1 

 

Södertörns Högskola 

 

 

 

 

Population genetic structure and connectivity of the abundant sea urchin, Diadema setosum around 

Unguja island (Zanzibar)                                                                                                                      

 

       

 

 

 

 

 

       Uppsats VT 2009 

     Författare:Josefine Larsson 

Handledare: Oskar Henriksson & Mats Grahn 

  

2 

 

Abstract 

The distribution and abundance of many coral reef organisms are affected by their predator’s distribution and abundance. Loss of predators may cause a shift in species compositions that will cascade down to other ecological processes on the reef. One example of a shift like this is the growing sea urchin populations inhabiting the coral reefs of East Africa. Areas with high fishing pressure often have large populations of sea urchins. The large populations of sea urchins have a negative impact on the reef ecology both by their grazing and bio‐erosion as well as on fish growth and the recovery of fish populations. Previous population genetic studies conducted on Diadema setsosum, using mtDNA and allozymes, found genetic structuring between populations on a large geographical and evolutionary scale. The aim of this study was to examine the genetic population structure of the sea urchin Diadema setosum, at four sites around Zanzibar. We used the amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique, a fast and effective method with high resolution. The long term objective is to understand the migration pattern and colonization of D. setosum to facilitate possible management actions. We found a significant genetic structuring of D. setosum hence the populations can not be considered panmictic. The reason behind this structure does not seem to be based on the geography nor size. One possible explanation might be that the structure lies on a larger geographical scale than we have studied, further studies around the Western Indian Ocean may reveal this. Another explanation may be that the structuring is due to differences in spawning time between the different phenotypes and an analysis of gonad maturations may give information about this. To find the reasons behind the observed genetic structure is of great importance for management of the sea urchins and therefore the management of whole reef ecosystems. 

 

Key words: Diadema setosum, population structure, Zanzibar, AFLP 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 

 

Table of Contents Introduction ......................................................................................................................................... 4 

Material and Methods ......................................................................................................................... 6 

Study area ................................................................................................................................................. 6 

Study sites ................................................................................................................................................. 7 

Sampling .................................................................................................................................................... 8 

Lab ............................................................................................................................................................. 9 

Morphological parameters ................................................................................................................... 9 

Dissection .............................................................................................................................................. 9 

Sex determination ................................................................................................................................. 9 

DNA extractions .................................................................................................................................... 9 

Quantifying DNA ................................................................................................................................. 10 

AFLP analysis ....................................................................................................................................... 10 

Data analyses .......................................................................................................................................... 11 

Results ............................................................................................................................................... 11 

Amplification and primer combinations .................................................................................................. 12 

Genetic variation ..................................................................................................................................... 13 

Discussion .......................................................................................................................................... 16 

Acknowledgements ........................................................................................................................... 18 

References ......................................................................................................................................... 19 

 

 

 

 

 

 

 

 

4 

 

Introduction 

The beautiful and highly diverse coral reef ecosystems are one of the most productive ecosystems on earths and they provide food and income for millions of people. The coral reef ecosystems are endangered, due to over‐exploitation, pollution, sedimentation and costal development (Wilkinson 2004). One large problem facing the coral reefs is overfishing, the excessive fishing cause problems for the whole reef ecosystem. One example of this problem is the large populations of sea urchins, inhabiting the coral reefs of East Africa. As the predator populations are decreasing due to the intensive fishing, the sea urchin population are increasing and causing a problem (McClanhan 1998). One of the most abundant species of sea urchins is the long spined Diadema setsoum (Leske). D. setsoum play a major role in the bentic ecology and the bio‐erosion of the coral reef as it has one of the highest bio‐erosion and herbivory rates among the sea urchins (Carrerio‐Silva and McClanahan 2001). 

The Tanzania coast and its islands are surrounded by fringing and patchy coral reefs including highly productive biotopes as mangroves, sea grass beds and estuaries, with a high biodiversity of marine animals and plants. The people of this area utilize marine ecological goods and services (fish is one of the most important resources) for survival and as a source of income. The demand for these goods and services has increased and the extensive utilisation of the coastal resources has negative impacts on the coastal ecosystem with the effect of a significant decline in the productivity and biodiversity of marine fisheries. The inshore fishing areas and several of the shallow reefs surrounding the coasts of Tanzania and Zanzibar are considered overexploited and degraded (Sesabo & Tol 1999, Jiddawi & Öhman 2002, Silva 2006). 

A population’s genetic variation and evolutionary potential are influenced by a number of factors; gene flow/exchange of alleles for example homogenizes allele frequencies as well as the degree of isolation and effective population size. Gene flow between populations in different geographically areas will be restricted by isolation by distance (Hardy & Vekemans 1999) hence, these populations will have different genetic structures due to random genetic drift (Carvalho 1993 and Herbert  2000). For benthic sessile organism the pelagic larval stage is a crucial step for connectivity and gene flow, given that the passive drift with ocean currents will assist the dispersal over both small and large geographical distances (Cowen & Sponaugle 2009). Consequently the duration of the larval stage is an important factor for how far an organism can spread; this determines the gene flow between populations (Strathmann 1978). Knowledge about gene flow and genetic structure among populations has important implications not only for ecology and evolutionary biology but also for conservation and management of biodiversity (Cowen & Sponaugle 2009).  

