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Grundlagen der Biochemie
• Aminosäuren, Peptide, Proteine (Aufbau, Funktion)
• Kohlenhydrate
• Lipide
• Nukleotide, Nukleinsäuren
• Einführung in die Molekularbiologie: Chromosomen, DNA-
Replikation, DNA-Reparatur
• Transkription, Translation
• Grundlagen der Gentechnik
• Vitamine, Cofaktoren
• Grundlagen des Stoffwechsels
• Mitochondrien, Atmungskette
• Stoffwechsel von Lipiden, Aminosäuren, Nukleotiden
• Zellkommunikation, Stofftransport
• Signalkaskaden, Zellzyklus
Biochemie 02/1
Peptide
GlycinAlanin
Biochemie 02/2
α
α
Peptidbindung
Peptide
Biochemie 02/3
Peptidbindung
N-Terminus C-Terminus
Peptide
Biochemie 02/4
Ala-Leu-Gly-Lys-His
Acetyl, CH3-CO-
Peptide
Biochemie 02/5
Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His
Ala-Leu-Gly-Lys-His
Peptide
Acetyl,
CH3-CO-
Biochemie 02/6
Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His
Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His
Ala-Leu-Gly-Lys-His
Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His
Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His
Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His-NH2
NH2
Säureamid
Peptide
Biochemie 02/7
Ala-Leu-Gly-Lys-His
Verzweigte Peptide
-Peptidbindung
-Peptidbindung
Glutathion
Biochemie 02/8
Cyclopeptide und verzweigte Peptide
Esterbindung
NH2 H2N
COOH
Biochemie 02/10
Peptide: Zusammensetzung
homodete Peptide: nur Amidbindungen (Peptidbindungen)
heterodete Peptide: auch andere Bindungen, wie Disulfidbrücken
mit Ether-Bindung
mit Thioether-Bindung
mit Disulfid-Bindung
mit Ester-Bindung
Biochemie 02/11
Peptide: Bindungen
homodete Peptide: nur Amidbindungen (Peptidbindungen)
heterodete Peptide: auch andere Bindungen, wie Disulfidbrücken
Biochemie 02/12
Peptide: Zusammensetzung
homöomere Peptide: Rückgrat nur aus Aminosäuren
heteromere Peptide: Aminosäuren und Pseudoaminosäuren
z.B. Depsipeptide: Aminosäuren und Hydroxycarbonsäuren
Surfactin (B. subtilis)
AminosäurenFettsäureEster
Amid
Biochemie 02/13
Peptide: Zusammensetzung
homöomere Peptide: Rückgrat nur aus Aminosäuren
heteromere Peptide: Aminosäuren und Pseudoaminosäuren
z.B. Depsipeptide: Aminosäuren und Hydroxycarbonsäuren
Surfactin (B. subtilis) Valinomycin (Streptomyceten)
Aminosäuren
Biochemie 02/14
Hormone
Neurotransmitter
Neuropeptide Peptidtoxine
Peptidantibiotika
Biologisch aktive Peptide
Biochemie 02/15
Peptidtoxine
Phallotoxine (grüner Knollenblätterpilz)
Amatoxine (grüner und
weißer Knollenblätterpilz)
Viscotoxine (Mistel)
Mellitin (Bienengift)
Mastoparan (Wespengift)
Conotoxine (Kegelschneckengift)
Cobratoxin (Schlangengift)
Anuratoxin (Froschgift)
Biochemie 02/16
Ala Trp
Cys
Hyp
variable
Positionen
Pilzgift-Peptide
Phallotoxine
• Mikroheterogenität
• modifizierte, nicht proteinogene Aminosäuren
• oft cyclische Struktur
• ungewöhnliche Verknüpfungen (Thioether Cys – Trp)Biochemie 02/17
Amatoxine
Wirkung:
• Hemmung der DNA-Transkription: RNA Polymerase II
• Blockierung der ribosomalen Proteinbiosynthese (Leber)
• Nekrose der Leberzellen, TodBiochemie 02/18
