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104
Beuth Hochschule für Technik Berlin, Fachbereich II (Mathematik-Physik-Chemie) Studiengang Pharma- und Chemietechnik Prof. Dr. H. Hungerbühler Praktikum Physikalische Chemie Praktikumsordnung 1. Vorkolloquien/ Verhalten im Labor Am Versuchstag werden zum jeweiligen Ver-such stichpunktartig Fragen gestellt sowie die schriftlich zu beantwortenden Fragen im La-borjournal kontrolliert. Bei ungenügender Vor-bereitung wird der/die Studierende von diesem Versuch ausgeschlossen und hat einen Nach-holversuch. Das praktische Verhalten im Labor geht in die Vorbereitungsbeurteilung mit ein. 2. Laborjournal / Deckblatt / Testate Jede/r Studierende hat ein gebundenes und durchnummeriertes Laborjournal zu führen. Darin sind alle Messwerte eines Praktikums-versuches, sowie Berechnungen, Versuchs-aufbauten und zu beantwortende Fragen, von jedem Mitglied in der Gruppe zu notieren. Die Bewertung der Laborjournale geht in die Vor-bereitungsbeurteilung mit ein. Das ausgeteilte Deckblatt mit den aktuellen Messwerten wird nach Überprüfung der Messwerte und des Messplatzes testiert. 3. Protokolle (siehe im Netz: „Hinweise zum Protokoll“) Jede/r Studierende hat ein Protokoll pro Prak-tikum selbständig zu erstellen, die restlichen Versuche werden als Gruppenprotokolle ange-fertigt. Alle diese Dokumente beginnen mit dem testierten Deckblatt und sind am Ende mit Datum und Unterschrift/en zu versehen. Die Protokolle sind gemäß den Hinweisen zum Protokoll zu erstellen. Bei einer Wiedervorlage werden 0,3 Anteile von der Note abgezogen Die grundsätzliche Gliederung beinhaltet:
Deckblatt Inhaltsverzeichnis: Symbolverzeichnis Einleitung Grundlagen Versuchsaufbau und Methoden Ergebnisse und Diskussion Fehlerberechnung Zusammenfassung Literaturverzeichnis Optional: Anhang
Wichtiger Hinweis: Bereits existierende Berichte/Protokolle oder Textteile, die auf Datenträgern gespeichert sind, werden keinesfalls als selbstständig ver-fasste Arbeiten akzeptiert (Plagiate), sondern als Betrug zurückgewiesen und in schweren Betrugsfällen mit dem Praktikumsausschluss geahndet und kann bis zur Exmatrikulation führen. 4. Nachholtermin Bei einmaligem Fehlen an einem Praktikums-tag (Fachgespräch nicht bestanden oder Krankheit mit Beleg) wird ein Nachholtermin angeboten. 5. Bewertung und Abschlussklausur Die für alle Praktikumsteilnehmer einheitliche Labor-Abschlussklausur findet am Ende der Vorlesungszeit statt und kann nicht als Nach-klausur in das folgende Semester verschoben werden. Die Praktikumsnote ergibt sich durch arithmetrische Mittelung beider Teilnoten aus Summe Protokoll (30%), Gruppen-Protokolle (10%), Beantwortung von Fragen, Führung der Laborjournale und Verhalten im Labor (10%) und Klausur (50%). Zur Klausur darf nur ein Taschenrechner, ein Stift und eine handge-schriebene Formelsammlung im Umfang von maximal 4 Seiten (2 Blätter) verwendet wer-den. Die Zulassung zur Klausur ist an folgende Voraussetzungen geknüpft: 1.) Teilnahme an allen Praktikumsplätzen 2.) Die Beurteilung aller Protokolle muss je-
weils mindestens ein ausreichend (4,0) er-geben.
Ergibt die Gesamtnote aller Einzelleistungen kein ausreichend (4,0) muss das Praktikum im nächsten Jahr neu belegt werden. Sommersemester 2018. Stand: 27.03.2018
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1
Trennung einer Alkaloidmischung mit der Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)
1. Aufgabenstellung 1.1. Optimierung der Trennung eines wässerigen Coffein-Theobromin-Theophyllin-Gemisches über die
Eluentenzusammensetzung und deren Fließgeschwindigkeit
1.2. Quantitative Bestimmung einer unbekannten Komponente über externe und interne Kalibrierung
2. Theoretische Grundlagen 2.1. Chromatographie
Chromatographie ist die allgemeine Bezeichnung für Trennmethoden, mit denen Substanzgemische
durch multiplikative Verteilungsvorgänge zwischen zwei nicht mischbare Phasen, einer ortsfesten
stationären Phase und einer strömenden mobilen Phase, in ihre Komponenten getrennt werden.
Das zu trennende Gemisch befindet sich zu Beginn der Chromatographie homogen gelöst in der
mobilen Phase. Eine mögliche Einteilung der unterschiedlichen chromatographischen Verfahren lässt
sich entsprechend der Aggregatzustände der Phasen vornehmen (Tab. 1).
Mobile Phase Stationäre Phase Verfahren Trennprinzip flüssig (liquid) fest (solid) LSC (liquid-solid-chrom.) Adsorption
flüssig (liquid) flüssig (liquid) LLC (liquid-liquid-chrom.) Verteilung
gasförmig (gaseous) fest (solid) GSC (gas-solid-chrom.) Adsorption
gasförmig (gaseous) flüssig (liquid) GLC (gas-liquid-chrom.) Verteilung
Tab. 1: Mögliche Einteilung chromatographischer Verfahren
Weitere Einteilungen richten sich nach den Ausführungstechniken wie Säulen-, Dünnschicht, Papier-
oder Kapillargaschromatographie oder andere nach den zugrunde liegenden physikalisch-chemischen
Vorgängen wie Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Affinitäts- oder Molekülausschluss-
chromatographie. Verteilungschromatographie meint hier im engeren Sinne die unterschiedliche
Verteilung der zu trennenden Komponenten zwischen zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen nach
dem NERNST`schen Verteilungsgesetz (in der GC auf der Basis des RAOULT und HENRY`schen
Gesetzes).
2.2. Physikalisch-chemische Grundlagen
In der Säulenchromatographie (HPLC) sind die physikalisch-chemischen Vorgänge hauptsächlich
Adsorption (Adsorptionschromatographie) an der Oberfläche einer festen stationären Phase und
Verteilung (Verteilungschromatographie) zwischen zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen. Diese
beiden Vorgänge treten allerdings nie in „reiner Form“ auf. Lösungs- oder Fließmittelmoleküle werden
ebenso wie die einzelnen zu trennenden Komponenten mehr oder weniger stark an der festen Phase
adsorbiert und bilden damit eine stationäre Flüssigkeit aus. Unabhängig von den physikalisch-
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2
chemischen Vorgängen, kommt es immer zu einer Verteilung der zu trennenden Stoffe zwischen
mobiler und stationärer Phase.
2.2.1. Adsorption
Adsorption ist die Anlagerung eines Stoffes aus der mobilen Phase an die Oberfläche der festen
stationären Phase. Man unterscheidet prinzipiell zwei unterschiedliche Adsorptionsvorgänge nach der
Stärke der Wechselwirkung: physikalische Adsorption = Physisorption mit Adsorptionsenthalpien
(freiwerde Bindungswärmen) zwischen 8 und 40 kJ/mol und chemische Adsorption = Chemisorption
mit Werten zwischen 80 und 600 kJ/mol. Vorraussetzung für den chromatographischen Prozess ist
natürlich die Reversibilität der Adsorption, d.h. die adsorbierten Stoffe müssen wieder unzersetzt
desorbiert werden können. Das Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht ist dabei eine Funktion der
Temperatur, der Konzentration des adsorbierten Stoffes und dem Verhältnis von adsorbierter Masse
zur Gesamtmasse an festem Adsorbens. Bei konstanter Temperatur sind diese beiden Adsorptions-
prozesse durch zwei Adsorptionsisothermen (1) und (2) beschreibbar und in Abb.1a grafisch darge-
stellt:
physikalische Adsorption nach FREUNDLICH: 1
nx= a c
m (1)
chemische Adsorption nach LANGMUIR: c
c b
max
x x=
m (2)
mit: m = Gesamtmasse an Adsorbens (stationäre Phase)
x = adsorbierte Masse
xmax = maximal adsorbierte Masse
c = Konzentration des Stoffes in der mobilen Phase
a,b,n = Konstanten, abhängig von Oberfläche, Eigenschaften adsorbierter Stoff, Lösemittel
Abb. 1: Y-Achse = stationäre Phase; x-Achse = mobile Phase; (a) Verlauf der Adsorptionsisothermen
nach FREUNDLICH und LANGMUIR; (b) Trennung zweier Komponenten A und B aufgrund unter-
schiedlicher Adsorptionsisothermen (aus Lit.1)
(a) (b)
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3
Konsequenzen für die chromatographische Praxis ergeben sich aus Abb.1:
1. Es muss im linearen Bereich der Adsorptionsisothermen gearbeitet werden, also bei kleinen
Stoffkonzentrationen in der mobilen Phase, weil sonst die stationäre Phase überladen wird.
2. Trennung ist nur möglich, wenn die Steigungen der Adsorptionsisothermen der jeweiligen Stoffe A
und B unterschiedlich groß sind. Bei steilem Kurvenverlauf hält sich die Komponente A vorwiegend in
der stationären Phase auf und erscheint im Chromatogramm später im Gegensatz zur Komponente B.
2.2.2. Verteilung
Die Grundlage bildet hier die unterschiedliche Löslichkeit von Stoffen in zwei miteinander nicht
mischbaren flüssigen Phasen (vgl. Scheidetrichter) und wird durch das NERNST`sche Verteilungs-
gesetz (3) beschrieben:
statx
mob
cK =
c oder xstat mobc = K c (3)
mit cstat = Konzentration (genauer Aktivität) des Stoffes x in der stationären Phase
cmob = Konzentration (genauer Aktivität) des Stoffes x in der mobilen Phase und
Kx = NERNST`scher Verteilungskoeffizient des Stoffes x
Die Verteilungsisothermen (T = konst.) zweier Stoffe A und B sind in Abb. 2 dargestellt. Ändert sich
die Temperatur, dann ändert sich natürlich der jeweilige Verteilungskoeffizient K. Eine Trennung der
beiden Stoffe A und B ist wie bei der Adorptionschromatographie nur möglich, wenn sich die
Verteilungskoeffizienten (Steigungen) von KA und KB unterscheiden. Bleibt K nicht konstant, dann
treten Abweichungen vom linearen Verhalten auf und die entsprechenden Peaks im Chromatogramm
werden unsymmetrisch (siehe Abb. 8b)
cmob
B
A
2.3. Chromatographischer Vorgang
Zur Optimierung der Trennung eines Stoffgemisches werden bei der Flüssigchromatographie die
mobile (Fließmittel) und die stationäre (Adsorbentien) Phase sowie die Fließgeschwindigkeit (Flow)
der mobilen Phase variiert. Die Temperatur wird hier konstant gehalten (im Gegensatz zu GC) Die
HPLC-Apparatur ist in Abb. 3 dargestellt. Zur Durchführung einer chromatographischen Trennung
muss die mobile Phase (Fließmittel mit homogen gelösten zu trennenden Komponenten) an der
stationären Phase vorbeibewegt werden. In der HPLC werden auf Grund der dicht gepackten Säulen
hierfür Pumpen verwendet mit Drücken bis 400 bar und Fließgeschwindigkeiten von 0,1 bis 10 mL/min
Das zu trennende Stoffgemisch wird im laufenden Fließvorgang über ein Sixportventil (Abb. 4) durch
Umlegen der mobilen Phase zugeführt.
