8/6/2019 hipoxia endotelina

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R a p i d P u b l i c a t i o nH y p o x i a I n d u c e s E n d o t h e l i n Gene E x p r e s s i o n and S e c r e t i o ni n C u l t u r e d Human E n d o t h e l i u mS t e l l a K o u r e m b a n a s , " t P h i l i p A . M a r s d e n , * Lynda P . M c Q u i l l a n , * and D o u g l a s V . F a l l e r ** D a n a F a r b e r C a n c e r I n s t i t u t e , $ J o i n t P r o g r a m i n N e o n a t o l o g y , T h e C h i l d r e n ' s H o s p i t a l , I T h e R e n a l D i v i s i o n a n dD e p a r t m e n t o f M e d i c i n e , B r i g h a m & W o m e n ' s H o s p i t a l , H a r v a r d M e d i c al S c h o o l , B o s t o n , M a s s a c h u s e t t s 0 2 1 1 5

A b s t r a c tH y p o x i a i n v i v o i s a s s o c i a t e d w i t h c o n s t r i c t i o n o f t h e d i s t a lv a s c u l a t u r e i n t h e l u n g . U n i q u e l y s i t u a t e d a t t h e i n t e r f a c e b e -t w e e n b l o o d a n d t h e v e s s e l w a l l p r o p e r , t h e v a s c u l a r e n d o t h e -l i u m may r e l e a s e v a s o a c t i v e m e d i a t o r s i n t h e s e t t i n g o f h y p -o x i a . E n d o t h e l i n - 1 i s a p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r r e l e a s e d b y e n d o -t h e l i a l c e l l s t h a t c o u l d f u n c t i o n as a p a r a c r i n e r e g u l a t o r o fv a s c u l a r t o n e . We f o u n d t h a t p h y s i o l o g i c l o w o x y g e n t e n s i o n( P o 2 = 3 0 T o r r ) i n c r e a s e d e n d o t h e l i n s e c r e t i o n f r o m c u l t u r e dh u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s f o u r t o e i g h t f o l d a b o v e t h e s e c r e t i o nr a t e a t a m b i e n t o x y g e n t e n s i o n . T h i s i n c r e a s e i n s e c r e t i o n w a sa c c o m p a n i e d b y a c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e i n t h e t r a n s c r i p t i o n a lr a t e o f t i e p r e p r o e n d o t h e l i n g e n e r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d s t e a d y -s t a t e mRNA l e v e l s o f p r e p r o e n d o t h e l i n . I n c o n t r a s t , t h e t r a n -s c r i p t i o n o f a n u m b e r o f o t h e r g r o w t h - f a c t o r - e n c o d i n g g e n e s ,i n c l u d i n g t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - j # , w a s u n a f f e c t e d b y h y p -o x i a . E n d o t h e l i n t r a n s c r i p t p r o d u c t i o n i n c r e a s e d w i t h i n 1 h o fh y p o x i a a n d p e r s i s t e d f o r a t l e a s t 4 8 h . I n a d d i t i o n , t h e s t i m u l a -t o r y e f f e c t s o f l o w o x y g e n t e n s i o n o n e n d o t h e l i n mRNA l e v e l sw e r e r e v e r s i b l e u p o n r e e x p o s u r e t o 21% o x y g e n e n v i r o n m e n t s .T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t a r o l e f o r e n d o t h e l i n i n t h e c o n t r o l o fr e g i o n a l b l o o d f l o w i n t h e v a s c u l a t u r e i n r e s p o n s e t o c h a n g e s i no x y g e n t e n s i o n . ( J . C l i n . I n v e s t . 1 9 9 1 . 8 8 : 1 0 5 4 - 1 0 5 7 . ) K e yw o r d s : v a s o c o n s t r i c t o r * g e n e r e g u l a t i o n * v a s c u l a r t o n e * t r a n -s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n * o x y g e n t e n s i o nI n t r o d u c t i o nE n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g a n d c o n t r a c t i n g f a c t o r s p l a y ak e y r o l e i n m o d u l a t i n g v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e . A b n o r -m a l i t i e s i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e a n d p r o l i f e r a t i o n u n -d e r l i e s u c h d i s e a s e s as a t h e r o s c l e r o s i s , p u l m o n a r y f i b r o s i s , a n dp e r s i s t e n t p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o n o f t h e n e w b o r n . E n d o t h e -l i a l c e l l s a r e k n o w n t o s y n t h e s i z e f a c t o r s w i t h v a s o c o n s t r i c t i v ea c t i v i t i e s . R e p o r t s i n d i c a t e t h a t v a s o c o n s t r i c t i o n o f i s o l a t e d a r -t e r i e s i n c e r t a i n s y s t e m s i s e n d o t h e l i u m d e p e n d e n t ( 1 , 2 ) , o re n d o t h e l i u m e n h a n c e d ( 3 ) . S i m i l a r l y , v a s o r e l a x a t i o n i n r e -A d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o D o u g l a s V . F a l l e r , M . D . , P h . D . , DanaF a r b e r C a n c e r I n s t i t u t e , 4 4 B i n n e y S t r e e t , B o s t o n , MA 0 2 1 1 5 .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 4 M a r c h 1 9 9 1 a n d i n r e v i s e d f o r m 2 0 May1 9 9 1 .