Pilzgift-Peptide
• Disulfidbrücken-reich (22-50% Cys-Reste)
• sehr starr
Wirkung:
• Cardiotoxine: Herzmuskelgifte, irreversible Depolarisation
• Neurotoxine: passen genau in verschiedene Rezeptoren
der Signalübertragung (Rezeptoren, Kanäle),
Atemgifte
Peptidtoxine von Schlangen, Kegelschnecken, Amphibien
Biochemie 02/19
Hydroxyprolin
Cys-reich
Peptidtoxine der Kegelschnecken
Conidae
Neurotoxine: Blockierung von Na+/K+-Kanälen
Biochemie 02/20
Hormone
Neurotransmitter
Neuropeptide Peptidtoxine
Peptidantibiotika
Biologisch aktive Peptide
Biochemie 02/21
• ungewöhnliche Aminosäuren
- D-Aminosäuren
- N-Methyl-Aminosäuren
- Dehydro-Ala, Lanthionin
• ungewöhnliche Bindungen
- Lacton-Bindungen
- Cyclopeptide
• reduzierter enzymatischer Abbau
- durch modifizierte N- und C-Termini
Peptidantibiotika
Biochemie 02/22
• hochaktiv gegen gram-positive Bakterien
Gramicidine
D-Aminosäuren
Ethanolamin
am C-Terminus
Formylgruppe
am N-Terminus
Bacillus brevis
Biochemie 02/23
(C) Gramicidin A
Gramicidine
• hochaktiv gegen gram-positive Bakterien
• hämolytisch, daher NICHT systemisch anwendbar
Biochemie 02/24
Valinomycin
• Depsipeptid
(alternierend Peptid- und Lacton-Bindungen)
(Streptomyces fulvissimus)
Lac = L-MilchsäureD-Hyo = D-α-Hydroxyisovaleriansäure
Biochemie 02/25
• Ionophor:
komplexiert Kationen in
käfigartiger Struktur:
K+ >>> Na+
• Transport durch Membran
• Zerstörung des Potentials
Valinomycin
- K+
+ K+
Biochemie 02/26
Hormone
Neurotransmitter
Neuropeptide Peptidtoxine
Peptidantibiotika
Biologisch aktive Peptide
Biochemie 02/27
Substanzen,
• die das Signal von einer Zelle an viele
weitergeben.
• die von einer Drüsenzelle nach Impuls
freigesetzt und in die Umgebung oder
Blutbahn abgeben werden.
• die an Erkennungsmoleküle
(Rezeptoren) binden.
Was sind Hormone?
Biochemie 02/28
Formen der Hormonstimulation
Biochemie 02/29
Was sind Neurotransmitter?
Substanzen,
• die das Signal von einer Zelle zur
nächsten durch den synaptischen Spalt
weitergeben.
• die von einer Nervenzelle nach Impuls
freigesetzt werden und durch den
synaptischen Spalt diffundieren
• die post- oder präsynaptisch an
Erkennungsmoleküle (Rezeptoren) binden
Biochemie 02/30
• Kommunikationssysteme des Körpers
• Nervensystem: schnell, gezielt, kurz
• Hormonsystem: langsam, breit, langanhaltend
Hormone und Neurotransmitter
Biochemie 02/31
Beispiele für Peptidhormone
Biochemie 02/32
Thyroliberin (TRH):
C-Terminus: amidiert
N-Terminus:
pyro-Glutamat
Gonadoliberin (GnRH):
Strukturelle Besonderheiten
pGlu-His-Pro-NH2 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Glutaminyl-Cyclase (QC):
TRH
pGlu-His-Pro-NH2
Pro-NH2
His
pyro-Glu
Biochemie 02/33
Beispiele für Peptidhormone
Biochemie 02/34
Insulin
Humanes Insulin:
51 Aminosäuren, 5808 Da
Biochemie 02/35
Biosynthese von Insulin
Biochemie 02/36
Hormonregelkreise
CRF: Corticotropin-releasing factor
TRF: Thyrotropin-releasing factor
GnRF: Gonadotropin-releasing factor
GRF: Growth hormone-releasing factor
ACTH: Adrenocorticotropes Hormon
TSH: Thyreocyte-stimulating hormone