Abb. 2: Verteilungsisothermen der
Stoffe A und B; Steigungen der
Geraden entsprechen den Vertei-
lungskoeffizienten KA und KB
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4
Abb. 3: HPLC-Apparatur mit Eluentenreservoir (1), Elektromagnetische Mischventile (2), Doppelkol-
benpumpe (3), RHEODYNE-Einspritzventil (4), Detektor (5), RP-Trennsäule (6), Fließmittelgradienten-
Controller (7), Integrator oder PC-Auswertesystem (8) und Abfallbehälter (9)
2.3.1. Stationäre Phasen (Adsorbentien)
Stationäre Phasen in der Adsorptionschromatographie reichen von Saccharose, Zellulose (Papier),
Magnesiumsilikat (Floresil), Magnesiumoxid, Aluminiumoxid usw. bis hin zu Kieselgel. Kieselgel ist
heute das am meisten verwendete Adsorbens und ist technisch in sphärischer Gestalt und enger
Korngrößenverteilung bis hin zu Korngrößen von 3 m Durchmesser verfügbar. Eine enge Verteilung,
hohe mechanische Stabilität und geringes Quellverhalten des Materials ist Vorraussetzung für eine
optimale Säulenpackung. Kieselgel wird aus Kieselsäure Si(OH)4 oder Natriumsilikat bei pH 4 durch
vorsichtige Dehydratisierung bei Temperaturen bis 300o C hergestellt, > 400o C Quarzbildung.
Normalphasiges Kieselgel ist porös und enthält viele polare OH-Gruppen an der Oberfläche. Werden
diese OH-Gruppen chemisch mit Alkyl-dimethyl-chlorsilanen umgesetzt, werden die polaren OH-
durch Alkyl-dimethyl-silan-Gruppen ersetzt und ergeben unpolare Adsorbentien, sogenannte
Umkehrphasen mit unterschiedlichen Alkylresten z.B. R = Methyl, Octyl oder Octadecyl:
R-Si(CH3)2-Cl + (Si-O-Si)x-OH (Si-O-Si)x-O-Si(CH3)2-R + HCl
Die Verwendung von Umkehrphasen (engl.: Reversed Phase) ermöglicht das Arbeiten mit wässerigen
und polaren Löse- und Fließmitteln und hat eine breite Anwendung für Trennungen in der Biochemie
und Pharmazie gefunden.
(a) (b) Abb. 4: 6-Wege-Probenaufgabe-
ventil (Sixportventil): (a) Füllen der
Probenschleife, Stellung LOAD; (b)
Überführung der Probe auf die
Säule, Stellung INJEKT (Injektion)
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5
2.3.2. Mobile Phasen (Fließ-, Lösungsmittel oder Eluenten)
Die Grundlage bildet hier die sogenannte eluotrope Reihe der Fließmittel in Abhängigkeit von der
stationären Phase auf der Basis der Adsorptionsisothermen. Wasser wird sehr gut an Kieselgel
(hydrophil) adsorbiert und besitzt daran eine hohe Elutionskraft (eluieren = auswaschen), an Kieslegel
mit Umkehrphase (hydrophob) dagegen wird Wasser abgewiesen. Die eluotrope Reihe an polarem
Al2O3 ist in Abb. 5 dargestellt, für RP-Adsorbentien dreht sich diese Reihe praktisch um.
2.3.3. Detektoren
Bei allen HPLC-Detektoren wird das Eluat nach dem Verlassen der Trennsäule durch eine
Durchflusszelle geleitet, in der die Änderungen einer physikalischen Eigenschaft bei Anwesenheit von
Komponenten im Fließmittel gemessen wird. Diese wird in Form eines elektrischen Signals an ein
Datenerfassungs- und Auswertesystem übertragen und als Chromatogramm aufgezeichnet. Man
unterscheidet zwischen selektiven und universellen Detektoren. Zu den selektiven gehören UV-,
Fluoreszenz-, elektrochemische und vor allem massenspektrometrische Detektoren, ein universeller
ist der Brechungsindex-Detektor. Der gebräuchlichste Detektor ist der UV-Detektor, der die
Lichtabsorption im Bereich von 200-400 nm misst. Ein Photodiodenarray-Detektor ist ein UV-Detektor,
der nicht nur die Absorption bei einer Wellenlänge misst, sondern gleichzeitig das gesamte UV-
Spektrum erfassen kann (siehe Abb. 6). Dieser Detektor eignet sich sehr gut zur Methoden-
entwicklung. Der empfindlichste Detektor ist der Fluoreszenz-Detektor.
Abb. 5: Eluotrope Reihe einiger
Fließ- und Lösungsmittel an
polarem Adsorbens Al2O3 mit
Dielektrizitätskonstanten , dynamische Viskositäten und
Oberflächenspannungen (in
mN/m
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6
2.3.4. Chromatogramme
Das Ergebnis einer chromatographischen Trennung wird als Chromatogramm dokumentiert (Abb. 7).
Abb. 8: (a) Symmetrischer GAUß-Peak mit den entsprechenden Daten und (b) asymmetrischer Peak
mit den Asymmetriefaktor- Berechnungsdaten in 10% Peakhöhe
Abb. 7: Chromatogramm mit symme-
trischen Peaks und den Retentions-
zeiten: Totzeit tm, Bruttretentionszeit tms
und Nettoretentionszeit ts (Index m =
mobil, s = stationär); Basisbreite W
(a)
(b)
Abb. 6: 3-Dimensionales Chroma-
togramm eines UV-Photodioden-
array-Detektors (aus Lit.1)
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7
Es bildet die Grundlage zur Auswertung der Trennung und Berechnung der chromatographischen
Kenngrößen: Retensionszeiten t, Peak-Basisbreiten W, Asymmetriefaktoren AF (Abb.8b), Kapazitäts-
faktoren k, Trennfaktoren r, Auflösung R, Trennstufenzahl N und Bodenhöhe H.
Die chromatographischen Kenngrößen berechnen sich aus dem Chromatogramm wie folgt:
Nettoretentionszeit t s: t s = t ms – t m (4)
Asymmetriefaktor AF: 0,1
0,1
bAF =
a (5)
mit AF > 1 (Tailing); AF = 1 (symmetrisch); AF < 1 (Fronting)
Kapazitätsfaktor k: s
m
tk =
t (6)
Trennfaktor r( ): s
s
t "k"r = =
k' t ' (mit k`` > k` ) (7)
Auflösung Rs zwischen 2 Peaks: ms ms s ss
0,1 0,1 0,5 0,5
t " - t ' t " - t 'R = 2 = 1,177
W " + W ' W " + W ' (8)
Theoretische/effektive Trennstufen- oder Bodenzahl N / Neff :
2 2
ms seff
0,1 0,1
t tN = 16 ; N = 16
W W (9)
Sind die Peaks asymmetrisch, wird folgende Gleichung verwendet:
2 2
ms seff
0,5 0,5
t tN = 5,54 ; N = 5,54
W W (10)
Trennstufen- oder Bodenhöhe H: effeff
L LH = bzw. H =
N N (11)
(L = Länge der Chromatographiesäule)
Asymmetrische Peaks führen zur Überlappungen und haben unterschiedliche Ursachen:
Stoffgemischkonzentration ist zu groß und damit Überladung der stationären Phase; langer Gebrauch
der Chromatographiesäule führt zur Veränderung und Abnutzung der stationären Phase; unvoll-
ständige homogene Lösung des Stoffgemisches in der mobilen Phase; Fließgeschwindigkeit der
mobilen Phase zu groß und Störung des Adsorpions-Desorptions- bzw. Verteilungsgleichgewichtes
(siehe Abb. 9).
ATL – 1
8
cm
(a)
(b)
(c)
cm
cs
cs
cs
cm
2.3.5. Dynamische Theorie
In der dynamischen Theorie wird der aus der Bodentheorie (fraktionierte Destillation) stammende
Begriff Boden- oder Trennstufenhöhe mit der Fleißgeschwindigkeit der mobilen Phase anschaulich zur
VAN DEEMTER-Gleichung verknüpft. Gleichung (12) stellt die einfachste Formulierung dar (Abb. 10):
B
H = A + + C uu
(12)
Die Konstante A ist von u unabhängig und berücksichtigt die Streudiffusion, welche zu einer
Peakverbreiterung führt. In A steckt der Partikeldurchmesser und eine Konstante, die die Unregel-
mäßigkeit der Säulenpackung berücksichtigt.
Der B-Term berücksichtigt die Molekulardiffusion in Längsrichtung der Trennstrecke und hängt vom
Diffusionskoeffizienten der mobilen Phase sowie vom sogenannten Labyrinthfaktor ab. Der C-Term
berücksichtigt Störungen der Gleichgewichtseinstellung zwischen mobiler und stationärer Phase,
Abb. 9: (a) symmetrischer Gauß-Peak;
(b) Tailing, Stoff hält sich vermehrt in
der mobilen Phase auf;
(c) Fronting, nun wechselwirkt der Stoff
verstärkt mit stationärer Phase (Lit.1)
Abb. 10: Grafische Darstellung der VAN
DEEMTER-Gleichung (12), zusammen mit
den einzelnen Term-Summanden;
Abhängigkeit der Bodenhöhe H (hier h) in
mm von der Fließgeschwindigkeit u in
cm/s: A bleibt konstant, B nimmt
hyperbolisch ab und C steigt linear an; die
optimale Fließgeschwindigkeit uopt (umin)
entspricht der kleinsten Bodenhöhe Hmin;
1. Ableitung der Gleichung (12):
dH/du = 0 ergibt: uopt = B/ C (aus Lit.1)
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9
sogenannter Massenübergangsterm. Hier spielt u.a. der Diffusionskoeffizient zwischen der mobilen
und stationären Phase eine große Rolle (Abb. 11).
Aus Gleichung (12) wird sofort ersichtlich, dass bei Erhöhung der Fließgeschwindigkeit der B-Term
hyperbolisch kleiner wird, jedoch der C-Term ungünstigerweise linear zunimmt. Die Optimierung einer
chromatographischen Trennung beinhaltet also auch die Bestimmung der optimalen
Fließgeschwindigkeit uopt d.h. Auffindung der kleinsten Bodenhöhe oder entsprechend Gleichung (11)
der größten Bodenzahl.
2.3.6. Quantitative Auswertung
Nach Zuordnung der einzelnen getrennten Peaks zu den jeweiligen Komponenten werden die Flächen
integriert und nach Kalibrierung über die erhaltene Kalibrierfunktion (Regressionsrechnung mit
EXCEL) z.B. y = ax + b in die Analysenfunktion x = y/a – b/a umgestellt mit y = Fläche F der
Einzelkomponente und x = Konzentration c. Diese Kalibrierung nennt man externe Kalibrierung, da
kein interner Standard zugemischt wurde. Bei Zumischung eines immer gleichkonzentrierten internen
Standards wird bei der Auswertung immer auf die Fläche Fis dieser internen Standardkomponente
bezogen und natürlich ebenso auf die Konzentration cis gemäß Gleichung (13). Durch diese interne
Kalibrierung wird man unabhängig vom aufgegebenen Probenvolumen.