s p o n s e t o a c e t y l c h o l i n e a n d b r a d y k i n i n i s e n d o t h e l i a l d e p e n -d e n t ( 4 , 5 ) . A c r i t i c a l b a l a n c e i n t h e p r o d u c t i o n o f t h e s e p o t e n tv a s o a c t i v e s u b s t a n c e s w o u l d , t h e r e f o r e , b e e s s e n t i a l i n t h e m a i n -t e n a n c e o f n o r m a l v a s c u l a r t o n e .E n d o t h e l i n i s a r e c e n t l y d i s c o v e r e d 2 1 - a m i n o a c i d p e p t i d ew h i c h w a s f i r s t i s o l a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t f r a c t i o n o f c u l -t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s a n d f o u n d t o h a v e p o t e n t v a s o a c t i v ep r o p e r t i e s ( 6 ) . E n d o t h e l i n r e p r e s e n t s o n e member o f a f a m i l yo f s t r u c t u r a l l y r e l a t e d p e p t i d e s . Human e n d o t h e l i n - 1 ( E T - 1 ) ' i sd e r i v e d f r o m a 2 1 2 - a m i n o a c i d p r e c u r s o r , p r e p r o e n d o t h e l i n ,v i a a 3 8 - a m i n o a c i d i n t e r m e d i a t e . E n d o t h e l i n i s c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e d b y e n d o t h e l i a l c e l l s a n d p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t oe n d o t h e l i n a r e r e p o r t e d f o r b l o o d v e s s e l s d e r i v e d f r o m a l a r g ev a r i e t y o f d i f f e r e n t t i s s u e s i n c l u d i n g t h e h e a r t , k i d n e y , a n db r a i n ( 7 ) . F a c t o r s s h o w n t o i n d u c e e n d o t h e l i n p r o d u c t i o n i n -c l u d e t h r o m b i n ( 8 ) , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r ( 3 , t h e C a 2 "i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 , a n d s h e a r s t r e s s ( 6 ) . T h e p o t e n t e f f e c t o fe n d o t h e l i n o n v a s c u l a r t o n e , c o u p l e d w i t h t h e r a p i d c l e a r a n c eo f t h e c i r c u l a t i n g p e p t i d e , s u g g e s t s a c r i t i c a l r o l e f o r l o c a l l yp r o d u c e d p e p t i d e i n t h e r e g u l a t i o n o f r e g i o n a l b l o o d f l o w . F o rt h e v a s c u l a t u r e o f t h e l u n g , a s w e l l as f o r c e r t a i n s y s t e m i c a r t e r -i e s ( 1 ) , h y p o x i a i s a p o t e n t p h y s i o l o g i c i n d u c e r o f l o c a l v a s o -c o n s t r i c t i o n . We t h e r e f o r e h y p o t h e s i z e d t h a t h y p o x i a m i g h tm e d i a t e i t s e f f e c t s b y r e g u l a t i n g t h e r e l e a s e o f v a s o a c t i v e s u b -s t a n c e s , s u c h a s e n d o t h e l i n , f r o m e n d o t h e l i a l c e l l s . I n t h e s t u d -i e s r e p o r t e d h e r e , e a r l y p a s s a g e c u l t u r e d e n d o t h e l i u m was u s e dt o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f o x y g e n t e n s i o n on e n d o t h e l i n p r o -d u c t i o n b y t h e s e c e l l s .MethodsC e l l c u l t u r e a n d c o n d i t i o n s f o r a c h i e v i n g h y p o x i a . P r i m a r y c u l t u r e s o fhuman u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s w e r e s u b c u l t u r e d on g e l a t i n -c o a t e d p l a t e s i n t h e p r e s e n c e o f h e p a r i n ( 1 5 U / m l ) a n d e n d o t h e l i a l c e l lg r o w t h s u p p l e m e n t ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , MO) i n M 1 9 9m e d i u m ( G i b c o L a b o r a t o r i e s , G r a n d I s l a n d , N Y ) w i t h 2 0 % FCS ( H y -C l o n e L a b o r a t o r i e s , L o g a n , U T ) a t 3 7 0 C , 5% C O 2 i n a h u m i d i f i e di n c u b a t o r . C e l l s w e r e p a s s a g e d b y t r y p s i n i z a t i o n w i t h 1 % t r y p s i n /EDTA ( G i b c o ) e v e r y 3 - 4 d . E n d o t h e l i a l c e l l s a t c o n f l u e n c e w e r e e x-p o s e d t o l o w o x y g e n t e n s i o n s i n a i r - t i g h t c h a m b e r s f l u s h e d w i t h p r e a n -a l y z e d g a s m i x t u r e s a t 3 7 C . T h e d e s i r e d o x y g e n m i x t u r e ( 1 % o x y g e n ,5% C 0 2 , 9 4 % N 2 ) w a s p r e a n a l y z e d ( N o r t h e a s t A i r G a s , I n c . , M a n c h e s -t e r , NH) a n d i n f u s e d p e r i o d i c a l l y i n t o a i r - t i g h t i n c u b a t o r s w i t h i n f l o wa n d o u t f l o w v a l v e s ( B i l l u p s - R o t h e n b e r g I n c . , D e l M a r , C A ) a t a f l o wr a t e o f 3 l i t e r / m i n . T h e P 0 2 w a s m e a s u r e d i n t h e m e d i a a t m u l t i p l e t i m ei n t e r v a l s . We f o u n d a s t e a d y d r o p i n P 0 2 f r o m 1 5 0 T o r r t o 6 0 T o r r b y 6

1 . A b b r e v i a t i o n s u s e d i n t h i s p a p e r : E T - 1 , e n d o t h e l i n - l ; P D G F - A , B ,p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r - A , B .1 0 5 4 S . K o u r e m b a n a s , P . A . M a r s d e n , L . P . M c Q u i l l a n , and D . V . F a l l e r

J . C l i n . I n v e s t . T h e A m e r i c a n S o c i e t y f o r C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n , I n c .0 0 2 1 - 9 7 3 8 / 9 1 / 0 9 / 1 0 5 4 / 0 4 $ 2 . 0 0V o l u m e 8 8 , S e p t e m b e r 1 9 9 1 , 1 0 5 4 - 1 0 5 7