FSH: Follikel-stimulierendes Hormon
LH: lutenisierendes Hormon
T3, T4: Schilddrüsenhormone
Biochemie 02/37
Struktur von Proteinen
Biochemie 02/38
Peptide
Peptidbindung ist mesomeriestabilisiert:
Biochemie 02/39
Peptide
Biochemie 02/40
Peptide
Bindungslänge in Å
C=O C-N
Kristallverband
Gasphase
1,241
1,219
1,3181,352
C=N Doppelbindung: 1,24 Å
C-N Einfachbindung: 1,47 Å
Biochemie 02/41
Peptide
Biochemie 02/42
Peptide
Biochemie 02/43
Peptide
non-proline amino acids:
proline amino acids:
Prolin:
Biochemie 02/44
Peptide
Biochemie 02/45
Mage: 02-2ndst.kin/kin1
Peptide
C-C: Ψ
C-N: Φ
Biochemie 02/46
Struktur von Proteinen
Biochemie 02/48
Struktur von Proteinen
Biochemie 02/49
Struktur von Proteinen
Biochemie 02/50
Struktur von Proteinen
Biochemie 02/51
Die -Helix
• rechtsgängige Helix
• 3,6 Aminosäuren/Windung
• Ganghöhe (Pitch): 0,54 nm
• Prolin verzerrt Struktur,
steuert keine H-Brücke
durch N bei: Helix-Brecher
• Torsionswinkel:
Phi (Φ) = -57°
Psi (Ψ) = -47°
Biochemie 02/52
Mage: c3Alpha.kin/Kin1
Die -Helix
Rop-Protein
(bakterielles RNA-bindendes Protein)
Biochemie 02/53
Helikale Strukturen
nm: n = Anzahl der Aminosäuren per turn
m = Anzahl der Atome im durch die H-Brücke geschlossenen Ring
(3.613)
Biochemie 02/54
Helikale Strukturen
310 Helix Helix
(3.613)
Helix
(4.416)
Biochemie 02/55
• Torsionswinkel:
Phi (Φ) = -75°
Psi (Ψ) = 145°
Helikale Strukturen
Polyprolin-Helix
• linksgängige Helix
• 3 Aminosäuren/Windung
• Ganghöhe (Pitch): 0,94 nm
• artifiziell
Biochemie 02/56
Kollagen
• linksgängig
• 3,3 Aminosäuren/Windung
• Ganghöhe (Pitch): 0,96 nm
• keine H-Brücken innerhalb der
Helix!
Biochemie 02/57
Kollagen
Biochemie 02/58
Kollagen
Biochemie 02/59
Kollagen
Kollagen vom Rind:
Biochemie 02/60
Kollagen
Biochemie 02/61
Kollagen
Biochemie 02/62
Keratin
Biochemie 02/63
Keratin
Biochemie 02/64
Struktur von Proteinen
Biochemie 02/65
Das -Faltblatt
Biochemie 02/66
Das -Faltblatt
Biochemie 02/67
Das -Faltblatt
Biochemie 02/68
Kohlenstoff ist
sp3-hybridisiert:
Das -Faltblatt
Biochemie 02/69
Das -Faltblatt
Seide
Mage:
Protein Secondary
Structures/ Kin1
Biochemie 02/70
• komplexere Sekundärstruktureinheiten
• häufig korreliert mit Funktionseinheit
Untereinheit des Enzyms
Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
Domänen
Glyceraldehyd-3-Phosphat-
Bindung
NAD+-Bindung
Biochemie 02/71
Domänen
• komplexere Sekundärstruktureinheiten
• häufig korreliert mit Funktionseinheit
• bestimmte Domänen in verschiedenen Proteinen gleich
Biochemie 02/72
Wichtige Strukturen aus Proteinen
• -Strukturen
4-Helix-Bündel
• / -Strukturen
- -Fässer
offene - -Strukturen
• antiparallele -Strukturen
-Faltblatt
-Fass
• Strukturen von Membranproteinen
E. coli
Cytochrom b562
Retinol-bindendes Protein
up-and-down barrelBiochemie 02/73
Hämoglobin
Quartärstruktur
Ribosom
• Proteine mit identischen Untereinheiten: Oligomere (Dimer,…)
• identische Untereinheiten: Protomere
Biochemie 02/74
• Struktur: wie sehen Proteine aus?
• Funktion: was machen Proteine
• Faltung: wie wird es aktiv?
• Reinigung: wie isoliere ich ein Protein?
