1

Gene Expression Profiles Unique to Chile (Capsicum annum L.) Resistan

to Phytophtora Root Rot

Richard D. Richins, Sandra Micheletto, Mary A. O’Cornell

Departement of Plant and Environmental Science, New Mexico State University, Las Cruces, NM 88003, USA

(Profil Ekspressi Gen Unik pada Cabe (Capsicum annum L.) Resisten terhadap Busuk

Akar)

AbstrakHasil profil transkriptome pada perakaran cabe (Capsicum annum L.) telah ditemukan beberapa profil ekspresi gen ketahanan yang dikorelasikan dengan fenotip resisten pathogen, Phytopthora capsici. Dua microarray telah di hasilkan : cetakan elemen 10K cDNA yang dicetak dari library of trancripsi exspress di Criollo de Morelos-334 varietas C.annum pada 6 jam post-chalange dengan P.capsici dan 2K elemen erray cetakan klon sequence cDNA pola ekpresi preliminary. Array yang kedua telah diperkaya untuk beberapa klon yang diseleksi dari diferensiasi ekspressi yang susceptibel (New Mexico 6-4) vs. resisten (CM334) varietas C.annum. Profil ekpresi gen telah dievaluasi kembali pada 0, 4 dan 24 post-inokulasi. Perlakuan control termasuk kedalam sampel yaitu 0, 4 dan 24 jam post-mock-inokulasi. Tambahan untuk parental CM334, yang merupakan varietas risisten hasil backross (01-1688) yang juga digunakan untuk mengidentifikasi pola ekspresi gen yang diasosiasikan dengan resisten fenotipe. Prinsip dalam komponen analisis, sampel CM334 ditunjukkan oleh transkripsi yang signifikan diinduksi pada 4 dan 24 jam post-inokulasi, variabilitas predominan pada susceptibel line ditunjukkan oleh ekspresi gen pada perlakuan 24 jam inokulasi. Satu set dari 168 gen dengan penggantian ekspresi yang signifikan pada perlakuan P.capsici telah teridentifikasi, ada 22 gen unik yang hanya diekspresikan pada line yang diekspresikan (CM334 atau 01-1688). Gen ini merepresentasikan kandidat gen yang akan digunakan pada penelitian selanjutnya sebagai marker untuk program recurrent selection dan kandidat gen yang

digunakan untuk mekanisme ketahanan terhadap penyakit.

PendahuluanP. capsici adalah soil born pathogen, yang menyebabkan penyakit busuk akar, gangguan pembungaan dan pod rot (busuk buah) pada hampir semua kultivar C.annum [1.2]. Pathogen tersebut menyebabkan kerugian yang amat besar secara ekonomi yang disebabkan oleh berkurangnya produksi, kerugian tersebut total mencapai sepuluh juta dolar diseluruh dunia. Jika tanman terinfeksi sindrom penyakit ini, menyebabkan rusaknya akar sehingga tanaman menjadi layu dan mati. Penyebaran jamur menyebabkan pathogen ini disebabkan oleh kondisi air dalam tanah dan perubahan suhu tanah, sehingga kondisi terebut dapat berpengaruh terhadap produksi cabe diseluruh dunia [3,4]. Pengendalian secara kimia hanya dapat meminimalisir gangguan pathogen. Kemajuan zaman saat ini memungkinkan untuk mengidentifikasi dan mengintroduksi kultivar cabe resisten terhadap serangan pathogen busuk akar dan menjadi prioritas utama dalam kegiatan pemuliaan tanaman cabe.Sumber terbaik dari P.capsici telah diamati pada varietas Criollo de Morelos-334 (CM334) [3,5]. CM334 menunjukkan derajat ketahanan yang tinggi terhadap berbagai sindrom desease yang disebabkan oleh sebagian besar strain P. capsici [6-9]. Percobaan telah dilakukan dengan mengitroduksi fenotipe yang resisten dari CM344 pada pemuliaan cabe secara konvensional. Percobaan ini tidak begitu sukses karena percobaan ini belum dapat menjelaskan bagaimana mekanisme ketahanan yang dilakukan oleh CM344. Ketahanan terhadap berbagai phatogen oleh CM344 dikendalikan oleh banyak gen [10,11]; sehingga terdapat gen yang berbeda dalam mengendalikan ketahanan terhadap phatogen misalnya gen pengendali resisten terhadap gangguan pembungaan (foliar blight) dan gen pengendali resisten busuk akar (root rot) [12]. QTL maps dan marka molekuler diasiosiasikan dengan resisten root rot pada CM344 dimana kendali ketahanan terhadap root rot dipengaruh oleh banyak gen [10,11,13-15]. Marka dan QTL maps tersebut sangat bermanfaat untuk tujuan pemuliaan cabe resisten root rot, tetapi

