genetica laboratorio..cariotipo!!!

8/3/2019 genetica laboratorio..cariotipo!!!

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Universidad Autónoma de Zacatecas

“Francisco García Salinas”

Unidad Académica de Ciencias

QuímicasQuímico Farmacéutico Biólogo

LABORATORIO DE GENÉTICA*CARIOTIPO HUMANO*

*Mónica Adriana Rodríguez Zavala

*Abraham López Arellano*Saraí Zúñiga Estupiñan

*Carlos Alberto Jasso Jasso

7º. Semestre Grupo “C”



OBJETIVOS

• Conocer y comprender la importancia de la técnica de

extracción y cultivo de leucocitos

•

Conocer y comprender la importancia de realizar un cariotipohumano

Laboratorio de Genética



INTRODUCCIÓN

Historia

Hoy en día sabemos que el número de cromosomas es característico de cada especie.

A mediados del siglo pasado surgió la citogenética; que tiene por objetivo el estudio de

los cromosomas y el de sus alteraciones.

El problema era que en la placa metafásica los cromosomas están juntos y es difícil

verlos por separado

Mediados del siglo XIX hasta mediados del siglo XX no se sabia el numero decromosomas del ser humano




• En 1960 Moorhead describió que los linfocitos sediferenciaban en la sangre periférica, pero que podía entrar

en mitosis en condiciones in vitro. Con este descubrimiento,

se realizo el cariotipo a partir de sangre periférica, lo que tuvo

varias ventajas:

• Es un tejido fácil de obtener.

• Permite la obtención de un gran numero de células con lo quese obtienen abundantes metafases.




Cultivo de leucocitos

El cultivo celular es elproceso mediante el

que células, ya seancélulas procariotas,

eucariotas ovegetales, pueden

cultivarse encondiciones

controladas.

Las células pueden

ser purificadas confacilidad de la sangresin embargo sólo los

leucocitos soncapaces de crecer en

cultivo.

Condicionesadecuadas paramantener un cultivo

celular:

• Temperatura

• pH

• Nutrientes

• Gases

Ante todo, deben guardarse las máximas

condiciones de esterilidad.Laboratorio de Genética



Cariotipo

• Cariotipo: conjunto ordenado de los cromosomas de un

organismo determinado, clasificados por su forma, tamaño y

estructura de bandas.

“Idiograma “de un cariotipo Laboratorio de Genética



Usos

• Mediante el cariotipo se pueden analizar anomalíasnuméricas y estructurales, cosa que sería muy difícil deobservar mediante genética mendeliana.

•

Esta variación proporciona la base para una gama deestudios que podría llamarse citología evolutiva.

• Pero usadas en conjunto con otros datos filogenéticos, elfisionamiento cariotipico puede ayudar a explicar

dramáticas diferencias en los números dipliodes entreespecies estrechamente relacionadas, que antes fueroninexplicables.




Clasificación de los cromosomas

Metacéntricos Submetacéntricos Acrocéntricos Telocéntricos




Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a su

longitud relativa y a la posición del centrómero, que define su morfología. De

esta manera, el cariotipo humano queda formado así:

Grupo A: Pares cromosómicos 1, 2 y 3. Cromosomas muy grandes, 1 y 3 metacéntricos; 2

submetacéntrico.

Grupo B:Pares cromosómicos 4 y 5. Cromosomas grandes y submetacéntricos.

Grupo C: Pares cromosómicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X. Cromosomas medianos

submetacéntricos.

Grupo D: Pares cromosómicos 13, 14 y 15. Cromosomas medianos acrocéntricos con

satélites.

Grupo E: Pares cromosómicos 16, 17 y 18. Cromosomas pequeños, metacéntrico el 16 y

submetacéntricos 17 y 18.

Grupo F: Pares cromosómicos 19 y 20. Cromosomas pequeños y metacéntricos.

Grupo G: Pares cromosómicos 21, 22, Y. Cromosomas pequeños y acrocéntricos (21 y 22 con

satélites).




• A partir de 1970 se comenzaron a realizar una serie de

tratamientos y tinciones a los cromosomas para identificarlos

mejor, que fueron las técnicas de bandeo, que las hay de dos

tipos:

Bandas de todo elcromosoma.

• Encontraremoscromosomas con bandas

alternantes (oscuras yclaras)

Bandas que tiñensolo determinados

puntos delcromosoma

• Bandas C: solo tiñen la heterocromatina.

• Bandas NOR: tiñe los satélites de los cromosomasacrocéntricos.

• Bandas T que marcan los telómeros para ver si falta alguno.




Bandas que se tiñen en los cromosomas

Bandas Q, dequinacrina.

Con esta tinción seobtienen unas bandas

alternantes, mas omenos fluorescentes.

Bandas G, de Giemsa.

Se obtiene un patrón debandas que permite

individualizar los

cromosomas yreconocerlos.




Materiales

• 1 jeringa de

5ml

• Frasco estéril

Equipo

• Campana de flujo laminar

• Incubadora a 37°C

Extracción y cultivo de leucocitos



REACTIVOS

• Medio de cultivo Mc coy

Este medio McCoy fue desarrollado originalmente para la

propagación de linfocitos humanos contiene los componentes

esenciales que imitan las condiciones óptimas para la

proliferación de las células.