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h . T h e P 0 2 r e a c h e d a n a d i r o f 3 0 T o r r b e t w e e n 1 2 a n d 1 8 h o ur s o f 1 %o x y g e n i n f u s e d i n t h e e n v i r o n m e n t a n d d i d n o t f l u c t u a t e t h r o u g h o u tt h e r e m a i n i n g i n c u b a t i o n p e r i o d .RN A a n a l y s i s . T o t a l c e l l u l a r RNA w a s p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o fC h i r g w i n e t a l . ( 9 ) , f r o m e n d o t h e l i a l c e l l s e x p o s e d t o v a r i o u s o x y g e nt e n s i o n s a t c o n f l u e n c e . 1 5 M u g o f RNA p e r l a n e w a s s e p a r a t e d b y e l e c t r o -p h o r e s i s o n 1 % a g a r o s e g e l s c o n t a i n i n g f o r m a l d e h y d e a n d t r a n s f e r r e dt o n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s b y b l o t t i n g . T h e f i l t e r s w e r e h y b r i d i z e dw i t h a 3 2 P - l a b e l e d c DNA p r o b e s p e c i f i c f o r t h e human p r e p r o e n d o t h e -l i n g e n e ( 1 0 ) . T h e a c t i n p r o b e w a s t h e 8 0 0 - b p P s t I f r a g m e n t o f t h em o u s e ( 3 - a c t i n g e n e . H y b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s w e r e c a r r i e d o u t as p r e v i -o u s l y d e s c r i b e d ( 1 1 ) . F o r q u a n t i t a t i o n , t r a n s c r i p t l e v e l s o f p r e p r o e n -d o t h e l i n w e r e n o r m a l i z e d a f t e r d e n s i t o m e t r y t o t h e l e v e l s o f a c t i n t r a n -s c r i p t s , w h i c h d i d n o t c h a n g e u n d e r t h e v a r i o u s o x y g e n e n v i r o n m e n t s .N u c l e a r r u n - o f f a n a l y s i s . C o n f l u e n t c u l t u r e s o f e n d o t h e l i a l c e l l s e x -p o s e d t o 1 % o r 2 1 % o x y g e n f o r 6 , 2 4 , a n d 4 8 h w e r e l y s e d a n d n u c l e ii s o l a t e d a s d e s c r i b e d b y K a v a n a u g h e t a l . ( 1 2 ) . 1 0 0 M l o f n u c l e a r s u s p e n -s i o n w e r e i n c u b a t e d w i t h 0 . 5 mM e a c h o f C TP , A TP , a n d G T P , a n d2 5 0 u C i o f a - 3 2 P - l a b e l e d UT P ( 3 , 0 0 0 C i / m m o l ) ( N e w E n g l a n d N u -c l e a r , B o s t o n , M A ) . T h e s a m p l e s w e r e p h e n o l / c h l o r o f o r m e x t r a c t e d ,p r e c i p i t a t e d , a n d r e s u s p e n d e d a t e q u a l c p m / m l i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r( 1 0 - 2 0 X 1 0 6 c p m / m l ) . H y b r i d i z a t i o n t o d e n a t u r e d p r o b e s ( 1 M g ) d o t -b l o t t e d o n n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s w a s p e r f o r m e d a t 40C f o r 2 d i n t h ep r e s e n c e o f f o r m a m i d e . c DNA p r o b e s f o r t h e e n d o t h e l i n - l , p l a t e l e t -d e r i v e d g r o w t h f a c t o r - A ( P D G F - A ) , s o d i u m - p o t a s s i u m A T P a s e , a n df l - a c t i n g e n e s w e r e u s e d .R a d i o b i n d i n g a s s a y . To q u a n t i f y t h e amount o f e n d o t h e l i n s e -c r e t e d b y e n d o t h e l i a l c e l l s u n d e r t h e v a r i o u s o x y g e n t e n s i o n s , c o n d i -t i o n e d m e d i u m w a s c e n t r i f u g e d a t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n p e r i o d sa n d a p p l i e d t o p r e a c t i v a t e d S e p - P a k C j 8 c o l u m n s . S a m p l e s w e r e e l u t e dw i t h e t h a n o l / H 2 0 / a c e t i c a c i d ( 9 0 : 9 . 6 : 0 . 4 ) , vacuum I y o p h i l i z e d , a n dr e s u s p e n d e d i n a s s a y b u f f e r . D e t e r m i n a t i o n s o f e n d o t h e l i n w e r e p e r -f o r m e d w i t h a r a d i o b i n d i n g a s s a y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y M a r s d e ne t a l . ( 1 3 ) . T h i s c o m p e t i t i v e r a d i o b i n d i n g a s s a y u s e s r a t g l o m e r u l a rm i c r o s o m e s b e a r i n g e n d o t h e l i n - s p e c i f i c r e c e p t o r s a s t h e b i n d i n g f r a c -t i o n a n d [ 1 2 5 1 ] - E T - l a s t h e r a d i o a c t i v e t r a c e r .R e s u l t sH y p o x i a i n c r e a s e s p r e p r o e n d o t h e l i n mRNA l e v e l s i n e n d o t h e -l i a l c e l l s . P r i m a r y c u l t u r e s o f human u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a lc e l l s w e r e e x p o s e d t o a h y p o x i c a t m o s p h e r e w i t h P o 2 = 3 0mmHg ( 1 % o x y g e n ) o r t o a n a m b i e n t ( 2 1 % o x y g e n ) e n v i r o n -m e n t . N o r t h e r n b l o t a n a l y s i s o f e n d o t h e l i a l c e l l RNA a f t e r h y -b r i d i z a t i o n w i t h a cDNA p r o b e f o r p r e p r o e n d o t h e l i n - 1 s h o w e da m a r k e d i n c r e a s e i n p r e p r o e n d o t h e l i n s t e a d y s t a t e mRNA l e v -e l s i n c e l l s e x p o s e d t o l o w o x y g e n t e n s i o n s f o r 2 4 o r 4 8 h , a sc o m p a r e d t o 21% o x y g e n c o n d i t i o n s ( F i g . 1 A ) . E n d o t h e l i nt r a n s c r i p t l e v e l s i n c r e a s e d t w o f o l d w i t h i n 1 h o f e x p o s u r e t oh y p o x i a a n d a p p r o x i m a t e l y s i x t o e i g h t f o l d b y 4 8 h ( F i g . 1 B ) .R e t u r n o f p r e p r o e n d o t h e l i n mRNA t o t h e b a s e l i n e l e v e l s o f t h en o r m o x i c c o n t r o l s w a s o b s e r v e d w i t h i n 2 4 h o f r e e x p o s u r e o fc e l l s t o a 21% o x y g e n e n v i r o n m e n t ( F i g . 1 C ) .H y p o x i a i n c r e a s e s t h e t r a n s c r i p t i o n a l r a t e o f e n d o t h e l i n - J .To e x a m i n e m e c h a n i s m s b y w h i c h h y p o x i a i n c r e a s e d e n d o t h e -l i n t r a n s c r i p t l e v e l s , t h e h a l f - l i f e o f t h e e n d o t h e l i n t r a n s c r i p tw a s d et e rm in e d i n t h e h y p o x i c a n d n o rm o xi c c o n d i t i o n s b ya c t i n o m y c i n - D c h a s e e x p e r i m e n t s . T h e h a l f - l i f e o f t h e e n d o t h -e l i n t r a n s c r i p t w a s -30 m i n u n d er b o th c o n d i t i o n s ( d a t a n o ts h o w n ) . H e n c e d i f f e r e n t i a l s t a b i l i t y o f p r e p r o e n d o t h e l i nmRNA c o u l d n o t a c c o u n t f o r t h e i n c r e a s e i n s t e a d y - s t a t e l e v e l sf o u n d u n d e r v a r y i n g l o w o x y g e n e n v i r o n m e n t s . N u c l e a r r u n -o f f a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t t o d e t e r m i n e t h e t r a n s c r i p t i o n a lr a t e o f t h e e n d o t h e l i n g e n e u n d e r h y p o x i c a s c o m p a r e d t o n o r -

A F i g u r e 1 . R e g u l a t i o n o fp r e p r o e n d o t h e l i n

2 8 S mRNA l e v e l s b y o x y g e nt e n s i o n i n human um-1 8 S 1 * E n d o t h e l i n b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a lc e l l s . ( A ) P h y s i o l o g i c1 % 2 1 % 1 % 2 1 % O x y g e n l e v e l s o f h y p o x i a i n -2 4 2 4 4 8 4 8 H o u r s c r e a s e p r e p r o e n d o t h e l i n

mRNA l e v e l s i n e n d o -t h e l i a l c e l l s . E a r l y p a s -A c t i n s a g e human u m b i l i c a lv e i n e n d o t h e l i a l c e l l sf r o m a t l e a s t t h r e e d i f -f e r e n t d o n o r s w e r eg r o w n t o c o n f l u e n c e i nB 1 % g e l a t i n - c o a t e d 1 0 -

7 cm d i a m e t e r t i s s u e c u l -6 Jlu r e p l a t e s c o n t a i n i n g5 m l o f c u l t u r e m e d i aE_ 5 / ( 1 1 ) . T h e c e l l s w e r e a l -es 4/o w e d t o r e a c h c o n -

a ' a 3 f l u e n c e a t 3 7 0 C , 5%C / O 2 a n d w e r e t h e np l a c e d i n a 2 1 % , or 1 %o x y g e n e n v i r o n m e n t0 - ; 4 6 2 ' 4 4 ' 8 w i t h 5% C O 2 a n d t h eT i m e I n H y p o x i a ( H o u r s ) b a l a n c e N 2 , f o r a p e r i o do f 2 4 o r 4 8 h . A t t h ee n d o f t h e 2 4 - a n d 4 8 - h

c i n c u b a t i o n p e r i o d s , t o -t a l c e l l u l a r RNA w a si s o l a t e d b y t h e m e t h o do f C h i r g w i n e t a l . ( 9 ) .2 8 S-15o f RN A p e r l a n ev

