

� ��� ������� ����������� 5�-< :*& � � � �7

� ��� ������� ����������� %�� 7:� � � � �*

��� ��������� ����������� ��+� �

����������

��� ���&( � � � ��

��� ��������� ����� ���� ��� �:22# � � � ��

�%������ 1����� ������ +� ����� � >���� ?��������0 - ����� �� /��� %���� ��� )����+������0 �����������0 /��� ��� 9���������

)����+������ ������0 @�������� �� )����0 A������ ��������� ������� ���� ��� �� � ,������0 � ���.������ �� ,����/������.�

� ��� � �� ! "# � ����������$ �� ��� % &''() ��*��+(;(

Page 3: Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

���� �������� ������ � � ������� ����� �����

����� � ��� ���������� � �� ���������

���� ����������� � ������ ��� ����� ��������� ��

����� ���� ��� ��� �������� ���� �����������

������� ��� ��� ����� ������� ������ ���������

�� �� ������� ������� ����� ���! ����� ��

������ ��� ������ "#$%�

��� ��&�' �������� � �� ��������� ��� ���

���� ��� �� ��� ��������� � ��� ���� ��� ��

����� �������� ������ ��� ������� �� �� �����

�� ()*& ������� ����� �� (*+ �������� ����

�� ��������, -./�. ���������� ��� 0��� 0���

0�� � � 122��������������2����2����� �3���

����!� /������� ��� ���� � �� ������� ������

��� ����� �� ����� $�

�� � ��� ��������� ���������

��� ��� ������� � �� � ����� � $4 �� ������

���1 #55 �� � �������� ������ �6. ����� ��

����� �� ����7 45 �) 8��7 #5 �) �����'�� '

9�47 5�54: �2�! ����� $57 $55 �) � ���� ��;��

��������� �� �� ��� �6��! � $55 �) �

�.��, ���� ��� �<��7 #=5 �) � ���� ��� >5

�) � ���;��������?�� �+<��?��! *��������!

�� �� ��������� ��� ������7 #�4 �) � )���� 7

# �) � ���� ����� ������ ��� ��������� *��

���7 ��� # ? � ��� �������� ������!� .�� ���

������� ������� ���� ������� �� � <��� .�

��� /���� $@55 �������(����!� ��� �� ������

���� ��� �� �����1 ���� �� ��������� �� �

A@B� �� @5 �, �������� �� � ������� � �� ���

�������, �� ��������� �� ������ ��� �� �

>5B� � �;������ #5B� ���� �� ��������

�� � �� ������! ��� ��������� �� #B� ����� ����

�� ����� ���� � ������ � C>B�� .��� # ��� �

�� ���������� ��������� �� ������, =4 ��������

������ ���� ������� �� (;����� ��� ������� �

>$B� �� 45 � ��� �� ���� ������ ���� ������ ��

�� �������� > ��� � >$B�� -������ �� ������

��, 9 �� � ���� ��� ����� ������ �� #�4:

������ ��� �� �.( ��D�� @5 �) ����������,

# �) (��., ' 9!� ��� ��� ��� ��� � 4 E2��

�� �.( ��D��, ������ �� � ����� �������� 5�4

�� � ������� ������ �� �� ��� ���� ��� ��

?E �����

���� ��� ��� ������������

. �;������ # �� � �������� ������ �6. �

���� &.* ����� ���� �� ��� ��� ��� � �� �

���� �������� *��������! �������� �� ����

��������F� ��������� ��� �+< �6. &�������� ���

������ 8� *��������! ��� ���� �� ���;������

��� ��������� � �� @@A�� ������� � �� �� ���

������� ��&�' ����� ��� ��������� ��� �������

�� ������� ����� '����������, ����� �� ����

��, ��� ��� ������� �������� �� ��������

����� $

/������� ��� ���� � �� ������ ���� �� �� �������� ����� �������

������ 6���������� &���� � ! /������� 4��=�!