Fi / Fis = f ( i / is ) (13)
mit Fi = Fläche der Komponente i; Fis = Fläche der internen Standardkomponente; i =
Massenkonzentration der Komponente i; is = Massenkonzentration der internen
Standardkomponente, f = Steigung der Kalibriergeraden (Responsefaktor).
Die Analysenfunktion wird dann nach i umgestellt und ergibt die gesuchte Konzentration der
unbekannten Probe nach Bestimmung der Flächen. Die Auswertung über die Höhen an Stelle der
Flächen wird heute eher selten durchgeführt.
Abb. 11: Schematische Darstellung der
Ursachen von Peakverbreiterungen, (a)
Streudiffusion durch Parikelbestandteile, A-
Term; (b) Molekulardiffusion in Längs-
richtung, B-Term; (c) Probenbestandteile
werden in der nahezu ruhenden mobilen
Phase von nicht-durchströmten Poren nicht
weitertransportiert und können nur durch
Diffusion wieder in die fließende mobile
Phase gelangen (aus Lit.1)
ATL – 1
10
2.4. Literaturhinweise (in der PC-Bibliothek vorhanden)
1) H. Naumer, W. Heller, Untersuchungsmethoden in der Chemie, Thieme Verlag 1990. 2. Auflage
2) D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer Verlag Berlin 1996
3) G. Aced, H. J. Möckel, Liquidchromatographie, VCH-Verlag, 1991
4) G. Schwedt, Analytische Chemie, Grundlagen, Methoden und Praxis, Thieme Verlag 1995
5) K. K. Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1: Leitfaden für Anfänger und Praktiker, GIT Verlag 1989
2.5. Vorbereitende Fragen (schriftlich im Laborjournal!)
1) Welche Zeiten beschreiben den Aufenthalt einer Komponente ausschließlich in der mobilen bzw. in
der stationären Phase ?
2) Wie kann man die Totzeit einer chromatographischen Anlage mit einer unpolaren bzw. polaren
stationären Phase am besten bestimmen? Warum ist die Bestimmung von tm immer unsicher?
3) Wie lassen sich einerseits Peakverbreiterungen und anderseits asymmetrische Peaks
beschreiben?
4) Formulieren Sie die Analysenfunktion der internen Kalibrierung.
5) Welcher Vorteil bietet der Kapazitätsfaktor k im Vergleich zur Nettoretentionszeit ts?
3. Praktische Durchführung 3.1. Geräte und Chemikalien
High-Pressure-Liquid-Chromatograph (MERCK-HITACHI; Nr. 655A)
UV-Detektor (MERCK-HITACHI; Nr. 655A-22);
Gradientensteuergerät (Controller) (MERCK-HITACHI, Nr. L-6200);
Rechnerauswertesystem Elite EZChrom
3 Maßkolben (1000 mL), 5 Maßkolben (100 mL), 3 Büretten (50 mL), 3 Stative mit Bürettenklammem,
1 Spritze (mL) für die HPLC Apparatur, 3 kleine Trichter
Anmerkung: Alle Chemikalien werden erst nach Rücksprache entsorgt.
Lösemittel: Bidest. Wasser;
Methanol-Lichrosolv (MERCK-Nr. 6007);
Substanzen:
Coffein, z.A. (MERCK-Nr. 2583); (Coffein) = 100 mg/L;
Theobromin z.A. (FLUKA-AG-Nr. 88304); (Theobromin) = 100 mg/L;
Theophyllin z.A. (ROTH-Nr. 3380); (Theophyllin) = 100 mg/L;
3.2. Vorbereitung der Messlösungen Aus den drei Stammlösungen, die jeweils 100 mg/L Alkaloid enthalten, werden 5 Kalibrierlösungen mit
Konzentrationen von 5 - 25 mg/L hergestellt. Als interner Standard wird eine der Stammlösungen mit
10 mg/L in jeden der 5 Kalibrierkolben pipettiert. Bevorzugt Theophyllin. Z.B. 5 mg/L Coffein, 5 mg/L
Theobromin und 10 mg/L Theophyllin für die erste Konzentration der Kalibrierreihe. Den
Kalibrierlösungen wird noch zusätzlich jeweils 5 ml einer 2 g/L Thioharnstofflösung zur Ermittlung der
Totzeit / Mobilzeit ( tm) hinzugesetzt. Anschließend werden die Maßkolben dann mit Chromatographie-
Wasser aufgefüllt.
ATL – 1
11
3.3. Inbetriebnahme der Geräte und Probenaufgabe Die Inbetriebnahme erfolgt in Gegenwart des Assistenten in folgender Reihenfolge:
1. UV-Detektor (Wellenlänge auf = 273 nm einstellen);
2. Chromatograph;
3. Gradientencontroller;
4. Rechneraufnahme- und Auswertesystem Elite EZChrom vom MERCK
3.3.1. Probenaufgabe
Die Probe wird mit der Spritze am RHEODYNE - Injektorblock (Stellung LOAD, vhl. Abb. 4) so
eingespritzt, dass die 20 μL - Schleife ausreichend gespült werden kann. Dann wird der Injektorhebel
auf INJEKT umgelegt. Wichtig ist ein schnelles Umlegen des Injektorhebels. Nach dem Umlegen des
Hebels auf Injekt, startet der angeschlossene Integrator bzw. das Rechnerauswertesystem
automatisch. Die Einstellungen am Integrator und am Rechner sind bereits voreingestellt und müssen
nur nach Bedarf verändert werden.
3.4. Erste Teilaufgabe: Trennoptimierung
Die Elutionsbedingungen werden über der MANUAL-Status am Controller eingegeben. Ein
Gradientenprogramm wird nicht erstellt, da im vorliegenden Fall isokratisch, d.h. mit konstanter
Eluentenzusammensetzung gearbeitet wird.
Die Durchflußrate wird bei einer Eluentenzusammensetzung von
A=50% (MeOH); B=50% (H2O); C=0% mit 0,7 mL/min bis 1,5 mL/min in 0,2 mL/min-Schritten
variiert.
Überlegen Sie sich zu Beginn, in welcher Reihenfolge die Alkaloide im Chromatogramm erscheinen
werden an Hand der Strukturformeln. Als Messlösung wird die Lösung eingesetzt, in welcher alle drei Alkaloide in der gleichen
Stoffmengenkonzentration vorliegen. (d.h. die Lösung mit je 10 mg/L für Theobromin, Theophyllin und
Coffein). Ist die HPLC-Apparatur messbereit, kann unter Anleitung des Assistenten bei einem Flow
von 0,7 mL/min das erste Chromatogramm gefahren werden. Die Messungen werden mit steigendem
Flow solange wiederholt, bis die einzelnen Peaks überlappen und nicht mehr getrennt sind.
3.3. Zweite Teilaufgabe: Kalibrierung Nach Rücksprache und Diskussion der HPLC-Chromatogramme aus der ersten Teilaufgabe ist der
optimale Flow einzustellen. Bei diesem Wert werden alle fünf Kalibrierlösungen unter isokratischen
Bedingungen, d.h. die Fließmittelzusammensetzung bleibt konstant, als Doppelbestimmung chromato-
graphiert. Messungen, bei denen die Peaks von Substanzen mit konstanten Mengen ganz vom Mittel
abweichen, sind zu wiederholen.
3.5. Dritte Teilaufgabe: quantitative Bestimmung einer unbekannten Probe (X-Probe)
Die unbekannte X-Probe ist mit Chromatographie-Wasser entsprechend aufzufüllen und im
Messprotokoll zu dokumentieren. Der X-Probe wurde ebenfalls zur Ermittlung der Totzeit tm 5 mL der
2 g/L konzentrierten Thioharnstoff-Lösung hinzugefügt. Im Chromatogramm erscheint der Thioharn-
stoff-Peak noch vor den drei Substanz-Peaks. Thioharnstoff geht mit der stationären Phase keine,
oder nur geringe Wechselwirkungen ein und fließt mit der mobilen Phase ungehindert durch die
HPLC-Apparatur. Das Absorptionsmaximum von Thioharnstoff liegt ebenfalls bei ca. 273 nm.
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12
4. Auswertung 4.1. Bestimmung der chromatographischen Kenngrößen
Aus dem optimierten Chromatogramm sind für jede der drei Alkaloidkomponenten folgende
Messgrößen zu ermitteln (vgl. Abbn. 7 und 8):
tms = Bruttoretentionzeit
tm = Totzeit, Durchbruchzeit
ts = Nettoretentionszeit
h = Peakhöhe
W 0.1 = Basisbreite der Peaks bei 0,134 h
W 0.5 = Basisbreite der Peaks bei 0,5 h
a 0,1 ; b 0,1 = Asymmetrieabschnitte bei 0,134 h
und daraus nach Abschnitt 2.3.4 die folgenden chromatographischen Kenngrößen zu berechnen:
k = Kapazitätsfaktor
AF = Asymmetriefaktor
r () = Trennfaktor
R = Auflösung
N = Trennstufenzahl (theoretisch)
H = Bodenhöhe (theoretisch);
4.2. Anwendung der VAN DEEMTER-Gleichung
Aus den Optimierungsversuchen 3.4 sind von allen drei Alkaloiden bei den fünf Fließgeschwindig-
keiten die grafische Darstellung –Bodenhöhe H gegen Flow u in mL/min- (vgl. Abb. 10) in einer
Abbildung für alle drei Komponenten anzufertigen, Die optimale Bodenhöhe Hopt und die optimale
Fließgeschwindigkeit uopt ist für jede Komponente anzugeben, gemittelt ergibt sich uopt für die
Mischung.
4.3. Quantitative Bestimmung
4.3.1. Methode des externen Standards
Für jede einzelne Alkaloidkomponente wird bei den 5 Konzentrationen eine Regressionsrechnung mit
EXCEL durchgeführt: Flächen Fi gegen Konzentrationen i. Die jeweilige Geradengleichung ist die
Kalibrierfunktion. Die Fläche der X-Probe Fx wird in die entsprechende Analysenfunktion eingesetzt
und x berechnet (vgl. Kapitel 2.3.6).
4.3.2. Methode des internen Standards
Auswertung wie zuvor, nur wird jetzt jeweils auf die Fläche Fis und Konzentration is bezogen gemäß
Gleichung (13). Nach Umstellung in die entsprechende Analysenfunktion werden die Flächen Fi und
Fis sowie i eingesetzt und x wird berechnet.
4.4. Diskussion der Ergebnisse
- War Ihre im Labor getroffene Entscheidung zur Wahl optimalen Betriebsbedingungen für das
untersuchte System richtig?
- Wie weichen die Ergebnisse der quantitativen Bestimmungen voneinander ab?
- Welche Bestimmungsmethode ist aufgrund der Versuchsergebnisse vorzuziehen?
- Welche weiteren Möglichkeiten und Auswertemethoden für die quantitative Analyse sind in der
Chromatographie noch gebräuchlich?