 The distribution and abundance of many coral reef organism’s are affected by their predator’s distribution and abundance and fish is one of the most important predators (Neudecker 1979, Wellington 1982, Hay et al. 1983, Hay 1984a,b, Lewis 1986, McClanahan 1989, McClanahan & Muthiga 1989 and Carreiro‐Silva & McClanahan 2001), high level of fishing will affect the whole coral reef ecosystem (Jiddawi & Öhman 2002). Consequently a loss of predators may cause a 

5 

 

shift in species compositions due to the fact that the competitive interactions (both intra and inter specific) will change in the absence of predators, cascading down to other ecological processes on the reef (McClanahan & Shafir 1990). One example of a shift like this is the growing sea urchin populations inhabiting the coral reefs. Reefs with a high level of fishing activities often have large populations of sea urchins (Hay 1984a and McClanahan & Muthiga 1988) because the major predators of the sea urchins; trigger fish (Balistid) and terminal‐male wrasses (Labridae) are being extensively fished (McClanahan 1995, 1998, 2000). The large populations of sea urchins have negative impact on the reef ecology by their grazing and bio‐erosion (Dumas et al. 2007) as well a negative impact on fish growth and the recovery of fish populations, even on reefs where the fishing is reduced or eliminated (McClanahan 1995). When the urchins feed on the reef they remove a large proportion of calcium carbonate and coralline algae, this is an important part of the turnover of the coral reef but when it is too extensive it will become destructive for the reef (Carreiro‐Silva & McClanahan 2001). The grazing of the sea urchin possesses yet another problem, increased sediment production, which has a negative impact on corals and coralline algae. This together with destructive fishing methods will reduce the abundance and diversity of corals (McClanahan & Arthur 2001). Sea urchins of the genus Diadema is one the most abundant and wide spread sea urchin genus (Lessios et al. 2001). The long‐spine sea urchin, Diadema setosum is one of the most abundant species on coral reefs in East Africa (Carreiro‐ Silva & McClanahan 2001).  The echinoderms are dioecious and have a high dispersal life‐history with high fecundity and external fertilization. The zygote develops into a pluteus larvae with a larval duration period, drifting as plankton, ranging from weeks to several months, before it undergo the metamorphosis to the adult (Miller & Harely 1999 and Addison & Hart 2004). The pelagic larval duration varies between 7 up to 36 weeks (depending on species) and consequently they can spread over long distances (Strathmann 1978). Ocean currents have a key role in the dispersal and connectivity of marine organism’s populations (Cowen & Sponaugle 2009). In the Western Indian Ocean (WIO) the South Equatorial Current, at approximately 10º south of the equator is the main oceanic current. Flowing from the east, by the northern part of Madagascar, it meet the coast of Africa where it splits into two, the north flowing east African coastal current and the south flowing Mozambique current (Richmond 2002). Knowing the pattern of dispersal and connectivity can also help us to find source and sink populations, which are very important for management as managing a sink population is ineffective. A source population is a population where reproduction exceeds mortality and an excess of individuals dispersing to sink populations where mortality exceeds local reproduction. A sink population is dependent on individuals from a source population to keep the population (Pulliam 1988 and Watkinson & Sutherland 1995). Unfortunately there is not enough information about the dispersal patterns distances of threatened or invasive species and many management efforts and approaches are based on assumptions about these topics (Jones et al. 2007).   There are different methods available to measure connectivity; the methods can be divided into direct and indirect methods/approaches (Robertson 2001). Direct approaches can be tag 

6 

 

and re‐capturing of individuals or in situ observation etc. The indirect methods are geochemical, biophysical analysis and analysis using genetic markers, the strength with the indirect methods is that they can give answers about a population’s connectivity between multiple populations as all individuals in the populations are marked. This will help us to understand the migration patterns between populations (Cowen & Sponaugle 2009).   

In population genetics, there are a number of genetic methods available, for example, microsatellites, mitochondrial DNA (mtDNA), allozymes and methods based on specific genes. Other population genetics studies on sea urchins have used allozymes, mtDNA and microsatellites as genetic markers (Lessios et al. 1996, Lessios & Pearse 1996, Lessios et al. 1998, Lessios et al. 1999, Lessios et al. 2001 and Addison & Hart 2004). The disadvantages with these methods are that microsatellites demands a fairly high amount of time and molecular skills to develop (Mueller & Wolfenbarger 1999) and allozymes and mtDNA have a low level of polymorphism and therefore a comparatively low resolution (Bernatchez et al. 1998 and Mueller & Wolfenbarger 1999). AFLP estimates the diversity of the genome, by detecting genomic restriction fragments, dominant genetic markers, amplified in a polymerase chain reaction (PCR). To obtain an optimal number of fragments, specific primers are used (Vos et al. 1995). This method is very quick and efficient method that generates hundreds of markers from a small amount of DNA, it has a high resolution in detecting genetic structures among populations. It is a good rigid technique for analysis of population structure and differentiation, including estimating Fst values (Mueller & Wolfenbarger 1999 and Bensch & Åkesson 2005).  

Knowledge about the gene flow enables the understanding of the connectivity patterns and dispersal distances of sea urchins. This knowledge is an important factor when assessing management strategies. To asses the scale on which gene flow lies we will try find out if the cohort recruitment is from single or multiple sources. A cohort is individuals that are of the same age. One can assume that individuals with the same size class are of the same age, hence recruited at the same time. By sampling within size classes one will sample cohorts. 

Consequently, the overall aim of this study was to investigate if the genetic structure of the population of the sea urchin, Diadema setosum, around Ungjua island (Zanzibar) is panmictic or structured. A second objective was to asses the scale on which the gene flow lies‐ if the cohort recruitment is from single or multiple source. The long term objective of this study is to understand the migration pattern and colonization of Diadema setosum to facilitate possible management actions. To examine the population structure of the sea urchin Diadema setosum we have chosen the amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique. 

Material and methods 

Study area 

In the Tanzanian archipelago there are three large islands; Pemba, Unguja (Zanzibar) and Mafia Island and three small islands; Misali (west of Pemba) and Mnemba and Chumbe (off the coast of Unguja) these islands are together named Zanzibar (Silva 2006). Approximately 8 million 

people (25% of the Tanzanian population) live around the coast of Tanzania and approximately 1 million people live on the islands of Zanzibar (Silva 2006). Unguja island ( 6º09’57,63”S, 39º22´49,62”E ,Google earth, 2009), the largest island of Zanzibar, is located in the Western Indian Ocean (WIO), 35 km off the coast of Tanzania. The Tanzanian coast as well as the islands is surrounded by well developed fringing coral reefs (Bergman et al. 2001). The high diversity of the reefs around Zanzibar is due to the South Equatorial Current that pass by the African continental shelf, the current intersects with Zanzibar and the islands function as recipients of nutrients as well as “larvae and other genetic material” (Johnstone et al. 1998).The west coast of Zanzibar is more protected, without the prevailing winds and strong currents, while the east coast have a high energy coast line with strong winds, currents and tide. The protection from the islands makes the reefs surrounding the west coast, and islands and sandbanks in the Zanzibar channel, more diverse and larger than the reefs on the east coast (Johnstone et al. 1998).  

