UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESARFACULTAD CIENCIAS DE LA SALUDASIGNATURA - FISIOLOGA MICROBIANADOCENTE-JUAN CARLOS PRADA HERRERAPROGRAMA MICROBIOLOGA

IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS A TRAVS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS CONVENCIONALES

GRELYS JOHANA TERNERA MEJIAGINO FRANCHESCO OLIVIERI SALASKATHY GRISALES HERNANDEZIVONN CAROLINA SIMANCA MEDINAHERNILDA HOYOS ANGULOIDEZARETH HERNANDEZ MESTRE

VALLEDUPAR CESAR2015INTRODUCCIN

Los microrganismos son capaces de crear materia orgnica a partir de elementos inorgnicos por eso deben nutrirse de acuerdo al medio en que se encuentren y que en el interior del medio ocurran una serie de reacciones de sntesis y descomposicin de sustancias orgnicas para su adecuado desarrollo. A partir de estas caractersticas se realizan pruebas para la identificacin, para conocer su metabolismo y su comportamiento frente a ellas. Las pruebas bioqumicas convencionales siempre han representado un camino muy rpido para la detencin directa de Enterobacterias porque son fciles de usar y revelar, el tiempo que manejan es de 24h-48h y se proporcionan como herramienta til para la caracterizacin de cada microrganismo.

OBJETIVOS Realizar y analizar las diferentes pruebas bioqumicas convencionales que se realizan para la identificacin de Enterobacterias. Identificar el microrganismo estudiado, puesto que el equipo de trabajo no lo conoca. Analizar los respectivos resultados y por medio de ellos hacer una previa interpretacin.

MARCO TEORICO

La capacidad de utilizar y transformar la energa es una de las propiedades fundamentales de los sistemas vivientes. La energa puede hallarse en muchas formas, pero aprovechables a los organismos vivos solo muy pocas. La energa mecnica se libera por ejemplo, durante movimiento celular, agitacin de cilios y flagelos, y las alteraciones de la forma celular; la energa electromagntica se encuentra en forma de radiaciones (la luz es la fuente de energa primaria para los organismos sintticos como las algas y las plantas), la energa trmica es producida por la agitacin molecular y, la energa qumica que es la contenida en los enlaces de sustancias y puede ser liberada de los compuestos orgnicos e inorgnicos a travs de ciertas reacciones. Las reacciones qumicas son acompaadas por cambios en el nivel energtico. La energa requerida para que una reaccin inicie se llama energa de activacin. Otros aspectos importantes a considerar es la necesidad de la clula de poseer, adems de catalizadores, una reserva de energa, esta servir para los procesos de sntesis celular y en la conversin de sustratos a formar actividades. En la clula ocurre dos importantes y opuestos procesos, y la generacin de energa y utilizacin de ella en los procesos de sntesis celular, los cuales constituyen el metabolismo, este es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de las clulas y que da lugar a la sntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas .El metabolismo puede dividirse para su mejor estudio en tres aspectos diferentes pero ntimamente ligados; el catabolismo que es la suma de reacciones exergnicas que permiten liberar la energa contenida en los nutrientes o sustratos y ser acumuladas en forma de ATP, u otros compuestos, el metabolismo intermedio que es el conjunto de reacciones de los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos nutrientes son transformados en cidos orgnicos, esteres fosfricos y otros compuestos como aminocidos, y el anabolismo que es la parte del metabolismo implicado en la sntesis de macromolculas (cidos nucleicos, protenas, sustancias de reserva y otros, todos reacciones endergnicas). (Koneman, 2006).

https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTd9xFwn84fJZyC0B1UGVRyNcCGSpHcZxG2ZkctFaZcbVgh5tai1Qhttp://www.elpais.com/recorte/20110526elpepusoc_5/SCO250/Ies/Bacteria_mortal.jpg

La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microrganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microrganismo en estudio es exigente.http://www.elpais.com/recorte/20110605elpepisoc_4/XLCO/Ies/Bacterias_coli_vistas_traves_microscopio.jpg

MATERIALES

Cepa bacteriana. Microscopio. Batera de pruebas bioqumicas convencionales (TSI, SIM, LIA, CITRATO, RM, VP, UREA, FEA). Gradilla. Asas para siembra (redonda y en punta). Mechero. Fsforos Reactivos para tincin de Gram (Cristal violeta, Lugol, alcohol cetona, safranina, aceite de inmersin). Alcohol Algodn Cinta para rotular Lminas

PROCEDIMIENTO

Se toma una cepa bacteriana como parte del anlisis cuya finalidad es lograr identificar que microorganismo est presente a travs del uso de una batera de pruebas bioqumicas convencionales, no obstante la caracterizacin macroscpica y la tincin de Gram hacen parte del anlisis.

Se ingres al laboratorio de microbiologa manteniendo las normas de bioseguridad. Se procedi a escuchar una breve introduccin de lo que ser la prctica a realizar (pruebas bioqumicas de identificacin). Escuchar con atencin las pautas, recomendaciones y normas para realizar la prctica (indicaciones) por parte del profesor. Observar con detenimiento y anotar todos los pasos realizados por el docente al realizar una demostracin rpida de lo que ser la prctica a realizar (pruebas bioqumicas de identificacin). Preparar el rtulo respectivo para los tubo asignado (8 tubos por grupo) (Fecha, agar, tcnica, muestra, T, nombre, grupo). Plaquear los tubos asiganados, ya con los medios (agares) dentro de ellos, para realizar la siembra. Se realiz la identificacin de la morfologa colonial de la cepa tal y como se percibe y se pudo observar que las colonias eran mediadas blanquecinas, con una forma redonda u ovalada. Luego se realiz la tincin de Gram con los respectivos reactivos y respetando el tiempo para cada uno. Se observ en el microscopio y se hizo una posible identificacin puesto que se encontraron Bacilos cortos de color rosado. Se tomaron fotografas y se anotaron los resultados. Se procedi a inocular el microorganismo en las diferentes pruebas bioqumicas para incubar a 37C y as determinar el nombre del microorganismo teniendo en cuenta los resultados al revelar.