Stand: 10.05.17
ATL – 2
1
Trennung und quantitative Bestimmung ausgewählter Kohlenwasserstoffe am Gaschromatographen
1. Aufgabenstellung 1.1. Optimierung der gaschromatographischen Trennung ausgewählter Kohlenwasserstoffe bei
verschiedenen Temperaturen an Hand aufgezeichneter Gaschromatogramme
1.2. Quantitative Bestimmung einer unbekannten Komponente über interne Kalibrierung
2. Theoretische Grundlagen Eine allgemeine Einführung in die Chromatographie ist im Versuch ATL-1 unter Kapitel 2.1 gegeben.
2.1. Physikalisch-chemische Grundlagen
Im Gegensatz zur Flüssigchromatographie (ATL-1) liegt die mobile Phase hier im gasförmigen
Zustand vor, in Form des Trägergases zusammen mit den gasförmigen Komponenten. Das zu
trennende Probengemisch muss also möglichst unzersetzt verdampfbar sein. Die Wechselwirkung
zwischen den Molekülen des Trägergases und dem Dampf der Probenkomponenten, sowie zwischen
Trägergas und stationärer Phase sind vernachlässigbar klein. Das Trägergas besitzt also im
Gegensatz zu Fließmitteln bei der Flüssigchromatographie keinerlei Eluenskraft (eluieren = aus-
waschen). Eine gaschromatographische Trennung erfolgt praktisch ausschließlich durch Wechsel-
wirkung der Probenmoleküle mit der stationären Phase und wird durch Temperaturänderung
maßgeblich beeinflusst. Häufig verwendete Trägergase sind Helium, Stickstoff und Wasserstoff.
Wasserstoff hat hierbei die niedrigste Viskosität und erzielt schnellere Resultate als Stickstoff, aller-
dings ist Wasserstoff brennbar, Stickstoff dagegen preiswerter und nicht reaktiv.
2.1.1. Adsorption
Adsorption spielt in der Gaschromatographie hier als GSC (Gas Solid Chromatography) keine große
Rolle, da die Bindung der Probenmoleküle an die Oberfläche des festen Adsorbens alleine wirkt
(Trägergas wechselwirkt praktisch nicht) und die Desorption nur bei höherer Temperatur erfolgt. Die
GSC wird deshalb nur bei Permanentgasen eingesetzt (CO2, SO2, NO2, Edelgase usw.) und versagt
bei größeren d.h. höher siedenden Molekülen, die in der Regel dann nicht unzersetzt wieder
desorbiert werden können. Ansonsten gelten die Gesetze von FREUNDLICH und LANGMUIR auch
hier (vgl. ATL-1).
2.1.2. Verteilung
Die Verteilung der Probenmoleküle zwischen der Gasphase und der flüssigen Phase (polymere
Silikonöle ohne eigenen Dampfdruck) spielt in der Gaschromatographie die größte Rolle. Dabei lösen
sich die Probenmoleküle in der praktisch nicht verdampfbaren flüssigen stationären Phase. Die
physikalische Beschreibung des Verteilungsprozesses kann einerseits durch das RAOULT`sche
Gesetz Gleichung (1) erfolgen, hier wird eine ideale Lösung der flüchtigen Probenmoleküle in einer
nichtflüchtigen stationären Flüssigkeit angenommen (gleicher Substanzklasse). Anderseits lässt sich
die Verteilung auch durch das HENRY-DALTON-Gesetz Gleichung (2) beschreiben, hier wird eine
ideal verdünnte Lösung der Komponenten in der flüssigen Phase vorausgesetzt, was für Gase in
Flüssigkeiten in guter Näherung zutrifft.
ATL – 2
2
o
1 1 1p = p x (1)
mit p1 = Dampfdruck der Probenkomponente 1 über der idealen Lösung
p1o = Dampfdruck der reinen Probenkomponente 1
x1 = Stoffmengenanteil (Molenbruch) der Probenkomponente 1 in der idealen Lösung.
1 11p = K x (2)
mit p1 = Dampfdruck der Probenkomponente 1 über der ideal verdünnten Lösung
K1 = HENRY-Konstante der Probenkomponente 1
x1 = Stoffmengenanteil (Molenbruch) der Probenkomponente 1 in der ideal verdünnten Lösung.
Im Folgenden wird der Ansatz nach RAOULT weiter verwendet. Entstammen die Probenkomponente
1 und die flüssige stationäre Phase 3 nicht der gleichen Stoffklasse (nicht ideale Lösungen), dann
resultieren Wechselwirkungen, die durch den Aktivitätskoeffizienten 1,3 ausgedrückt werden und
entweder eine Erhöhung des Dampfdruckes durch Abstoßung (1,3 > 1) oder eine Erniedrigung durch
Anziehung (1,3 < 1) bewirken (Aktivität a = x1 1,3):
o1 1 1p = p x (3)
Damit wird die lineare Steigung des Verteilungskoeffizienten in Abhängigkeit des steigenden
Stoffmengenanteils x1 erhöht oder verringert, was im Gaschromatogramm als asymmetrische Peaks
gemäß Abb. 1 in Erscheinung tritt.
x1
x1
x1
p1
p1
p1
(a)
(b)
(c)
Gleichung (3) lässt sich umformulieren als Verhältnis des Partialdrucks der Komponente 1 bezogen
auf ihren Stoffmengenanteil in der stationären flüssigen Phase. Damit wird ersichtlich, je größer p1/x1
wird, desto größer ist auch die Geschwindigkeit, mit der Komponente 1 die Säule durchläuft.
Abb. 1: (a) symmetrischer Peak: 1,3 konst.,
bei 1,3 = 1 ideale Lösung; (b) Tailing: 1,3
nimmt mit x1 zu, Probenkomponente 1 wird
von stationärer flüssiger Phase 3
abgestoßen; (c) Fronting: 1,3 nimmt mit x1
ab, entsprechend Anziehung (aus Lit.1)
ATL – 2
3
o11
1
p= p
x (4)
Passieren unter gleichen Bedingungen die beiden zu trennenden Komponenten 1 und 2 (Temperatur
und stationäre Phase gleich), dann lässt sich nach HERINGTON für das Verhältnis der Netto-
retentionszeiten ts1/ts2 Beziehung (5) formulieren:
t
t~
1o
s1 1 1o
2s2 2
2
p
x p=
p p
x
(5)
Die Beziehung von HERINGTON zeigt die beiden prinzipiellen Möglichkeiten der GC auf:
a) Trennung von chemisch sehr ähnlichen Komponenten z.B. von Kohlenwasserstoffen, aber
unterschiedlichen Siedetemperaturen und damit über die Dampdfdrücke po;
b) Trennung von Komponenten gleicher Siedetemperatur aber unterschiedlichen chemischen
Eigenschaften und damit verschiedene Wechselwirkungen mit der stationären Phase über den
Aktivitätskoeffizienten .
Der wichtigste Parameter der GC ist im Gegensatz zur HPLC die Temperatur, da die jeweiligen
Dampfdrücke po der Komponenten über die CLAUSIUS-CLAPEYRON-Gleichung (6) temperatur-
abhängig sind (vgl. PCL1-3):
V
2R T
dlnp H=
dT (6)
Bei Erhöhung der Temperatur der GC-Säule nehmen damit die Dampfdrücke der einzelnen
Komponenten zu, befinden sich damit in höherem Anteil in der mobilen Phase und passieren die
Säule schneller. Bei zu hohen Temperaturen würden sich alle Komponenten in der mobilen Phase
aufhalten und eine Trennung wäre nicht mehr möglich.
2.2. Gaschromatographisches System
Zur Optimierung der Trennung eines Stoffgemisches werden bei der Gaschromatographie die
stationäre (polymere Silikonöle, siehe auch ATL1) Phase sowie die Temperatur der Säule variiert, die
Veränderung des Trägergasdruckes (Flow der mobilen Phase) spielt eine ungeordnete Rolle. Die GC-
Apparatur ist in Abb. 2 dargestellt. Zur Durchführung einer chromatographischen Trennung wird die
mobile Phase (Trägergas mit dem Dampf der zu trennenden Komponenten) durch eingestellten
Trägergasdruck an der stationären Phase vorbeibewegt. Das zu trennende Stoffgemisch wird dem
Trägergas über einen heizbaren Injektorblock durch Einspritzung zugeführt.
ATL – 2
4
Ein komplettes GC-System besteht aus vier Hauptbestandteilen:
Injektor: Damit wird die vollständige Überführung der Probe auf die
Trennsäule gewährleistet. (Probenaufgabe-System) Trennsäule: Dient zur chromatographischen Trennung der Substanzgemische.
Detektor: Eigentliche analytische Messapparatur, die kontinuierlich eine physikalische
Eigenschaft der vorbeifließenden Gasmischung als Messgröße erkennt.
Datenerfassung: (Schreiber, Integrator, Laborrechner): Zeitabhängige Registrierung und
Aufzeichnung des vom Detektor gelieferten elektrischen Signals der
Messgröße (Aufzeichnung des Chromatogramms).
Abb. 2: Blockschema einer gaschromatographischen Apparatur Als Trägergas werden in der Gaschromatographie Stickstoff (N2); Wasserstoff (H2) oder Helium (He)
verwendet. Dieses wird aus einer Druckflasche über eine Regeleinheit bezogen (Druckminderer an
der Stahlflasche & Feinregulierung im Gaschromatographen). Injektoren sind entweder nach der
Gasführungsart oder nach ihrer Heiztemperaturregelung einteilbar. Injektoren nach der
Gasführungsart sind die SPLIT-/SPLITLESS- und ON-COLUMN-Injektoren. Nach der
Temperaturführung eingeteilt, handelt es sich bei den beiden am meisten eingesetzten Injektortypen.
"verdampfende" Injektoren oder um "Kaltaufgabesysteme". Die erstgenannten sollen die Probe
schlagartig verdampfen, so dass die Probe in gasförmigem Zustand schnell und gleichmäßig vom
Trägergas in die Trennsäule transportiert wird. Bei Kaltaufgabesystemen übernimmt die Verdampfung
der GC-Ofen oder ein programmierbares Heizsystem im Injektor. Eine wichtige Voraussetzung für die
GC ist also die Verdampfbarkeit der zu messenden Stoffe. Hochmolekulare, anorganische oder
polymere Stoffe, die selten unzersetzt oder gar nicht in die Gasphase übergehen, können daher nicht
einer GC-Analyse unterzogen werden.
Als Trennsäulen werden heute bevorzugt die sogenannten Kapillarsäulen verwendet. Kapillarsäulen
zeichnen sich durch eine extrem hohe Trennleistung aus, haben einen inneren Durchmesser von 0,1
bis 0,4 mm und sind in den meisten Fällen zwischen 10 und 50 m lang. Sie bestehen aus Glas oder
Kieselglas mit einzelnen OH-Gruppen, an die die flüssige stationäre Phase (Trennflüssigkeit) auf der
Innenwand als Film kovalent gebunden ist. Die Filmdicken bewegen sich zwischen 0,05 –10 m. Die
große Anzahl an Trennflüssigkeiten bestehen aus Polymeren wie z.B. die am häufigsten verwendeten
unpolaren Methylsilikone (-O-Si(Me)2-O-Si(Me)2-)x mit wechselnden polareren Anteilen an Phenyl-,
Cyanoethyl-, oder Trifluorpropyl-Gruppen oder polaren Polyethylenglykolen. Die Trennsäule befindet
sich im Säulenofen. Ist das zu analysierende Stoffgemisch auf der Trennsäule im GC-Ofen getrennt,
so müssen die einzelnen Substanzen das Ende der Trennstrecke erreichen, um in den dort
ATL – 2
5
installierten Detektor analysiert zu werden. Zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Substanzen
werden die verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Komponenten benutzt.