Study sites 

Nungwi Four sites around Unguja island were chosen, Chumbe island (Ch), Bawe island (Ba), Nungwi (Nu) and Jambiani (Ja) (Fig. 1). All the sites are shallow, 0.5m‐3m at low tide and had an area ranging from 150 m2, the smallest and 200 m2 the largest with urchin densities ranging from low , medium and high (Table 1). The density of D. setosum was estimated based on a rapid visual census.  Bawe 

 

Chumbe island  (06°16’54.51”S, 39°10’32.85”E ) is a “no take” Marine Protected Area (MPA), since 1993 (McClanahan 2000). The island is situated 13 km south of Stone Town, Zanzibar (Bergman et al. 2000). The reef is very lush and well managed with high diversity of hard corals, (Mbije et al. 2002), fish and invertebrates (Carter 2006). The urchins were sampled in an area with large patches of corals and isolated coral heads with sandy bottom in between and the urchins distributed both on the corals and on the sand. 

Chumbe Jambiani 

Fig. 1 Study sites around Unguja island, Zanzibar. Google® maps 2009 

Bawe island (06°08’16.36”S, 39°07’57.82”E) is situated 5 km west of Stone town (Bergman et al. 2000) the reef is a recipient of the town sewage, the disposals and discharge from the harbor activities (Mbije et al. 2002). The sampling was divided on two sub‐sites, both with coral “boommies” and a fairly high activity of small fish. Between the “boommies” it was sand bottom or sand covered old corals. The urchins were evenly distributed on the bottom and/or on the corals. 

7 

 

The sampling site in Nungwi (05°43’47.44”S, 39°17’27.75”E) is located outside an area under heavy utilization from both tourists and other stakeholders; fishermen, dive operators etc. Outside this area the small reef called “home reef” (by the local dive operators) is located. The reef consists of “boommies” on approixmately 7 m depth. The sampling was conducted just prior to the actual reef in an area with small coral heads and patches of live corals and anemones intermixed with dead corals and sand. The area inhabits large populations of sea urchins D. setosum D. savigniy and Echinotrix diadema as well as star fishes, damsel fishes, sea cucumbers etc.   Jambiani (06°19’57.32”S, 39°33’32.16”E)is the only site located on the east coast of the island, this side is less protected from prevailing winds, currents and other hydrodynamic conditions (Bergman et al. 2000). This area has a very large intertidal zone with a varied activity such as fishing, collection and seaweed farming. The intertidal area had a very large population of Echinometra sp. The samples were collected during low tide on an old reef patch quite far out from the beach. The patch consisted of sea grass intermixed with old/dead corals and populations of the urchins Diadema setosum, Diadema savigniy and Astropyga radiata were present. 

Table 1 Approximately area of sampled site in square meters and the density of urchins ranging low to high. 

 Site  Area sampled (m2) Density level

Bawe   150 High

Chumbe  170 Medium

Jambiani  200 Low

Nungwi   150 High

         Sampling 

A total of 240 individuals of the sea urchin Diadema setosum were collected on 4 sites around Unguja island Zanzibar. Within each site 60 individuals were sampled, 20 individuals from each size group: small, medium and large. The sampling was conducted in November 2008.  Each individual was classified as a Diadema setosum based on the species specific features. The two Diadema species, D.  setosum and D. savigniy can be appear very similar, especially the juveniles, but there are some discriminating features. Diadema setosum has an orange ring around the anal entrance (easily distinguished from above) and five white spots evenly distributed around the body. Diadema savignyi lack these features but have continuous iridescent blue lines around the anal entrance and running downwards along the tests (Lessios & Pearse 1996). The sampling was made by snorkeling or SCUBA. The sea urchins were collected by long tongs and mesh baskets and placed in containers with sea water. The 

8 

 

9 

 

collected urchins were submerged in a marine water tank system before further analyses took place.    Lab 

The laboratory work and DNA extractions were conducted at the WIO‐magnet facility at the Institute of Marine Science (IMS), Stone town, Zanzibar. The AFLP analysis and data analysis were conducted at Södertörns University in Stockholm. 

Morphological parameters 

Each of the urchins was given a serial number and was photographed. The morphological parameters that were evaluated for each individual were length, height and weight. To achieve a good size measurement a caliper was used and the urchin was measured from the oral side (the urchin turned up side down) where the spines are shorter. The caliper was inserted, with pressure, between the spines until both sides touched the tests. The urchin was weighed after blotting on paper for one minute on a Kern EW scale with accuracy 0.01g.   

Dissection 

The tissue used for DNA extraction was gonad tissue. To obtain the gonad tissue, the urchins were dissected. When dissecting, the pointed part of the scissor was inserted through the soft tissue that surrounds the mouth (the peristomal membrane) and the tests were cut across and the two halves were pulled apart. Two pieces of the gonad was cut out, one small and one large, and rinsed with double distilled water (DDW) and dried on a non‐abrasive paper tissue. The small piece was placed in extraction solution (lysis buffer) and the large one in preservation solution (EtOH 70%). The samples for preservation were placed in ‐20ºC and the samples placed in extraction solution were extracted following the fish fin extraction protocol by Laird et al. (1991).  

