G.A. Carrillo-B, S. Martin-Solano. Estudio Preliminar

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G.A.Carrillo-B,S.Martin-Solano.EstudioPreliminarsobrelacomunidaddeprimatesenelbosqueprotectordelOglánAlto.RevistaEcuatorianadeMedicinayCienciasBiológicas.V...

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SarahMartinSolano

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Revista Ecuatoriana de

MEDICINAY CIENCIAS

BIOLÓGICAS

VOLUMEN XXXINÚMEROS 1 y 2

OCTUBRE / 2010

ISSN 00349313

FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 1

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias BiológicasVolumen XXXI Números 1 y 2Octubre 2010Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamín Carrión, 2010Dirección de Publicaciones / CCEAv. Seis de Diciembre N16-224 y Patria, Quito, Ecuador

Diseño portada: Andrés Cepeda, AC ImagenFotografía portada: Santiago F. BurneoDiagramación: César E. Salazar O.Corrección: SEB-PichinchaISSN 00349313


DIRECTORIOCasa de la Cultura

Presidente: Dr. Marco Antonio RodríguezSecretario General: Dr. José MerinoDirector de Publicaciones: Dr. Fabián Guerrero Obando

Sección de Ciencias Naturales, Biológicas y Ciencias Exactas

Presidente: Dr. Claudio Cañizares ProañoSecretaria: Dra. Nina León (E)Vocales: Dr. Plutarco Naranjo Vargas

Dra. Laura Arcos TeránDr. David Niell

MiembrosLaura Arcos Terán Plutarco Naranjo VargasFernando Astudillo Arroyo (+) Celín Astudillo EspinozaHolm Nielsen Lauritz David NiellEnriqueta Banda de Naranjo Arturo Nina LeónJaime Bhreil Tjitte de VriesAugusto Bonilla Barco Milton Paz y MiñoClaudio Cañizares Proaño Hernán ProañoEugenia Del Pino Edgar Samaniego RojasJaime Díaz Moreno Cristóbal SantacruzRodrigo Fierro Benítez Fausto Sarmiento RodríguezRaúl Granda Jorge Suárez ArmijosAlex Hirtz Fernando Sempértegui OntanedaEduardo Luna Yépez Jorge SoriaAníbal Jarrín José Varea TeránOswaldo Morán Pinto Henrik BalslevMarcelo Moreano Dávila Rodrigo Yépez MiñoMiguel Moreno Espinoza (+)

Editores Comité Editorial

Dr. Sergio Barba (Medicina) Licd. Santiago BurneoDr.Carlos A. Soria (Ciencias Naturales)


ÍNDICE

Directorio de la Casa de la Cultura .............................................................................pág. 3

Editorial .......................................................................................................................pág. 5

Trabajos originalesImpacto genético en comunidades Amazónicas del Ecuador localizadasen zonas petrolerasCésar Paz-y-Miño, Bernardo Castro, Andrés López-Cortés, María José Muñoz, Alejandro Cabrera, Catalina Herrera, Adolfo Maldonado, Carolina Valladares,María Eugenia Sánchez..............................................................................................................pág. 7

Resistencia a carbapenemes asociada a integrones clase 1 en Pseudomonas aeruginosaMaría Fernanda Yauri, Iliana Alcocer, Mercedes Rodríguez-Riglos & Jeannete Zurita .........pág. 20

Estandarización de la metodología para el conteo cromosómico en especiesdel género Polylepis en el EcuadorQuija-Lamina, P., Segovia-Salcedo, C., Jadán, M. & Proaño K .............................................pág. 33

Análisis RAPD de la diversidad genética de Theobroma cacao L. de una poblacióndel Literol Ecuatoriano.Mercedes Carranza, Emmerick Motte, Virma Cedeño, Orly Cevallos, Silvia Saucedo,Hyron Canchingnia, Ariel Escobar ..........................................................................................pág. 50

Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicosCarlos A. Soria…………………………………………………………………………..……pág. 58

Un método cuantitativo para medir el área de tubérculo dañado por larvas deTecia solanivora (Lep.; Gelechiidae) a través de análisis de imágenes digitalesCarlos Carpio, Jean-Louis Zeddam , Álvaro Barragán, Gustavo Nuñez,Marcelo Patiño & Olivier Dangles ..........................................................................................pág. 69

Estudio preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto.Araujo-Pastaza.Gabriel Alberto Carrillo Bilbao & Sarah Martin-Solano.........................................................pág. 79

Trabajos de revisiónLa gastrulación en ranas con diversos modos de reproducciónEugenia del Pino ......................................................................................................................pág. 94

Resúmenes Simposio: 200 años de Humboldt.......................................................................pag. 106

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 21-127, octubre 2010

ISNN 003349313


Estandarizar conteos cromosómicos o hablar de huellas digitales con microsaté-lites como marcadores de la diversidad genética o de la necesidad de la conser-

vación, tiene similar importancia como hablar de resistencia o sensibilidad micro-biana o de métodos para remover nitratos, contaminantes del agua y modernosdetractores de la salud.

También podríamos especializarnos en el uso de membranas proteicas bacte-rianas que secuestran nanobiomoléculas, estimuladoras de la absorción de nutrien-tes o en el uso de enzimas o cepas microbiológicas para degradar colorantes o des-perdicios industriales.

La investigación plantea infinidad de temas, antes impensables, como laextracción de carotenoides o de keratinasas de los desperdicios orgánicos y de suuso en la medicina o en la industria cosmética, o quizá nos advierte sobre el meta-no de los rumiantes o de los basureros y su significativa contribución al efectoinvernadero.

Imagínese lector lo fascinante que sería ahondar en temas como las diferen-cias a nivel molecular en los procesos de gastrulación o el papel de la arginodecarboxilasa en la transformación de los estados extracelulares a intracelularesen los protozoos parasíticos. No estará muy lejos el día en que se pueda hablarde vacunas efectivas contra los mismos retrovirus o entender molecularmente elpapel de las poliaminas de la leche materna o del maíz como factores de creci-miento infantil, o hasta podría imaginar a las arañas fabricando variadas proteí-nas en fase líquida que al expulsarse por las hilanderías, en contacto con el medioy al cambiar su pH, se vuelve fibra muy resistente o tela de araña para cazar obolas de fibroin que responde a las corrientes de aire y que les sirve para trans-portarse grandes distancias.

No dejaría de sorprendernos que los mortiños de nuestros páramos fueranfuente de prociamidinas conocidas en la prevención de enfermedades coronarias,diabetes y obesidad. O que los aceites esenciales del clavo de olor o del árbol delté o de la canela, entre otros, controlen infecciones entéricas o parasitarias o actú-en como antioxidantes naturales.

Como ciudadanos de la tierra, se vuelve deber el entender y enseñar el respe-to por la vida y su entorno; que nuestros bosques, por ejemplo, no son solamentecelulosa y clorofila o que debajo de ellos se esconden riquezas hidrocarburíferas.¿Qué pasó por ejemplo con la sobreexplotación del saprol del árbol de canela haceaños no muy lejanos? Ahora conocemos la disminución continua de su biomasa porfalta de sostenibilidad y equilibrio entre producción y comercialización. La des-trucción de las frágiles comunidades ecológicas del páramo, del bosque tropical, de

EDITORIAL


los manglares, causarían una disminución peligrosa de la disponibilidad de hábitatssilvestres a medida que crece la densidad poblacional, las plagas, el avance de loscultivos extensivos o la explotación no controlada de orgánicos y minerales. ¿Cuán-tas hectáreas de mundo ecológico destruimos al día?

El tener conciencia sobre estos temas se lo debemos a nuestros investigado-res, capital intelectual importante en la toma de decisiones, especialmente en losconflictos entre economía política y economía ecológica.