2

pada waktu sekarang, tidak ditemukan adanya indikasi yang jelas mengenai gen spesifik atau bagaimana mekanisme ketahanan tersebut.Perubahan gen dalam merespon pathogen pada umumnya dapat diamati pada tanaman dan ada sejumlah contoh yang menunjukkan peningkatan ekspresi gen dalam merespon virus, nakteri dan inokulasi jamur. Gen ini disebut dengan phatogenesis-relate protein (PR) dan beberapa cabe telah dideskripsikan tahan terhadap serangan phatogen [16]. Peningkatan ekspresi gen tersebut pada umumnya telah teramati, bahwa ada juga gen yang hypersensitive-respons (HR) yang diasosiasikan dengan pewarisan ketahanan terhadap phatogen. Pada banyak kasus, gen dominan dihasilkan dari fenotipe yang kaya akan leucine, dan gen tipe tersebut telah dideskripsikan untuk ketahanan terhadap Xanthomonas-Capsicum [17]. Contohnya gen ini telah telah terekspresi pada tanaman yang terserang phatogen melalui jalur sinyal HR, sinyal ROS sehingga tanaman akan menginduksi protein PR [18,19]. Karakter spesifik merupakan produk baru dari respon terhadap Phytoptora pada tanaman cabe yang menunjukkan adanya induksi phenol, enzim antioksidan [20], N+2O- (nitrit oksida) dan enzimologi [21].Profil ekspresi gen secara global atau analisis microarray telah dilakukan untuk mengkarakterisasi dari ekspresi gen pada interaksi tanaman dengan pathogen [22], termasuk pada tanaman kentang dan Phytoptophtora infestans [23,24] dan kedelai Phytophtora sojae [25]. Sedangkan penelitian terhadap P. capsici masih sangat jarang. Penelitian kali ini akan menggunakan pemanfaatan cDNA dengan teknologi microarray untuk mengidentifikasi gen terutama inokulasi P. capsici dan kultivar C.annum pada tingkat waktu yang berbeda (post-inoculating). Hasil penelitian ini akan mengidentifikasi gen yang mengekspresi ketahanan cabe terhadap penyakit busuk akar (root rot).

Bahan dan Metode

Tanaman dan Sumber PatogenVirus P. capsici disiolasi dari PWB-24 [3], virus ini khusus digunakan bagi penelitian. P. capsici

dikulturkan dan inokulum dipersiapkan [12] dengan pengecualian terhadap penyaring (filter) dan heat sterilization dari P. capsici diperoleh dari tanah yang mengandung sporangia. Ektraksi dipersiapkan dari pencampuran 20 g tanah dari Leyendecker Farm, NMSU, dan kemudian dinkubasi semalaman. Hasil ekstraksi disentrifius (10.000 x g selama 10 menit) ukuran dari vacuum penyaring kira-kira 0.22 u. Hasil ekstraksi kemudian di autoclave. Penghitungan zoospore menggunakan hemocytometer.Bahan tanaman terdiri atas 4 genotipe cabe yaitu New Mexico 6-4 (NM6-4) sebagai susceptibel line; Criollo de Morelos-334 (CM334) sebagai resisten line, 01C 1688 sebagai resisten line hasil backcross CM334 dan C.annum cv. Early Jalapeno [3,35,37]. Tanaman ditumbuhkan pada pasir steril dengan pemupukan metode Peters Professional (20:20:20) (Scotts) pada dosis 0,5 g per L.

cDNA library dan MikorarrayTanaman CM334 dideskripsikan ketika jumlah daun 8. Enam tanaman dipindahkan dari pasir dan dibenamkan pada gelas ukur 150 ml yang telah mengandung zoozpora P. capsici (2 x 105/mL). Selanjutnya, dinkubasi pada suhu ruang selama 2 jam, tanaman yang telah ditanam selama 4 jam dipasir kemudian di ambil akarnya dan sesegera mungkin dicampur dengan nitrogen cair.RNA total yang telah diisolasi dideskripsikan pada [28] dan mRNA diisolasi dengan menggunakan Ambion’s Poly A Pure Kit. Lambda ZAPII cDNA library telah dipersiapkan dari mRNA menurut instruksi (Stratagen). Inisial dari library kompleks pada mendekati 1 x 106, kemudian diamplifikasi pada 3,1 x 1010/mL. Plaques dari individu ditransfer dari agar plates kedalam 500 uL SM [0,1 NaCl;0,05 M Tris-HCl, ph 7,5; 0,1M; MgSO4 0,01% (w/v gelatin). Cholorform (50 uL) ditambahkan kedalam perlakuan stok pertumbuhan mikrobia. PCR digunakan untuk mengamplifikasi 9500 rekombinan unik dengan menggunakan M13 forward (-20) dan revers (-24) primer site (Qiagen) on the ZAPII vector sequence. Pada amplifikasi, fragmen dianalisis dengan menggunakan elektroforesis agarose gel, kemudian reaksi amplifikasi di prespitasi dengan isopropanol semalaman pada suhu -200C. Hasil prespitasi