Sex determination 

After the dissection and the removal of gonad tissue for preservation and DNA extraction, a small piece of the gonad was smeared on a glass slide together with a drop of sea water. A cover slip was added. The sex was determined by indentifying eggs or sperm by using a light microscope with magnification x10 or x40, depending on the status of the sample.   

   DNA extraction 

Genomic DNA was isolated by lysing a small piece of gonad tissue, following the protocol described by Laird et al. (1991) with small modifications.  The DNA was isolated at 56 ºC for 4 hours in 100 µl of lyses buffer [1M TRIS‐HCL, pH 8.5, 0.5M EDTA, 10% SDS, 5M NaCl and H20] and 3 µl proteinase K [10mg/ml]. After one hour of incubation the samples was shaken and 

10 

 

centrifuged in 14000 rpm for 30 s. After four hour of incubation the samples was shaken and centrifuged for 10 min at 14000 rmp. The supernatant was removed in to a tube with 200 µl freezing 99.5% EtOH and 20 µl NaAc [3M] and centrifuged for 10 min at 14 000 rmp. The pellet was washed in 200 µl 70% EtOH and centrifuged for 5 min at 14 000 rpm, the supernatant was removed and the pellet was dried for ~24 h in room temperature.  The dry pellet was dissolved in 50 µl 1x TE buffer and stored in fridge for 24 h and then moved to freezer (‐20 ºC) for storage.  

Quantifying DNA  

The DNA in each sample was quantified in a NanoDrop© ND‐1000 Spectrophotometer and diluted to working concentration of 25ng/ µl. The samples were randomized before the AFLP analysis to eliminate the effect of PCR reaction errors.  

AFLP‐analysis 

The AFLP‐analysis was carried out at the department of life science at Södertörn University in Stockholm. The AFLP‐analysis was performed according to Vos et al. (1995) and with modifications from Bensch et al. (2002).  

To digest the urchin DNA it was incubated for 1 h in 37ºC in a cocktail of (for 10µl DNA with of concentration of 25ng/µl) 6.9µl ddH2O, 2µl TA‐buffer (10X), 1µl BSA and 0.05µl ECO R1 (Fermentas) (5´‐G↓AATTC‐3´, 50u/µl) cutting, 0.05µl Tru/MseI (Fermentas) ((5´‐T↓TAA‐3´, 50u/µl) a total volume of 20µl. After one hour of digestion 5.025µl ligation cocktail was added to the DNA and incubated for 3h in 37ºC. The ligation cocktail (5 µl for each sample) contained 4.15µl, 0.5 ligation buffer (10X), 0.025µl E‐adaptor (5´‐CTCGTAGACTGCGTACC‐3´,3´‐CATCTGACGCATG GTTAA‐5´, 100 µM) and 0.25μl M‐adaptor, corresponding to fragments cut by Tru1 (5´‐GACGATGAGTCC TGAG‐3´, 3´‐TACTCAGGACTCAT‐5´),0.1µl T4 Ligase (5u/µl). The reason behind adding ten times more of the M‐adaptor than the E‐adaptor is that the cut site for Tru1 is recognized by four base pair while ECO R1 is recognized by six. This will create more fragments that have M‐adaptor “sticky ends” than fragments with E‐adaptor “sticky ends” so to ligate all the M adaptor fragments more adaptor is needed (Bensch et. al. 2002). The DNA was diluted with 180µl ddH2O and stored in ‐20ºC. 

The pre‐amplification was conducted with a Gene Amp ® PCR System 9700 PCR with following temperature profile [94ºC 2 min]+ 94 ºC ‐30s, 56 ºC ‐30s, 72 ºC ‐60s] x 20 cycles + [72 ºC ‐ 10 min]. For the pre‐amplification DNA was added in into volume of 10µl pre‐amplification cocktail containing 1.8µl ddH2O, 2µl MgCl (25mM), 2µl PCR‐buffer (10X), 4µl dNTP (1mM), 0.06µl E‐primer (5´‐GACTGCGTACCAATTCC‐3´), 0.06µl M‐primer (5´‐GATGAGTCCTGAGTAAG‐3´) and 0.08µl Taq polymerase (5u/µl). The amplified samples were diluted with 180µl ddH2O and stored in ‐20ºC. 

2.5µl diluted pre‐amplified sample was added in tubes containing 7.5µl selective‐amplification cocktail. The cocktail contained 3.3 µl ddH2O, 1µl MgCl (25mM), 1µl PCR‐buffer (10X), 2µl dNTP (1mM), 0.06µl FAM labeled E‐primer (5´‐GACTGCGTACCAATTCCAT‐3´), 0.06µl M‐primer (5´‐

11 

 

GATGAGTCCTGAGTAATA‐3) and 0.08µl Taq polymerase (5u/µl). The samples were incubated in the PCR with the following temperature profile (“touch‐down” PCR):  [94ºC‐2min]+[94ºC‐30s, 65ºC ‐ 0.7ºC/cykle‐30s, 72ºC‐60s] x 12 cycles + [94ºC‐30s, 56ºC‐30s, 72ºC‐60s] x 23 cycles +[72ºC‐10min]. 

3µl of the selective‐amplified samples was added into a PCR‐plate containing 87µl ddH2O and the DNA fragments were separated in an ABI3730XL capillary electrophoresis unit. 