Nuestra Revista de Medicina y Ciencias Biológicas recogerá y publicará artí-culos científicos generados por los diferentes caminos que ofrece la investigaciónde las Ciencias Biológicas y Médicas. Es nuestra forma de socializar lo aprendidoy estimular la creatividad del investigador.

Dr. Carlos A. SoriaEditor, Sección Ciencias Biológicas


Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 7-19, octubre 2010

TRABAJOS ORIGINALES

Impacto genético en comunidades Amazónicasdel Ecuador localizadas en zonas petroleras

César Paz-y-Miño1, Bernardo Castro1, Andrés López-Cortés1, María José Muñoz, Alejandro Cabrera1, Catalina Herrera1, Adolfo Maldonado2, Carolina Valladares2,

María Eugenia Sánchez1

1 Instituto de Investigaciones Biomédicas. Facultad de Ciencias de la SaludUniversidad de las Américas. Av. de los Granados y Colimes. Quito, Ecuador.

Postal code: [email protected]

2 Corporación Acción Ecológica. Área de investigación en salud y ambiente.Alejandro de Valdez N24-33 y La Gasca. Quito, Ecuador. Postal code: 1715246-C

Recibido: 2010-02-05, aprobado: 2010-08-31

RESUMEN.- La exposición de agentes carcinógenos usados en la industria petro-lera incrementa el desarrollo de cáncer tanto en hombres como en mujeres y niños.Se ha observado que los individuos expuestos a agentes genotóxicos presentan unainestabilidad general del genoma humano que puede ser evaluada por medio delestudio de cromosomas o de genes involucrados en daño genético a través del aná-lisis del nivel de fragmentación del ADN en individuos expuestos a los hidrocarbu-ros. Para el estudio se escogieron 23 mujeres que viven cerca de la actividad petro-lera y a quienes se supone presentaron una mayor exposición a las fuentes de con-taminación. Los individuos control fueron 25 mujeres provenientes de la Joya deLos Sachas, en Orellana, sin antecedentes de exposición continua a genotóxicos.La técnica usada para determinar alteraciones genéticas fue el ensayo cometa. Losdatos obtenidos indican que existe un mayor riesgo a padecer cáncer, malformacio-nes congénitas y abortos en las zonas ubicadas más cerca a la actividad petrolera,por ende con mayor exposición a factores tóxicos. La distancia al foco de exposi-ción y la asimilación de los mismos facilita la mutación del ADN en las células,originando fallas en los sistemas de reparación.

PALABRAS CLAVE: Petróleo, genotóxicos, inestabilidad genómica, fragmenta-ción de ADN, ensayo cometa.

ABSTRACT.- The exposition to the carcinogenic agents used in the oil industryincrement the development of cancer in the Amazonian communities. According torevised health data, exposed individuals to genotoxic agents present general instabili-ty of the human genome. This instability can be measured through analysis of the


8César Paz-y-Miño, Bernardo Castro, Andrés López-Cortés, María José Muñoz, Alejandro Cabrera,

Catalina Herrera, Adolfo Maldonado, Carolina Valladares, María Eugenia Sánchez


INTRODUCCIÓN.- En Ecuador,el petróleo ha sido y continúa siendo,además de la fuente principal de ingre-so económico, una de las amenazasmás importantes hacia el ambiente y lapoblación nativa de la región Amazó-nica del Ecuador. La actividad petrole-ra, en Ecuador, empezó en 1972 (1).En el proceso, millones de galones depetróleo y desechos tóxicos han sidoeliminados directamente al ambiente,ocasionando problemas a la saludpública (2).

Desde los primeros años de laexplotación petrolera en el Ecuador, lascomunidades indígenas y campesinas,así como grupos ecologistas nacionales,se han organizado en oposición a lafalta de regulación del desarrollo petro-lero y denunciado que la contaminaciónha causado un daño enorme tanto alambiente como a la salud de la pobla-ción (2, 3).

El petróleo y sus componentes pue-den ingresar al cuerpo por medio de tresvías: a) absorción por la piel, b) ingestiónde comida y bebida, y, c) inhalación degases por medio de la respiración (4);además, la exposición al petróleo no estálimitada al área cercana a la contamina-ción. Cuando el petróleo contamina elambiente, los componentes más pesadostienden a depositarse en los sedimentosdesde donde pueden contaminar repetida-mente las fuentes de agua o ser consumi-dos por organismos que pueden entrar enla cadena alimenticia del hombre. Loscomponentes del petróleo más ligerospueden evaporarse en cuestión de horas yser depositados a gran distancia de sulugar de producción a través del aire o delagua (5).

Los hidrocarburos de gran podertoxicológico, que se encuentran presen-tes en el petróleo, son compuestos orgá-nicos volátiles, como el benceno, tolue-

DNA fragmentation level in individuals exposed to hydrocarbons. For the presentstudy, 23 women who live near oil activity and contamination sources, are consideredto be exposed to major contamination environments. Control individuals were 25women who live in Joya de los Sachas, in the Orellana province, without continuousexposure to genotoxics. The technique used to determine genetic alterations was theComet Assay. The data obtained indicate that there is an increased risk of cancer, con-genital malformation and abortions in the zones located closer to oil activity. The dis-tance to the contamination source and assimilated genotoxic agents, facilitate the DNAmutation in the cells, originating failures in the repairing systems.

KEY WORDS: Oil, genotoxics, genomic instability, DNA fragmentation, CometAssay.


9Impacto genético en comunidades Amazónicas del Ecuador localizadas en zonas petroleras


no, xileno e hidrocarburos aromáticospolinucleares (6). Altas concentracionesde benceno causan síntomas neurotóxi-cos que desarrollan daños en la médulaósea con pancitopenia persistente y laexposición a este agente químico es unade las causas del desarrollo de leucemiay tumores de carácter hematológico (1).La exposición de agentes carcinógenosusados en la industria petrolera incre-menta el desarrollo de cáncer tanto enhombres como en mujeres y niños. Se haobservado incremento en el número decasos con cáncer de pulmón, esófago,recto, piel y riñones en hombres; enmujeres se ha observado más casos decáncer de cérvix, ganglios linfáticos yvejiga; en niños, los casos de cáncer decarácter hematopoyético han ido enaumento (1).

Las petroleras en la AmazoníaEcuatorianaLa Amazonía del Ecuador está for-

mada por más de 10 millones de hectá-reas de bosque tropical situadas en lascabeceras de la inmensa red de ríosamazónicos. La región contiene unadiversidad de plantas y animales másrica del mundo, que tiene su máximaconcentración en el denominado Par-que Nacional Yasuní (7, 8).

En 1967, el consorcio Texaco-Gulfdescubrió un rico campo de petróleobajo el suelo amazónico ecuatorianoque condujo a un “boom” petrolero queha modificado la región permanente-

mente. Desde entonces, compañíaspetroleras internacionales junto con lacompañía nacional Petroecuador hanextraído miles de millones de barrilesde crudo de la Amazonía ecuatoriana.Las actividades de explotación petrole-ra incluyen diversos procesos contami-nantes del ambiente. En la Amazoníadel Ecuador, la explotación del petróleoha ocasionado la apertura de caminosen el interior de la selva y cientos demiles de detonaciones en la fase sísmi-ca que han causado la erosión de la tie-rra y la dispersión de la fauna. Cadapozo de exploración que se perfora pro-duce un promedio de 4.000 metroscúbicos de desechos de perforación.Estos desechos se depositaron durantemuchos años en huecos excavados en latierra que se denominan piscinas dondepor filtración, sobreflujo o directamen-te, son eliminados al ambiente (3); en laactualidad suelen depositarse, sin aisla-miento o tratamiento alguno, en las pla-taformas de los mismos pozos.