3

dicentrifius ( 1850 x g selama 30 menit), kemudian dibilas dengan ethanol 70% dan dikeringkan. Sampel yang dihasilkan berukuran 20 uL. Kemudian di Microarray dan disimpan pada suhu -200C.Dua set microarray kemudian dicetak. Mikroarray pertama berukuran 10K yang mengandung 9312 amplicon yang diperoleh dari akar CM334 sebagai buffer dan kedap udara dan ukuran amplicon ˷ 1000 cDNA yang berasal dari Phaseolus acutifolius drought-stress library [29] atau C.annum drought-strees leaf library [30]. 10K array dicetak dengan menggunakan Gene Machine Microarray printer pada polylysine-coated microscopes slides. Array kedua, 2K array, telah dipersiapkan pada subset yang mengandung cDNA responsive yang terindentifikasi pada 10K array. 2K array meliputi 1783 cDNA yang diduplikasi dari cetakan array dan ditambahkan spot cetakan dengan buffer dan air blanks. 2K array telah dicetak dengan menggunakan SMP4 printing pins (Telechem, Sunnyvale, CA, USA) on polylysine-coted microscope slides, yang dideskripsikan pada [31]. Kedua array tersebut telah di post-proses oleh diskripsi [32].

Persiapan SampelSelama skrining awal, tanaman yang ditumbuhkan di dalam pasir diberi pupuk. Pada saat tanaman telah memiliki 8 daun, dipindahkan dengan hati-hati dari pasir dan kemudian dibenamkan, baik kedalam zoospore containing solution atau air. Setelah itu, diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang, pada perlakuan 3 jam atau 23 jam juga dilakukan dengan cara yang sama. Tanaman yang telah dipindahkan dari pasir, kemudian secepatnya dibekukan dengan nitrogen cair. Untuk perlakuan control (0 jam) ketika dipindahkan dari pasir sesegera mungkin akarnya di bekukan dengan nitrogen cair. Semua jaringan disimpan kedalam suhu -800 sampai isolasi RNA.Cy-3 dan Cy-5 dilabel cDNAs dihasilkan dari RNA total (60 ug) menggunakan aminoallyl-duTP (aadUTP) dye incorporation method [33]. Rasio dTTP : aadUTP pada seluruh eksperimen 1:1. Hibridisasi dilaksanakan dengan microarray cassette (Arrylt) dan kemudian dimasukkan kedalam waterbath pada suhu 420C, setelah itu ditutup dengan aluminium foil untuk membatasi pemutihan (bleaching) dari pewarna.

Hibridisasi dilakukan selama 16 jam setelah itu microarray dicuci 2 kali dengan 1 x SSC, 0,1% (w/v) SDS; 2 x SSC;0,1% (w/v) SDS; dan 3 kali 0,1 x SSC, semua proses pencucian dilakukan pada suhu 420C. Slide kemudian di centrifius secara singkat hingga mongering kemudian discan dengan Genomic Solution GenTac UC4 microarray.

DNA sequencingSequence DNA telah ditemukan pada proses sequencing amplicon PCR juga dicetak dengan arrays. Primer AT3 digunakan selama rekasi sequencer. Produk hasil PCR dianalisis dengan ABI 3100 DNA sequencer. Untuk sejumlah klon, sequence DNA direscuing dan dimasukkan kedalam plasmid (Statagene), pada kasus ini, rekombinan plasmid disequence menggunakan dideoxy sequenching method dan di baca pada LI-COR automated DNA sequencer.

2.5.Analisis DataIntensitas spot sinyal dihitung dengan menggunakan Genomic Solution GenTac Integrator 4.0 scanner. Untuk 10K array, analisis data sangat esesensial sehingga perlu dideskripsikan terlebih dahulu [29]. Untuk 2K array, data diekspor ke microsft excel dengan XLstat plugin (www.xlstat.com) untuk analisis lebih lanjut. Target total intensity values digunakan untuk semua perhitungan. Data dari 4 atau 6 hibridisasi dan utilisasi minimal 2 sampel RNA independen yang telah diberi perlakuan. Nilai kemudian dinormaslkan dengan non-linear regression dan Lowess transformation. Z-test digunakan pada data yang dihasilkan untuk mengidentifikasi adanya nilai variabel highly (“bad spot”). Data z-score pada tingkat 0,01-0,99 juga termasuk kedalam subsequence analysis. Nilai yang berkorelasi dengan “bad spot” dibuang atau tidak digunakan dalam analisis microarray.Rasio dan p-value telah dihitung dengan 7 perlakuan yaitu : (1) CM334, 0 jam vs NM64 0 jam; (2) CM334, 4 jam P. capsici vs CM344 0 jam; (3) CM334, 4 jam P. capsici vs CM334, 4 jam mock-inokulasi; (4) CM334, 4 jam P. capsici vs NM64, 4 jam P. capsici; (5) CM334, 24 jam P. capsici CM334, 0 jam; (6) CM334, 24 jam P. capsici vs NM64, 24 jam P.