 

Data analyses 

From the of DNA extraction the samples were analyzed in a randomized order relative to sample site to avoid potential influence from variation between batches.  To detect unamplified samples and possible contamination the data was analyzed in Genemarker V1.8 DEMO version. The program is very sufficient for this purpose as it creates a “gel image” of the samples. For subsequently scoring Genemapper 3.0 (Applied Biosystems) was used. In this program the unamplified samples was deleted and the subsequently scoring was done using default AFLP settings with no normalization. The analysis range was set to 150bp‐ 500bp and the locus selection threshold was set to 200rfu. The starting point of 150bp was chosen to eliminate noise generated by primers. Genemapper 3.0 (Applied Biosystems) creates a table based on PCR‐fluorescence, peak heights, for every locus. The table was exported into AFLP‐score. The purpose of AFLP‐score is to score genotype data from AFLP markers (dominant molecular markers). AFLP‐score interpret and normalizes the peak height data. In the program the optimal scoring conditions are determined and used to create a genotype matrix, to be used for further analysis. In addition the program uses the normalized data together with duplicates to perform an error rate analysis (Whitlock et al. 2008). AFLP‐score generated a 1/0 matrix with 150 retained loci for further analyzes. In addition the program calculated an error analysis, providing a phenotypic threshold of 20%, 200rfu and 51% mismatch. The matrix obtained in AFLP‐score was analyzed in AFLP‐surv generating values of genetic diversity (H) and Fst value of genetic diversity between the different sites (fixed geographic locations) and different size classes (Vekemans et al. 2002). These calculations are based on F‐statistics. The data set was analyzed assuming Hardy‐Weinberg equilibrium using the Bayesian method with non‐uniform prior distribution of allele frequencies (Zhivotovsky 1999). 1000 permutations were used to calculate the significance of the Fst.  To analyze the genetic structure of the populations and size classes, STRCTURE 2.2 was used. The burning was set to 50 000 with 50 000 additional cycles and the Bayesian approach was used, each run was iterated 3 times. The program assigns each individual to a genetic cluster, depending on their genetic information. This assignment is independent of the prior information, in this case site and size class. Prior to the run assumptions of an admixture of the populations and no correlation of allele frequencies was set. From the data a number of different potential numbers of clusters was created. The optimal number of clusters were 

calculated, where the K with the highest probability is indicated having the lowest Pr(X|K)(Pritchard et al. 2000).  

Results 

Amplification and primer combinations 

The gel image obtained from Genemarker V1.8DEMO (Fig. 2) was used for evaluation of primer combination as well as identifying un‐amplified sample and possible contamination. The primer combination with the highest number of variable bands was chosen. The primer combination ECAT‐MGTA yielded 288 variable bands and was chosen for the study. The primer combination was obtained by testing three different primer combinations for pre‐amplification (EC‐MG, ET‐MC, ET‐MG) and nine different primer combinations for selective‐amplification (ECGT‐MGTA, ECGT‐MGTG, ECAT‐MGTA, ETAG‐MGTA, ETAG‐MGTG, ETAG‐MGGC, ETAG‐MCTT, ETAG‐MCAC, ETAG‐MCGT) (Table 2).  

 

 

Negative control

Unamplified sample

Y‐axis: Sam

ple/individu

al 

  

X‐axis: Base pair, bp

Fig. 2 The gel image obtained from Genemarker V1.8DEMO using the ECAT‐MGTA primer combination. Note that the sample name/individuals are on the Y‐axis and the base pair are on the X‐axis.  

          

 

12 

 

13 

 

Table 2 Primer combinations tested for pre‐amplification (N‐3´) and selective amplification (NNN‐3´). 

EcoR1‐primer (N‐3´) 

Tru1‐primer (N‐3´) 

EcoR1‐primer (NNN‐3´) 

Tru1‐primer (NNN‐3´) 

EC  MG  ECGT  MGTA EC  MG  ECGT  MGTG EC  MG  ECAT  MGTA ET  MG  ETAG  MGTA ET  MG  ETAG  MGTG ET  MG  ETAG  MGGC ET  MC  ETAG  MCTT ET  MC  ETAG  MCAC ET  MC  ETAG  MCGT 

 

Genetic variation 

The height matrix from Genemapper contained 288 variable loci.  After AFLP‐score normalized and error reduced the data set, 105 variable repeatable loci were retained. To be able to detect genetic structuring on different spatial scales the sites where sampled in a nested fashion, with different distances between them. The smallest distance was between Bawe and Chumbe islands (15 km) and the largest distance was between Nungwi and Jambiani (155 km). The global Fst was used as a value of genetic structuring between geographic sites and phenotypically different groups, size classes. The global Fst for genetic structuring between sites was, Fst: ‐0.0008, p‐value: 0.5155, the global Fst for genetic structuring between size classes was, Fst: ‐0.0018, p‐value: 0.8791, the global Fst based on genetic clustering was, Fst 0.1234, p‐value 0.0000 (Table 3). All global Fst was based on 1000 random permutations. There is a genetic structuring among the populations, but the structuring is not based on geography or size. Pair wise Fst comparisons showed no significance for neither sites nor size classes (Table 4 and Table 5). 

 Table 3 Global Fst of different possible genetic cohorts based on site, size and Bayesian assignment   Number    Fst  S.E   P 

Site  4  ‐0.0008 1.053095 0.5155 

Size class  3  ‐0.0018 0.000000 0.8791 

Cluster  6  0.1234 0.229523 0.0000 

 

Table 4 Pair wise Fst between populations above the diagonal and approximately geographic distances in kilometers below. No pair wise Fst values was significant when Bonfferoni corrections had been applied. 

Site   Bawe  Chumbe  Jambiani  Nungwi Bawe  ‐‐  0.0015      0.0005      0.0000 Chumbe  15  ‐‐      0.0000      0.0002 Jambiani  100  85  ‐‐      0.0000 Nungwi  55  70  155 (85)  ‐‐ 

 

Table 5 Pair wise Fst between size classes. No pair wise Fst values was significant when Bonfferoni corrections had been applied. 

Size class  Large  Medium  Small 

Large  0.0000      0.0000      0.0000     

Medium  0.0000    0.0000  0.0000     

Small  0.0000      0.0000      0.0000     

 

The clustering algorithm implemented in the software Structure 2.2 uses no prior geographic information when assigning individuals to a genetic cluster. The analysis tested for the highest probability of a K‐run. 20 K‐runs was tested and the analysis revealed K=6 (Fig. 3) each run was iterated three times. The cluster distribution for each site is shown in figure 4 note that cluster number four is not represented in Jambiani (east coast). Figure 5 show cluster distribution for size classes, all cluster are represented in all size classes. 