Si se encuentran cantidades depetróleo comerciales, comienza la fasede producción. Durante esta fase, elpetróleo se extrae mezclado con aguade formación y gas y se lleva a una cen-tral de separación. En esta central, másde 4,3 millones de galones de líquidosde desechos se generan cada día y seeliminan sin tratamiento a las piscinas.Aproximadamente, millones de piescúbicos de gas procedentes del procesode separación se queman diariamente



en la Amazonía ecuatoriana. Este gas sequema sin ningún tipo de control de latemperatura o de las emisiones conta-minándose el aire con un gran númerode sustancias tóxicas (7). Las activida-des de mantenimiento en los más de1.000 pozos de producción de la Ama-zonía Ecuatoriana descargan cada añoaproximadamente 5 millones de galo-nes de desechos tóxicos no tratados enel ambiente. Los escapes y derrames delos pozos y tanques son también habi-tuales (9).

Los daños genéticos y el petróleoEn 1994, el Centro de Derechos

Económicos y Sociales publicó uninforme documentando peligrososniveles de contaminación por petróleoen los ríos del nororiente ecuatoriano.En ese estudio, se encontraron concen-traciones de hidrocarburos aromáticospolicíclicos (HAP) en las aguas utiliza-das para beber, bañarse o pescar de 10 a10.000 veces superiores a los límitespermitidos por la Agencia de Protec-ción Medio Ambiental de los EstadosUnidos. En ese mismo informe sereportaron numerosos problemas depiel (dermatosis) entre la poblaciónlocal aparentemente relacionados conla contaminación petrolera. Asimismo,el gobierno ecuatoriano fue acusado deviolación de los derechos humanos (5).

La relación entre exposición a agen-tes químicos y cáncer se inicia con unaobservación efectuada por el médico

británico Percival Pott, en cuyos resul-tados publicados en 1775 describe unaprevalencia del cáncer genital en indi-viduos expuestos al hollín (10).

Los hidrocarburos aromáticos poli-cíclicos son un grupo numeroso de sus-tancias que, químicamente, son deriva-dos poliméricos del benceno. Histórica-mente fueron los primeros agentes quí-micos en ser reconocidos como causan-tes de tumores malignos en humanos(11) y actualmente se ha correlacionadola exposición a hidrocarburos aromáti-cos policíclicos con el desarrollo decáncer pulmonar (12, 13, 14).

Según datos de salud revisados, seha observado que los individuosexpuestos a los compuestos volátiles delos hidrocarburos presentan síntomasleves como irritación de la piel, come-zón, irritación de los ojos, náusea,mareo, vértigo y dolor de cabeza (15).De la misma forma, la exposición aagentes genotóxicos produce una ines-tabilidad general del genoma humanoque puede ser evaluada por medio delestudio de cromosomas o de genesinvolucrados en daño genético a travésdel análisis del nivel de fragmentacióndel ADN en individuos expuestos a loshidrocarburos. A nivel cromosómicolos agentes genotóxicos producen rotu-ras e inestabilidad cromosómica. Medirel porcentaje de presentación de estasalteraciones citogenéticas constituye unmétodo confiable de biomonitorizaciónde población expuesta (1).

10César Paz-y-Miño, Bernardo Castro, Andrés López-Cortés, María José Muñoz, Alejandro Cabrera,

Catalina Herrera, Adolfo Maldonado, Carolina Valladares, María Eugenia Sánchez



Muchas actividades enzimáticasinvolucradas en el metabolismo dexenobióticos humanos son sujetas apolimorfismos genéticos y se hanreportado los estudios de asociaciónentre la susceptibilidad al cáncer y lapresencia de estos polimorfismos (1).Otros factores que influencian la res-puesta a los xenobióticos y el daño quepuede ser inducido en el ADN son losgenes de reparación (1).

El objetivo de este estudio fue evaluarel impacto genético en los individuos queviven en las comunidades que se encuen-tran en las cercanías de la actividad petro-lera, reportadas en los Bloques 7 y 21, ylocalizadas en la provincia de Orellana;además de relacionar la distancia entre losfocos de contaminación y las viviendas delos individuos con el daño genético pre-sente en las células.

MATERIALES Y MÉTODOSÁreas de estudioLas comunidades seleccionadas

para el estudio como afectadas por lacontaminación petrolera fueron: LosVencedores, 15 de Abril, AsociaciónPayamino y Flor de Manduro en laprovincia de Orellana, reportadascomo comunidades influenciadas porlas actividades petroleras en los Blo-ques 7 y 21 (16). Estas muestras fue-ron comparadas con un grupo controlcon características geográficas simila-res, localizada dentro de la mismaprovincia a más de diez kilómetros de

la actividad petrolera en el cantón dela Joya de los Sachas.

Población de estudio y obtenciónde las muestras

La población de estudio consiste en23 mujeres que viven cerca de la activi-dad petrolera. De las cuales, ocho pro-vienen de la comunidad de Los Vence-dores, siete de la comunidad Flor deManduro y ocho de las comunidadesPayamino–15 de Abril; a estas últimasse les ubicó en un mismo grupo ya queambas comunidades se encuentran muycerca una de la otra. Las comunidadesfueron escogidas porque suponenmayor exposición a contaminantesdebido a que los focos de emisión seencuentran en los alrededores de lasmismas.

Los individuos control fueron 25mujeres provenientes de la Joya de LosSachas en Orellana, sin antecedentes deexposición continua a genotóxicos. Elgrupo de exposición a petróleo tieneuna media de edad de 36,4 años frentea los 37,5 de edad media del grupo con-trol en la Amazonía ecuatoriana. Elrango de edad de los individuos afectosse encuentra entre los 3 y 72 años,mientras que en el grupo control elrango se encuentra entre los 21 y 71años de edad. Se realizaron historiasclínicas y se obtuvieron muestras desangre periférica para los análisis gené-ticos de los individuos de estudio y losindividuos control.



12


Análisis genéticoEnsayo cometa – Electroforesis en

gel alcalino de células individualesLa técnica del ensayo cometa es un

método relativamente rápido y simplepara la detección del daño de ADN invivo (17, 18), debido a la exposición defactores como rayos X, pesticidas,hidrocarburos (17, 19, 20). La prueba

consiste en someter los leucocitos san-guíneos a un campo eléctrico. Si no haydaño celular el material genético no sealtera y los núcleos celulares se mantie-nen circulares. Conforme se incrementael daño al material genético, los núcleoscelulares se van deformando por el des-plazamiento de los fragmentos de lascadenas y van adquiriendo una forma decometa estelar, de ahí su nombre, que enfunción del daño tendrá mayor o menorextensión de la dispersión (16).

Las muestras fueron analizadas pormedio de la técnica descrita por Singhy colaboradores (17) con implementa-ciones realizadas en otras investigacio-nes (20, 21). Las placas fueron analiza-das usando un microscopio de fluores-cencia con una lámpara de mercurio y

un filtro de 515-560nm de excitación.El daño es clasificado por medio de 6categorías predefinidas (de la A hastaF) dependiendo del nivel de fragmen-tación del ADN presente en la cola delcometa, siendo A: sin daño, B: bajonivel de daño, C: nivel medio de daño,D: alto nivel de daño, E y F: daño total(Figura 1).

RESULTADOSComparando los grupos expuestos y

los control es a la actividad petrolera, seobserva un incremento notable delcometa tipo C en el grupo de expuestos(21,6% daño medio), D (0,3% dañoalto) y E (0,1% daño muy alto) queestán presentes en una media del 22%,lo que significa tres veces más fragmen-tación del ADN que el grupo control dela Amazonía (Figura 2).