• Fijador de Carnoy

El fijador de Carnoy es un fijador que contiene

cloroformo. Penetra en tejidos extremadamenterápido y pude fijar piezas de tejido de pequeñotamaño en minutos.

Contiene:

Etanol absoluto---------60 ml

Acido acético glacial----10 ml

Cloroformo-------------30 ml




• Fitohemaglutinina

• Las células deben encontrarse en división. Para ello, sehará la incubación de la muestra en presencia deproductos inductores de la mitosis (mitógenos), como es

el caso de fitohemaglutinina.

• La Fitohemaglutinina (PHA) del Phaseolusvulgaris aglutina hematíes y leucocitos; es capaz deunirse a oligosacáridos y estimula la mitosis en

diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos.




• Colchicina

• Es un fármaco antimitótico que detiene o inhibe la división

celular en metafase o en anafase. Es un compuesto que evita

el reparto de las cromátidas de un cromosoma durante

la mitosis, provocando la poliploidía de la célula filial, ya queaunque no haya separación, sí hay duplicación del material

genético.

•

Su efecto se debe a su acción sobre las proteínascitoesqueléticas del huso mitótico interfiriendo en la

polimerización de los microtúbulos del huso mitótico.




Medio hipotónico

• Con el objetivo de conseguir una buena

separación cromosómica, las células deben

someterse a choque osmótico.

• Para ello, se emplea un medio hipotónico

(0,075M KCl), que ocasiona el aumento de

volumen de las células.




Tinción

• Hay que proceder a la tinción de los cromosomaspara que sean identificables.

• En el cariotipo clásico se suele utilizar unasolución de Giemsa como tinción (específica paralos grupos fosfato del ADN) para colorear lasbandas de los cromosomas (Bandas-G).

• Cada cromosoma tiene un patrón característicode banda que ayuda a identificarla.







Tenerlo listo en unacampana de flujo

laminar.

Añadir al frasco 10

gotas de sangre +2.2mlfitohemaglutinina.

Incubar 72hrs. 37°C.




• CARIOTIPO HUMANO

Añadir 0.25ml

colchicina,incubar 1 hr/37°C.

Pasar cultivo a untubo cónico.

Centrifugar 2000rpm. Decantar.




Añadir 2mlKCL yhomogenizar.

Añadir 3ml KCLy re suspender.

Incubar a 37°C

por 20 min.

Centrifugar 2000rpm . 5 min. Ydecantar.

Añadir 2ml desolución Carnoy.Re suspender , ycompletar hasta8ml,

homogenizar.




Centrifugar2000 rpm,5 min. Ydecantar.

Adicionar 2mlde Carnoy.Incubar 4°Cpor 24 hrs.

Llevar hasta 5mlcon Carnoy.

Centrifugar 2000rpm. 5 min. Y

decantar.

Resuspender en0.5ml de Carnoy.




En un portaobjetoslavado con alcoholdejar caer gotas de lamuestra de unaaltura considerable

El goteoexpandirá yromperá lascélulas

Dejar secar alaire




Realizar una tinciónde giemsa

Observar almicroscopio




RESULTADOS

• La tinción permitió observar loscromosomas en el proceso de división

celular.

• Se puede apreciar las diferencias de

tamaño y formas.

• Estas diferencias son las que permitenagrupar los cromosomas con

características similares, es decir

realizar el cariotipo.

Estos resultados son los que

se esperarían observar.




Discusión

• Al realizar la observación en el microscópio nopudimos visualizar los cromosomas debido aque faltó que las células se hincharan aun

más, por lo que nuestros resultados no fueronlos esperados.

•

Para un mejor resultado tendríamos querealizar la técnica nuevamente poniendoespecial cuidado en este paso.




Conclusión

• El cariotipo es una herramienta muy útil almomento de analizar anomalías numéricas yestructurales.

•

Y con ello ayudar a diagnosticar numerosasenfermedades genéticas.

• En un cariotipo encontramos el conjunto decaracterísticas que permiten reconocer la

dotación cromosómica de una célula.• Permitiendo identificar y separar especies.




Referencias

• Robert L., Nussbaum; Roderick R. McInnes; Huntington F. Willard (2008). «Capítulo 5: Principios decitogenética clínica» (en castellano). Thompson & Thompson. Genética en Medicina (7ª edición).Barcelona: Elsevier Masson. pp. 68-75

• Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas versión impresa ISSN 0864-0300 Rev Cubana Invest Bioméd v.24 n.1 Ciudad de la Habana ene.-mar. 2005 Instituto de Nutrición e Higiene de los AlimentosEfecto inmunomodulador de la fitohemaglutinina dePhaseolus vulgaris Dr. Vladimir Ruiz Álvarez, Dra.María de los Ángeles Boffill Cárdenas, Dra. Olga Lidia González González, Dra. Maira Masjuan del Pino y

Téc. Freisman Blanco Machado.• http://www.euita.upv.es/varios/biologia/tecnicas_de_histologia_vegetal/Documentos/Fijadores_quimicos

.htm

• http://www.laboratoriomicrovet.com/medios/mccoy.html


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