Funktion von Proteinen
Biochemie 02/75
• Einteilung nach der Herkunft:
- bakterielle, virale, pflanzliche, tierische Proteine
• Einteilung nach der Struktur:
- globuläre, fibrilläre Proteine
- mit/ohne Cofaktoren/Coenzyme, prosthetische Gruppen
• Einteilung nach der Funktion:
- Strukturproteine
- Enzyme
- Transportproteine
- Bewegungsproteine
- Speicherproteine
- Verteidigungsproteine
- Regulatorische Proteine
Möglichkeiten zur Einteilung
Biochemie 02/76
Seide
Haare
Strukturproteine
Geißeln
Muskulatur
Mikrotubuli
GeißelnBiochemie 02/77
Strukturproteine
Keratin: Haare, Fingernägel, Federn
fest, unlöslich
-Helices
Collagen: Knorpel, Bindegewebe
fibrillös
Collagen-Helix
Elastin: Ligamente
dehnbar in zwei Richtungen
Fibroin: Seidenfasern, Spinnweben -Faltblatt
Biochemie 02/78
katalysieren eine chemische Reaktion
Enzyme
Biochemie 02/79
• binden spezifische Moleküle oder Ionen
• transportieren sie im Blutplasma
• transportieren sie durch die Zellmembran
Beispiele:
Hämoglobin: Sauerstoff
Lipoproteine: Lipide
Albumin
Aminosäuren-Transporter
Glykoprotein P (ABC-Transporter)
Transportproteine
Biochemie 02/80
Hämoglobin
Biochemie 02/81
• Actin und Myosin
kontraktile Skelettmuskeln
Bewegungsproteine
Biochemie 02/82
Bewegungsproteine
• Tubulin
Protein der Mikrotubuli, Geißeln, Cilien
Biochemie 02/83
• Ovalbumin (Eiweiss)
Speicherproteine
• Ferritin (Eisenspeicher im Gewebe)
• Casein (Milch)
Biochemie 02/84
• Proteine der Blutgerinnung:
Fibrinogen, Thrombin
Verteidigungsproteine
• Schlangengifte, bakterielle, pflanzliche Toxine
• Proteine des Immunsystems:
Immunglobuline, Cytokine, Interferone
Biochemie 02/85
• Protein-Hormone:
Wachstumshormon
Parathormon
Regulatorische Proteine
• Repressoren/Aktivatoren
regulieren die Transkription, Biosynthese
Biochemie 02/86
Reinigung und Analytik von Proteinen
Proteinisolierung zur
• Untersuchung von Strukturen
• Bestimmung der Eigenschaften von Proteinen
• Bestimmung der Funktion, biologischen Aktivität
dazu
• Analytik
• Funktionelle Tests
Biochemie 02/87
Eigenschaften von Proteinen
• Größe von Proteinen
- Je größer ein Protein, desto schwieriger seine Isolierung und
Reinigung
• Verfügbare Mengen
- Reinigung wird mit steigender Mengen eines Proteins um ein
Vielfaches einfacher
• Säure-Base-Eigenschaften
- Ausnutzung in Ionenaustauschchromatographie und
Elektrophorese
Biochemie 02/88
Eigenschaften von Proteinen
• Biologische Aktivität
- beruht auf einer bestimmten molekularen und räumlichen
Anordnung
- unterschiedliche Stabilität unter verschiedenen Umgebungs-
bedingungen (zu hohe oder zu niedrige Pufferkonzentration,
Temperatur, Kontakte zu unphysiologischen Oberflächen, fehlende
Cofaktoren, etc.)
