Upload
maleah
View
73
Download
0
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
GENETICA FUNCIONAL. Estudio de la expresión de genomas completos. GENETICA FUNCIONAL. Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement The Chipping Forecast. GENETICA FUNCIONAL. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
GENETICA FUNCIONAL
Estudio de la expresión de genomas completos
GENETICA FUNCIONAL
Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, SupplementThe Chipping Forecast
GENETICA FUNCIONAL1) El entendimiento de los sistemas biológicos constituidos por miles de genes requiere la organización de las partes según sus propiedades:
+ Similaridad de secuencia de DNA en las regiones codificantes y reguladoras+ Variaciones polimórficas entre especies y subgrupos+ Tiempo y lugar de expresión de los RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones fisiológicas y/o patológicas.+ Localización subcelular de los productos génicos.
2) Este entendimiento precisa el desarrollo de técnicas de "visión global" de los procesos biológicos: estimación simultanea de todos los componentes.
+ DNA chips (o DNA microarrays)+ Serial Analysis of Gene Expresion (SAGE)+ Differential Display (Expresión diferencial).
3) Estas técnicas permiten estudiar en paralelo los niveles de expresión de muchos genes y generan información estática (donde se expresa un gen) y dinámica (como se relaciona la expresión de unos genes con otros).
DNA Chips o DNA Microarrays1) Evolución histórica:
+ Técnica de Shouthern: "Las moléculas de ácido nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse para extraer información de muestras de de ácidos nucleicos fijadas a un soporte sólido": Técnicas de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc.
+ Fijación de clones individuales de forma ordenada en filtros para localizar los clones deseados e investigar patrones de expresión de genes.
2) Innovaciones clave:A) Utilización de soportes sólidos no-porosos, que permiten la miniaturización y la detección fluorescente.
+ Pueden inmovilizarse de forma automática hasta 10.000 cDNAs en un soporte microscópico e hibridarlo con sondas marcadas.
B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a alta densidad, de oligonucleótidos en dichas superficies. + Mediante técnicas fotolitográficas: matrices con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno confinado en una región de 20 µm2
+ Mediante la colocación in situ de los reactivos de síntesis por dispositivos similares los utilizados en las impresoras de chorro de tinta.
3) Usos propuestos:A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.
+ cDNA arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.+Oligonucleotide arrays: Idem pero por síntesis in situ de oligonucleótidos
B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide Polymorfisms).+ Oligonucleotide arrays: Para secuenciación en paralelo.
Affymetrix
Chip de vidrio
cDNA microarray schema
Impresión o “espoteo”
• Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio
Pen microarray robot
Pen microarray robot
Estación automátic
a de hibridación
Modelo de DNA array
Light directed oligonucleotide synthesis
Light directed oligonucleotide synthesis
Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor Animation.Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor Cinepak.
40,000 genes en una única matriz
Usos propuestos para los DNA Chips o DNA Microarrays
A) Análisis de niveles de expresión de RNAs.+ cDNA o oligonucleotide arrays: Producidas
por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos.
B) Secuenciación+ Oligonucleotide arrays
C) Genotipado+ Oligonucleotide arrays
cDNA microarray
co-hybridization of cDNAs to DNA microarray
Blank-not expressed
Yellow- expressed inBoth, culture and infection
Green- expressed in infection only
Red- expressed in culture only
RNA binds to corresponding gene
Bacteria from sit of infection.Label cDNA from bacteria with green Cy5 dye
Bacteria grown in cultureLabel cDNA from bacteria with red Cy3 dye
Simulación de detección
Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y deun descompresor Animation.
An hybridized microarray
cDNA Microarrays Quantitation
cDNA Microarrays Detection Limits
Estrategias de secuenciación con chips de DNA
Oligonucleótidos utilizados en secuenciación por ganancia de señal
Sequence analysis arrays
Secuenciación y genotipado
Secuenciación y genotipado
Genotipado
Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar 3.000 loci bialélicos
SAGE
Serial Analysis of Gene Expression
SAGE
• Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o 10 pares de bases contiene suficiente información para identificar un transcrito.
Ligate and amplify with primers A and B
GGATGCATGXXXXXXXXXCCTACGTACXXXXXXXXX
OOOOOOOOOCATGCATCCOOOOOOOOOGTACGTAGG
Primer BPrimer A
TE AE Ditag TEAE
CATGXXXXXXXXXGTACXXXXXXXXX
OOOOOOOOOCATGOOOOOOOOOGTAC
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
OOOOOOOOOCATGOOOOOOOOOGTAC
AE
Ditag
AETag 1 Tag 2
Ditag
AETag 3 Tag 4
Isolate Ditags. Concatenate and clone
XXXXXXXXXGTACXXXXXXXXX
OOOOOOOOOCATGOOOOOOOOO Primer BCATCC
GTACGTAGGPrimer A CCTAC
GGATGCATG
Cleave with anchoring enzyme
GGATGCATGXXXXXXXXXCCTACGTACXXXXXXXXXPrimer A GGATGCATGOOOOOOOOO
CCTACGTACOOOOOOOOOPrimer B
TE AE Tag TE AE Tag
Cleave with tagging enzyme (TE). Blunt Ends
AAAAATTTTT
CATGGTAC
AAAAATTTTT
CATGGTAC
AAAAATTTTT
CATGGTAC
AAAAATTTTT
CATGGTAC
Divide in half Ligate to linkers (A+B)
AE is Nia IIITE is Fok I
AAAAATTTTT
AAAAATTTTT
AAAAATTTTTAAAAATTTTT
GTAC
GTAC
Cleave with anchoring enzyme (AE)Bind to streptavidin beads