Se observa que en las comunidadesdonde existe mayor contaminación,como son en Los Vencedores y Flor deManduro, existe una mayor cantidad decometas tipo B y C. Los cometas tipo Cse encuentran con mayor frecuencia enla población de Los Vencedores (Figura3) y los cometas tipo B en la población

César Paz-y-Miño, Bernardo Castro, Andrés López-Cortés, María José Muñoz, Alejandro Cabrera,Catalina Herrera, Adolfo Maldonado, Carolina Valladares, María Eugenia Sánchez

Figura 1. Tipos de núcleos observados en el ensayo cometa. El tamaño de la cola determina la can-tidad ADN fragmentado.




de Flor de Manduro y Joya de losSachas (Figuras 4, 5). Mientras que lacomunidad Payamino 15 de abril pre-senta mayor porcentaje de cometas tipoA (Figuras 6).

Se observa una relación entre la dis-tancia de las viviendas de los indivi-duos afectos con las fuentes de conta-minación (mecheros) y los daños celu-lares registrados por el ensayo. Losindividuos fueron agrupados en 3 cate-gorías de acuerdo a la distancia de laque se encuentran de los focos de con-

taminación: distancia menor a 250 m,de 251 a 500 m y de 501 a 1.500 m.

Conforme los individuos se encuen-tran más lejos de los focos de contami-nación se observa que la cantidad decometas tipo C analizados también dis-minuye, pasando de 49,5 % presente enindividuos que viven a una distanciamenor a 250 m, a 24,2 % y 14 % obser-vados en individuos que viven a unadistancia de 251 a 500 m y 501 a 1.500m, respectivamente (Figura 7). Usandouna escala de distancia más precisa (de

* n = Número de individuos

Figura 2. Relación entre afectos y grupo control. Los valores observados corresponden a la media de los resul-tados observados.


14


375 a 3 025 m), se observa que la can-tidad de cometas tipo A presentes en lapoblación estudiada van en aumentoconforme los individuos vivan máslejos de los focos de contaminación(6,5% de cometas A en una distancia de375 m y 72% de cometas A en una dis-tancia de 3.025 m; Figura 8).

DISCUSIÓN YCONCLUSIONESLa evidencia científica indica que

los individuos expuestos a hidrocar-buros presentan mayor riesgo muta-génico y carcinogénico (1). Los indi-viduos que están expuestos a losagentes químicos usados en la indus-


Figura 3. Porcentaje y tipos de cometas en los individuos afectos de la comunidad Los Vencedores.

Figura 4. Porcentaje y tipos de cometas en los individuos afectos de la comunidad Flor de Manduro.




tria petrolera presentan ligeros, perofrecuentes síntomas de fatiga, micosiscutánea, dolores de cabeza, dermati-tis, irritación nasal y ocular, gastritis,náusea y diarrea (1). El ensayo come-ta es una técnica muy sensible a loscambios o alteraciones de una o de lasdos cadenas de ADN, sobre las cuales

ha actuado el agente genotóxico. Lagenotoxicidad es la facilidad paraproducir alteraciones en el materialgenético y por lo tanto aumenta lapropensión al cáncer, a las mutacio-nes y alteraciones en el embrión quepueden acabar en abortos (22).

Los datos indican que existe unmayor riesgo a padecer cáncer, mal-formaciones congénitas y abortos enlas zonas ubicadas más cerca a laactividad petrolera, por ende conmayor exposición a factores tóxicos.Comparando estos resultados con losobtenidos en un estudio realizado entrabajadores petroleros de la comuni-dad de San Carlos en la provincia deOrellana, Ecuador, se observa que laexposición a hidrocarburos afectadirectamente al daño del ADN en lascélulas (1).

La presencia de cometas tipo C enlas células de los individuos que se

Figura 6. Porcentaje y tipos de cometas en los individuos afectos de la comunidad Payamino 15 de Abril.

Figura 5. Porcentaje y tipos de cometas en losindividuos control de Joya de los Sachas


16


encuentran expuestos a contaminanteshidrocarburíferos indican daño genéti-co medio en la población afectada. Losindividuos que viven más cerca de losfocos de contaminación o mecherospresentan una mayor cantidad de dañogenético (como cometas tipo C) a dife-rencia de los individuos que viven máslejos de los focos de contaminación queno presentan daño genético (cometastipo A) o daño genético bajo (cometastipo B). Este dato sugiere que la distan-cia está relacionada con una mayorexposición a agentes contaminantes.

La distancia al foco de emisión deagentes genotóxicos y la asimilación delos mismos facilitan la mutación delADN en las células, originando fallas enlos sistemas de reparación (1). En el

estudio realizado en San Carlos, se rela-ciona los resultados de individuosexpuestos a hidrocarburos con polimor-fismos del gen MSH2, en el cromosoma13, encargado de la reparación de nucle-ótidos mal pareados en el ADN (1). Losresultados obtenidos en ese estudiodemuestran que los individuos expues-tos a hidrocarburos y los polimorfismosen los genes tienen una mayor suscepti-bilidad mutagénica, carcinogénica yteratogénica (1), lo que nos permitesuponer que las comunidades que vivencerca de los focos de contaminación pre-sentes en los Bloques 7 y 21 pueden pre-sentar alteraciones genéticas.

Los derrames de petróleo y de des-echos tóxicos en el ambiente sin trata-miento son problemas graves en el

Figura 7. Daño genético observado en cometas, de acuerdo a la distancia de la fuente de contaminación(mecheros).




Impacto genético en comunidades Amazónicas del Ecuador localizadas en zonas petroleras 17

Ecuador. No existe una legislación claraque proteja a los habitantes de las cerca-nías de los campos de explotación, ni alambiente de la selva ecuatoriana. Sedeben desarrollar programas de controlde explotación de recursos hidrocarbu-ríferos, productos primarios y secunda-rios derivados del petróleo y desechosgenerados por la explotación petrolerapara disminuir el impacto de la mismaen la Amazonía a nivel ambiental, sani-tario y social.

REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS

1. Paz-y-Miño C., López-Cortés A.,Arévalo M., Sánchez M. 2008.Monitoring of DNA damage inindividuals exposed to petroleumhydrocarbons in Ecuador. Annals ofthe New York Academy of Science(NYAS) 1140, 121-8.

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Resistencia a carbapenemes asociada a integronesclase 1 en Pseudomonas aeruginosa

María Fernanda Yauri1, Iliana Alcocer1, Jeannete Zurita2 & Mercedes Rodríguez-Riglos1

1Laboratorio de Microbiología, Escuela de Ciencias Biológicas, PUCE,

Quito, Ecuador. [email protected] de Microbiología, Zurita&Zurita Laboratorios, Quito, Ecuador

Recibido: 2010-05-27, aprobado: 2010-08-31.

RESUMEN: Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo, oportunista dehumanos, comúnmente aislado de infecciones nosocomiales. Es difícil de tratar porsu inherente resistencia a varios antibióticos y por su rápida adquisición de genesde resistencia. En los últimos años han sido reportados aislados multiresistentes deP. aeruginosa con genes que codifican enzimas que confieren resistencia a los car-bapenemes: las metalo-β-lactamasas (MBLs). Estos genes, comúnmente, seencuentran localizados en integrones. El objetivo del estudio fue identificar genesque codifican metalo-β-lactamasas (MBLs) y su ubicación en integrones clase 1 enaislados clínicos de P. aeruginosa. Se colectaron 129 aislados clínicos enZurita&Zurita Laboratorios entre enero de 2005 a diciembre de 2008. La detecciónde genes que codifican MBLs se realizó por PCR, amplificando los genes mayor-mente diseminados entre bacilos Gram negativos no fermentadores productores deMBLs y encontrados en Latinoamérica: blaVIM, blaIMP y blaSPM. La ubicación

de estos genes en integrones clase 1 fue determinada por PCR anidado. De los 129aislados analizados, 46 aislados fueron resistentes a carbapenemes. De los 46 ais-lados resistentes 34 (73,9%) presentaron genes que codifican MBLs y el 14,7%estuvieron ubicados en integrones clase 1. Fue evidente la alta prevalencia de genesproductores de MBLs en la población estudiada.