Die wichtigsten hiervon sind: Wärmeleitfähigkeit, Ionisierbarkeit, Elektronenaffinität und spektrosko-
pische Eigenschaften (MS; FT-IR; Flammenphotometrie).
GC-Detektoren sind Messinstrumente, die Eigenschaftsunterschiede zwischen Probenkomponenten
und Trägergas messen und dieser Informationen in elektrische Signale umwandeln. Detektoren
müssen bestimmte Eigenschaften erfüllen, damit sie in der praktischen Gaschromatographie
einsetzbar sind. Man unterscheidet Detektoren auch danach, ob sie die Probemoleküle ohne
Zerstörung oder durch Zerstörung detektieren:
- Destruktive Detektoren sind der Flammenionisationsdetektor (FID), der Phosphor-Stickstoff-
Detektor (PND), der Flammenphotometrische Detektor (FPD) und der Massendetektor (MSD).
Alle destruktiv detektierenden Detektoren arbeiten als massenregistrierende Detektoren d.h. sie
registrieren die, bei der Destruktion entstandenen Teilchen (zumeist Ionen).
- Nicht-destruktive Detektoren sind der Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD), der Photoionisations-
detektor (PID) und der Infrarotdetektor (IRD). Alle Nicht-destruktiven Detektoren sind arbeiten
konzentrationsabhängig. Bei diesen Detektoren ist das Volumen der Detektionszelle von großer
Bedeutung. Bei den meisten heute üblichen Detektoren handelt es sich um Differential - Detektoren. Wenn reines
Trägergas diesen Detektortyp durchströmt, wird das erhaltene Signal kompensiert. Kommt neben dem
Trägergas eine Probenkomponente in den Detektor, dann wird der Unterschied zum reinen Trägergas
- Signal als Probensignal ausgegeben. Im Prinzip lässt sich jede Messsonde als Detektor nutzen, die
auf solche Unterschiede anspricht. Die Signale aus dem Detektor werden verstärkt, auf einem
Schreiber ausgegeben oder in einem Computer - Integrator weiterverarbeitet. Besonders bei der
Schreiberauswertung muss die Ausgangsverstärkung des Detektors groß genug sein, damit alle
Peaks messbar sind. In der wissenschaftlichen Literatur sind heute rund 100 verschiedene Detektoren
beschrieben. Nur rund 10 davon spielen eine Rolle, der WLD und FID sollen hier kurz besprochen
werden. Wärmeleitfähigkeitsdetektor WLD
Dieser Detektor besteht aus einem gut thermostatisierten Metallblock mit vier gleichen Zellen. Zwei
Zellen (Messzellen) werden vom Trägergas aus der Trennsäule durchströmt, zwei (Vergleichszellen)
vom reinen Trägergas. In allen vier Zellen befinden sich Platin- oder Wolfram-Heizwendeln, die zu
einer WHEATSTONE`schen-Brückenschaltung zusammengeschlossen sind.
Abb. 3: Wärmeleitfähigkeitsdetektor WLD und Messprinzip, MZ=Messzelle, VZ=Vergleichszelle
ATL – 2
6
Alle Heizdrähte werden von elektrischem Strom durchflossen und dadurch erwärmt. Die Temperatur
der Drähte, und damit ihr Widerstand hängt von der Wärmeleitfähigkeit der Gase ab, die die Zellen
durchströmen. Veränderungen in der Zusammensetzung des Gases, das die Messzellen durchströmt,
verursachen Temperaturänderungen und damit Widerstandsänderungen der Drähte in den Mess-
zellen. Da alle Zellen zu einer WHEATSTONE`schen Brücke zusammengeschaltet sind, gerät die
Schaltung aus dem Gleichgewicht, sobald eine Komponente (mit schlechterer Wärmeleitfähigkeit als
das Trägergas) aus der Trennsäule in die Messzelle strömt. Die Temperatur der Heizdrähte in den
Messzellen stabilisiert sich durch die Wärmeabfuhr auf einem höheren Niveau. Die Temperatur der
Heizdrähte in den Vergleichszellen ändert sich nicht. Diese Temperaturdifferenz der Heizdrähte in
Mess- und Vergleichszellen bewirkt einen Spannungsunterschied, der verstärkt auf ein Ausgabegerät
gegeben wird. Die Signale sind der Probenkonzentration im Trägergas proportional.
Der WLD ist grundsätzlich für alle Substanzen verwendbar, die ihn nicht durch Korrosion zerstören.
Man sollte den Brückenstrom nicht einschalten, bevor die Heizdrähte vom Trägergas umspült und
dadurch gekühlt werden. Überhitzung kann die Drähte durchbrennen lassen.
Flammenionisationsdetektor FID
Beim Flammenionisationsdetektor (FID) wird dem Trägergas am Säulenende Wasserstoff als
Brenngas beigemischt. Gleichzeitig wird synthetische Luft so in den Detektor eingeleitet, dass der
Wasserstoff an einer feinen Düse verbrennen kann. Alle Substanzen, die vom Trägergas eluiert
werden, verbrennen in der Wasserstoffflamme. Das Detektorsignal beruht auf der Ionenbildung bei
der Verbrennung von Substanzen mit C-C und C-H Bindungen. Die Wasserstoffflamme selbst ist
kaum ionisiert. Gelangen aber Verbindungen in die Flamme, so werden über eine Radikalreaktion
CH + O ----> CHO+ + e-
Ionen und Elektronen gebildet, die durch das elektrische Feld der Sammelelektrode aufgefangen
werden können. Die Düse, an der Trägergas und Wasserstoff in den Luftstrom eintreten und
verbrennen, besitzt ein negatives Potential. Positive Ionen werden dadurch neutralisiert, während die
freigesetzten Elektronen an der positiven Sammelelektrode eingefangen werden und den Signalstrom
liefern. Damit ein FID einwandfrei arbeitet, müssen Brenngas-, Luft- und Trägergas-Strömung richtig
eingestellt werden. (Angaben finden sich in den Gerätehandbücher). Ferner dürfen die Elektroden
nicht durch Korrosion oder durch Siliziumdioxidablagerungen aus verbrannten Silikonphasen
verschmutzt sein. Damit der FID nicht durch Kondenswasser geschädigt wird, darf die Brennerflamme
erst gezündet werden, wenn der Detektor wärmer als 100 °C ist. Der Flammenionisationsdetektor ist
für organische Verbindungen verwendbar. Er spricht auf viele anorganische Verbindungen nicht an,
z.B. H2O, CO2, SO2, NH3, CO.
Abb. 4: Flammenionisationsdetektor FID
ATL – 2
7
Die von der Datenerfassung aufgezeichneten Chromatogramme (Abb. 5) werden wie bei der
Flüssigchromatographie ausgewertet (vgl. ATL1, Kapitel 2.3.4, Abb. 7 und 8).
Die chromatographischen Kenngrößen berechnen sich aus dem Chromatogramm wie folgt:
Nettoretentionszeit t s: t s = t ms – t m (7)
Asymmetriefaktor AF: 0,1
0,1
bAF =
a (8)
Kapazitätsfaktor k: s
m
tk =
t (9)
Trennfaktor r( ): s
s
t "k"r = =
k' t ' (mit k`` > k` ) (10)
Abb. 5: GC-Chromatogramme des selben Kohlenwasserstoffgemisches (a) isotherm bei 150 °C
mit unvollständiger Trennung und asym-metrischen Peaks; (b) mit Temperarurgradient von
50 – 250 °C mit einer Rate von 8 °C/min: basis-liniengetrennte symmetrische Peaks in deutlich
kürzerer Zeit; (a) gegenüber (b) 16 mal verstärkt
(a)
(b)
ATL – 2
8
Auflösung Rs zwischen 2 Peaks: ms ms s ss
0,1 0,1 0,5 0,5
t " - t ' t " - t 'R = 2 = 1,177
W " + W ' W " + W ' (11)
Theoretische/effektive Trennstufen- oder Bodenzahl N / Neff :
2 2
ms seff
0,1 0,1
t tN = 16 ; N = 16
W W (12)
Sind die Peaks asymmetrisch, wird folgende Gleichung verwendet:
2 2
ms seff
0,5 0,5
t tN = 5,54 ; N = 5,54
W W (13)
Trennstufen- oder Bodenhöhe H: effeff
L LH = bzw. H =
N N (14)
(L = Länge der Chromatographiesäule)
Dynamische Theorie
Die VAN DEEMTER-Gleichung der dynamischen Theorie (vgl. ATL-1, Kapitel 2.3.5) gilt auch in der
Gaschromatographie und wurde sogar zuerst an Hand der GSC abgeleitet. In der Kapillar-GC ist der
A-Term gleich Null, da keine, durch Partikel verursachte Streudiffusion vorliegt. Durch unterschied-
liche Trägergasdrücke lässt sich hier der optimale Flow ermitteln.
Quantitative Auswertung
Nach Zuordnung der einzelnen getrennten Peaks zu den jeweiligen Komponenten werden die Flächen
integriert und nach Kalibrierung über die erhaltene Kalibrierfunktion (Regressionsrechnung mit
EXCEL) z.B. y = ax + b in die Analysenfunktion x = y/a – b/a umgestellt mit y = Fläche F der
Einzelkomponente und x = Volumen V. Diese Kalibrierung nennt man externe Kalibrierung wenn kein
interner Standard zugemischt wurde. Bei Zumischung eines immer gleichkonzentrierten internen
Standards wird bei der Auswertung immer auf die Fläche Fis dieser internen Standardkomponente
bezogen und natürlich ebenso auf die Volumen Vis gemäß Gleichung (15). Durch diese interne
Kalibrierung ist man unabhängig vom aufgegebenen Probenvolumen. Die interne Kalibrierung wird in
der GC wegen Unsicherheiten bei der Probenzufuhr gegenüber der externen bevorzugt.
Fi / Fis = f ( Vi / Vis ) (15)
mit Fi = Fläche der Komponente i; Fis = Fläche der internen Standardkomponente; Vi = Volumen der
Komponente i im Gesamtvolumen; Vis = Volumen der internen Standardkomponente im
Gesamtvolumen, f = Steigung der Kalibriergeraden (Responsefaktor).
ATL – 2
9
Die Analysenfunktion wird dann nach Vi umgestellt und ergibt das gesuchte Volumen der unbekannten
Probe nach Bestimmung der Flächen. 2.3. Literaturhinweise (in der PC-Bibliothek vorhanden)
1) H. Naumer, W. Heller, Untersuchungsmethoden in der Chemie, Thieme Verlag 1990. 2. Auflage
2) D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer Verlag Berlin 1996
3) G. Schomburg, Gaschromatographie, VCH-Verlag, 2. Auflage 1987
4) G. Schwedt, Analytische Chemie, Grundlagen, Methoden und Praxis, Thieme Verlag 1995
5) J. Böcker, Chromatographie, Vogel Buchverlag, 1997
2.4. Vorbereitende Fragen (schriftlich im Laborjournal!)
1) Welche Parameter werden in der GC zur Optimierung einer Trennung varriert und welche Gesetz-
mäßigkeiten kommen zur Anwendung?
2) Wie kann man die Totzeit in der GC mit einem FID bestimmen?
