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8/17/2019 Guia_practico_laboratorio_de_transformacion.doc

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LABORATORIO 1TRANSFORMACION BACTERIANA:

I.-Introducción

La transformación bacteriana consiste básicamente en la captación de ADN

exógeno, ya sea de genes cromosomales o extracromosomales, por

parte de microorganismos procariontes, adquiriendo éstos nuevas

propiedades fenotípicas

Los plásmidos bacterianos corresponden a elementos genéticos móviles,los que pueden ser captados por otros microorganismos mediantetransformación u otros mecanismos de transferencia genética!recuentemente, estos elementos contienen genes que codifican para unao más características "resistencia a antibióticos, metales pesados, etc#que ba$o determinadas circunstancias podrían favorecerlos en su propiasobrevivencia

La transformación también es una %erramienta molecular ampliamente

utili&ada en 'iotecnología en áreas tales como la agricultura en donde

aporta a las plantas resistencia al frío o a la descomposición (n

biorremediación, las bacterias pueden ser transformadas con genes que

codifican en&imas capaces de digerir los compuestos de desec%o generados

en procesos industriales) y en medicina, se estudia en las enfermedades

causadas por alteraciones genéticas la factibilidad de utili&ar esta

%erramienta como tratamiento mediante terapia génica

(n esta actividad práctica, usted aprenderá el proceso de transferir

genes de origen exógeno en una célula bacteriana receptora "(sc%eric%ia

coli#, estos genes se ubicarán en un plásmido, el que servirá de vector paratal procedimiento *e utili&ará como marcador de expresión, la proteína

verde fluorescente, denominada +! "+reen !luorescent rotein#, cuya

fuente original del gen, es una medusa bioluminiscente llamada

Aequorea victoria or lo tanto, es la proteína +! la responsable de

que la medusa brille o emita fluorescencia en la oscuridad -na ve&

finali&ado el proceso de transformación, se observará en las bacterias la

expresión del gen de la medusa, lo que les permitirá emitir un color verde

brillante cuando sean expuestas ba$o la lu& ultravioleta

(s importante comprender que el plásmido p+L. contiene el gen para la

síntesis de la proteína +! y un gen de resistencia al antibiótico ampicilina

p+L. también contiene un sistema especial de regulación de genes que se

puede usar para controlar la expresión de la proteína fluorescente en las


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células transformadas (l gen para sinteti&ar +! se puede activar en las

células transformadas simplemente a/adiendo arabinosa al medio de

cultivo La selección de las células que se %an transformado con el

plásmido p+L. se reali&a observando el crecimiento en placas con

antibiótico Las células transformadas aparecerán blancas "fenotipo salva$e#

en placas que no contengan arabinosa, y de color verde fluorescente cuando

se a/ada arabinosa al agar

El proceso de trns!or"ción

(ste proceso de transformación presenta tres pasos principales, dirigidos a

introducir el plásmido en ( coli, y proporcionar las condiciones adecuadas para

que las células expresen los nuevos genes adquiridos ara introducir el plásmido

p+L. a través de la membrana celular0

1 -sar una solución de transformación de 2a2l3 "cloruro cálcico#

3 *ometer las células a un proceso denominado c%oque térmico ara que las

células transformadas cre&can en presencia de ampicilina0

4 onerlas en un medio de cultivo adecuado y someterlas a una corta incubación

para que empiecen a expresar los nuevos genes adquiridos


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II. INSTR#CCIONES

L cti$idd pr%ctic se lle$r% c&o endos sesiones

(n la primera sesión se discutirá el dise/o experimental del proceso de

transferencia de genes y se e$ecutara dic%a transformación, en tanto, en la

segunda sesión asignada se discutirán los resultados obtenidos

No olvide registrar en su cuaderno de protocolo, todas las anotacionesnecesarias

5ecuerde que debe elaborar la primera parte del informe en esta

actividad, de acuerdo al formato entregado

.bserve las colonias de ( coli en las placas de cultivo, y anote todas las

características que considere relevantes

Las siguientes observaciones, antes de la transformación en ( coli, pueden proporcionar datos básicos para determinar si después del proceso se %a producido alguna modificación genética

a# N6mero de colonias

b# 7ama/o de colonias

c# 2olor de las colonias

d# Distribución de las colonias en la placa

e# Aspecto de la colonia ba$o lu& ultravioleta


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O&'eti$os0

Discutir un dise/o experimental en el proceso de transferencia de genes

Aprender y aplicar los pasos del método de transformación bacteriana y sus

aplicaciones en la biología

Anali&ar e interpretar los resultados experimentales

2omprender la regulación de la expresión genética en sistemas genéticos artificiales

(rocedi"iento de

1 8arcar un tubo 9p+L. y otro :p+L.