PALABRAS CLAVE: Carbapenemes, integrones, metalo-β-lactamasas, multire-sistencia, Pseudomonas aeruginosa.

ABSTRACT.- Pudomonas aeruginosa is a microbial agent, human opportunisticand commonly isolated from nosocomial infections. It is a difficult organism totreat because of its inherent resistance to various antibiotics and rapid acquisitionof resistance genes. In recent years, it has been reported multiresistant isolates ofP. aeruginosa with genes that encode enzymes which confer principally resistance


21Resistencia a carbapenemes asociada a integrones clase 1 en Pseudomonas aeruginosa


to carbapenems: metallo-β-lactamases (MBLs). These genes are often located inintegrons. Its importance lies in the spread of resistance genes between Gram-neg-ative bacteria. The aim of this study was to identify genes that encode metallo-β-lactamases (MBLs) and their location in class 1 integrons in clinical isolates of P.aeruginosa. The 129 clinical isolates were collected in Zurita&Zurita Laboratoriesbetween 2006 and 2008. The detection of genes that encode MBLs was performedby PCR, amplifying the genes mostly scattered among non-fermenting Gram neg-ative bacilli that produce MBLs: blaVIM, blaIMP and blaSPM. The location of

these genes in class 1 integrons was determined by nested PCR. Of the 129 isolatesanalyzed, 46 were resistant to carbapenems. Of the 46 resistant isolates, 34 (73.9%)had genes encoding MBLs. Only 14.7% were located in class 1 integrons. It wasevident the high prevalence of MBLs producing genes in the population studied.

KEYWORDS: Carbapenems, integrons, metallo-β-lactamase, multiresistance,Pseudomonas aeruginosa.

INTRODUCCIÓN.- Pseudomonasaeruginosa es una bacteria aerobia,Gram negativa, no fermentadora ni for-madora de esporas, móvil por la presen-cia de flagelos lofótricos y miembro dela familia Pseudomonadaceae. Es unpatógeno oportunista comúnmente aso-ciado a personas inmunocomprometidasque presentan infecciones en pulmones,oído, válvulas cardíacas, tracto urinario,sistema nervioso central, piel y en heri-das quirúrgicas. Adquiere especialimportancia en pacientes con fibrosisquística (1). El programa Internacionalde Control de las Infecciones Nosoco-miales (INICC) describe a las infeccio-nes nosocomiales como uno de losmayores problemas sanitarios, siendo departicular importancia las infeccionescausadas por bacterias multiresistentes(2). Además, establece que la mayor pre-

valencia mundial de infecciones intra-hospitalaria corresponde a América Lati-na, donde el 11,4% de los aislados obte-nidos son de P. aeruginosa (3).

Pseudomonas aeruginosa es inhe-rentemente resistente a una ampliavariedad de antisépticos y antibióticoscomo cefalosporinas de primera ysegunda generación, tetraciclinas, clo-ranfenicol, macrólidos, novobiocina;dejando como última alternativa de tra-tamiento al grupo de los carbapenemes(4). Los carbapenemes son los antimi-crobianos β-lactámicos en la terapiacontra P. aeruginosa mayormenteempleados. Sin embargo, durante laúltima década, la aparición de nuevosfactores de resistencia ha elevado elnúmero de aislados resistentes a estosantibióticos (5 y 6).


22 María Fernanda Yauri, Iliana Alcocer, Jeannete Zurita & Mercedes Rodríguez-Riglos


La resistencia en P. aeruginosa a loscarbapenemes es generada por múlti-ples mecanismos, tales como: bombasde flujo, mutación de porinas, produc-ción de enzimas que hidrolizan al anti-biótico. Este estudio se centró en esteúltimo mecanismo: la producción demetalo-β-lactamasas (MBLs; 7). LasMBLs son enzimas bacterianas con unaelevada actividad hidrolítica que inacti-van a todos los antibióticos β-lactámi-cos (penicilinas, cefalosporinas y car-bapenemes), transformando a estosagentes terapéuticos en compuestosinofensivos para las bacterias (8). Lasmás comunes y ampliamente reporta-das MBLs son las tipo VIM e IMP, lascuales exhiben una amplia distribucióna nivel mundial con más de 50 varian-tes alélicas descritas (9 y 10). Los genesque codifican enzimas tipo MBLs son,generalmente, transferidos por determi-nantes genéticos móviles como son losplásmidos o transposones, los cuales asu vez pueden contener sistemas derecombinación sitio-específica denomi-nados integrones (11). Esto sumado asu frecuente relación con otros genesque confieren resistencia a diversasfamilias de antibióticos (como amino-glucósidos), convierten a estos aisladosen un importante problema terapéuticoa nivel hospitalario (12).

Los primeros aislados resistentes acarbapenemes y productores de MBLsfueron registrados en la década de los80 en Asia y Europa (8). En Latinoamé-

rica no fueron encontradas sino hasta el2003, siendo descritas por primera vezen Chile y Venezuela (13).

Las MBLs han sido descritas y cla-sificadas en cuatro tipos clínicamenterelevantes: IMP reportada en Japón(14), VIM detectada originalmente enItalia (15); GIM observada en Alema-nia (16) y SPM descubierta en SaoPaulo, Brasil (17).

Diversos estudios de genes quecodifican MBLs demostraron su ubica-ción como genes “cassette” en integro-nes clase 1 (18). Los integrones son sis-temas formados de dos segmentos con-servados y separados por una regiónvariable capaz de insertar y escindirgenes en “cassettes” (19). Los genes en“cassette” son elementos móviles extra-cromosómicos circularizados que no seexpresan hasta que son insertos en unintegrón. Los integrones son moviliza-dos por transposición en plásmidos ytransposones (19).

En el Ecuador no existen datos quedemuestren el estudio de la resistenciaen Gram negativos no fermentadores.Así, este trabajo contribuye en el cono-cimiento de la multiresistencia, la pre-sencia de genes relacionados con laresistencia y su relación con integronesclase 1. El objetivo de este estudio fueidentificar los genes relacionados conla resistencia a carbapenemes tipometalo-β-lactamasas y su ubicación enintegrones clase 1 en aislados clínicosde Pseudomonas aeruginosa resistentes




a imipenem y meropenem. Los objeti-vos específicos fueron: a) Identificarfenotípica y genotípicamente los aisla-dos de Pseudomonas aeruginosamediante pruebas bioquímicas y mole-culares como la Reacción en Cadena dela Polimerasa (PCR) por amplificacióndel gen de la proteína de la membranaexterna oprL. b) Detectar la presenciade genes productores de metalo-β-lac-tamasas (MBLs) mediante PCR. c)Determinar la localización de los genesque codifican metalo-β-lactamasas através de la amplificación de la regiónvariable de integrones clase 1.

MATERIALES Y MÉTODOSAislamientos bacterianosSe analizaron 129 aislados de Pseu-

domonas aeruginosa recibidas de lacolección del Departamento de Micro-biología de los laboratorios Zurita &Zurita y tomados de muestras clínicasde pacientes atendidos en diversos cen-tros hospitalarios de Quito. El períodode colección de los aislados fue com-prendido entre enero de 2005 a diciem-bre de 2008. La identificación y el per-fil de resistencia fueron obtenidosmediante MicroScan (VITEK) siguien-do las especificaciones del fabricante.

Caracterización fenotípica ygenotípica de PseudomonasaeruginosaPseudomonas aeruginosa de acuer-

do a sus reacciones bioquímicas se

identifica como un bacilo Gram negati-vo móvil, no fermentador de azúcares,oxidasa positiva, productora de ornitinadescarboxilasa, no productora de tripto-fanasas y sintetizadora de lisina descar-boxilasa. Para evidenciar este perfil serealizaron las pruebas bioquímicasestándares: Agar con triple azúcar yhierro (TSI), Motilidad, Indol, Ornitina(MIO), Motilidad, indol, lisina (MILI),óxido fermentación (O-F).