3) Warum sind asymmetrische Peaks unerwünscht und wie lassen sich diese vermeiden?
4) Wie sehen die beiden GC-Chromatogramme an derselben unpolaren stationären Phase aus, a)
wenn Sie 2 Kohlenwasserstoffe mit unterschiedlichen Siedepunkten und b), wenn Sie 2
Komponenten mit dem gleichen Siedepunkt, aber unterschiedlichen Polaritäten trennen wollen?
3. Praktische Durchführung 3.1. Geräte und Chemikalien
Hewlett Packard 5890A Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor (FID), Autosampler und PC-Auswertesystem HP 3365 – ChemStation – Series II
Dünnfilm-Quarzkapillarsäule "Permaphase" Rtx-5 (OV-5), Länge 30 m,
Innendurchmesser 0.32 mm, Filmdicke 0.3 μm,
EPPENDORF Mikroliterpipette ( 100-1000 µL )
5 Maßkolben (10 mL) enthalten die 2 Komponenten und den internen Standard für die Kalibrierreihe
1 Maßkolben (10 mL) Test-Probe: Enthält alle Komponenten 1:10 gelöst in n-Hexan
(je 0,5 mL/10 mL)
1 Maßkolben (10 mL) X-Probe. Enthält die beiden ausgewählten Komponenten aus der Kalibrierreihe
in unbekannter Konzentration und den internen Standard mit 0,5 mL
Kohlenwasserstoffe (Komponenten: Toluol, Cumol, o-Xylol, p-Xylol, Mesitylen, iso-Octan 1:10 gelöst
in n-Hexan
3.1.1.Geräteeinstellungen:
Die Einstellungen für die Ofen-, Injektor- und Detektortemperatur, sowie die Analysezeiten werden
automatisch vom Rechnersystem an den Gaschromatographen übermittelt.
Injektionsvolumen: 0,1 - 0,5 μL wird im Programm eingestellt.
Injektortemperatur: 250 °C wird im Programm eingestellt
Detektortemperatur: 250 °C wird im Programm eingestellt
Optimale Ofen-Temperatur: wird während des Praktikums bestimmt.
3.2. Vorbereitung der Messlösungen: 3.2.1.Kalibrierlösungen
Es stehen 5 Kalibrierlösungen bereit, in denen sind jeweils zwei der 7 Stammkomponenten von 0,1 bis
0.9 mL in 0,2 mL Intervallen (siehe dazu 3.1) enthalten. Als internen Standard wird aus den
ATL – 2
10
Stammlösungen noch eine dritte Komponente mit konstant 0,5 mL hinzugesetzt. Aufgefüllt wurde mit
n-Hexan. Die Kalibrierlösungen, die Test-Probe sowie die X-Probe (siehe 3.1) sollen mit
Pasteurpipetten in Vials überführt und verschlossen werden. Die Vials sind entsprechend zu
kennzeichnen.
3.3. Durchführung:
3.3.1. Das Einschalten des GC und eine Einweisung erfolgt während des Praktikums
3.3.2. Temperatureinflüsse / Temperaturprogramm
Injektorblock-Temperatur Die Einspritzzone sollte heiß genug sein, um die Probe so schnell zu verdampfen, dass keine
Substanzverluste aufgrund der Einspritztechnik entstehen. Bei zu rascher Aufheizung der
Spritzennadel verdampft das meist leichter siedende Lösemittel schneller, so dass hochsiedende
Komponenten in der Kanüle zurückbleiben und auskristallisieren (Diskriminierung). Als Faustregel gilt:
Die Injektorblocktemperatur ist ca. 50 K höher zu wählen als der höchste Siedetemperatur unter
Berücksichtigung der vom Gerätehersteller angegebene Maximaltemperatur des Injektors bzw. seiner
Bestandteile (Septum etc.).
Detektor-Temperatur Der Detektor und die Verbindungen vom Säulenausgang zum Detektor sollten genügend hohe
Temperatur aufweisen, so dass Kondensationen mit Sicherheit vermieden werden; sie soll mindestens
so hoch sein wie im Injektor. Als Faustregel gilt auch hier das bereits beim Injektor gesagte.
Die Säulentemperatur wird während des Praktikums bestimmt.
3.3.3. Aufnahme der Chromatogramme
In diesen Teil der Durchführung wird isotherm gearbeitet, d.h. die Ofentemperatur bleibt während der
Analysenzeit konstant. Es werden jeweils Chromatogramme bei 3 verschiedenen Temperaturen
(90 °C / 120 °C / 150 °C) aufgenommen. Die Einstellungen am Gaschromatographen bzw. am
Rechnersystem erfolgen während des Praktikums unter Anleitung des Hochschullehrers oder des
Assistenten. Der Gaschromatograph ist messbereit wenn in der Anzeige am Gerät <Ready>
erscheint, oder im Rechnerprogramm <Ready> erscheint. Jetzt kann bei der entsprechenden
Säulenofentemperatur das erste Chromatogramm aufgenommen werden. Nach Analysenende wird
die Ofentemperatur am PC auf 120 °C erhöht und bei Temperaturkonstanz (<Ready> Signal) das
nächste Chromatogramm aufgenommen. Für das Chromatogramm bei 150 °C wird analog verfahren.
Die Temperatur, bei der die beste Trennung erfolgt d.h. basisliniengetrennte Peaks in möglichst kurzer
Zeit, wird zur quantitativen Analyse eingestellt. Auf einen Temperaturgradienten wird verzichtet. Es
soll aber diskutiert werden, wie über einen Temperaturgradienten die Trennung weiter optimiert
werden kann.
Bevor die quantitative Analyse nach der Methode des internen Standards beginnt, wird die Totzeit tm
durch Einspritzung von Stadtgas bestimmt.
4. Auswertung 4.1. Identifizierung der Substanzen
Anhand der Siedepunkte der einzelnen Kohlenwasserstoffe aus dem MERCK-Katalog. Warum?
ATL – 2
11
4.2. Bestimmung der chromatographischen Kenngrößen
Aus dem optimierten Chromatogramm sind für jede der sieben KW-Komponenten folgende Mess-
größen zu ermitteln (vgl. Abbn. 7 und 8, ATL-1):
tms = Bruttoretentionszeit
tm = Totzeit, Durchbruchzeit
ts = Nettoretentionszeit
h = Peakhöhe
W 0.1 = Basisbreite der Peaks bei 0,134 h
W 0.5 = Basisbreite der Peaks bei 0,5 h
a 0,1 ; b 0,1 = Asymmetrieabschnitte bei 0,134 h
und daraus nach Gln. 7 bis 14 die folgenden chromatographischen Kenngrößen zu berechnen:
k = Kapazitätsfaktor
AF = Asymmetriefaktor
r () = Trennfaktor
R = Auflösung
N, Neff = Trennstufenzahl (theoretisch, effektiv)
H, Heff = Bodenhöhe (theoretisch, effektiv); (Länge der Säule: 3000 cm)
4.3. Quantitative Bestimmung
4.3.1. Bestimmung der Responsefaktoren
Die Messlösungen enthalten einen inneren Standard, um eventuelle Ungenauigkeiten beim
Einspritzen auszugleichen. Mittels den Volumina und der gemessenen Peakflächen lassen sich die
Responsefaktoren für die verschiedenen Komponenten berechnen. Berechnung der
Responsefaktoren fi :
i is
iis i
F Vf =
F V (16)
mit fi = Responsefaktor der Komponente i, Fi = Peakfläche der Komponente i, Fis = Peakfläche des
inneren Standards, Vi = Volumen der Komponente i, Vis = Volumen des inneren Standards
Der Responsefaktor lässt sich auch graphisch ermitteln, indem man den Quotienten der Flächen über
den Quotienten der Volumina aufträgt und daraus die Steigung ermittelt gemäß (15):
Fi / Fis = f ( Vi / Vis ) (15)
4.3.2. Quantitative Bestimmung der unbekannten Probe cp
Mittels des Volumens des inneren Standards, den Peakflächen und den Responsefaktoren lassen
sich die Volumina der beiden unbekannten Probenkomponenten berechnen.
Berechnung des jeweiligen Volumens Vp in der Probe:
i is
Pis i
F VV =
F f
Alternativ wird für jede der beiden unbekannten Probenkomponenten eine grafische Auswertung über
EXCEL mit Gleichung (15) erstellt. Aus den sich ergebenden Geraden wird in die Analysenfunktion
umgestellt berechnet und das Ergebnis mit der rechnerischen Auswertung verglichen.
Stand: 11.03.14
Vp = Volumen der Komponente i in der Probe
Vis = 0,5 mL in der unbekannten Probe
ATL - 3
1
Spektralfluorimetrische Untersuchung von Natrium-Fluorescein 1. Aufgabenstellung 1.1. Aufnahme des Absorptions- und Emissionsspektrums von Natrium-Fluorescein: Bestimmung des
Maximums der Anregungs- und Emissionswellenlänge 1.2. Auffinden des linearen Bereichs der Fluoreszenz durch Auftragung der Fluoreszenz-Intensität in
Abhängigkeit von der Konzentration und Erstellung einer Kalibriergeraden und Funktionsgleichung für den Linearbereich
1.3. Quantitative Bestimmung einer unbekannten Natrium-Fluoresceinprobe 2. Theoretische Grundlagen 2.1. Einführung in die Spektroskopie Die Energiezustände der Materie sind quantisiert (diskontinuierlich) und bestehen aus Coulomb-Wechselwirkungen zwischen Atomkernen und Elektronen, Bewegungsenergien der Elektronen und der Atomkerne sowie Wechselwirkungen magnetischer Momente (Kern- und Elektronenspins, Bahn-drehimpuls). Die Bewegungen der Elektronen und der Kerne sind nach der BORN-OPPENHEIMER-Näherung unabhängig voneinander. Die Gesamtenergie EGes setzt sich gemäß Gleichung (1) aus mehreren Anteilen zusammen: EGes = Eel + Evib + Erot + Etrans + Emagn (1) mit elektronischer Energie Eel (kinetische Energie der Elektronen und potentielle Energie der Elektronen/Kern-Anziehung und Kern/Kern sowie Elektron/Elektron-Abstoßung), Schwingungs-, Rotations- und Translationsenergie sowie Wechselwirkung mit externen Magnetfeldern Emagn und Eel > Evib > Erot > Etrans > Emagn. Alle Energiearten sind dabei quantisiert (Translation ist quasi-klassisch d.h. kontinuierlich) und die Anzahl möglicher Energieniveaus in Molekülen ist unterhalb der Ionisierungs-energie unbegrenzt. Der tiefstmögliche Energiezustand heisst Grundzustand (elektronischer Grundzu-stand und Nullpunktschwingungsenergie), alle anderen sind angeregte Zustände. Die möglichen Energiewerte (= Eigenwerte) lassen sich quantenmechanisch durch Lösen der SCHRÖDINGER-Gleichung berechnen über E mit HAMILTON-Operator , Wellenfunktion und Energie E.