- .4 4 Endothelin w e r e s e p a r a t e d b y e l e c -I S S E n d o t h e l i n t r o p h o r e s i s o n 1 % a g a -r o s e g e l c o n t a i n i n g1 % 2 1 % 1 % O x y g e n f o r m a l d e h y d e a n d t r a n s -

2 1 % f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e b y b l o t t i n g .T h e f i l t e r w a s h y b r i d i z e d w i t h a 3 2 P - l a b e l e d cD NA p r o b e s p e c i f i c f o rt h e human p r e p r o e n d o t h e l i n g e n e ( 1 0 ) . H y b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s a n ds t r i n g e n t w a s h e s w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 2 ) . A f t e ra u t o r a d i o g r a p h y , t h e f i l t e r w a s s t r i p p e d a n d r e h y b r i d i z e d w i t h a f l -a c t i n s p e c i f i c p r o b e . ( B ) T i m e c o u r s e o f p r e p r o e n d o t h e l i n mRNA i n -d u c t i o n b y h y p o x i a . E n d o t h e l i a l c e l l s w e r e f e d w i t h g r o w t h m e d i u ma t l e a s t 1 2 h b e f o r e e x p o s u r e t o h y p o x i a . T o t a l RNA w a s e x t r a c t e d a tt i m e 0 , a n d a f t e r 1 , 4 , 6 , 2 4 , a n d 4 8 h o f e x p o s u r e o f c e l l s t o h y p o x i a ,s e p a r a t e d o n a f o r m a l d e h y d e g e l , t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e , a n dh y b r i d i z e d w i t h a 3 2 P - l a b e l e d E T - 1 p r o b e . T h e p a r t i a l p r e s s u r e o f o x -y g e n i n t h e m e d i u m o v e r t h e c e l l s w a s 6 0 - 8 0 T o r r f o r t h e f i r s t 6 ha n d d e cr e a s e d t o 3 0 T o r r b y 2 4 h , w h e r e i t r e m a i n e d f o r t h e d u r a t i o no f t h i s e x p e r i m e n t . R e l a t i v e p r e p r o e n d o t h e l i n t r a n s c r i p t l e v e l s a rep l o t t e d a g a i n s t t i m e o f e x p o s u r e o f c e l l s t o h y p o x i a . T h e p r e p r o e n -d o t h e l i n mRNA l e v e l s a t 2 1 % o x y g e n ( t i m e 0 ) w e r e a r b i t r a r i l y m a d ee q u a l t o 1 . T h e f i l t e r w a s s t r i p p e d a n d r e h y b r i d i z e d w i t h a # l - a c t i ns p e c i f i c p r o b e , f o l l o w e d b y a n A T P a s e s p e c i f i c p r o b e . T h e r e w e r e n oc h a n g e s i n t h e t r a n s c r i p t l e v e l s o f e i t h e r f l - a c t i n o r A T P a s e g e n e s i nr e s p o n s e t o o x y g e n t e n s i o n ( n o t sh o wn ) . ( C ) T h e e f f e c t o f h y p o x i ao n e n d o t h e l i n i s r e v e r s i b l e . T o t a l c e l l u l a r RNA w a s h a r v e s t e d f r o me n d o t h e l i a l c e l l s g r o w n i n 1 % o r 21% o x y g e n e n v i r o n m e n t s f o r 2 4 h( l a n e s I a n d 2 , r e s p e c t i v e l y ) , a n d f r o m c e l l s e x p o s e d t o 1 % o x y g e nf o r 2 4 h f o l l o w e d b y 21% o x y g e n f o r 2 4 h ( l a n e 3 ) . C e l l u l a r RNA w a si s o l a t e d a n d t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e a n d t h e b l o t w a s h y b r i d i z e dw i t h a 3 2 P - l a b e l e d E T - 1 s p e c i f i c p r o b e a n d t h e n s t r i p p e d a n d r e h y b r i -d i z e d w i t h a f - a c t i n s p e c i f i c p r o b e . f l - a c t i n t r a n s c r i p t l e v e l s r e m a i n e dt h e s a m e u n d e r a l l c o n d i t i o n s ( n o t s h o w n ) .