La confirmación molecular de losaislados se realizó mediante la técnicade PCR amplificando el gen que codifi-ca la proteína oprL de la membranaexterna, empleando los iniciadores ycondiciones descritos por Xu et al.(20): F 5’ ATGGAAATGCT-GAAATTCGGC 3’ y R 5’CTTCTT-CAGCTCGACGCGACG 3’.

El templado fue preparado median-te kit de extracción de ADN genómico(PROMEGA nro. A1120). La reacciónse preparó en un volumen final de 25βl, conteniendo 1,25 U de Taq polime-rasa (PROMEGA nro.M8295) 0,l mMde cada dNTP, 2,5 mM de MgCl2, 3,5mM de KCl, 0,1 µM de cada iniciadory 4 µl de ADN templado en tampónpara PCR 1X. La amplificación se rea-lizó en un termociclador GeneAmpPCR system 9700 (Perkin Elmer). Elprograma de PCR consistió en 35 ciclosde 96 ºC por 1 minuto, 55 ºC por 1minuto y 72 ºC por un minuto, seguidode un paso de extensión final de 72 ºCpor diez minutos.



Los productos de PCR se sometie-ron a electroforesis en geles de agaro-sa (Invitrogen) al 1% a 125 V/cm por60 min en tampón 44,5 mM tris-HCl,44,5 mM ácido bórico, 1,5 mMEDTA (TBE). Se empleó como mar-cador molecular ADN de 100 pb(Invitrogen). Los geles fueron teñidosempleando Syber gold 10.000x enDMSO (Invitrogen). Los productosde amplificación se analizaron enSafe Imager (Invitrogen) por examenvisual considerando todas las bandasvisibles, independientemente de suintensidad.

Detección de genes que codificanMBLsLa detección de genes productores

de MBLs se realizó por PCR. Fueronanalizados los dos genes más frecuen-temente encontrados entre bacilosGram negativos no fermentadores y ungen reportado únicamente para Latino-américa (7 y 10).

Los iniciadores empleados para elgen blaVIM fueron: F 5' GTTTGGTCGCATATCGCAAC 3' y R 5'AATGCGCAGCACCAGGATAG 3'(21); para el gen blaIMP los iniciadoresempleados fueron F 5' GAAGGYGTT-TATGTTCATAC 3' y R 5'GTAMGTTTCAAGAGTGATGC 3'(10); y para el gen blaSPM se usaron losiniciadores F 5` CTGCTTGGATTCATGGGCGC 3` y blaSPM R 5`CCTTTT CCGCGACCTTGATC 3`

(21). Las condiciones de amplificaciónfueron las descritas por Pitaut et al.(21).

El templado fue preparado median-te kit de extracción de ADN genómico(PROMEGA No. A1120). La reacciónse preparó en un volumen final de 25µl, conteniendo 1 U de Taq polimerasa(PROMEGA No.M8295), 0,16 mM decada dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 0,16mM de cada iniciador y 2 µl de ADNtemplado en tampón para PCR 1X(PROMEGA). La amplificación se rea-lizó en un termociclador GeneAmpPCR system 9700 (Perkin Elmer). Elprograma de PCR consistió de unaincubación inicial de 37 ºC por 10minutos, una denaturación inicial de 94ºC por 5 minutos, seguido por 30 ciclosde 94 ºC por 1 minuto, 54 ºC por 31minutos y un paso de extensión final de72 ºC por 1,5 minutos.

Los productos de PCR se sometie-ron a electroforesis con las mismascondiciones empleadas para la identifi-cación molecular de P. aeruginosa.

Determinación de la localizaciónde los genes que codifican MBLsEl ADN de los aislados que resulta-

ron positivos para la presencia de genescodificantes de MBLs fue empleado enuna segunda PCR para determinar laregión variable de integrones de clase1. Los iniciadores empleados son losdetallados por Pitout et al. (21). Para lareacción en cadena de la polimerasa se





prepararon reacciones de 25 µl conte-niendo: 1 U de Taq polimerasa (PRO-MEGA nro. M8295), 0,16 mM de cadadNTP, 1,5 mM de MgCl2, 0,16 mM de

cada iniciador y 2 µl de ADN templadoen tampón para PCR 1X.

Los parámetros de amplificaciónfueron: 95 °C por 5 minutos; seguidode 30 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 52°C por 1 minuto y 72 °C por 2 minutos,y un período de extensión final de 72°C por 10 minutos.

Los productos resultantes de la PCRfueron separados a través de electrofo-resis horizontal en geles de agarosa(Invitrogen 15510-027) al 1%.

Los productos obtenidos de lasamplificaciones anteriores fueron usadoscomo templados para la ejecución de laPCR anidada y fueron empleados inicia-dores para cada uno de los genes encon-trados (blaVIM y blaIMP). Las cantidadesy los parámetros de amplificación son losmismos descritos anteriormente.

RESULTADOSEl 100% de los aislados (129) fue-

ron confirmados como Pseudomonasaeruginosa mediante análisis moleculardel gen que codifica la proteína oprL dela membrana externa (Figura 1). Laidentificación molecular concordó conla identificación fenotípica realizada através de pruebas bioquímicas.

De los 129 aislados estudiados, 46mostraron resistencia a carbapenemes.Los datos del origen de los aisladosresistentes se encuentran en la Tabla 1.

Los perfiles de resistencia a los car-bapenemes evaluados en los 46 aisla-dos de Pseudomonas aeruginosa mos-traron un alto porcentaje de resistenciaa ambos β-lactámicos empleados (imi-penem y meropenem), con 34 aisladosresistentes (73,9%); nueve aislados(19,6%) fueron resistentes únicamentea imipenem y tres (6,5%) fueron única-mente para meropenem (Figura 2).

De los 46 aislados resistentes, 34(73,9%) presentaron uno o dos genesque codificaban MBLs. En los doce ais-lados restantes (26,1%) no fue detecta-do ningún gen estudiado. De los 34 ais-lados portadores de genes que codificanMBLs, 24 (70,6%) presentaron el genblaVIM, seis (17,6%) registraron el genblaIMP y cuatro aislados (11,8%) pre-sentaban ambos genes blaVIM /blaIMP

(Figura 3). Cinco (14,7%) de los 34 ais-lados codificantes de MBLs fueron ubi-cados en la región variable de integro-nes clase 1 y 29 (84,3%) no lo fueron.

De los 24 aislados que presentaronel gen blaVIM, cinco (20,8%) fueronubicados en la región variable de inte-grones clase 1 (Figura 4). De los seisaislados portadores del gen blaIMP,tan solo uno (16,7%), pudo ser situa-do en la región variable de integronesclase 1 (Figura 5). Finalmente, de loscuatro aislados positivos para ambosgenes, dos aislados (50%) fueron ubi-cados en región variable de integro-nes clase 1.




DISCUSIÓNEn los últimos años se ha observado

el incremento de genes productores deMBLs asociados a integrones, los cua-les a su vez se relacionan con plásmidosy transposones, facilitando su transfe-rencia vertical a una amplia gama deagentes patógenos (11).

El estudio de la presencia de genesque codifican MBLs reveló un alto por-centaje de genes blaVIM (70,6%), en losaislados analizados resistentes a carba-penemes. Datos que concuerdan conestudios previos, donde el gen blaVIM,especialmente la variante alélica bla-VIM-2, ha sido identificada de manerapredominante en Latinoamérica yvarios países alrededor del mundo (7, 9,12 y 22).

El gen blaIMP fue registrado en unmenor porcentaje (17,6 %). Anterior-mente se ha descrito porcentajes simila-res de presencia para genes blaIMP en

aislados clínicos de Pseudomonasaeruginosa resistentes a carbapenemes(8, 21 y 24).