3 Abrir los tubos y transferir 3;< ul de solución de

transformación, con una pipeta estéril, a cada

uno de los tubos

4 2olocar los tubos en %ielo

= inc%ar con un asa de siembra estéril unacolonia bacteriana desde la placa de partida

Llevar el asa al tubo marcado 9p+L. y

sumergirla %asta el fondo del tubo y agitar

5epetir el mismo procedimiento para el tubo

rotulado :p+L.

; (xaminar la solución de ADN plasmidial p+L.

con lámpara -> *acar con asa estéril una

película de la solución de ADN plasmidial y

me&clarla con la solución del tubo 9p+L. 2errar

el tubo y regresarlo al %ielo N. A?AD@5 ADN AL

7-'. :p+L.

@ncubar el tubo en %ielo por 1< minutos

"asegurarse de que los tubos estén bien

cerrados#

B 8ientras se incuban los tubos, marcar las = placas

de agar nutritivo0 L'Camp9p+L.,

L'CampCara9p+L.) L'Campp+L. y L'p+L.E 7ransferir los tubos 9p+L. y :p+L. a un ba/o de

agua a =3F2 por exactamente ;< segundos -na

ve& finali&ado el tiempo, regresar

rápidamente los tubos al %ielo por otros 3

minutos


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G 5etirar los tubos del %ielo Abrir los tubos y agregar con

una pipeta estéril 3;< l de caldo nutritivo L', cerrar

@ncubar los tubos por 1< minutos a temperatura

ambiente

1


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+pGLO

LB/Amp

+pGLO

LB/Amp/ar

a

–pGLO

LB/Amp

–pGLO

LB

LABORATORIO N) *

TRANSFORMACION BACTERIANA: SE+#N,A (ARTE

Anotción de Resultdos

.bserve los resultados obtenidos tras la transformación a la lu& normal de la

%abitación Después ubique las placas ba$o lu& ultravioleta y registre lo que ocurre

1 .bserve atentamente todas las placas y dibu$e lo que ve en cada una de ellas Dibu$e

en la tabla de resultados en la columna de la derec%a Anote los resultados para poder

comparar las observaciones de las células bacterianas 9p+L. transformadas con

aquellas que no lo fueron

Anote ls siuientes o&ser$ciones pr cd plc.

3 H2uánto crecimiento se observa en cada placa, a simple vistaI

4 HDe qué color son las bacteriasI

= H2uántas colonias bacterianas %ay en cada placaI

"2uéntalas# .bservaciones


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An%lisis de los resultdos

La finalidad del análisis de los resultados obtenidos es determinar si se %a

producido la transformación genética

1 HJué características inicialmente observadas en ( coli no parecen %aberse alteradoI

Anote a continuación esas características que no se %an modificado y las observaciones

al respecto

Crcterstic oriinl O&ser$ciones

3 De las características de ( coli inicialmente observadas, Hcuáles parecen ser

significativamente diferentes después de la transformaciónI Anota esas características a

continuación y describe los cambios que %as observado

Nue$s crcterstics C"&ios o&ser$dos

4 *i las células transformadas %an adquirido la capacidad para crecer en presencia del

antibiótico ampicilina, Hqué puedes deducir acerca de los otros genes presentes en el

plásmido util i&ado para la transformaciónI

= 'asándose en los resultados obtenidos, Hcómo puede demostrar que los cambios

producidos se deben al proceso reali&adoI


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C u e s t i o n r i o d e r e s u l t d o s

Areue su in!or"e ls siuientes preunts con sus correspondientesrespuests.

H2uál es el origen del brillo en la placa con las colonias bacterianasI

*i se observa un color verde fluorescente en las colonias de ( coli, debemos plantear una

nueva pregunta0

H2uáles son las dos posibles fuentes de fluorescencia en las colonias cuando se

exponen a la lu& ultravioletaI

E/pli0ue:

1 5ecuerde qué observó cuando iluminó con lu& ultravioleta el vial que contenía el

plásmido p+L. y anota sus observaciones

3 HJué indica esta observación sobre la fuente de fluorescenciaI4 Describa qué evidencias indican si la transformación genética se %a reali&ado con éxito o

no

Intercción entre los enes el "edio

8ire de nuevo sus cuatro placas H.bserva alguna colonia de ( coli en la placa L' que

no contenga ampicilina y arabinosaI

1 'asándose en sus resultados, Hpuede decir si estas bacterias son resistentes a

ampicilina observándolas en la placa L'I3 H2ómo modificaría el medio "el agar en el que están creciendo# para poder saber si

son resistentes a ampicilinaI

4 8uy a menudo las características de un organismo se deben a la combinación de sus

genes y del medio 5eflexione sobre el color verde que vio en las bacterias

transformadas0

a HJué dos factores ambientales deben estar presentes para que pueda ver el color verdeI

"-na pista0 un factor está en la placa y el otro en la forma cómo mira las bacterias#

b H2uál de los dos factores ambientales se/alados en la pregunta anterior %acen a la

bacteria transformada que apare&ca verdeI

c HJué venta$as tendrá para un organismo el poder activar o desactivar determinados genes

en respuesta a diferentes condicionesI

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