I n d u c t i o n o f E n d o t h e l i n b y H y po x i a 1 0 5 5

8/6/2019 hipoxia endotelina

3/4

m o x i c c o n d i t i o n s . T r a n s c r i p t i o n a l r a t e s w e r e d et e rm i n ed a t 6 ,2 4 , a n d 4 8 h a f t e r e x p o s u r e t o 21% o r 1 % o x y g e n ( P o 2 = 3 0mmHg) a t m o s p h e r e . T r a n s c r i p t i o n a l r a t e s o f o t he r g en e s e x -p r e s s e d b y e n d o t h e l i a l c e l l s s u c h a s vWF, s o d i u m - p o t a s s i u mA T P a s e , P D G F - A , a n d # - a c t i n w e r e a n a l y z e d f o r c o m p a r i s o n .In f i v e s e p a r a t e e xp er i me n t s, h y p o x i a s t i m u l a t e d t r a n s c r i p t i o no f t h e e n d o t h e l i n g e n e a n a v e r a g e o f f o u r t o e i g h t f o l d a b o v e t h er a t e o b s e r v e d a t 21% o x y g e n ( F i g . 2 ) . T h e t r a n s c r i p t i o n a l r a t e so f t h e A T P a s e , vWF, a n d PDGF-A g e n e s w e r e n o t i n c r e a s e d b yh y p o x i a . I n t w o o u t o f f i v e experi m e n t s , t h e g e n e f o r ( l - a c t i nw a s t r a n s c r i b e d a t a r a t e t w o t o t h r e e t i m e s h i g h e r i n c e l l s e x -p o s e d t o h y p o x i c c o m p a r e d t o n o r m o x i c c o n d i t i o n s . ( T h es t e a d y - s t a t e mRNA l e v e l s o f # - a c t i n , h o w e v e r , r e m a i n e d c o n -s t a n t u n d e r a l l o x y g e n e n v i r o n m e n t s . ) T h e h y p o x i a - i n d u c e di n c r e a s e i n p r e p r o e n d o t h e l i n mRNA i n human u m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a l c e l l s i s t h e r e f o r e p r e d o m i n a n t l y d u e t o i n c r e a s e dg e n e t r a n s c r i p t i o n a s o p p o s e d t o e n h a n c e d s t a b i l i t y o f i t smRNA t r a n s c r i p t .H y p o x i a - m e d i a t e d i n c r e a s e s i n e n d o t h e l i n s e c r e t i o n . To d e -t e r m i n e w h e t h e r t h i s f o u r t o e i g h t f o l d i n c r e a s e i n g e n e t r a n -s c r i p t i o n r e s u l t e d i n c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e s i n e n d o t h e l i n p r o -t e i n s e c r e t e d b y e n d o t h e l i a l c e l l s , a r a d i o l i g a n d b i n d i n g a s s a yw a s u s e d t o q u a n t i t a t e t h e e n d o t h e l i n c o n t e n t i n c o n d i t i o n e dmedia . A f t e r e x p o s i n g e n d o t h e l i a l c e l l s t o h y po x ia , c o n d i t io n e dm e d i a w e r e c o l l e c t e d a t 1 - h , 3 - h , 6 - h , 1 2 - h , a n d 2 4 - h i n t e r v a l si n p a r a l l e l w i t h m ed ia f r o m c e l l s e x p o s e d t o a m b i e n t a t m o -s p h e r e s . T h e m e d i a w e r e a s s a y e d f o r e n d o t h e l i n a c t i v i t y a s d e -s c r i b e d u n d e r M e t h o d s , a n d c o m p a r e d b e t w e e n t h e t w o c o n d i -t i o n s a t e a c h o f t h e i n d i c a t e d t i m e p o i n t s . A r e p r e s e n t a t i v er e s u l t f r o m f o u r i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s i s s h o w n o n F i g . 3 .T h e a m o u n t o f s e c r e t e d e n d o t h e l i n i n c r e a s e d f o u r t o e i g h t f o l dw h e n c e l l s w e r e i n c u b a t e d i n l o w o x y g e n a t m o s p h e r e s a s c o m -pared t o 21% o x y g e n c o n d i t i o n s . T h i s e f f e c t w a s d em o n st r ab l ew i t h i n 6 h o f e x p o s u r e t o h y p o x i a . I n c u b a t i o n p e r i o d s s h o r t e rt h a n 6 h y i e l d e d n o d e t e c t a b l e d i f f e r e n c e s i n e n d o t h e l i n s e c r e -t i o n b e t w e e n t h e t w o o x y g e n e n v i r o n m e n t s . I t i s p o s s i b l e t h a td i f f e r e n c e s i n s e c r e t i o n o f e n d o t h e l i n o c c u r s u b s t a n t i a l l y f a s t e rt h a n 6 h , b u t t h e c o n s t r a i n t s o f o u r s y s t e m ar e s u c h t h a t e n o u g he n d o t h e l i n m u s t b e s e c r e t e d b y 1 0 6 c e l l s t o c h a n g e t h e c o n c e n -t r a t i o n i n 5 m l o f o v e r l y i n g medium b e f o r e i t c a n b e d e t e c t e d .A l t h o u g h t h e r a d i o r e c e p t o r a s s a y u s e d h e r e c a n n o t d i s t i n g u i s hamong t h e d i f f e r e n t e n d o t h e l i n i s o t y p e s ( E T - 1 , - 2 , - 3 ) , t h ecDNA p r o b e u s e d i n t h e h y b r i d i z a t i o n e x p e r i m e n t s r e c o g n i z e s

F i g u r e 2 . H y p o x i a i n c r e a s e s e n d o t h e -l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n . E n d o t h e l i a lA T P a s e c e l l s a t c o n f l u e n c e w e r e e x p o s e d t o* vWF 1 % o r 21% o x y g e n e n v i r o n m e n t s f o r* * E n d o t h e l i n 6 , 2 4 , a n d 4 8 h a s d e s c r i b e d i n t h e

* * A c t i n l e g e n d t o F i g . 1 . N u c l e i w e r e i s o l a t e d* as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 5 , 2 1 ) , a n dP D G F - A i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n w a s a l l o w e d t or e s u m e i n t h e p r e s e n c e o f a - 3 2 P - U T P .1% 2 1 % O x y g e n E q u a l a m o u n t s o f 3 2 P - l a b e l e d , i n v i t r ot r a n s c r i b e d RNA w e r e h y b r i d i z e d t od e n a t u r e d cD NA f o r t h e e n d o t h e l i n - 1 , P D G F - A , s o d i u m - p o t a s s i u mA T P a s e , a n d f l - a c t i n g e n e s , w h i c h h a d b e e n p r e v i o u s l y i m m o b i l i z e do n n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s . S h o w n a re r e p r e s e n t a t i v e a u t o r a d i o g r a m sf r o m n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n a f t e r 6 h o f e x p o s u r e t o 1 % o r 2 1 % o x y g e n ,f r o m f i v e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . S i m i l a r r e s u l t s a r e o b t a i n e d a f t e r 2 4

o r 4 8 h o f e x p o s u r e t o h y p o x i a .

F i g u r e 3 . H y p o x i a i n -c r e a s e s t h e s e c r e t i o n o fe n d o t h e l i n f r o m c u l -_1 % t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s .M e d i a c o n d i t i o n e d b yhuman u m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a l c e l l s u n d e rn o r m o x i c ( 2 1 % o x y g e n ;!2 4 h a t c h e d b a r s ) o r h y p -H o u r s o x i c ( 1 % o x y g e n ; s o l i db a r s ) c o n d i t i o n s w e r ec o l l e c t e d a t t h e i n d i c a t e d t i m e s . D e t e r m i n a t i o n s o f e n d o t h e l i n w e r ep e r f o r m e d w i t h a r a d i o b i n d i n g a s s a y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 3 ) .R ec o v e ry o f E T - l w a s 2 9 0 % . I n t e r - a n d i n t r a a s s a y v a r i a b i l i t y a r e1 1 . 7 % a n d 6 . 0 % , r e s p e c t i v e l y . A f t e r r e m o v a l o f t h e c o n d i t i o n e d m e -d i a , t h e c e l l s w e r e l y s e d a n d t o t a l p r o t e i n w a s q u a n t i f i e d t o n o r m a l i z ef o r a n y d i f f e r e n c e s i n c e l l s u r v i v a l . E q u a l a m o u n t s o f t o t a l c e l l u l a rp r o t e i n w e r e o b t a i n e d u n d e r h y p o x i c a n d n o r m o x i c c o n d i t i o n s f o re a c h t i m e p o i n t , s u g g e s t i n g t h a t t h i s perio d o f h y p o x i a h ad n o t o x i ce f f e c t s o n t h e e n d o t h e l i a l c e l l s . E n d o t h el i n p r o du c t i o n i s s h o w n a se n d o t h e l i n c o n c e n t r a t i o n i n 5 m l o f m e d i u m p r o d u c e d / t i m e .