��� /�/��� ���C> �� ����������!���/�$$ �<..�����<��..��<.��.�

� � /�/��������CA �� ���������!���/�$$ �<..�����<��..��<.��.<

�� /�G�&���A@5 �� ���������!���.�#9 9>$ .����<�<<��<�.����

���- ���/��������##A$ �� ���������!���/�$5 <<.���<.�..�<�.���<�

���� ���/��������#C@5 �� ���������!���.�$5 @@A <����<����<�.���<.��

�6��������� �� ����� �������� �� ���� � ������������ �� ���������� �� ����������� ���� ��� ��� ������ �������� ��

.�� � ��� "##%��H ������ ��������� �� ������1 C>B��

-��� #� � �� ����������� � � ����� ���� ��� ��

�6. � �� ���������, �� ���������� ������ ��� ��� ������

�������� ������ &.*� ��� ����� ����� ������� �� ���� �� ��

� ������� � �� ��� ��� ����� �� ����� #�

�� ��� �� � � ���� ��������� � !������ "�" #"$$%& �'"(�') $==

Page 4: Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

������� ������������ ��� �������������� �

����������� ����� � ��� � ��� �������� ��

���� � �������� ����� � �� �!!�" �� #����

�� ������� � �������

����������� ���������� � ����������� ������

���� ��� � #! �$%& ��'���� ����(��� ��

)*�+� �� ������� �� ��((�� �� �(� , +-� . ����

��/ � ����� � � ��� �� ������� �0��" 0���

� ��� #! �$%& ��� �� �� ���������� � �� ���

������� ���� �1�� � �(� � � �����" �� �� ���� ��

� ��� +�2������( ������� �� ��� ������ �3��(� ���

3�� ����� ������� ������ �0�� ����(���(� �������

��� #! �$%& ��� �� ��� � � ������� �� �����������

� �� �(�� ����� ��� ���� ��� �� ����� 4&5�

3�� �����6���� �� ��� 0�� � 0�� �(�����(�����

��'����� �� 6��� ����/� ���� ��� $70 ����/2

����� ������ , �- �� �� ���� ���� � ����6���

������� ��� ������ ��� ����� ���(( ������

$%& ���� ��'���� � ����� � ��� $70 ���2

���� �� �������� �� 8��( , �-�

3�� �����6���� �� ��� 0��20� ������ ��� ��� ��

���������� � ��� 0��20� ������ ��� ��� �� ����

������ �� ���� � 3�8 � 3�� ����������" ��2

��������(� � +� � � � ����� ������ ��� +�2� ��2

����� �� ��� ��� �� �������� 9 �/ �� �(� , �-

������� ���� ���� /� �� �����������(��� ��������

�� ��� +�2� �� ��� ������ �(( �((� ���(�6������

�� �:���� �� ����� �� ��� �������(� ������ �������

����(���� ;� ��������� ���(��� � 0�$ �������

��� ���� 0�� � 0�� ��� �� ������� � � 0�

������� ������ �� ����� �����6� ���(�6����� �� �

*<�2�� ������� ������ �(� ��� �� ���������� � ��

���������� ������� & ������� �� ��� �=����� �2

����� �� �(� ������ � ����(�� ������� ��� �

7%& ����(��� ���� �� ���������� � �� ������

���� ������ ��� � �������� ���(�� �����������

�� #<�� � �� �> �� >��(�� %� ���(�6�����

?��� �� &������ ��( �(������������� �� ��(��� ��� ���(�6����� ������� ���� �� ����������" �� ���������� ������ � ���� ���(������2

��((� ��(��� 4&5� �� ���������� 7!> ���*� �(�� ��" 7!> ����# �(�� +�" 7!> ���*+ �(�� ��" 7!> ���* �(�� ��" &3�� +++ #

�(�� #�" &3�� *�* �(�� <�" &3�� �<) �(�� *�" &3�� ��<�� �(�� )�" &3�� +++ � �(�� ��" �� ���������� 7!> ���+* �(�� �"

7!> ���*� �(�� ��" &3�� *��� �(�� +�" &3�� �#)< �(�� #�" &3�� ��<�� �(�� <�" 0�� �(�� *�" �� �������� 7!> ��++ �

�(�� )�" �� ������� 7!> ��++� �(�� ���" 0��� � �(�� � �" ���������� ������� 7!> ��+ �� �(�� ���" ���������� ������ ���� �����

�(�� �+�" ���������� ��������� $��� �(�� ���" ����������� ���������� %�7A �<� �(�� ���" ����������� ���������� !�� #�

�(�� �#�" ���������� ���������� ���� ��������� &3�� *�� �(�� �<�" ���������� �������� �(�� �*�� 4��� " �" �" ��(���(��

����� ���/�� B. �5���������C � <#" <##" �+�" �++" #�+" � <" ��+" +)�" �)*" �+�" ���" �� ���

�� ���� � �� � ���� ���������� ����� �!� "�##$% &'�(&'��+�

Page 5: Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

����� ���� ������ � �� ���� �� �������� ��

��� ��� �� ���� �� �� ����� �� ��� ������

�� � �� ��� ������ ���� � ��� ��������� � �� ��

�� �� ��!� ���� � �� � �" #$% ����� ��� ��

���������� ���&���� �� ���� ����������� ����

��� �� � ����� ��� &���� �"������ � ����&�

����� �� ���'���%� ��� ������� �� ��� ����

�� ��������� ���� �� ���� ������������� �� ��

����� ����� ��� ���� ��� ������� � �� ��� ������

�� (�) ������ � �� *+)( ��������

,� ����� � !���� �� ����&�� �� �� ������

��' ��� ��% �� &�� ����-�� ��� ���������

�� � �� ���-����� ��������� � �� *+)( ����

���� ���� *), �������� ���� ��� '����

��������� � ��� ����� �"������ ��� ������ ��

� ����� �� #$% ������� ��� �� ����&�� ��

�� ������ ��� �� ����� �� ��'���%� ��

����� �� ��������� �� ./0$ ��� ������ �� ��1

�+ �� +�$ �� ��� &���� ������� �� �� �"�

����� 223 �� ���� ������ �� � � �� ���� �� ����

����� �� �� ��� ��� �� ���� �� ����� �����

����� �� ��� &���� ������ ��� ������ � ��

���� �� �������� �� �� ��� ��� ��� ���� ��

������ ���� ��� �� ���� ��� ������� � �� ���

������ ���� � ��� 4� � ���� �� ��� &���� �"�

������ ��� ������ �� � �� ����� �� �������

��� �� 110$ � ���- ���� � 223 �� ��� � �� � ��

����� � �� ���� �� �� ���� �� ������ ���� �����

������������� ���������� �� .1 ��� � �����������

� ������ #��! �2� � !��� ��� ���� � ���� .1� ��

��� ������ � �� ���� � �� ����������� � ������

��+ 5�665 ��� � ������ �� ���� 63� �� ���

������ � �� ���� � �� � ���� ������ ����������� ����

���� ����� ��$$ ��725 ���� �� ������� ,� �����

� !���� �� ����&�� �� �� 223��� �������

����� �� �� ��(�8 ���� ��� � �!� ��� �� ����

�� � �� ���� �� � �����������&� ����� � ����

�� ����� ����� ����� �� ������ �� � �� � � ���

������� �"������ �� �� ��� ������� ��

�� �� �� ���"����� ��� ���� � ������ ������

���� ���� � �� � ��� ��� ����� �� �� ����� �����

����� �'�� ��� ��� ������� �� ���� �� �!�� ���

�������� � �������� ��� ������ � �� ��(�8 ����

��� &�� ����� �� 223 �� ������ �� ����� �����

��� �� ������ ���� ����� ��� ��� ��� ������

�� �������� '��������� ������� �� ��� ��

����� � � ��� �� ��� ������� �� � �����������

�&� ����� ��� �� ������ �� �� ����� ����� ������

���� ���� ��� ����� �"������� � �� � �"

#$% �� ����� ��� #���#� #���#� ��� ���'�

��% ��� ������ � �� ����� �� ���������

�� ./0$ ��� ��1 �+ �� +�$ �� ��� ��� &����

����� ������ ������ �� ���� ������� �� 7/5

�� � �!��� �� ����� ����� ��� �� ������ ���� ����

�� �� ���� � �� ���� ����� �� (�)� ��� ���

������� ��� �� � ������ � �� ����� ����� �����

�'�� 5��

,� ���� ���� �� ��!� ��!� ���� �� ����� �����

�� �.� �%�� ��� �� ����������� �� � �"