Los aislados clínicos de P. aerugi-nosa resistentes a carbapenemes arroja-ron un 0,0% de presencia de genes pro-ductores de MBLs tipo SPM, resultadoque contribuye a su localización endé-mica al norte de Brasil (17).

Mecanismos como la baja permea-bilidad para el ingreso del antibióticopor pérdida de porinas o expulsióndel mismo a través de bombas deflujo podrían explicar la resistenciaobservada en los aislados que no pro-

Figura 1. Representación gráfica de la identificación de la proteína de la membrana externa oprL para con-firmación genotípica de Pseudomona aeruginosa. M, marcador de peso molecular 100pb; canaletas 1-13, ais-lados de Pseudomonas aeruginosa confirmados.




Bacteria PacienteCódigo de Código Fecha de Aislamiento Sexo Edad Origen de laCongelación Hospital (años) muestra

13 Ps aer 10 01/07/2005 M 2 Herida16 Ps aer 4 01/07/2005 M 5 Biopsia17 Ps aer 7 08/07/2005 F 7 Herida23 Ps aer 274 09/08/2005 F 16 Herida28 Ps aer 60 09/09/2005 M 59 Herida29 Ps aer 237 22/09/2005 F 19 Esputo40 Ps aer 189 01/10/2005 D ND Absceso45 Ps aer 773 01/10/2005 D ND Absceso48 Ps aer 835 24/10/2005 M 8 Biopsia57 Ps aer 430 13/12/2005 M 30 Herida quirúrgica95 Ps aer 714 22/03/2006 F 79 Herida97 Ps aer 483 15/03/2006 M 6 Hemocultivo104 Ps aer 1042 31/03/2006 F 34 Secreción traqueal130 Ps aer 597 19/05/2006 F 40 Secreción traqueal140 Ps aer 638 22/06/2006 F 31 Secreción traqueal142 Ps aer 632 22/06/2006 M 56 Líquido peritoneal150 Ps aer 899 30/06/2006 M 26 Secreción traqueal167 Ps aer 3532 22/08/2006 F 48 Herida quirúrgica191 Ps aer 4149 03/10/2006 M ND Absceso228 Ps aer 26 01/12/2006 M 36 Secreción traqueal235 Ps aer 565 20/06/2007 F 2 meses Hemocultivo236 Ps aer 945 28/12/2006 M 27 Secreción traqueal237 Ps aer 942 28/12/2006 M 72 Secreción traqueal310 Ps aer 4831 15/11/2007 M ND Esputo319 Ps aer 924 28/11/2007 M 60 Secreción traqueal326 Ps aer 256 08/12/2007 F 77 Secreción traqueal330 Ps aer 528 16/12/2007 M 21 Secreción traqueal332 Ps aer 742 22/12/2007 M 86 Líquido pleural333 Ps aer 768 23/12/2007 F 80 Secreción traqueal335 Ps aer 800 24/12/2007 F 61 Herida quirúrgica345 Ps aer 963 29/12/2007 F 61 Secreción traqueal346 Ps aer 975 30/12/2007 M 61 Esputo355 Ps aer 183 06/03/2008 M ND Urocultivo362 Ps aer 595 26/09/2008 F 22 Secreción traqueal365 Ps aer 466 26/09/2008 F ND Esputo377 Ps aer 332 26/09/2008 M ND Secreción traqueal381 Ps aer 334 30/09/2008 F ND Herida385 Ps aer 467 30/09/2008 M 46 Secreción traqueal387 Ps aer 531 30/09/2008 M 8 Herida quirúrgica403 Ps aer 792 30/09/2008 M 77 Secreción traqueal411 Ps aer 944 30/09/2008 F ND Herida quirúrgica413 Ps aer 153 30/09/2008 M 74 Hemocultivo429 Ps aer 818 01/10/2008 F ND Herida quirúrgica437 Ps aer 508 02/10/2008 M ND Herida quirúrgica438 Ps aer 170 01/10/2008 M 26 Secreción traqueal443 Ps aer 3560 01/10/2008 F 75 Esputo

F, femenino; M, masculino; ND, no determinado

Tabla 1 Datos de origen de los aislados de Pseudomonas aeruginosa analizados en este estudio (Continuación)




ducían MBLs (7). Estos mecanismosno fueron analizados en el presentetrabajo.

En cuanto a la ubicación de losgenes que codifican MBLs, el estudiodemostró que fueron pocos los aisladosde P. aeruginosa, alrededor del 14,0%,encontrados como “cassettes” génicosen la región variable de integrones clase1; a pesar de encontrarse a estos ele-mentos genéticos ampliamente distri-buidos entre los bacilos Gram negati-vos no fermenteadores (19,23).

La presencia del “cassette” portadordel gen blaVIM y blaIMP en un integrón

no confiere movilidad por sí solo, perosí pueden encontrarse insertos en ele-mentos genéticos móviles como plás-midos y transposones. Los integrones alencontrarse asociados a plataformasgenéticas móviles incrementan su dise-minación y transferencia intra e interes-pecífica (18).

CONCLUSIONESLos 129 aislados clínicos fueron

confirmados como Pseudomonas aeru-ginosa mediante pruebas bioquímicas.

La identificación genotípica de Pseu-domonas aeruginosa mediante la reac-ción en cadena de la polimerasa (PCR)fue positiva para los 129 aislados.

La mayoría de aislados resistentes acarbapenemes, imipenem y meropenem(73,9%), presentaron genes que codifi-can metalo-β-lactamasas.

Los genes blaVIM y blaIMP fueronencontrados en la mayoría de aisladosresistentes a carbapenemes en un70,6% y 17,6%, respectivamente. Unbajo porcentaje de aislados presentaronambos genes. El gen blaSPM no fueencontrado en ningún aislado resistentede origen hospitalario.

Un considerable porcentaje del totalde los aislados resistentes a carbapene-mes fueron ubicados en integronesclase 1.

Figura 2. Porcentaje deresistencia a carbapenemes enaislados clínicos de Pseudo-monas aeruginosa.




Figura 3. Porcentaje genesque codifican metalo-β-lacta-masas en aislados clínicos dePseudomonas aeruginosa.

Figura 4. Representación gráficade electroforesis de los genes bla-VIM y blaIMP de aislados de Pseu-domonas aeruginosa resistentes acarbapenemes. Canaletas 1, inte-grón; canaleta 2 y 4, integrón y genblaVIM; canaleta 3, gen blaVIM;canaleta 5, marcador de pesomolecular 100pb; canaletas 6 y 7,control negativo y canaleta 8, genblaIMP




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Figura 5. Representación gráfi-ca de eletroforesis del gen blaIMP

de aislados de Pseudomonasaeruginosa resistentes a carbape-nemes. M, marcador de pesomolecular 100pb; canaleta 1,control negativo; canaleta 2, inte-grón y gen blaIMP; canaleta 3, 4

y 5, integrón; canaletas 6 ausen-cia integrón y canaleta 7 inte-grón.




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Estandarización de la metodología para el conteocromosómico en especies del género Polylepis

en el EcuadorQuija-Lamina, P1., Segovia-Salcedo, C1, 2., Jadán, M.1 & Proaño K.1

1Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ing. en Biotecnología, ESPE, Sangolquí, [email protected]

2Universidad de Florida, Departamento de Biología, Florida Museum of Natural History(FLMNH), Gainesville, USA


RESUMEN.- El género Polylepis incluye 26 especies de árboles y arbustos quehabitan desde Venezuela hasta la parte central de Argentina. Los bosques de Poly-lepis constituyen en su mayor parte la vegetación natural de los Andes con unafauna y flora sumamente especializada y de gran importancia ecológica. En las últi-mas décadas, varios intentos de clarificar su filogenia a través de técnicas molecu-lares no han tenido éxito. Debido posiblemente a la frecuente hibridización; otrashipótesis se centran en la poliploidía, la cual no ha sido analizada con éxito, debi-do a la falta de protocolos en el área de citogenética. Esta investigación presentapor primera vez una metodología estandarizada para la visualización y conteo decromosomas, así como para la obtención de fases celulares en las especies delgénero Polylepis. Se utilizaron meristemos radiculares y botones florales paraestandarizar la metodología. Adicionalmente, fueron llevados a cabo estudios delciclo celular para determinar la hora apropiada de recolección de las muestras. Lasplacas preparadas permitieron obtener los números cromosómicos de las especiesde Polylepis presentes en el Ecuador, los cuales revelan por primera vez la presen-cia de poliplodía dentro del género, proceso muy importante dentro de la diversifi-cación de las especies.