SIEMBRA EN AGAR HIERRO TRES AZUCARES (T.S.I) Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. Luego el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el Agar Hierro Tres Azucares. Luego flamear el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por puncin. Una vez realizada la siembra por puncin, antes de sacar el asa, de manera inmediata, con mucho cuidado se realiz la siembra por estria de superfie, guardando mucho cuidado para no romper el agar. Cerrar despus de sembrar y colocar en la gradilla.SIEMBRA EN UREA Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. luego el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el urea agar. Despus se flame el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por puncin. Cerrar despus de sembrar y colocar en la gradilla.SIEMBRA EN MR-VP MEDIO Se tomaron de la placa con el medio de cultivo dos muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. Se tomaron los tubos de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el MR-VP. Luego se flamearon los tubos al abrir y se sembr con el asa utilizando el metodo de siembra por resuspensin. Cerrar despus de sembrar y colocar en la gradilla. SIEMBRA EN AGAR CITRATO Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. Se tom el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el Agar Citrato. Luego se flame el tubo al abrir y sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por puncin para luego incubar.SIEMBRA EN AGAR SIM Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada. Se tom el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el agar SIM. Luego se flame el tubo al abrir y se sembr con el asa utilizando el metodo de siembra por puncin. Cerrar despus de sembrar y colocar en la gradilla. Luego de sembrar se llev a incubar a37C por 24h.

RESULTADOS

ANTES DE INOCULAR E INCUBAR

DESPUS DE INCUBAR A 37C DURANTE 24H

CEPA BACTERIANA

CARACTERIZACIN MICOSCPICA

ANLISIS DE RESULTADO

PRUEBARESULTADOPOSIBLES MICROORGANISMOS

AGAR TRIPLE HIERRO Y AZUCAR (TSI) Color: rojo ladrillo Inhibidores: no tiene Indicador: rojo fenol Sustratos Principales: Lactosa, sacarosa y glucosaA/A: El microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. Se present ruptura del medio de cultivo lo cual indica que hubo produccin de gas. E. coli Klebsiella

MEDIO LIA (LISINA HIERRO AGAR) Color: lila Inhibidores: no tiene Indicador: prpura de bromocresol Sustratos principales: lisina y glucosaK/K: El microorganismo descarboxila la lisina Salmonella E. coli

SULFITO INDOL MOTILIDAD (SIM) Color: crema Indicador: no tiene Inhibidor: no tiene Sustrato principal: peptona Sustrato secundario: tiosulfato sodico, hierro y amanioACIDO SULFHIDRICO : Negativo

INDOL: Positivo

MOTILIDAD : Positivo E. coli

CITRATO Color: verde Inhibidor: no tiene Indicador: azul de bromocresol Sustrato principal: citrato de sodioNEGATIVO: El microorganismo ni tiene la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. E. coli Citrobacter Klebsiella

UREA Color: Amarillo Indicador: rojo fenol Inhibidor: no tiene Sustrato principal: ureaNEGATIVO : El microorganismo no hidroliza la urea E. coli Salmonella Klebsiella

FENILALANINA (FEA) Determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocidofenilalaninaencido fenilpirvicoNEGATIVO: El microrganismo no tiene la capacidad de desaminar la fenilalanina Klebsiella pneumoniae E.coli

ROJO DE METILO Para revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.POSITIVO: disminucin a un pH acido en el medio

E. coli Proteus mirabilis

VOGES- PROSKAUERLa oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio.NEGATIVO : El microorganismo no oxida la acetoina Klebsiella E. coliProteus mirabilis

Los resultados del anlisis de Enterobacterias despus de haber sido aisladas y sometidas a diferentes pruebas bioqumicas se pudo clasificar en E. coli y lo que se observ en el microscopio tambin fue fundamental para poder reconocer este microorganismo. Se logr cumplir el tercer objetivo de esta prctica.

CONCLUSIN

Siempre es importante contar con las herramientas necesarias que faciliten la identificacin de los microorganismos y las pruebas bioqumicas convencionales son bastante til para esa identificacin, puesto que segn los resultados que se obtengan imparten informacin clara y precisa sobre el comportamiento de los microorganismos y la actividad enzimtica que ellos posean.

BIBLIOGRAFIA

Elmer W. Koneman, Stephen Allen.Diagnostico Microbiolgico. Capitulo 6 pg. 280.Editorial Mdica panamericana. Ao 2006. Argentina,Espaa, Mxico, Venezuela. https://biotaetscientia.wordpress.com/2011/06/15/pruebas-microbiologicas-para-e-coli/Da: 28-05-2015Hora: 12:02 pm http://es.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-5-pruebas-bioqumicas-8146300?next_slideshow=2Da: 28-05-2015Hora: 11:30 am file:///C:/Users/gifra/Downloads/1682472836.Bact_identificaci%C3%B3n_bioqu%C3%ADmica_enterobacterias.pdf.Da: 28-05-2015Hora: 11:30 am