E = ha
b
c
Abb.1.: Absorptions- und Emissionsspektren: a) Linienspektren bei Atomen; b) Molekülspektren mit
aufgelösten Schwingungsfeinstrukturen z.B. Moleküle in der Gasphase; c) Molekülspektren ohne Feinstruktur für Moleküle in Lösung
ATL - 3
2
Absolute Energien sind nicht messbar, wohl aber Energiedifferenzen E zwischen verschiedenen Energiezuständen. Das Prinzip der Spektroskopie ist in Abb. 1 dargestellt. Dabei muss als notwendige (aber nicht hinreichende) Bedingung die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung so gewählt werden, dass die Energie h der Energiedifferenz E zwischen zwei Energieniveaus entspricht (PLANCK Beziehung). Ist diese sogenannte Resonanzbedingung nicht erfüllt, wird keine Energie der elektromagnetischen Strahlung absorbiert. Diese Energiedifferenzen haben für die verschiedenartigen Wechselwirkungen unterschiedliche Größenordnungen, folglich unterschiedliche spektrale Bereiche, in unserem Versuch zur Elektronenanregung der UV-Vis Bereich 200-750 nm mit = 3x1014 bis 3x1016 Hz bzw. 105 bis 107 J/mol, für die NMR-Spektroskopie zum Umklappen von Kernspins reichen dagegen energieärmere Radiowellen mit = 3x106 bis 3x108 Hz bzw. 10-3 bis 10-1 J/mol aus. Das elektromagnetische Spektrum reicht von energiereichen -Strahlen über den UV-Vis-Bereich bis hin zu den Hörfrequenzen. Die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung ist dabei direkt und die Wellenlänge indirekt proportional zur Energie einer elektromagnetischen Welle, der Zusammenhang zwischen Wellenlänge und Frequenz bildet die Lichtgeschwindigkeit c mit c = . Dabei ist die Licht- oder Wellenausbreitungsgeschwindigkeit c abhängig vom Ausbreitungsmedium mit co (Vakuum) > c (Medium mit Brechungsindex n > 1) und c = co/n. Der Brechungsindex n ist über das SNELLIUS Brechungsgesetz definiert und von der Wellenlänge abhängig (Dispersion, vgl. Prisma). Mono- bzw. polychromatisches Licht besitzt nur eine bzw. viele Wellenlängen, kohärentes Licht hat nur eine Phasenlage und polarisiertes Licht schwingt nur in einer Ebene (linear polarisiert) bzw. dreht sich gleichförmig um die Ausbreitungsrichtung (zirkular polarisiert). Experimentell zeigt sich, dass nicht alle denkbaren Übergänge zwischen Energieniveaus „erlaubt“ sind, es gibt quantenmechanisch „erlaubte“ und „verbotene“ Übergänge, die durch Auswahlregeln bestimmbar sind und sich häufig aus der Symmetrie der Wellenfunktionen ableiten lassen. Die quantenmechanische Formulierung sagt aus, dass das Übergangsmoment 1,2, das die Veränderung des Dipolmomentes während des Übergangs repräsentiert, ungleich Null sein muss. Z.B. ist es in der Mikrowellen- oder Rotationsspektroskopie notwendig, dass ein permanentes elektrisches Dipolmoment vorhanden ist und in der Infrarot- oder Schwingungsspektroskopie muss sich das Dipolmoment durch die Vibration ändern. Zur Anregung von Elektronen im UV-Vis-Bereich treten die elektromagnetischen Lichtwellen mit den bewegten Elektronen in Wechselwirkung, damit verändert sich ebenso das elektrische Dipolmoment des Moleküls. Die Oszillatorenstärke f ist hierbei ein Maß für die Stärke der Kopplung mit dem elektromagnetischen Feld des Lichtes. Die Lichtabsorption hängt von der Anzahl der „getroffenen“ Moleküle ab, also von der Schichtdicke und der Konzentration. Dabei verringert sich die Intensität (Amplitude) der absorbierten Lichtwelle beim Küvettendurchgang exponentiell und wird durch das LAMBERT-BEER Gesetz quantitativ beschrieben: = o10-cd oder = lg o/ = cd mit Extinktion (optische Dichte OD, engl.: absorbance A), molarer Extinktionskoeffizient , Konzentration c und Schichtdicke d. und sind auch wie der Brechungsindex eine Funktion der Wellenlänge. 2.2. UV-Vis-Absorption, Fluoreszenz und Phosphoreszenz Im UV-Vis-Bereich werden bei Molekülen neben Rotationen und Schwingungen bindende ( und ) und nichtbindende (n) Elektronen in antibindende Zustände (*) angeregt. Mögliche Übergänge bei Resonanz sind *, *, *, *, n* und n*, wobei aus Symmetriegründen die Übergänge * und n* sehr unwahrscheinlich und daher quantenmechanisch „verboten“ sind.) Bei konjugierten - und mesomeriestabilisierten n--Elektronensystemen wird die notwendige Anregungsenergie dieser Valenzelektronen immer geringer und die Absorptionsbanden verschieben sich immer weiter zu größeren Wellenlängen (Rotverschiebung oder bathochromer Effekt).
ATL - 3
3
SoSo
T1
S1
ISC
o1234
o
234
sD
1
A F
P
Abb.2.: JABLONSKI-Diagramm von gelöstem Anthracen (in Cyclohexan) mit den Schwingungszu-
ständen 1, 2, 3 und 4 im elektronischen Singulett-Grundzustand So und den beiden angereg-ten Zuständen Singulett S1 und Triplett T1 sowie den entsprechenden Absorptions- (gestrich-elt) und jeweils langwellig verschobenen Emissionsspektren; A. Absorption; sD: strahlungs-lose Desaktivierung; F: Fluoreszenz; ISC: Intersystem Crossing; P: Phosphoreszenz
Genauer betrachtet erfolgt die Anregung aus dem elektronischen Singulett-Grundzustand So im Schwingungsgrundzustand o (bei 25oC sind Schwingungen kaum angeregt) innerhalb von 10-15 s in den elektronisch ersten angeregten Singulettzustand S1 und dazugehörenden Schwingungszu-ständen. Diese Anregung ist ein „erlaubter“ Vorgang (großes ) im Gegensatz zur Anregung in den Triplettzustand T1, der quantenmechanisch „verboten“ ist (sehr kleines , Abb.2, oben). Bevor die angeregten Elektronen wieder in den Grundzustand So zurückkehren, erfolgt zunächst innerhalb von ca. 10-12 s eine strahlungslose Desaktivierung sD der höheren Schwingungszustände in den Schwin-gungsgrundzustand o des angeregten S1-Zustandes. Die Fluoreszenz F kann jetzt aus dem niedrigsten Schwingungszustand o in S1 zu verschiedenen Schwingungszuständen in So innerhalb von 10-8 bis 10-5 s erfolgen. Die Energiedifferenzen bei der Emission sind grundsätzlich kleiner als bei der Absorption und mit Ausnahme des (o,o)-Übergangs sind deshalb die Emissionsspektren im Vergleich zu den Anregungsspektren bathochrom verschoben. Infolge von Lösungsmitteleinflüssen fallen aber oft selbst die (o,o)-Banden im Spektrum nicht zusammen. Diese Verschiebung ist analytisch allerdings vorteilhaft, da sonst das Fluoreszenzlicht von anderen, nicht angeregten Molekülen der gleichen Substanz reabsorbiert werden würde. Der Übergang von S1 nach S0 erfolgt bei den meisten Molekülen allerdings unter Wärmeabgabe d.h. strahlungsloser Desaktivierung. Ist dieser Schwingungsvorgang jedoch behindert, dann kann Licht in
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4
Form von Fluoreszenz emittiert werden. Eine allgemeine Regel für die Erfüllung dieser Voraussetzung gibt es nicht. Günstig bei organischen Molekülen sind starre Gerüste wie z.B. kondensierte Aromaten, Chinin in Schweppes oder überbrückte Triphenylmethanfarbstoffe (Abb.3), da dann die Umwandlung der Elektronenanregungs- in Schwingungsenergie erschwert ist.
O OH
COONa
O OH
COONa
O
Abb.3: Vergleich zweier Triphenylmethanfarbstoffe im protonierten Zustand: Phenolphthalein (nicht
fluoreszierend, pKs 9,5) und Fluorescein (pKs 6,2) Absorption und Emission im Singulettzustand laufen ab, ohne dass sich die Spinrichtung des betreffenden Elektrons ändert (Abb.2). Außer in Radikalen und vielen Übergangsmetallkomplexen liegen in Molekülen nur gepaarte Elektronen vor, deren entgegengesetzte Spins und magnetische Momente sich aufheben, d.h. sie sind diamagnetisch und der Gesamtspin S des Moleküls ist Null. Übergänge unter Spinumkehr sind quantenmechanisch sehr unwahrscheinlich und damit verboten. Manchmal, vor allem bei tiefer Temperatur in festen Stoffen, wird vom Singulettzustand S1 her unter Wärmeabgabe und Spinumkehr ein energetisch niedrigerer Triplettzustand T1 erreicht, in der Fachsprache Inter System Crossing (ISC) genannt. Auf Grund der beiden gleichgerichteten Spins der beiden ungepaarten Elektronen ist der Gesamtspin S = 1, d.h. das Molekül ist jetzt paramagnetisch. Zur Beschreibung elektronischer Zustände von Molekülen eignet sich die Multiplizität M = 2 S + 1, d.h. bei S = 0 liegt ein Singulett- bzw. bei S = 1 ein Triplettzustand mit den Multiplizitäten M = 1 bzw. M = 3 vor. Ein Radikal ist also elektronisch betrachtet ein Dublettzustand mit S = ½ und M = 2. Der Triplettzustand ist längerlebig, da der Übergang von T1So eine erneute Spinumkehr erfordert. Findet dieser T1So Übergang unter Lichtaussendung statt, so dauert die Emission nach dem Abschalten der Erregerstrahlung noch einige Zeit an, u.U. mehr als 10 s. Ein solcher Emissionsprozess heißt Phosphoreszenz. In der Praxis ist der Mechanismus der Emission oft unbekannt. Man spricht dann von Phosphoreszenz statt Fluoreszenz, wenn nach dem Abschalten des Erregerlichts die Lichtaussendung länger als 10-4 s andauert. 2.3. Herleitung der Auswerteformeln Der gesuchten Konzentration c proportional ist die Intensität IF des emittierten Fluoreszenzlichtes. IF kann höchstens so groß sein wie die zuvor von der Substanz absorbierte Intensität Iabs:
F abs F absI I und I K' I , K' 1.wobei (2)
Ist I0, die Intensität des eingestrahlten Erregerlichtes (Primärlichtes) und I die von der Probe durchge-lassene, d.h. nicht absorbierte Intensität, so ist Iabs = I0 - I. Der absorbierte relative Anteil von I0 ist dann nach Gleichung (3):
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5
abs 0
0 0 0
I I - I I 1 - I I I
(3)
Für den Ausdruck (I / I0) gilt aber nach dem LAMBERT-BEER Gesetz:
0
0
II - c d 10 oder E log c dI I
(4)
Daraus folgt:
Fabs
0 0
F 0
II K' 1 - 10 ,I I
- c dI K' I (1 - 10 )
c d
(5)
Die Fluoreszenzintänsität hängt also nicht linear von der Konzentration ab und strebt mit wachsendem c einem konstanten Endwert 0K' I zu gemäß Abb. 4.