4

capsici. Ekspresi gen yang menunjukkan signifikansi diidentifikasi pada rasion kurang dari 0,5 dikalkulasi dari respon p-value kurang dari 0,6. Tingkat kemiripan dilakukan dengan penambahan genotype yang resisten, 0,1-1688. Data replikasi menggunakan isolasi single RNA.

2.6.Blot HibridisasiRNA total (10 ug) diisolasi dari akar tanaman yang diinokulasi dari Phytopthora, diekstraforesis, membran nilon ditransfer dan dihibridisasi dengan 32P-label probe dideskripsikan lebih awal [34].

3.1. Identifikasi dan Karakterisasi cDNAs yang diamati pada analisis microarray

Tiga eksperimen yang berbeda telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen yang dieksprrsi pada array 10K. Perbandingan perubahan ekspresi gen resisten pada line CM334 terdapat pada aplikasi P.capsici perlakuan (1, 4 dan 24 jam). Perubahan line yang suspectibel, pada line NM 6-4, dan akhirnya terdapat perbedaan tingkat ekspresi gen pada waktu yang sama. Fig.1 menunjukkan plot normal dari rasio ekspresi gen dan terdapat perbedaan ekspresi diantara CM334 dan N-M 6-4. Garis merepresentasikan pola dari ekspresi single gen. Garis diberi warna sebagai dasar dari rasio ekspresi gen pada t=0 diantara CM-334 dan NM 6-4. Bersamaan pada 335 gen dari 10.000 elemen array telah teridentifikasi mengalami perbedaan ekspresi pada satu atau lebih dari tiga percobaan berbeda.Range daerah statistika memungkinkan untuk dianalisis data dengan mikroarray, terutama dimensi reduction tool yaitu dengan menggunakan principal componen analysis (PCA), analisis kluster dengan menggunakan Hierarki Clustering (HC) atau K-means dengan menggunakan suoftwere [35]. Kami telah membandingkan hasil dari perbedaan alat analisis data pada capsicum dan phithoptora [36]. Hasil dari PCA analisis ditunjukkan oleh Gambar 2; PCA menunjukkan kepada kita interpretasi secara global dari perubahan ekspresi gen ketahanan dan line yang susceptibel. Hanya gen ini yang menunjukkan perubahan ekspresi gen setelah dianalisis dengan PCA.Untuk CM334, ada 87 gen yang mengalami differensiasi ekspresi gen terhadap respon inokulasi P.capsici. Perilaku dari gen ini telah digambarkan oleh

PCA (Gambar 2A). Gen menunjukkan ekspren tingkat tinggi setelah 1 jam diinokulasi dengan P.capsici dan gen-gen tersebut mengalami induksi diferensiasi setelah 4 dan 24 jam infeksi (garis merah Gambar 2A).

Gambar 1. Data Gambar CM334 vs New Mexico, 10K microarray. Normalisasi semi-log plot rasio dari transkrip levels (CM334/NM6-4) pada perlakuan 0,1,4,dan 24 post-inokulasi dengan P.capsici. Klon yang diberi warna menunjukkan perbedaan dengan perlakuan 0.

Gen-gen yang berkontribusi dalam componen yang prinsip pada saat 1 jam, tekanan tertinggi pada perlakuan 4 jam dan mengalami puncak differensiasi setelah 24 jam diinfeksi oleh P.capsici (Garis biru terang). Komponen ketiga yang bersifat prinsif didifferensiasikan oleh gen yang menerima respon dari inokulasi P.capsici. Perilaku gen-gen tersebut telah dapat dilihat pada hasil analisis PCA (Gambar 2B). Gen-gen yang memiliki kontibusi pada PC1 telah netral pada level perlakuan 1 dan 4 jam, akan tetapi gen-gen tersebut mengalami penurunan pada perlakuan 24 jam (garis Merah Gambar 2B). PCA2 direpresentasikan oleh gen pada perlakuan 1 jam dan kembali netral setelah 4 dan 24 jam (garis biru). PC3 direpresentasikan oeleh pola transkripsi yang telah netral setelah perlakuan 1 dan 24 jam, dam diferensiasi induksi pada perlakuan 4 jam (Garis Hijau).

5

Garis PC1, PC2 datu PC3 (Gambar 2) tidak hanya direpresentasikan oleh gen spesifik tetapi juga adanya trend ekspresi. Jadi pada line CM334, ada peningkaan ekspresi pada 4 dan 24 jam post-inokulasi, tetapi pada line NM 6-4 terdapat perbedaan respon pada perlakuan 24 jam (garis merah Gambar 2A dan B). Pada PCA, analisis sampel CM334 menunjukkan trnskripsi induksi pada perlakuan 4 dan 24 jam, akan tetapi pada line NM 6-4 dominan gen mengalami tekanan pada perlakuan 24 jam.