 

 Fig. 3 Distributions of probability for K‐runs. K=6 has the highest probability and was 

subsequently chosen. 

 

14 

 

 

Fig. 4 Cluster distribution within each site (number of individuals). 

 

 

 

Fig. 5 Cluster distribution within each size class. 

 

 

 

15 

 

Discussion 

This study revealed a high genetic structuring (different genetic clusters) of the Diadema setosum around Ungjua island, Zanzibar, hence the population can not be considered panmictic. The genetic structure does not seem to be based on geography, at least not on the scale I have studied.  

The presence of different genetic clusters within all the sites indicates a genetic separation/barrier between these clusters/genetic groups. As the different clusters are divided over all the sites geography does not seem to be the reason behind this. However, previous population genetic studies conducted on Diadema setsosum, using mtDNA and allozymes, found genetic differentiation between populations on a large geographical and evolutionary scale. A study by Lessios et al. (2001) using mtDNA as genetic marker revealed two divergent groups of D. setosum; Diadema setosum‐a (WIO+indo‐west pacific) and D. setsoum‐b (Arabian peninsula). Within the Diadema setosum‐a clade a genetic divergence between the populations, in the western Indian Ocean on one hand and the indo‐pacific on the other, was found. However this genetic structure/divergence was weaker than between the two clades (a and b), indicating a small gene flow between the WIO and indo‐pacific. As AFLP is a high resolution marker, it would be able to identify genetic differences between populations on a smaller geographical and evolutionary scale than mtDNA, hence the gene flow seems to lie on a larger geographical scale than the observed one. Since the D. setosum has a long pelagic larval duration (Lessios & Pearse 1996), populations around Unguja island may receive genetic material from different populations around the Western Indian Ocean. Sampling from additional locations within the WIO area would give more information on this issue and hopefully this will make it possible to identify the origin of the different groups/clusters.  To ensure that the different clusters were not created by the different PCR‐runs i.e. one cluster for each run, this was tested and no genetic structuring based on runs was found (Fig. 6).  

 Fig 6. PCR‐runs compared with clusters. The clustering is not based on different PCR‐runs as all the runs 

contain multiple clusters. The graph is only based on Chumbe and Bawe.  

16 

 

17 

 

Another possible explanation to the observed pattern might be that the different clusters consist of individuals that spawn at the same time, but different time between the clusters i.e. not mixing the gametes between the groups hence keeping the genetic groups over generations. The D. setosum, in this area (10‐15º latitude of the equator), spawn throughout the year, approximately once a month. During the spawning period both the spawning and gametogenesis is synchronous and rhythmically among individuals (Pearse 1968 and Muthiga 2003). It is possible that spawning occur synchronously within different phenotypes, but on different time of the month. One way to measure this is to collect urchins throughout a month, and examine for mature gonads to see if this pattern differ between the genetic groups. The spawning in D. setosum is temperature regulated, when temperature reach above 25ºC the urchins are reproductively active (Pearse 1968). So if individuals are recruited from a more temperate area they might be “out of sync” with the locally recruited individuals, hence spawn at a different time during the month.   One interesting observation is that cluster number four is not represented in the Jambiani site (Fig. 4). A possible explanation to this pattern might be that the phenotypes assigned to cluster number four are less adapted to the rough environment within the site, hence have a lower fitness. Jambiani is the only site on the east coast and has a different ecology due to more prevailing winds, strong currents and wave action. There is less and smaller populations of D. setosum on this side of the island as the strong currents and wave action are not preferred by the long spined Diademas (Bronstein per. com, 2008.). An alternative explanation might be that, as cluster four is a rare cluster (Fig. 4) the probability of this cluster to fall out, by chance, is higher. Sampling additional sites on the east coast will give a better view of this.   Size classes  To find out if the cohorts were recruited from a single or multiple sources we assigned the urchins in size classes (small, medium and large) this was done based on the assumption that the urchins assigned to the same size class was of the same cohort. We did not find any structuring based on size class, which may indicate that different size classes did not represent different age classes/cohorts (Fig 5). A better way to determine age in sea urchins is to measure the growth lines in the jaws and/or tests, further on assign the individuals to different cohorts based on this information (Ebert 1982, Rowley 1990 and Agatsuma & Nakata 2004).   Management implications  Knowledge of the sea urchin population structure, migration patterns and geographical scale of gene flow is crucial for management strategies. This knowledge will help us identify the source and sink populations which are a key for functioning and sustainable management actions. To be able to control the growing populations of sea urchins it is important to identify, and put the management strategies, on the populations that supply other populations with individuals, the source populations. One way to decrease the urchin abundance in such areas is to release the fishing pressure in these areas. With released fishing pressure the predator populations (trigger 

18 

 

fish and terminal‐wrasses) can re‐grow and suppress the increase of sea urchins (McClanahan & Shafir 1990). Another management option is “Sea Urchin Reduction” (SUR) a method where sea urchin populations are reduced by hand, a labor intensive but fairly effective method but with some inbuilt constraints. SUR is only recommended on protected reefs or reefs that are already degraded. The method is not recommended on reefs with high coral abundance and diversity combined with high or moderate fishing pressure as a reduction of sea urchins will enhance the growth of algae and without algal grazing fish or sea urchins the corals will be outcompeted by the algae. For a successful management, using this method, understanding and knowledge about the reef ecology, species interactions and human influence are crucial (McClanahan et al. 1996).  In the studied case the SUR‐ strategy may not provide positive results, given that the most of the sites consists of many cluster which indicate a high migration between the sites and a “hand cleared“ area would be re‐colonized very fast and from many different sources. So for the long run and a more sustainable result I believe that releasing the fishing pressure, by creating protected areas at the source populations, will the most successful and maybe only solution to the “sea urchin problems” since this will help the reef to re‐establish it self. In areas with a very high abundance of sea urchins it may be a good idea to start with a SUR‐strategy, to accelerate the process, when it can take more than 30 years for the predator populations to recover (McClanahan 2000). If the geographic structuring lies on regional scale (within the WIO), the management is required to be on the same scale. This includes cooperation and common management plans between the countries in the region.  Conclusively, the high abundance of sea urchins is a complex problem that needs complex solutions. I do think that population genetics is a very useful and important tool for these issues.  

