MakalahHigh performance Liquid chromatography(HPLC)

DISusun oleh :

Citra ning dewiDesi nurmala sariMisayu aprili ekalariaSeptiani dwi nuraini

1

2

High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)BAB IPENDAHULUANKromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung

gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003). HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance Liquid Chromatography.

BAB IIPEMBAHASAN

A. Perkembangan KromatografiKromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986). Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004). Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).

B. Teknik Pemisahan dengan HPLCTehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam.Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai. Selain dari beberapa factor ini, hal utama yang harus diperhatikan adalah pengetahuan yang baik mengenai HPLC serta pengalaman dan keterampilan kerja yang baik. Pelarut yang digunakan dialirkan terus menerus secara kontinyu ke dalam pompa. Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10.Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0. Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detector sebagai kordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel (Ahmad dan Suherman, 1991).

Berikut dapat dilihat susunan peralatan HPLC, yaitu :1. Tempat peletakan fasa gerak (reservoir)Pada tempat fasa gerak kebersihannya harus terjaga, agar tidak ada zat-zat pengotor yang dapat mengotori pelarut. Fasa gerak (pelarut) bermacam-macam kepolaritasannya. Sebab diharapkan agar komponen yang akan dipisahkan memiliki sifat yang sama dengan pelarut, sehingga zat tersebut dapat terpisahkan. 2. PompaUntuk mengalirkan fasa gerak digunakan pompa, yang akan mengalirkan fasa gerak ke dalam sistem. Pompa yang baik adalah pompa yang dapat memompakan fasa gerak secara konstan, memiliki batas tekanan maksimal yang cukup tinggi (3000-6000 ), tidak mengandung bahan yang reaktif terhadap pelarut, cara kerjanya sederhana, mempunyai noise yang rendah, dan mempunyai fluktasi tekanan minimal.3. InjectorKetepatan jumlah volume yang diijeksikan sangat penting untuk analisi kuantitatif. Oleh karena itu, tipe injector yang digunakan pada HPLC adalah injector dengan pipa dosis. Suatu injector dikatakan baik apabila memiliki keberulangan yang tinggi, mudah digunakan, dan dapat digunakan pada keadaan dimana tekanan balik pada kolom relative lebih tinggi.Agar injector tetap awet, maka setiap selesai analisa injector dicuci dengan menggunakan pelarut (fasa gerak) yang digunakan, dan jangan mengganti posisi injector dengan posisi load ke posisi injek karena dapat menyebabkan seal pada injector cepatrusak atau aus.4. KolomKolom merupakan area terjadinya pemisahan komponen-komponen yang dianalisa. Sama halnya dengan injector, setelah menganalisa kolom harus dicuci, dan direndam dalam pelarut organic yang sesuai. Jika fasa gerak yang digunakan diganti dengan yang kepolaritasannya berbeda maka harus menggunakan pelarut perantara dalam kolom tersebut. Laju alir pelarut pun perlu diperhatikan, sebab jika laju alirnya tinggi dapat menyebabkan kolom rusak atau tersumbat.5. DetektorDetektor digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan.Suatu detector harus memiliki kepekaan tinggi; limit deteksi kecil; noise rendah, stabil dan mempunyai keberulangan naik; tidak terpengaruh oleh perubahan suhu, dan yang terpenting memberikan respon terhadap bermacam-macam jenis senyawa.6. RecorderRecorder berfungsi sebagai sistem pencatat yang mampu menampilakan kromatogram dengan jelas tepat dan cukup peka. Recorder ini mampu menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu oleh noise listrik.

Pada penggunaannya, eluen yang akan digunakan dialirkan dengan pump A dan pump B dengan perbandingan volume yang dikontrol melalui monitor. Pelarut-pelarut tersebut akan melalui degassit untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara dalam pelarut tersebut. Sampel yang ingin dianalisis diinjeksikan melalui injektor dan akan bercampur dengan eluen didalam mixer yang selanjutnya akan mengalir menuju kolom untuk dilakukan pemisahan. Out put data akan ditampilkan pada monitor, baik berupa data kualitatif mupun kuantitatif. Data kualitatif diperoleh dalam bentuk spktrum dengan cara membandingkan dengan spktrum standar sehingga dapat diidentifikasi suatu zat atau senyawa. Sedangkan data kuantitatif langsung ditunjukkan pada layar berupa kadar atau konsentrasi suatu zat yang ingin ditentukan.

C. Kelebihan HPLCKromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain: Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Mudah melaksanakannya Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik Dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas Banyak pilihan fasa geraknyaCepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam HPLC Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai normal, ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC.Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolomItu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.DetektorAda beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.Interpretasi output dari detektorOutput akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

SIMPULAN

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut denganHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yangtidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakanmenjadi: Kromatografi fase normal dan fase terbalik. Beberapa kegunaan HPLCyaitu HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasidan pestisida.Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkankepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentusebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografilainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannyauntuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramatipada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.Alat yang berperan penting di dalamnya, antara lain yaitu pompa, injektor,kolom, deterktor, dan fase gerak. HPLC digunakan untuk analisa kualitatifdidasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkanapabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapatdipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:1.Parameter percobaan sama antara standar dan sampel2.Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama3.Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) denganmenggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaituberdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

DAFTAR PUSTAKAAhmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press. Surabaya.

. 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.Putra, Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi J. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3-6.

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

adalah meminimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensikolom paling tinggi.Nilai H menurun dengan:1.Ukuran partikel kolom yang kecil2.Laju alir fase gerak yang rendah3.Fase gerak yang kurang kental4.Pemisahan pada temperature tinggi5.Molekul-molekul sample yang kecil6.Meningkatkan panjang kolom.Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system.Lebar punak kromatografi menunjukkan efisiensi. Efisiensi danselektivitas merupakan descriptor pelengkap yang tergantung padaparameter-parameter kromatografi yang berbeda-beda. Efisiensi lebihtergantung pada kualitas packing kolom, ukuran partikel, laju alir, danoptimasi instrumental, sedangkan selektivitas lebih tergantung padakomponen fasa diam dan analit itu sendiri.Keuntungan dan keterbatasan HPLCAda beberapa keuntungan HPLC, yaitu:1.Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidakstabil dengan pemanasan.2.Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerakdan fasa diam berperan dalam proses kromatografi.3.Berbagai jenis kolom yang selektif.4.Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.5.Waktu analisis yang cepat.6.Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehinggamenjamin presisi kuantitatif.7.Resiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukanpemanasan.8.Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektivitas metodetersebut dapat disesuaikan dengan mudah.Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jikaHPL dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu,keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, makaresolusi yang baik sulit diperoleh.BAB III DAFTAR PUSTAKAGritter, Roy J, dkk. 1991.Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITBBandung.Hendayana, Sumar, dkk. 1994.Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. Semarang:IKIP Semarang Press.. 2006.Kimia Pemisahan Metode Kromatografi danElektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja RosdakaryaOffset.Johnson, Edward L, dkk. 1991.Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITBBandung.Bella, Lisa.2009.Skripsi Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan KadarCampuran Guaifenesin dan Dextrometorfan HBr dalamSirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi(KCKT). Medan: Fakultas Farmasi Universitas SumatraUtara.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) | Chem-Is-Try.Org | Situs KimiaIndonesia |HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ LansidaDasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC | BLoG kiTa

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)Ditulis oleh Jim Clark pada 06-10-2007HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.Pelaksanaan HPLC

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.