Gambar 2. Hasil Analisis Principal Component Analysis (PCA) pada saat post-inokulasi dengan P.capsici. (A) Perbedaan ekspresi gene dari CM334 yang di-represesntasikan oleh rasio semi-log pada waktu 1,4 dan 24 jam; merah (PC1), biru terang (PC2) dan hijau PC3. (B) PCA pada NM6-4.

3.2. Ekspresi differensiasi Gen Respon terhadap P.capsici, 2K microarray

Berdasarkan hasil analisis Robust ekspresi gen yang ada pada akar CM334 yaitu P.capsici, cetakan array lebih kecil dengan lebih dari satu gen yang telah dimasukkan. Semua klon yang dominan diidentifikasi pada 10K array sebagai respon dari P.capsici yang telah disisipkan pada plasmid dan DNA sequence. Set dari klon telah ditelusuri termasuk 200 klon tidak

memberikan respon terhadap P.capsici hanya ada sedikit dari klon yang telah diamati memberikan respon terhadap P.capsici.

Gambar 3. Hasil kluster K-Means pada perbedaan ekspresi gen (2K microarray) pada sampel akar line capsicum. Pola ekspresi dari 168 gen (baris) dibandingkan dengan sampel RNA (kolom) yang direpresentasikan pada kombinasi (kolom kiri ke kanan): (1) CM334, 0 jam vs NM64 0 jam; (2) CM334, 4 jam P. capsici vs CM344 0 jam; (3) CM334, 4 jam P. capsici vs CM334, 4 jam mock-inokulasi; (4) CM334, 4 jam P. capsici vs NM64, 4 jam P. capsici; (5) CM334, 24 jam P. capsici CM334, 0 jam; (6) CM334, 24 jam P. capsici vs NM64, 24 jam P. capsici. Tingkat ranskrips ekspresi dan rasio dari kompetitf hibridisasi diindikasikan oleh warna, intensitas dari kiri atas. Kluster terluas #7 , 2 kluster #21 dan #12 pada gambar 4 dengan gen dianotasikan oleh tanda panah.

6

Hasil ini pada 1700 amplicon yang telah dicetak pada array 2K. Hal utama yang menjadi prioritas adalah untuk mengamankan plasmid dan DNA sequence. Sejumlah gen pada data Gen Bank EST telah dapat dirediksi (suplement tabel 1). Gen-gen ini kemudian disesuaikan dengan data sequence yang ada pada GenBank deng expectasi value (E-value) <10-10.Perbedaan ekspresi gen dari 2K array untuk mengindentifikasi gen yang merespon P.capsici. Dapat dilihat pada Section 2, hal ini menunjukkan ada 7 perbedaan hibridisasi kompetitif, dan direplikasi pada RNA sampel. Rasio dan p-value telah dikalkulasi pada perbandingan CM334, 0 jam vs NM64 0 jam;

CM334, 4 jam P. capsici vs CM344 0 jam; CM334, 4 jam P. capsici vs CM334, 4 jam mock-inokulasi; CM334, 4 jam P. capsici vs NM64, 4 jam P. capsici; CM334, 24 jam P. capsici CM334, 0 jam; CM334, 24 jam P. capsici vs NM64, 24 jam P. capsici. P-value dan rataan rasio ini dikalkulasi pada replikasi nilai spot per slide dan hibridisasi indpendent, data ini disediakan pada suplemen file 2. Gen-gen ini menunjukkan ekspresi gen yang nyata secara statistik. Hal ini mengurangi set dari gen hingga 168 gen. Hal ini harus menjadi catatan pada gen-gen yang direpresntasikan oleh kopi dari array.

Gambar 4. Ekpresi dari 2 kluster, 12 dan 21 hasil analisis K-means. Pola ekspresi dari 10 gen pada 12 kluster dan 21 kluster. Kolum heading membandigkan antara sampel DNA (kolom dari kiri ke kanan) ; col 1: CM334, 0 h vs NM64, 0 h; col 2–4: CM334, 4 h P. capsici vs CM334, 0 h or vs CM334, 4 hmock inoculation; or vs NM64, 4 h P. capsici; col 5–7: CM334, 24 h P. capsici vs CM334, 0 h; or vs CM334, 24 hmock inoculation; or vs NM64, 24 h P. capsici; col 8–9: CM334, 4 h P. capsici vs CM334, 0 h; NM64, 4 h P. capsici vs NM64 0 h; col 10–11: CM334, 24 h P. capsici vs CM334, 0 h; NM64, 24 h P. capsici vs NM64, 0 h; col 12–13 CM334, 4 h P. capsici; or NM64, 4 h P. capsici vs NM64, 0 h; col 14–15: CM334, 24 h P. capsici or NM64, 24 h P. capsici vs NM64, 0 h. Jumlah kluster ID Klon dan fungsi diperoleh dari hasil BLAST yang dihadirkan pada kolom 3 akhir. Kunci warna dan kodi dari expresi transkripsi diekspresikan pada level dan rasio Gambar 3.