o n l y t h e g e n e f o r E T - 1 a n d d o e s n o t c r o s s - r e a c t w i t h t h e o t h e r s .In a d d i t i o n , t h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m a p p e a r s t o e x p r e s s E T - Io n l y ( 1 4 ) . T h e r e f o r e , h y p o x i a - i n d u c e d i n c r e a s e s i n e n d o t h e -l i u m p r o d u c t i o n b y e n d o t h e l i a l c e l l s a r e d u e t o i n c r e a s e si n E T - 1 .D i s c u s s i o nE n d o t h e l i n i s a p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r a n d a l s o a m i t o g e n f o rf i b r o b l a s t s a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s ( 1 5 , 1 6 ) . I n c r e a s e s i n i t ss e c r e t i o n f r o m e n d o t h e l i a l c e l l s c a n , t h e r e f o r e , i n c r e a s e t h ec o n t r a c t i l e a n d p r o l i f e r a t i v e s t a t e o f t h e u n d e r l y i n g f i b r o b l a s t sa n d s mo o t h m u s c l e c e l l s . H y p o x i a h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e av a r i e t y o f e f f e c t s o n e n d o t h e l i a l c e l l s , r a n g i n g f r o m a l t e r a t i o n si n p r o t e i n s y n t h e s i s t o c h a n g e s i n g e n e t r a n s c r i p t i o n ( 1 7 - 2 2 ) .F o r e x a m p l e , V e n d e r e t a l . ( 1 8 ) r e p o r t e d t h e r e l e a s e o f a u n i q u es m o o t h m u s c l e c e l l m i t o g e n f r o m b o v i n e p u l m o n a r y e n d o t h e -h a l c e l l s e x p o s e d t o h y p o x i a . H u m p h r i e s e t a l . ( 1 9 ) s h o w e d t h a th y p o x i a c a u s e s a d e c r e a s e i n t h e s e c r e t i o n o f h e p a r a n s u l f a t ep r o t e o g l y c a n f r o m c u l t u r e s o f b o v i n e p u l m o n a r y a r t e r y e n d o -t h e l i a l c e l l s . We h a v e r e p o r t e d t h a t PDGF-B c h a i n g e n e e x p r e s -s i o n i s d r a m a t i c a l l y i n c r e a s e d i n e n d o t h e l i a l c e l l s e x p o s e d t o an a r r o w a n d p h y s i o l o g i c r a n g e o f l o w o x y g e n t e n s i o n ( P o 2= 2 0 - 4 5 mmHg) ( 2 2 ) .H y p o x i a a l s o h a s b e e n r e p o r t e d t o r e s u l t i n t h e r e l e a s e o fv a s o a c t i v e s u b s t a n c e s f r o m w h o l e v e s s e l s . R a k u g i e t a l . ( 2 3 )r e p o r t e d a s t i m u l a t i o n o f e n d o t h e l i n r e l e a s e o f 7 0 % a b o v e b a s e -l i n e i n r e s p o n s e t o h y p o x i a i n a mese n t e ri c a r t e r y p e r f u s a t es y s t e m . V a n h o u t t e e t a l . ( 2 4 ) u s i n g a b i o a s s a y s y s t e m a l s of o u n d e v i d e n c e o f e n d o t h e l i n - l i k e m e d i a t e d v a s o c o n s t r i c t i o ni n r e s p o n s e t o h y p o x i a . I n t h e s t u d i e s r e p o r t e d h e r e , h y p o x i aw a s f o u n d t o i n c r e a s e e n d o t h e l i n p r o d u c t i o n b y e n d o t h e l i a lc e l l s p r i n c i p a l l y b y i n c r e a s i n g t h e t r a n s c r i p t i o n a l r a t e o f t h eg e n e w i t h i n 1 h o f e x p o s u r e t o l o w o x y g e n t e n s i o n . T h e m a x i -m a l i n c r e a s e w a s f o u r t o e i g h t f o l d a b o v e t h e b a s e l i n e r a t e o ft r a n s c r i p t i o n p r e s e n t a t a m b i e n t a t m o s p h e r e s . A c o m p a r a b l ei n c r e a s e w a s s h o w n f o r t h e amount o f t o t a l e n d o t h e l i n p r o t e i ns e c r e t e d b y t h e s e c e l l s w it hi n 6 h a f t e r h y p o x i c e x p o s u r e . T h ee n d o t h e l i a l c e l l s c o n t i n u e d t o p r o l i f e r a t e d u r i n g e x p o s u r e t o

1 0 5 6 S . K o u r e m b a n a s , P . A . M a r s d e n , L . P . M c Q u i l l a n , a n d D . V . F a l l e r