Acknowledgements 

I would to like thank Oskar Henriksson and Mats Grahn for excellent supervising and Mikael 

Lönn for the examination. A special thanks to Omri Bronstein for all the help, support, 

supervising and great company in the field/lab on Zanzibar. Thanks to the very helpful staff at 

IMS and a special thanks to Sadri Said for all the help with lab.  Thank you; Niklas Olsson, Emma 

Lind, Johan Näslund and Petter Thureborn for answering all my questions. Lina Nordlund for 

valuable comments on the written word. Family, friends and the “Zanzi crowd” for all the love 

and support. This work was supported by SIDA (as a Minor Field Study grant) and the WIO‐

magnet project.  

 

19 

 

References 

Addison J.A. and Hart M.W. (2004) Analysis of population genetic structure of the green sea urchin (Stronglylocentrotus droebachiensis) using microsatellites. Marine Biology, 144, 243‐251. 

Agatsuma Y. And Nakata A. (2004) Age determination, reproduction and growth of the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus in Oshoro Bay, Hokkaido, Japan. J. Mar. Biol. Ass. U.K, 84, 401‐405. 

Bensch S., Helbig A.J., Salomon M. and Seibold I. (2002) Amplified fragment length polymorphism analysis identifies hybrids between two subspecies of warblers. Molecular Ecology, 11, 473‐481. 

Bensch S. and Åkesson M. (2005) Ten years of AFLP in ecology and evolution:why so few animals?” Molecular Ecology, 14, 2899‐2914. 

Bergman K.C., Öhman M.C. and Svensson S. (2000). Influence of habitat structure on Pomacentrus sulfureus a western Indian Ocean reef fish. Environmental Biology of Fishes, 59, 243‐252. 

Bergman K.C., Svensson S. and Öhman M.C. (2001) Influence of algal farming on fish assemblages. Marine Pollution Bulletin, 42, 1379‐1389. 

Bernatchez L., Dempson B. and Martin S. (1998) Microsatellite gene diversity analysis in anadromous arctic char, Salvelinus alpinus, from Labrador, Canada. Canadian Journal of Aquatic Science, 55, 1264‐1272. 

Carrerio‐Silva M and McClanahan T.R. (2001) Echinoid bioerosion and herbivory on Kenyan coral reefs: the role of protection from fishing. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 262, 133‐153. 

Carvalho G.R. (1993) Evolutionary aspects of fish distribution: genetic variability and adaptation. Journal of Fish Biology, 43, 53‐73. 

Cowen R.K. and Sponaugle S. (2009). Larval dispersal and marine population connectivity. The Annual Review of Marine Science, 1, 443‐66. 

Dumas, P., Kulbicki, M., Chifflet, S., Fichez, R. and Ferraris, J. (2007) Environmental factors influencing urchin spatial distributions on disturbed coral reefs (New Caledonia, South Pacific). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 344, 88–100. 

Ebert T.A. (1982) Longetivity, life history and relative body wall size in sea urchins. Ecological Monographs, 52, 353‐394. 

Hardy O.J. and Vekemans, X. (1999) Isolation by distance in a continuous population: reconciliation between spatial autocorrelation analysis and population genetics models. HEREDITY,   83, 145‐154.   

Hay M.E. (1984a) Patterns of fish and urchin grazing on Caribbean coral reefs: are previous results typical? Ecology, 65, 446‐454. 

Hay M.E. (1984b) Predictable spatial escapes from herbivory: how do these affect the evolution of herbivore resistance in tropical marine communities? Oecologia, 58, 299‐308. 

20 

 

Hay M.E, Colburn T.and Downing D. (1983) Spatial and temporal patterns in herbivory on Caribbean reefs. Oecologia, 58, 299‐ 308. 

Hérbert C., Danzman R.G., Jones M.W. and Bernatchez L. (2000) Hydrography and population genetic structure in brook charr (Salvelinus fontinalis, Mitchill) from eastern Canada. Molecular Ecology, 9, 971‐982. 

Jiddawi, N. S. and Öhman M.C. (2002) Marine Fisheries in Tanzania. AMBIO:A Journal of the human Environment, 13, 518‐527 

Johnstone R.W., Muhando C.A. and Francis J. (1998). The status of the coral reefs of Zanzibar: One example of a regional predicament. AMBIO, 27, 701‐707. 

Jones G.P., Srinivasan M. and Almany G.R. (2007) Population connectivity and conservation of marine biodiversity. Oceanography, 20, 100‐111. 

Laikre, L., Palm, S. and Ryman, N. (2005) Genetic population structure of fishes: implication for coastal zone management. AMBIO, 34, 111‐119. 

Laird P. W., Zijderveld A., Linders K, Rudnicki M. A., Jaenisch R. and Berns A. (1991) Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids research, 19, 4293.  

Lessios H.A., Kessing B.D.and Pearse J.S. (2001) Population structure and speciation in tropical seas: global phylogeography of the sea urchin Diadema. Evolution, 55, 955‐975. 

Lessios H.A., Kessing B.D. and Robertson D.R. (1998) Massive gene flow across the world’s most potent marine biogeographic barrier. Proc. R. Soc. Lond. B, 265, 583‐588. 

Lessios H.A., Kessing B.D., Robertson D.R. and Paulay G. (1999) Phylogeography of the pantropical sea urchin Eucidaris in relation to land barriers and ocean currents. Evolution, 53, 806‐817. 

Lessios H.A., Kessing B.D., Wellington G.M. and Graybeal A. (1996) Indo‐Pacific echinoids in the tropical eastern Pacific. Coral Reefs, 15, 133‐142. 