Rasio dinormalisasi untuk gen-gen yang akan dimasukkan kedalam analisis kluter K-means. Algoritma dari gen-gen ini memeiliki 168 gen dari 25 kluster (gambar 3). Kluster yang terluas, #7, memiliki 17 gen; eksprei gen ini terdapat pada line CM334 post-inokulasi. Ada 5 jklister pada satu gen:#15; 19,20, 22 dan 24. Setengah keatas mengandung pola ekspresi gen yang diekspresikan oleh P. capsicim, dan banyak dari sel yang telah diberi warna merah. Termasuk pada

kluster 1,2,5,9,11,13,15,17-20,22,24, dan 25. Secara bersama memiliki jumlah 92 gen. Untuk lebih detail lagi direpresantasikan oleh 2 kluster, 12# dan 21, direpresentasikan pada gambar 4. 2 kluster mengandung gen yang diekspresikan pada induksi CM334 pada 24 jam post-inokulasi dan tidak ada induksi pada line NM 6-4. Inspeksi dari intensitas kotak hijau kolom (5-7) membandingkan CM334 24 jam PC vs CM334 0 jam, atau CM334 24 jam mock

7

inokulasi, atau vs NM 6-4 24 jam PC yang diindikasi dari pola induksi.

3.3. Karakterisasi Fungsional Gen Responsif P.capsici

Semua gen yang merespon pada 2 K array, telah dideteksi secara signifikan untuk membandingkan perlakuan 24 dan 4 jam, yang diklasifikasi pada 16 grup dalam meprediksi protein sequence pada DNA sequence. Distribusi dari grup ini adalah membandingkan CM334 (95 gen) dan NM 6-4 (68 gen) pada Gambar 5. Ada sejumlah perbedaan antara CM334 dan NM 6-4 pada ukuran populasi yang

terdapat pada hasil analisis kluster. Untuk CM334 fungsi daripada sebagian besar gen berada dalam kelompok "respon to stimuli" dengan 17% yang memberi respon; untuk line NM6-4 yang paling luas adalah fungsinya sebagai "transport" dengan 22%. Tidak ada gen yang berada pada kelompok "fotosintesis" untuk CM334 akan tetapi kelasnya 6% dari gen responsif untuk NM 6-4. Ada tiga kelas yang tidak memberikan respon pada NM 6-4, "drug methabolisme", "nucleic acid metabolism" dan "protein metabolism", nilai kelas ini 1,5 dan 9% dinilai memberikan respon pada CM334.

Gambar 5. Klasifikasi identifikasi gen respon P.capsici pada CM334 dan NM6-4. Respon gen dari P.capsici pada perlakuan 24 vs 4 jam hos-inokulasi pada CM334 (95 gen) dan NM6-4 yang ditandai oleh 16 klas fungsional,. Repon total gen dlihat pada diagram line Capsici.

8

3.4. Konfirmasi Northern Blot Pola Ekspresi RNA Terseleksi

Empat klon (RR03-61, RR58-41, RR90-87 dan RR80-18) telah digunakan pada pengamatan northern blot (Gambar 6). RR58-41, Dikode pada sebua dinding sel protein, yang telah terekspresi akibat dari P. capsici pada CM334 tetapi tidak pada NM 6-4 menurut analisis mikroarray (Tabel 1). Pola ekspresi dikonfirmasi dari northern blot RR90-87, dikode dari tonoplast intrinsik protein oleh analisis mikroarray yang diinduksi dari NM 6-4 dalam merespon P. capsici, tetapi tidak diinduksi di CM334 (Tabel 2). Pola ini diekspresikan dari northern blot . RR03-61, di kode berdasarkan expansin-like protein, kecuali jika tidak mengalami respon pada kedua line yaitu pada perlakuan 4 dan 24 jam post-inokulasi dan menunjukkan suatu pola yang telah diobservasi dari Northern Blot. RR80-18 pengkode katalase, diperlihatkan oleh Tabel 3 dan pola ekspresi juga telah diobservasi dari Northern Blot analisis. Keempat gen ini menunjukkan perbedaan respon terhadap penyakit, pola tersebut ditunjukkan berdasarkan hasil analisis mikroarray yang dilakukan pada Northern Blot.