#$% ���� ����� � ���� ��� ���������� ����

&���� ��� �9������� �� �� ����� ����� ��� ��

������ ���� ������ :� ������ �� -�� �� ���

������ �� �� � ����!� � �� ��� �� ���� ���

�������� �������� ���� �� �� ��������� ��

������� �� ��� �� �� ;<$ ����� ����

��� ������ � �� �� � ����� �� � ��� � ��������

�� ����� ����� ��� �� ������ �����

�������������

��� �������� ��� �������� �� � ���� �� ��

+���� �� �� =�!���� ��� ������ ���� ���

����&� %������� �+=%�� .�>��

���������

?�@ � �� +�*� ��33.� )�������!��� �� ��� ��� �������

����� !�� (���������- /� 66�A621�

?5@ B ��������� ��%� ��336� ;����� �� ��������� ��������

�� ��� ��� ������� '*+� +����� � %�!� �5 63A7.�

?6@ $��� (�+� %������C D�+� '�������C +�'� � ��� B�

��� ,�'� 8�������C #�*� ��� 8� � 8� ��331� ,�� ��� ���

��������C��� �� ������ (1� � ��� �������� ���� ���

��������� ����� ����� �� � ����� ������ �������� ��� �

*�!���� +����� � .� 5.26A5.27�

?2@ ;��!� *�,� ��37.� $�����!��� �� �� ���� �����������

����� ����� �� ��+ 5�572 �� �� ������ ���� ��� ��E���

�� �� �� ���!��� ������ ���� �$�4 �713 �F ,'4

6772 F ��+ 5�666 F ��$$ 666�2�� ,�� D� ���� )����� �

6. 1/3A17��

?1@ ���������� �� 4-��� �� B�C�- +� ��� B������ B�

��336� $�������C��� �� ����������� ������ ���� ��� ���

��������� ����� ����� ����� ��� ��� ������ �� �� ��� ����

�� �� ����� ����� �� �� �������� ������ ��+ 5�572� ,��

D� ���� )����� � 26 7.�A7.6�

?.@ B E� �� :���-��� ��8� ��� �� G�� :�+� ��33�� ,����

&���� �� ������ � ��� ��� ������ �� ���� �� �����

� ��� �� �� � ���� ������������ ������� � � !�""#$ %&�'%&� 561

Page 6: Identification of Pediococcus acidilactici and Pediococcus pentosaceus based on 16S rRNA and ldhD gene-targeted multiplex PCR analysis

��� ����� ���������� ���� ������ � ������ � ��� ����

��� ������� ��� ������ ��� � ������� ������ � ��

!!"#$!!"!�

%�& '������� ��(� ������� �� ) *�+� ��� ,���-�. ,�'�

/�""�0 1�� � ������� ��� ������������� ',� ������� ��

������������ � ������ ����������� �������� ���� *���

������ � 2���� �!! ��$���

%3& � � ��4� 5������ ��+� 2����� �� ���� ���� ��� ���

6�� 2� /�""�0 7�� ���8� ����� ���� ��������� ��� � ��

����� ������ � �9 !���$!��"�

%"& , ��� ���� �����8�: 1� ���� ,� ��8���� �� *���-

(����� �������:�8���� �� '�� ��� +��� 4� ���� ����

��� 4� ���6� �� /�""�0 '�. ������� ��� .��� � ��� ���8�

����������� ��� �� ���� ����� ���� �������� �� ���������� �.

������� ������������� ��;8������ � ��� ����� *��� ����

�� � 2���� �� �$�9�

%�#& *����� ��<� '����� ,� ��������� '�2� ��� � 2� +�

��::� =� ��� ,����� '� /�""#0 <���.��� ��� �����.���

���� ��������� ���� ��� ������� � ����������� ��� ����

���� +������ � 2���� �9 ���$��#�

%��& ������� ��<� ��� ��>�. 2�2� /�"3!0 ���� � ��� �����

����� �� �� ����� ���� � ����� ��� ��� ����� ������

����� ��� � ������� ������ � ?� �?"$��9�

%�9& 2����� �� 5 ��� <�(� �����6 +�2� ��,�8���. ��(�

5������6 �� ���6� 7�(� ����� 7�2 ��� 4��� ,���

/�""!0 7�� ������ �������� ��@���� �8� ��� ����� ����

9� !#9�$!#9!�

%�!& , ��� ���� 4� ���� ���� ��� 4� ���6� �� /�""#0 7��

��. ���. � �������� ��� ��������� �� ���������� �.

��� ���� ��;8���� ��� .���A ���������� � �������������

���� ��� *��� ������ � 2���� �# 9��$9�9�

%�?& <���� ���� /�""�0 ,��8����� ��� .��� � ��� ���������. �

��� ����������� ������8�� ��;8����� �� �������.��� ��

�� ���� �������� *� ������ � �! �$���

%��& >-6 �� >� �� ���� ��>����. �� ������ �� <��

2� 2������ ,� ��� �����6. (�(� /�""#0 �B���� � ������

���� ��� ���������� � ��� � .������ ����� �������A �8

��� ���8���������. ���8� �.�� � ��� ��8����� �8� ���

����� ���� �3 """$�##��

�� ��� �� ��� � ���� �������� ������� ��� �!!"# $%�&$%'9!