Lessios H.A. and Pearse J.S. (1996) Hybridization and introgression between Indo‐Pacific species of Diadema. Marine Biology, 126, 715‐723. 

Lewis S.A. (1986) The role of herbivorous fishes in the community organization of a Caribbean reef community. Ecol Monogr, 51, 183‐200. 

Mbije N.E., Wagner G.M., Francis J., Öhman M.C. and Garpe K. (2002) Patterns in the distribution and abundance of hard corals around Zanzibar island. AMBIO, 31, 7‐8. 

McClanahan T.R. (1989) Kenyan coral reef‐associated gastropod fauna: a comparison between protected and unprotected reefs. Mar Ecol Prog Ser 53:11‐20 

McClanahan T. R. (1995) Fish predators and scavengers of the sea urchin Echinometra mathaei in Kenyan coral‐reef marine parks. Environmental Biology of Fishes, 43, 187‐ 193 

21 

 

McClanahan T.R. (1998) Predation and the distribution and abundance of tropical sea urchin populations. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 221, 231‐255. 

McClanahan T.R. (2000) Recovery of coral reef keystone predator, Balistapus undulates, in East African marine parks. Biological Conservation, 94, 191‐198. 

McClanahan T.R. and Arthur R. (2001) The effect of marine reserves and habitat on population of East African coral reef fishes. Ecological Applications, 11, 559‐569. 

McClanahan T.R. and Muthiga N.A. (1988) Changes in Kenyan coral reef community structure and function due to exploitation. Hydrobiologia, 166, 269‐276  

McClanahan T.R. and Muthiga N.A. (1989) Patterns of predation on a sea urchin, Echinometra mathaei (de Blainville), on Kenyan coral reefs. J Exp Mar Biol Ecol, 126, 77‐94 

McClanahan T.R., Kamukuru A.T, Muthiga N.A, Gilagabher Yebio M. and Obura D. (1996) Effect of Sea Urchin Reductions on algae, coral and fish populations. Conservation Biology, 10, 136‐154. 

McClanahan T.R. and Shafir S.H. (1990) Causes and consequences of sea urchin abundance and diversity in Kenyan coral reef lagoons. Oecologia, 83, 362‐370. 

Mueller U. and Wolfenbarger L. L. (1999) AFLP genotyping and fingerprinting. Trends in Ecology & Evolution, 14, 389‐394. 

Neudecker S. (1979) Effects of grazing and browsing fishes on the zonation of corals in Guam. Ecology, 60,666‐672. 

Pearse J.S. (1970) Patterns of reproductive periodicities in four species of indo‐pacific echinoderms. Proc Indian Acad Sci B, 67, 247‐279. 

Pritchard J.K., Stephens M. and Donnelly P. (2000) Inference of population structure using multilocus genetype data. Genetics, 155, 945‐959.  Pulliam R.H. (1988) Sources, sinks and population regulation. The American Naturalist, 132, 652‐661.  Raymond B.G. and Scheibling R.E. (1987) Recruitment and growth of the sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis (Muller) following mass mortalities off Nova Scotia, Canada. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 108, 31‐54.  

Robertson D.R. ( 2001) Population maintenance among tropical reef‐fishes: inferences from the biology of small‐island endemics. Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 5668–70. 

Rogers‐Bennet L., Rogers D.W., Bennet W.A. andEbert T.A. (2003) Modeling red sea urchin (Strongylocentrotus franciscanus) growth using six growth functions. Fish bulletin, 101, 614‐626.  Rowley R.J. (1990) Newly settled sea urchins in a kelp bed and urchin barren ground: a comparison of growth and mortality. Marine Ecology Progress Series, 62, 229‐240.  

22 

 

Sesabo J.K. and Tol S.J. (2007) Technical efficiency of small‐scale fishing households in Tanzanian coastal villages: an empirical analysis. African Journal of Aquatic Science, 32, 51‐61. 

Strathmann R. (1978) Lenght of pelagic period in Echinoderms with feeding larvae from the northeast pacific.  J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 34, 23‐27. 

Vos P., Hogers R., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kupier M. and Zabeau M. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407‐4414.  

Vekemans ,X., Beauwens T., Lemaire M. and Roldan‐Ruiz I. (2002) Data from amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers show indication of size homoplasy and of a relationship between degree of homoplasy and fragment size. Molecular Ecology, 11, 139‐151. 

Watkinson A.R. and Sutherland W.J. (1995) Sources, sinks, and pseudo‐sinks. Journal of Animal Ecology, 64, 126‐130.  Wellington GM (1982) Depth zonation of corals in the Gulf of Panama: control of facilitation by resident reef fishes. Ecol Monogr, 52, 223‐241.  

Whitlock R., Hipperson H., Mannarelli M., Butlin R.K. and Burke T. (2008) An obective, rapid and repoducible method for socring AFLP peak‐height data that minimizes genotyping error. Molecular Ecology Resources, 8, 752‐735.  

Report 

Carter E. (2006) Chumbe Island Marine Protected Area‐ Management plan 2006‐2016. 

Silva, P. (2006) Exploring the linkage between poverty, marine protected area management, and the use of destructive fishing gear in Tanzania. The World Bank Policy Research Working Paper Series. 3831. 

Wilkinson C. (2004) Staus of the Coral Reefs of the world 2004. Australian institute of marine science, Townsville, Queensland Australia, 1, pp 1‐6.  

Zhivotovsky L.A. (1999) Estimating population structure in diploids with multilocus dominant markers. Molecular Ecology, 8, 907‐913. 

Text book 

Miller, S.A. and Harley, J.P.(1999) Zoology. 4th ed. pp 408‐409. WCB McGraw‐Hill, USA. 

Richmond, M.D (ed.), (2002). A guide to the seashores of eastern Africa and the western Indian Ocean islands. pp 8. SIDA, department for research and cooperation, SAREC. 

Maps and coordinates  

Google® inc. 2009