8/6/2019 hipoxia endotelina

4/4

h yp o xi a , a n d c o n t i n u e d t o e x p r e s s t r a n s c r i p t s f o r o t h e r g r o w t hf a c t o r s l i k e t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r f l , P D G F - A , b a s i c f i b r o -b l a s t g r o w t h f a c t o r , a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n s l i k e f l - a c t i n ( 2 2 ) .F u r t h e r m o r e , e n d o t h e l i n p r o d u c t i o n r e t u r n e d t o b a s e l i n e l e v -e l s u p o n r e e x p o s u r e o f c e l l s t o n o r m o x i a s u g g e s t i n g t h a t t h ec e l l u l a r r e s p o n s e t o h y p o x i a w a s n o t m e d i a t e d b y c e l l u l a r t o x i c -i t y . T h e i n c r e a s e i n g e n e t r a n s c r i p t i o n among t h e g r o w t h f a c -t o r s t e s t e d w a s l i m i t e d t o t h e v a s o c o n s t r i c t o r s ( e n d o t h e l i n a n dPDGF-B) p r o d u c e d b y e n d o t h e l i a l c e l l s .I n c o n t r a s t t o PDGF-B w h ic h w a s i n d u c e d 2 4 h a f t e r h y p -o x i c e x p o s u r e , h o w e v e r , i n c r e a s e s i n e n d o t h e l i n p r o d u c t i o n o c -c u r r e d w i t h i n 1 h o f h y p o x i a a n d l a s t e d f o r a p e r i o d o f a t l e a s t2 - 3 d ( l o n g e r e x p o s u r e t i m e s w e r e n o t e x a m i n e d ) . I n d e e d , n o to n l y i s t h e r e s p o n s e t im e o f t h e e n d o t h e l i n g e n e t o h y p o x i amuch f a s t e r t h a n f o r t h e PDGF-B g e n e , b u t i t s e x p r e s s i o n i si n c r e a s e d a t m i l d e r d e g r e e s o f h y p o x i a . T h e p h y s i c a l c o n -s t r a i n t s o f t h e e x p er i m e n t a l s y s t e m s we e m p l o y i n t h e s e s t u d i e sr e s u l t i n a s u b s t a n t i a l d e l a y p e r i o d b e f o r e t h e o x y g e n t e n s i o n i nt h e m e d i a b a t h i n g t h e e n d o t h e l i a l c e l l s e q u i l i b r a t e s w i t h t h es u r r o u n d i n g g a s m i x t u r e . A s a r e s u l t , t h e P o 2 i n t h e m e d i a i sa b o u t 6 0 - 8 0 T o r r a f t e r 1 h o f e x p o s u r e o f c e l l s t o 1 % o x y g e na t m o s p he r e s . Y e t , t h i s p e r i o d o f t i m e a n d m i l d d e g r e e o f h y p -o x i a i s s u f f i c i e n t t o i n c r e a s e e n d o t h e l i n t r a n s c r i p t l e v e l s . Am o r e s e v e r e deg ree o f h y p o x i a , n a m e l y a P o 2 o f 2 0 - 4 5 T o r r ,w a s n e c e s s a r y t o i n d u c e t h e PDGF-B g e n e .T h e e n d o t h e l i a l c e l l s e x h i b i t a t w o - p h a s e r e s p o n s e t o h yp -o x i a s t i m u l i i n t h e i r s e c r e t i o n o f v a s o a c t i v e a g e n t s . T h e s e n s i -t i v e a n d r a p i d r e g u l a t i o n o f e n d o t h e l i n e x p r e s s i o n i n r e s p o n s et o e n v i r o n m e n t a l o x y g e n m a k e s i t a l i k e l y c a n d i d a t e a s a n i m -p o r t a n t r e g u l a t o r o f r e g i o n a l b l o o d f l o w i n r e s p o n s e t o a c u t ec h a n g e s i n o x y g e n t e n s i o n . H y p o x i a - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o fp u l m o n a r y a r t e r y s t r i p s o c c u r a t l e a s t 2 - 6 h a f t e r a n a d a p t a t i o na t P o 2 o f 2 0 - 4 0 T o r r ( 1 ) . F a c t o r s s u c h a s e n d o t h e l i n t h a t a r es e c r e t e d w i t h i n 6 h o f h y p o x i a c o u l d m e d i a t e s u c h v a s o c o n -s t r i c t i v e e v e n t s . P D G F - B , w i t h i t s l a t e r i n d u c t i o n r e q u i r i n gm o r e s e v e r e d e g r e e s o f h yp o xi a , ma y t h e n b e a m o r e i m p o r t a n tm o d u l a t o r o f t h e s m o o t h m u s c l e h y p e r t r o p h y a n d a r c h i t e c -t u r a l r e m o d e l i n g o c c u r r i n g i n c h r o n i c h y p o x i a . B o t h p r o c e s s e s ,v a s o c o n s t r i c t i o n a n d s mo o t h m u s c l e c e l l h y p e r p l a s i a , a r e c r i t i -c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s o f d i s e a s e s s u c h a s a t h e r o s c l e r o s i s , p u l -m o n a r y f i b r o s i s , a n d p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o n .AcknowledgmentsWe t h a n k D r . M e r t o n B e r n f i e l d f o r c r i t i c a l r e v i e w o f t h e m a n u s c r i p t .D r . K o u r e m b a n a s w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e A m e r i c a nL u n g A s s o c i a t i o n . D r . F a l l e r w a s s u p p o r t e d b y r e s e a r c h g r a n t s f r o m t h eA m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , T h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , a n d T h eC o u n c i l f o r T o b a c c o R e s e a r c h . D r . K o u r e m b a n a s i s t h e r e c i p i e n t o f aC l i n i c a l I n v e s t i g a t o r A w a r d a n d a C h a r l e s H . H o o d / M e d i c a l F o u n d a -t i o n F e l l o w s h i p . D r . M a r s d e n i s a M e d i c a l R es ea rc h C o u n c i l o f C a n a d af e l l o w s h i p r e c i p i e n t . D r . F a l l e r i s t h e r e c i p i e n t o f a S e n i o r F a c u l t yA w a r d f r o m t h e A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y .R e f e r e n c e s

1 . H o l d e n , W . E . , a n d E . M c C a l l . 1 9 8 4 . H y p o x i a - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s o fp o r c i n e p u l m o n a r y a r t e r y s t r i p s d e p e n d o n i n t a c t e n d o t h e l i u m . E x p . L u n g R e s .7 : 1 0 1 - 1 1 2 .

2 . R ub an y i, G . M . , a n d P . M . V a n h o u t t e . 1 9 8 5 . H y p o x i a r e l e a s e s a v a so c o n-s t r i c t o r s u b s t a n c e f r o m t h e c a n i n e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) .3 6 4 : 4 5 - 5 6 .3 . B r e n n e r , B . M . , J . L . T r o y , a n d B . J . B a l l e r m a n . 1 9 8 9 . E n d o t h e l i u m - d e p e n -d e n t v a s c u l a r r e s p o n s e s . M e d i a t o r s a n d m e c h a n i s m s . J . C l i n . I n v e s t . 8 4 : 1 3 7 3 -1 3 7 8 .4 . F u r c h g o t t , R . F . , a n d J . V . Z a w a d z k i . 1 9 8 0 . T h e o b l i g a t o r y r o l e o f e n d o t h e -l a l c e l l s i n t h e r e l a x a t i o n o f a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e b y a c e t y l c h o l i n e . N a t u r e( L o n d . ) . 2 8 8 : 3 7 3 - 3 7 6 .5 . P a l m e r , R . M . J . , A . G . F e r r i g e , a n d S . M o n c a d a . 1 9 8 7 . N i t r i c o x i d e r e l e a s ea c c o u n t s f o r t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r . N a -t u r e ( L o n d . ) . 3 2 7 : 5 2 4 - 5 2 6 .6 . Y a n a g i s a w a , M . , H . K u n h a r a , S . K i m u r a , Y . T o m o b e , M. K o b a y a s h i , Y .M i t s u i , Y . Y a z a k i , K . G o t o , a n d T . M a s a k i . 1 9 8 8 . A n o v e l p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o rp e p t i d e p r o d u c e d b y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . N a t u r e ( L o n d . ) . 3 3 2 : 4 1 1 - 4 1 5 .7 . M a c C u m b e r , M. W . , C . A . R o s s , B . M . G l a s e r , a n d S . H . S n y d e r . 1 9 8 9 .E n d o t h e l i n : v i s u a l i z a t i o n o f mRNAs b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n p r o v i d e s e v i d e n c ef o r l o c a l a c t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 6 : 7 2 8 5 - 7 2 8 9 .8 . M o o n , D . G . , M . J . H o r g a n , T . T . A n d e r s e n , S . R . K r y s t e k , J r . , J . W. F e n t o nI I , a n d A . B . M a l i k . 1 9 8 9 . E n d o t h e l i n - l i k e p u l m o n a r y v a s o c o n s t r i c t o r p e p t i d er e l e a s e b y a - t h r o m b i n . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A . 8 6 : 9 5 2 9 - 9 5 3 3 .9 . C h i r g w i n , J . M . , A . E . P r z y b y l a , R. J . M a c D o n a l d , a n d W. J . R u t t e r . 1 9 7 9 .I s o l a t i o n o f b i o l o g i c a l l y a c t i v e r i b o n u c l e i c a c i d f r o m s o u r c e s e n r i c h e d i n r i b o n u -c l e a s e . B i o c h e m i s t r y . 1 8 : 5 2 9 4 - 5 2 9 9 .1 0 . I t o h , Y . , M . Y a n a g i s a w a , S . O h k u b o , C . K i m u r a , T . K o s ak a , A . I n o u e , N .I s h i d a , Y . M i t s u i , H . O n d a , M . F u j i n o , a n d T . M a s a k i . 1 9 8 8 . C l o n i n g a n d s e -q u e n c e a n a l y s i s o f c D NA e n c o d i n g t h e p r e c u r s o r o f a human e n d o t h e l i u m - d e -r i v e d v a s o c o n s t r i c t o r p e p t i d e , e n d o t h e l i n : i d e n t i t y o f human a n d p o r c i n e e n d o -t h e l i n . FEBS ( F e d . E u r . B i o c h e m . S o c . ) L e t t . 2 3 1 : 4 4 0 - 4 4 4 .