Abb. 4. Graphische Darstellung von Gleichung 5
Entwickelt man die Gleichung (5) in eine Taylor-Reihe, so kann man diese für kleine Werte von . c . d mit genügender Näherung nach dem 1. Glied abbrechen und erhält eine lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von kleinen Konzentrationen c gemäß Gleichung (6): F 0I K I c d mit K = K' 2,303 (6) Im Bereich genügend kleiner Konzentrationen steigt IF also annähernd linear mit c. Um trotz kleiner Werte von c eine gut messbar hohe Intensität IF zu erhalten, macht man I0 groß. Man verwendet also eine möglichst intensive Lichtquelle. Das in den inneren Bereichen der Probe emittierte Fluoreszenz-licht kann auf seinem Weg nach außen von dem fluoreszenzfähigen Stoff selbst wieder reabsorbiert werden. Die aus der Küvette austretende Intensität IF wird dadurch verringert und zwar um so stärker, je höher die Konzentration ist. Der Vorgang entspricht der Selbstabsorption in der Flammenphotometrie und führt zu einer zusätzlichen Krümmung der fluorimetrischen Kalibrierkurve.
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2.4. Literaturhinweise (Lit. 1+2 in der PC-Bibliothek vorhanden) 1) D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Springer Verlag Berlin 1996 2) W. Schmidt, Optische Spektroskopie, Wiley-VCH-Verlag, 2. Auflage 2000 3) G. Schwedt, Analytische Chemie, Grundlagen, Methoden und Praxis, Thieme Verlag 1995 4) G. Schwedt, Fluorimetrische Analyse, Methoden und Anwendungen, Verlag Chemie, 1981 2.5. Vorbereitende Fragen (schriftlich im Laborjournal!) 1) Warum ist die Lebensdauer der Phosphoreszenz im Vergleich zur Fluoreszenz deutlich größer? 2) Welche Eigenschaften haben elektronische Dublett-Zustände? 3) Wodurch unterscheidet sich ein Spektrofluorimeter von einem UV-Vis-Spektralphotometer? 4) Weshalb wird die Na-Fluorescein-Lösung bei pH 7 gepuffert? 3. Praktische Durchführung 3.1. Geräte und Chemikalien
Analysenwaage Maßkolben Pipetten Wägeschiff Spritzflasche
3.2. Vorbeitung der Messlösungen Ansetzen des Puffers nach SÖRENSEN 1/15 mol/L Na2HPO4 = 11,86 g/L 1/15 mol/L KH2PO4 = 9,073 g/L Bei einen pH-Bereich von 7,0 bis 7,1 beträgt das Volumenmischungsverhältnis nach HENDERSON-HASSELBALCH mit pKs(H2PO4- , 25 °C) = 7,21: 61,1 Vol-% 1/15 mol/L Na2HPO4 und 38,9 Vol-% 1/15 mol/L KH2PO4 (nur bei 20 oC) Scanbereich: Anregungspektrum 400 bis 600 nm; Emissionsspektrum von 400 bis 650 nm
Herstellung der Na-Fluorescein-Stammlösung:.
C(Na-Fluorescein) = 10 -3 mol/L mit der Pufferlösung auf 1 L aufgefüllt.
Durch Aliquotieren von 10 mL der Stammlösung und Auffüllen auf 100 mL mit Phosphatpuffer wird
eine 10fach verdünnte Lösung hergestellt. Es soll so eine Verdünnungsreihe von 10-4 – 10-9 mol/L bei
Na-Fluorescein (insgesamt 6 Proben) aufgestellt werden.
3.3. Durchführung Die Anregung muss in einem Spektralbereich erfolgen, in dem die Substanz das Licht absorbiert, d.h. in dem sie einen endlichen Extinktionskoeffizienten hat. Hält man die Messwellenlänge am Emissionsmonochromator konstant (Abb. 5) und verändert die Anregungswellenlänge am Excitations-
Shimadzu RF 1501 Spektrofluorometer Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Di-Natriumfluorescein Quarzglasküvette (QS)
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monochromator, so ergibt sich das Anregungsspektrum. Es entspricht näherungsweise dem photometrisch gemessenen Absorptionsspektrum der fluoreszenzfähigen Substanz. Bei konstanter Anregungswellenlänge und Veränderung des Emissionsmonochromators misst man die spektrale Verteilung des emittierten Lichtes, das Fluoreszenz- oder Emissionsspektrum.
Bestimmung der maximalen Anregungs –und Emissionswellenlänge: Im Hauptmenü, (Abb. 6) die 1 drücken um ins Spektrum-Menü (Abb. 7.) zu gelangen. Im Spektrum Menü kann über die 1 zwischen Anregung (EX) oder Emissionsspectrum (EM). Zunächst jedoch sollte das Anregungsspektrum (EX) aufgenommen werden. Mit der 2 für (EX) bzw. 3 für (EM) den Scanbereich auf 400 – 600 nm festlegen. Alle Eingaben müssen immer mit der ENTER – Taste bestätigt werden. Die Scangeschwindigkeit mit der 4 auf schnell einstellen. Über die 5 werden nun noch die Werte des ordinaten Maximums und Minimums eingegeben. Für Max. 1000 für Min. 0. Über die Taste F4 in das Instrument Menü (Abb. 8.) wechseln. Dann für die einzelnen Punkte folgende Einstellungen vornehmen: Bandbreite EX/EM 10 nm, Response Auto, Empfindlichkeit hoch, Auto Shutter EIN. Mit der Return Taste zum Spektrum Menü (Abb. 7.) zurückkehren. Einmal die Auto Zero-Taste für den Nullabgleich drücken. Probe zur Bestimmung der maximalen Anregungs- und Emissionswellenlänge (10-6 mol/l) in den Probenaufnahmeraum stellen. Durch Drücken der Start/Stop Taste (Abb. 11.) wird der Scanvorgang begonnen. Sollte der max. Ordinatenwert eventuell verändert werden, kann der Wert im Spektrum Menü verändert und anschließend der Scanvorgang wiederholt werden. Über die F3-Taste (DatBearb) wählen sie die Peak-Pick. (1) Die Maxima werden angezeigt und können mit der Copy-Taste direkt ausgedruckt werden. Mit Return kehren sie zum DatBearb zurück und wählen Daten Drucken (3). Wählen sie die Anfangs- und Endwellenlänge so, dass ein Bereich von ca. 50 nm vor und hinter dem Maximum erfasst wird. Als Intervall ist 1 nm einzustellen. Der Ausdruck der Daten erfolgt nach der letzten Eingabebestätigung automatisch. Diese Prozedur wird für das Emissionsspektrum analog durchgeführt. Die maximale Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge werden aus dem Fluoreszenzspektrum entnommen. Dabei muss beachtet werden, daß die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge möglichst weit auseinander liegen sollten (sonst Streuung 1. Ordnung und keine Fluoreszenz). Kehren sie nun mit Return zum Hauptmenü zurück und wählen Quantitativ (2) (Abb. 6.) Geben sie nun die Anzahl der Standards, die vorher ermittelte Anregungs- und Emissionswellenlänge, die Einheit µM/l und als Wiederholungen 1 ein. Über die Taste-F2 (neue Eichkurve), gelangen sie nun in ein Tabellenmenü (Abb. 10.). Tragen sie dort die entsprechenden Konzentrationseinheiten z.B. 10-6 Mol/l = 1 µM/l usw. ein. Jetzt können sie erste Kalibrierlösung in die Quarzküvette füllen und in den Probenraum stellen. Die korrekte Konzentrationsreihenfolge ist unbedingt einzuhalten. Die Messung beginnt, indem die 2
Abb.5: Schematischer Aufbau eines Spektralfluorimeters: senkrechte Anordnung der Anregungs- und Emissionsstrahlung
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gefolgt von Start/Stop gedrückt wird. Die erste Messung wird nun durchgeführt. Nächste Kalibrierlösung einfüllen, einstellen und mit Start/Stop fortfahren usw. bis alle Konzentrationen gemessen wurden. Die Datentabelle kann dann über Copy ausgedruckt werden. Mit Hilfe der Daten der Verdünnungsreihe wird nun der Linearbereich der Fluoreszenz ermittelt indem die Messwerte entsprechend aufgetragen werden. Überlegen sie wie am Besten und warum !!! Innerhalb des ermittelten Linearbereiches wird eine eigene Konzentrationsreihe angefertigt, aus der dann die Kalibriergerade erstellt wird. Es wird dann analog verfahren wie zur Bestimmung des Linearbereichs.
Eingabefeld des RF 1501 Spektrofluometer (Fa. Shimadzu):
Abb. 6. Hauptmenü Abb. 7. Spektrum Menü
Abb. 8. Instrument Menü Abb. 9. Quantitativ Menü
Abb. 10. Tabellen Menü
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9
Abb. 11. Eingabefeld RF 1501 1 = Copy Taste - Ausdruck des LCD Schirms auf einen Drucker
(Screencopy) 2 = EX Goto Taste - Eingabe der Anregungswellenlänge 3 = Auto Zero Taste - Nullstellen der Fluoerszenzanzeige (Auto Zero) 4 = Return Taste - Rückkehrtaste – mit dieser Taste ist eine Rückkehr zum
letzen Menü möglich - Auch als Abbruchtaste verwendbar 5 = Shutter Key Taste - Durch Betätigen diese Taste kann der Verschluss
manuell bedient werden 6 = EM Goto - Eingabe der Emissionswellenlänge 7 = Start/Stop - Startet und beendet den Messvorgang 8 = F1 bis F4 Tasten - Funktionstasten zum LCD Bildschirm 9 = Zifferntasten 0 bis 9 - Eingabe von Zahlen 10 = Dezimalpunkt-Taste 11 = CE Taste - Löscht falsch eingegebene Zahlenwerte 12 = Cursor links/rechts Taste – Bewegen des Cursors nach links oder
rechts ; - die linke Cursor-Taste dient gleichzeitig als negativ (-) Eingabetaste 13 = Enter Taste - Übernimmt eingegebene Zahlenwerte in den
Arbeitsspeicher 4. Auswertung 4.1 Aufnahme des Absorptions- und Emissionsspektrums von Natrium-Fluorescein: Bestimmung des
Maximums der Anregungs- und Emissionswellenlänge Die Spektren sind jeweils in EXCEL grafisch darzustellen. Die beiden Maxima werden für die folgende Aufgabe benötigt und am Spektrofluorimeter eingegeben. 4.2 Auffinden des linearen Bereichs der Fluoreszenz
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Doppeltlogarithmische Auftragung (warum?) der Fluoreszenz-Intensität lg IF in Abhängigkeit von der Konzentration lg c von 10-4 bis 10-9 mol/L in EXCEL. Der lineare Bereich wird bestimmt. 4.3 Erstellung einer Kalibriergeraden und Funktionsgleichung für den Linearbereich Die Konzentrationen der Kalibrierung des linearen Bereichs sind herzustellen und zu vermessen. Die lineare Auftragung IF gegen c in EXCEL sollte eine Gerade ergeben. Die Kalibriergleichung wird in die Analysengleichung umgestellt d.h. nach c aufgelöst. 4.4 Quantitative Bestimmung einer unbekannten Natrium-Fluoresceinprobe Die unbekannte Probe muss im Kalibrierbereich liegen. Ist sie zu konzentriert, muss entsprechend verdünnt werden. Die gemessene Fluoreszenzintensität wird in die Analysengleichung eingesetzt und c berechnet. Diese Berechnung wird an der Kalibriergeraden grafisch überprüft. Stand: 17.03.15