3.5. Perbedaan antara Gen yang Respon terhadap P.capsici dan Gen yang Respon Wounding (luka)

Sampel RNA dikoleksi dari akar pada perlakuan 4 dan 24 jam setelah mock-inokulasi CM334. Gen yang muncul menunjukkkan perbedaan ekspresi pada sampel yang diidentifikasi. Data ditunjukkan oleh Suplementary File 2. Hanya ada satu gen yang ada pada daftar Tabel 1, RR57-34, universal stress protein, juka diinduksi dari CM334. Dua dari daftar tersebut di lihat pada Tabel 2, RR96-41 dan RR94-81 telah diinduksi pada CM334. Tujuh gen tersebut dapat dilihat pada Tabel 3, juga diinduksi pada CM334 : RR43-29, RR61-77, RR60-02, RR78-76, RR39-65, RR37-04, RR80-02 dan RR58-08. Fakta dari sejumlah gen yang direspon telah dideteksi pada set gen terutama pada line yang respon terhadap P. capsici di CM334, NM6-4 dan 01-1688 (Tabel 3). Pengamatan hanya pada kandidiat yang respon untuk diidentifikasi dalam set unik dalam mengekspresikan genetipe yang resisten (Tabel 1) dan mengidikasikannya terhadap

gen yang diassosiakan dengan penotipe resisten P. capsici.

Gambar 6. Analisis northern blot pada penyakti busuk akar line Capsicum. Sampel RNA dari CM334 atau NM6-4 pada perlakuan 4 atau 24 jam post-inokulasi dari P.capsici. RR90-87, tonopplast intrinsic protein; RR58-41 dinding sel, RR03-61, expansin-like protein. Gambar terbawah etidiumbromida gel.

9

3.6. Konfirmasi Profil Ekspresi Gen ResistenLine C.annum, 01-1688, backros diantara CM334 dan line susceptibel, Early Jalapeno yang resisten terhadap P. capsici. element array telah diskrining dengan menggunakan sampel RNA yang diisolasi dari akar 01-1688 pada 4 dan 24 jam post-inokulasi dengan P. capsici. Rasio rata-rata dan assosiasi p-value untuk hibridisasi dapat dilihat pada suplemen file 3.Gen-gen tersebut mengalami differensiasi berdasarkan ekspresi terhadap P. capsici pada 01-1688 yang telah

teridentifikasi memberikan respon terhadap P. capsici pada CM334 dan NM6-4. Perbandingan tersebut dapat dilihat pada diagram Venn pada Gambar 7. Delapan puluh gen mengalami diferensiasi ekspresi pada titik 01-1688 akar dalam merespon P. capsici, daftar gen, tingkat level ekspresi dan prediksi anotasi ditunjukkan pada Tabel 1-3. Diantara 22 gen yang telah berasosiasi dengan ketahanan terhadap busuk akar, Transkrip level untuk 19 gen muncul dari respon terhadap P.capsici sementara transkrip 3 tertekan.

tingkat transkripsi pada 19 gen yang muncul dalam merespon P. capsici ketika gen mengalami tekanan (Tabel 1).Differensiasi dari pola ekspresi plot diantara 3 line C.annum dapat dilihat pada Gambar 8. Ekspresi ketiga gen tersebut berasosiasi dengan ketahanan terhadap ketahanan penyakit, RR66-33, RR43-66 dan RR58-41. Peningkatan ekspresi dari ketiga gen tersebut berasosiasi dengan ketahanan terhadap penyakit busuk akar (rod root). Untuk gen ini, ekspresinya berada pada waktu perlakuan 0 dan 4 jam dan menunjukkan Plot dari difrensiasi dari 3 line capsicum dihadirkan pada gambar 8. Dari ketiga pola gen berhubungan dengan ketahanan panyakit. RR66-33, RR43-66 dan RR58-41. Peningkatan ekspresi dari ketigan gen tersebut diasosiasikan dengan ketahanan terhadap penyakit rod root P.capsici . Ada reduksi transkripsi pada level 4 jam dari kedua tanaman yang resisten dan genotipe susceptibel. Akan tetapi, peningkatan ekspresi ketahanan genotipe ditunjukkan oleh peningkatan akumulasi transkripsi, banyak selubung yang terdapat pada perlakuan 24 jam, ketika transkrip pada NM-64 dan konstan dari perlakuan 4 ke 24 jam. Kemiripan pola ekspresi telah diobservasi pada gen-gen lainnya, dapat dilihat pada Tabel 1.

PembahasanKeutamaan dari ketahanan terhadap penyakit terutama pada P. capsici penyakit pada busuk akar, leaf blight, stem blight dan busuk buah (fruit rot) telah ditemukan padit C.annum [5]. Pembawa CM334 merupakan line yang resisten terhadap penyakit P. capsici diskripsi pada [37]. Akan tetapi, tidak ada kultivar yang dapat dirilis yang tahan terhadap P. capsici sebagaimana CM334; hal ini mungkin terjadi karena bayak faktor lingkungan yang berpengaruh [10,11]. Penelitian ini

telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen yang terekspresi untuk ketahanan penyakit dan bagaimana respon line yang suceptibel terhadap P. capsici . Gen ini mengekspresikan hubungan antara kunci genetik yang inheriten terhadap ketahanan penyakit, kuncinya terletak pada marka genetik dan program pemuliaan tanaman. Selanjutnya, diskripsi yang mendetail tentang ekspresi gen unik yang dapat dihubungkan dengan ketahanan terhadap penyakit perlu untuk diamatai pada masing-maisng kultivar.Ada sejumlah gen yang mentranskripsikan peningkatan respon terhadap ketahanan penyakit yang signifikan dalam inokulasi P. capsici ; Tabel 1-3 memperlihatkan pengelompokan gen dimanapun perubahan tersebut menunjukkan ekspresi gen yang unik baik itu pada fenotipe resisten, fenotipe susceptibel, dan tipe kedua fenotipe. Gen-gen itu diidentifkasi pada Tabel 1 (hanya line yang respon terhadap ketahanan) yang dapat dijadikan sebagai marka molekuler untuk proses pemuliaan tanaman. Alel-alel dari gen ini berasal dari gen CM334 yang menunjukkan perbedaan pad koding atau daerah promotor seperti sequen DNA sebagai marka yang akan dikembangkan. 22 Gen telah dilist pada Tabel 1 dan merupakan marka molekuler utnuk ketahanan penyakit root rod (busuk akar). Ada 4 gen yang dapat dan bukan untuk memprediksi fungsi bahan kimia sebagao mana tidak sesuai untuk public database. Hal ini akan menjadi menarik untuk menemukan fungsi dari sequence tersebut.Hanya 10 gen yang diidentikasi untuk merespon ketahanan penyakit yang unik dalam line suspectibel (Tabel 2). Kedepannya, ada model yang menginduksi, 2 sampai 3 fold, untuk gen DNA. Microarray telah dicetak dari cDNA library transkrip dari perkaran CM334 selama 6 jam inokulasi P. capsici . Oleh

10

karena itu, keberlimpahan gen ekspresi pada line yang susceptibel tidak dihadirkan dalam gen cetakan pada array saat ini.Set gen yang sangat luas (Tabel 3) telah teridentifikasi sebagai respon penyakit pada kedua line resisten dan sucetibel line : induksi 24 jam dan 8 jam untuk menekan gen. Kedepannya set ini akan diinduksi kedalam gen yang memiliki ekspresi yang baik, sebagamana 26 fold meningkat ketika diekspresikan pada asparagine synthetase pada CM334 dengan kemiripan pningkatan 16 fold meningkat pada NM6-4. Indikasi daftar ini akan menunjukkan line yang resisten dan susceptibel pada phytoptora.Transkripsi sel untuk dinding sel protein unik dengan diiunduksi pada line C.annum yang respon terhadap phytopthora. Anotasi dari gen sebagai dinding sel protein memiliki tingkat kemiripan sequence mencapai 95% dengan sel yang diinduksi C.annum (GenBank AF242730) yang respon terhadap tobacco virus mosaic (TMV) [38]. Transkripsi dinding sel protein dimonitor dengan menggunakan northern blot jaringan daun dari C.annum yang diisolasi dengan TMV phatotype yang berbeda, satu yang virulent, dan dan lainnya avirulen yaitu pada VK-1 host plant. Peningkatan transkripsi dinding sel protein telah diamati bagaimana respon yang hypersensitif respon. Transkripsi produk gen dikaitkan dengan kemampuan heritabel pada dua penyakit yang berbeda, TMV dan phytopthera adalah dua organ yang berbeda, daun dan akar pada Capsicum.Dinding sel protein, telah direview kembali sebagai komponen tanaman yang resisten pada berbagai penyakit yang dibawa oleh patoghen tanaman [39]. Aturan dari klas protein termasuk mendeteksi keduanya dan pengakuan terhadap terhadap pathogen sebagai mana pertahanan terhadap phatogen crosslinking, pereoksidase, atau senyawa kimia lainnya. Aturan dari dinding sel protein (RR58-4) menyebutkan bahwa kemunculan ekspresi yang unik dari dari line yang merespon serangan pathogen belum dapat diketahui. Tetapi hal ini sudah jelas pola ekspresi gen yang melimpah pada line yang tahan dan susceptibel. Pekerjaan selanjutnya bahwa gen dapat menyediakan informasi dalam mekanisme ketahanan terhadap phythoptora pada C. annum Criollo de Morelos-334.

Ucapan Terima KasihPenulis mengucapkan terima kasih kepada Robert Cary, Los Alamos Nasional Labs yang telah membantu dalam mencetak 11.000 elementa-array dan juga kepada Maggie Warner-Washburne, Universitas New Mexico dalam membantu pencetakan 2.000 microarray. Penelitian inji didukung oleh NM Agricultural Experiment Station, dan grant dari USDA CREES 2006-34387-16885, CREES 2009-34604-19939; Chile Improvement Program, NUCOR-STB-UC-01-10004.