1 1 . K o u r e m b a n a s , S . , a n d D . V . F a l l e r . 1 9 8 9 . P l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o rp r o d u c t i o n b y human u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s i s r e g u l a t e d b y b a s i c f i b r o -b l a s t g r o w t h f a c t o r . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 4 4 5 6 - 4 4 5 9 .1 2 . K a v a n a u g h , W . M . , G . R . H a r s h I V , N . F . S t a r k s e n , C . M . R o c c o , a n dL . T . W i l l i a m s . 1 9 8 8 . T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f t h e A a n d B c h a i n g e n e s o fp l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r i n m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . J . B i o l . C h e m .2 6 3 : 8 4 7 0 - 8 4 7 2 .1 3 . M a r s d e n , P . A . , D . M . D o r f m a n , T . C o l l i n s , B . M . B r e n n e r , S . H . O r k i n ,a n d B . J . B a l l e r m a n n . 1 9 9 1 . R e g u l a t e d e x p r e s s i o n o f e n d o t h e l i n - l i n b o v i n eg l o m e r u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . A m . J . P h y s i o l . 2 6 1 ( R en a l F l u i d E l e c t r o l y t e P h y s i o l .3 0 ) . F 1 1 7 - F 1 25 .1 4 . Y a n a g i s a w a , M . , a n d T . M a s a k i . 1 9 8 9 . E n d o t h e l i n , a n o v el e n d o t h e l i u m -d e r i v e d p e p t i d e . P h a r m a c o l o g i c a l a c t i v i t i e s , r e g u l a t i o n a n d p o s s i b l e r o l e s i n c a r -d i o v a s c u l a r c o n t r o l . B i o c h e m . P h a r ma c o l . 3 8 : 1 8 7 7 - 1 8 8 3 .1 5 . K o m u r o , I . , H . K u r i h a r a , T . S u g i y a m a , F . T a k a k u , a n d Y . Y a z a k i . 1 9 8 8 .E n d o t h e l i n s t i m u l a t e s c - f o s a n d c - m y c e x p r e s s i o n a n d p r o l i f e r a t i o n o f v a s c u l a rs m o o t h m u s c l e c e l l s . FEBS ( F e d . E u r . B i o c h e m . S o c . ) L e t t . 2 3 8 : 2 4 9 - 2 5 2 .1 6 . N a k a k i , T . , M . N a k a y a m a , S . Y a m a m o t o , a n d R. K a t o . 1 9 8 9 . E n d o t h e l i n -m e d i a t e d s t i m u l a t i o n o f DNA s y n t h e s i s i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . B i o -c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 5 8 : 8 8 0 - 8 8 3 .1 7 . O g a w a , S . , H . G e r l a c h , C . E s p o s i t o , A . P a s a g i a n - M a c a u l a y , J . B r e t t , a n dD . S t e r n . 1 9 9 0 . H y p o x i a m o d u l a t e s t h e b a r r i e r a n d c o a g u l a n t f u n c t i o n o f c u l -t u r e d b o v i n e e n d o t h e l i u m . I n c r e a s e d m o n o l a y e r p e r m e a b i l i t y a n d i n d u c t i o n o fp r o c o a g u l a n t p r o p e r t i e s . J . C l i n . I n v e s t . 8 5 : 1 0 9 0 - 1 0 9 8 .1 8 . V e n d e r , R . L . , D . R . C l e m m o n s , L . K w o c k , a n d M . F r i e d m a n . 1 9 8 7 .R e d u c e d o x y g e n t e n s i o n i n d u c e s p u l m o n a r y e n d o t h e l i u m t o r e l e a s e a p u l m o n a r ys m o o t h m u s c l e c e l l m i t o g e n ( s ) . Am. R e v . R e s p i r . D i s . 1 3 5 : 6 2 2 - 6 2 7 .1 9 . H u m p h r i e s , D . E . , S . - L . L e e , B . L . F a n b u r g , a n d J . E . S i l b e r t . 1 9 8 6 . E f f e c t so f h y p o x i a a n d h y p e r o x i a o n p r o t e o g l y c a n p r o d u c t i o n b y b o v i n e p u l m o n a r ya r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s . J . C e l l . P h y s i o l . 1 2 6 : 2 4 9 - 2 5 3 .2 0 . S c i a n d r a , J . , J . S u b j e c k , a n d C . H u g h e s . 1 9 8 4 . I n d u c t i o n o f g l u c o s e - r e g u -l a t e d p r o t e i n s d u r i n g a n a e r o b i c e x p o s u r e a n d o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s a f t e r r e o x y -g e n a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 1 : 4 8 4 3 - 4 8 4 7 .2 1 . H e a c o c k , C . , a n d R. S u t h e r l a n d . 1 9 8 6 . I n d u c t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f o x y g e nr e g u l a t e d p r o t e i n s . J . R a d i a t . O n c o l . B i o p h y s . 1 2 : 1 2 8 7 - 1 2 9 0 .2 2 . K o u r e m b a n a s , S . , R . L . H an n a n , a n d D . V . F a l l e r . 1 9 9 0 . O x y g e n t e n s i o nr e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r - B c h a i n g e n e i nhuman e n d o t h e l i a l c e l l s . J . C l i n . I n v e s t . 8 6 : 6 7 0 - 6 7 4 .2 3 . R a k u g i , H . , Y . T a b u c h i , M. N a k a m a r u , M . N a g a n o , K H i g a s h i m o r i , H .M i k a m i , T . O g i h a r a , a n d N . S u z u k i . 1 9 9 0 . E v i d e n c e f o r e n d o t h e l i n - l r e l e a s ef r o m r e s i s t a n c e v e s s e l s o f r a t s i n r e s p o n s e t o h y p o x i a . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .C o m m u n . 1 6 9 : 9 7 3 - 9 7 7 .2 4 . V a n h o u t t e , P . M . , W. A u c h - S c h w e l k , C . B o u l a n g e r , P . A . J a n s s e n , Z . S .K a t u s i c , K . K o m o r i , V . M. M i l l e r , V . B . S c h i n i , a n d M . V i d a l . 1 9 8 9 . D o e s en -d o t h e l i n - l m e d i a t e e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t c o n t r a c t i o n s d u r i n g a n o x i a ? J . C a r -d i o v a s c . P h a r m a c o l . 1 3 ( S u p p l 5 ) : S 1 2 4 - 1 2 8 .

I n d u c t i o n o f E n d o t h e l i n b y H y p o x i a 1 0 5 7