- Zerstörung = Denaturierung
• Stabilität
- Schutz vor Proteasen, Aggregation zu unlöslichen Komplexen
Biochemie 02/89
Reinigungsschema für verschiedene Proteine
Biochemie 02/90
Zellruption/Homogenisation
Reinigungen aus intaktem Gewebe:
• Zerstörung von komplexen Zellverbände durch Homogenisieren
• Gemisch aus intakten und aufgebrochenen Zellen (Zellorganellen, Membranfragmenten, Cytoplasma und beschädigten subzellulären Kompartimenten)
Homogenisationsmedium
• Schutz der Zellen vor osmotischem Platzen
• Schutz vor Proteasen
• Schutz der biologischen Aktivität (Funktion)
• Verhinderung von Aggregation
• möglichst wenig Zerstörung von Organellen
• keine Interferenzen mit biologischen Analysen und funktionellen Tests
Biochemie 02/91
Trennmethoden für Biomoleküle
PulsfeldelektrophoreseZentrifugation
2D
Elektro-
phorese
1D CE
Chromatographie
Biochemie 02/92
Ultrazentrifugation
Biochemie 02/93
Ultrazentrifugation
• 80-100.000 rpm (~1.500 Umdrehungen pro Sekunde)
• etwa 600.000 G (1g ½ Tonne)
Biochemie 02/94
Chromatographische Trennverfahren
• Ionenaustausch-Chromatographie
• Gelfiltrations-Chromatographie
• Affinitätschromatographie
• Hydroxylapatit-Chromatographie
• Reversed-Phase-Chromatographie
• Hydrophobe Wechselwirkungs-
Chromatographie
Ausnutzung von Wechselwirkungen zwischen
stationärer Phase und dem gelösten Substanzgemisch
Biochemie 02/95
Ionenaustauschchromatographie
Biochemie 02/96
Ionenaustauscher: Funktionelle Gruppen
Biochemie 02/97
Gelfiltrationschromatographie
Biochemie 02/98
Gelfiltrationschromatographie
Bestimmung der molekularen Masse mittels Gelfiltration:
Korrelation von relativem Elutionsvolumen
und dem Logarithmus der molaren Masse
verschiedener Proteine
Biochemie 02/99
Affinitätschromatographie
Biochemie 02/100
Dialyse
Biochemie 02/101
• Proteinbestimmung
• Elektrophorese
• Massenspektrometrie
• Edman-Sequenzierung
• Funktionstests
Protein-Analytik
Biochemie 02/102
Proteinbestimmungsmethoden
• Direkte photometrische Bestimmung (UV)
• Biuret-Methode
• Lowry-Methode
• BCA-Methode
• Bradford-Methode
Biochemie 02/103
Proteinbestimmungsmethoden
Prinzip: aromatische Aminosäuren (Tryptophan,
Tyrosin) absorbieren bei 280nm (UV)
Nachteile:• geringere Sensitivität
• störanfällig: kontaminierende
Nukleinsäuren, Nukleotide
• Direkte photometrische Bestimmung (UV)
Biochemie 02/104
Proteinbestimmungsmethoden
• Bradford-Methode
Farbstoff bindet an Arginin, Tryptophan, Histidin, Phenylalanin
Dabei verschiebt sich sein Absorptionsmaximum von 465 zu 595nm.
Coomassie Brilliant Blue G-250
Biochemie 02/105
Proteinbestimmungsmethoden
Voraussetzung: Messung in linearem Bereich
Biochemie 02/106
Elektrophoretische Trennmethoden
• Agarose-Gele
• Polyacrylamidgelelektrophorese
• SDS-PAGE
• Isoelektrische Fokussierung
• 2D-Elektrophorese
Biochemie 02/107
Papierelektrophorese
Biochemie 02/108
Gelelektrophorese
Biochemie 02/109
SDS-Gelelektrophorese.mov
SDS-Gelelektrophorese
Biochemie 02/110
Diskontinuierliche Gelelektrophorese
pH 6,8
pH 8,8
Glycin(IEP: Zwitterion)
2
Glycin(Anion)
Biochemie 02/111
Diskontinuierliche Gelelektrophorese
Biochemie 02/112
Diskontinuierliche Gelelektrophorese
SDS
Biochemie 02/113
Isoelektrische Fokussierung
2 10 Protein ist am pI ungeladen,
wandert nicht mehr weiter
Bei niedrigem pH sind die
Proteine hoch protoniert und
positiv geladen, wandern zur
Kathode
Bei hohem pH sind die Proteine
deprotoniert und negativ
geladen, wandern zur Anode
Biochemie 02/114
2D-Gelelektrophorese
Biochemie 02/115
Wo ist mein Protein???
Protein
Markerspur
Biochemie 02/116
Western Blot
farbiges Produkt
Biochemie 02/117
Western Blot
SDS-Gel Western Blot
Biochemie 02/118
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Biochemie 02/119
Biologische Aktivität
• Enzymtests
• Immunchemische Methoden
Biochemie 02/120
Proteinanalytik
• Massenspektrometrie: MALDI, ESI-MS
• Edman-Sequenzierung
Biochemie 02/121