PALABRAS CLAVE: Ciclo celular, conservación, cromosomas, índice mitótico,Polylepis

ABSTRACT.- The genus Polylepis include 26 species of trees and shrubs distrib-uted from Venezuela to central Argentina. Polylepis forests are mostly natural veg-etation of the Andes with a highly specialized fauna and flora and they have greatecological importance. In recent decades, several attempts to clarify their phyloge-


34 Quija-Lamina, P., Segovia-Salcedo, C. Jadán, M. & Proaño K.


ny through molecular techniques have not been successful. One of the possible rea-sons could be the frequent hybridization, other hypotheses focus on the presence ofpolyploidy, phenomenon that has not been tested with success, due to lack of pro-tocols for conducting cytogenetic studies. This research has developed for the firsttime a standardized methodology for visualization and chromosome counting ofgenus Polylepis as well as data about the cellular phases. Root tips and flower budswere used to standardize the methodology. Additionally cell cycle studies were car-ried out to determine the proper time of collection of samples. The plates preparedallowed to obtain the chromosome numbers of Polylepis species present inEcuador, which revealed for the first time, the presence of polyploidism in thisgenus, a very important condition in the diversification of the species.

KEYWORDS: Cell cycle, conservation, chromosomes, mitotic index, Polylepis

INTRODUCCIÓN.- El géneroPolylepis incluye 26 especies de árbo-les y arbustos que habitan desde losAndes Venezolanos hasta la parte cen-tral de Argentina (1). En el Ecuadorencontramos ocho especies que perte-necen a los diferentes complejos evolu-tivos desde el grupo basal Sericea hastael más derivado: el complejo Incana(2). Los bosques de Polylepis formanparte de la vegetación natural de losAndes con una fauna sumamente espe-cializada. Sin embargo, la distribuciónactual de éstos ha sido disminuida demanera alarmante por procesos antro-pogénicos como agricultura, pastoreo,tala, quema e introducción de especiesexóticas (2).

En las últimas décadas varios inten-tos de aclarar su filogenia a través de téc-nicas moleculares se han visto truncadospor la falta de resolución en los análisis

a nivel de especies (3). Una de las posi-bles razones de esta falta de claridadevolutiva se puede centrar en la frecuen-te hibridización entre las especies de estegénero, por razones naturales (polen quepuede viajar largas distancias) y por reu-bicación de poblaciones debido a activi-dades humanas (reforestación no tecnifi-cada; 4, 5, 6). Otras hipótesis se enfocanen la existencia de poliplodía en el géne-ro, la cual no ha podido ser analizadacon éxito (7).

Los estudios cromosómicos son unaherramienta importante y básica para elanálisis intra e inter-poblacional, evolu-tivo y sistemático, permitiendo diferen-ciar especies morfológicamente simila-res o con un estatus taxonómico incier-to. Los conteos cromosómicos mitóti-cos y meióticos son usados comúnmen-te para determinar hibridización, rela-ciones entre especies, análisis de cario-


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tipos y translocaciones (8), ademásconstituyen la vía más directa para esta-blecer niveles de ploidía (9, 10).

De igual manera, el análisis delciclo celular presenta varias aplicacio-nes como eliminar el factor del azar yutilizar criterios objetivos para la tomade las muestras vegetales y esclarecerlas causas que determinan el rol de lapoliploidía (11, 12). Además, permitedeterminar la mejor hora del día para laprefijación, en función del número decélulas en división y de los componen-tes del índice mitótico (11). Estos datosconstituyen las herramientas principa-les para aumentar la efectividad de losmétodos químicos y físicos para lavisualización de cromosomas en espe-cies vegetales (13).

En el caso del género Polylepis, losestudios cromosómicos son relevantespara aclarar las hipótesis sobre poliploi-día, así como supuestos de hibridiza-ción y apomixis (3). Sin embargo,dichos estudios no se han podido reali-zar debido a la falta de una metodologíaestandarizada que permita la visualiza-ción de cromosomas metafásicos.

Simpson (16) menciona, en su estu-dio sistemático, que los ensayos no die-ron resultados específicos, y Kessler(15) observó números cromosómicosde 80 en muestras de raíces meristemá-ticas en tres especies de Polylepis, peroel conteo exacto no fue posible debidoal tamaño reducido de los cromosomasque fácilmente se pueden confundir con

partículas del colorante y suciedades(3). Posteriormente, Schmidt-Lebuhn etal., aseguran que debido al tamaño delos cromosomas y a la dificultad dedeterminar metafases en este género, esvirtualmente imposible obtener conteoscromosómicos (14).

La presente investigación presentauna metodología estandarizada que per-mite la visualización de fases celularesy cromosomas metafásicos en las espe-cies del género Polylepis, presentes enel Ecuador. Método que nos permitiráobtener por primera vez los númeroscromosómicos para el género Polylepis,datos sumamente importantes y básicospara aclarar las hipótesis sobre su ori-gen y evolución.

Además, los estudios del ciclo celu-lar en P. pauta y P. incana permitiránrealizar análisis genéticos comparativospara la determinación de mecanismoscitológicos como la duplicación somá-tica y la no reducción de los gametosque inducen poliploidía en plantas (17).

MATERIALES Y MÉTODOSMuestras de meristemo radicular y

botón floral de las especies del géneroPolylepis fueron obtenidas para estan-darizar la metodología para la obten-ción de cromosomas metafásicos, asícomo células en diferentes fases delciclo celular. Diferentes variaciones enlos procesos de pretratamiento, fija-ción, hidrólisis, tinción y preparaciónde placas, en base a las características

Estandarización de la metodología para el conteo cromosómico en especies del géneroPolylepis en el Ecuador


de los cromosomas observados en ensa-yos previos fueron utilizadas para laestandarización de la metodología.

Recolección de las muestrasvegetalesSe utilizaron muestras de meriste-

mos radiculares (1-2 cm de longitud)y ovarios de botones florales de lasespecies de género Polylepis las cua-les fueron colectadas durante losmeses de junio y julio del 2008, endiferentes localidades de los páramosecuatorianos.

Se tomaron datos de localizacióngeográfica, localidad, especie y tipo demuestras de cada una de las poblaciones.Se colectaron plántulas de 5–10 cm ymuestras de botones florales (Tabla 1).Las plántulas fueron transportadas con

bloques de tierra hasta los invernaderosdel laboratorio de la Carrera de Ingenie-ría en Biotecnología de la Escuela Poli-

técnica del Ejército, en donde fuerontransferidas a macetas con un sustratoapropiado para su enraizamiento con lafinalidad de obtener muestras de meris-temo radicular en forma regular y encantidades adecuadas para la estandari-zación de la metodología.

Los botones florales encontradosfueron pretratados en el sitio de colec-ción y transportados en un contenedorque permitía mantenerlos a temperatu-ras bajas. En el laboratorio, después delproceso de fijación y lavado, las mues-tras se almacenaron a -20 °C en etanolal 70% hasta su posterior uso.

Estudio del ciclo celularLos estudios del ciclo celular fueron

realizados en muestras de meristemoradicular en dos especies del género

Polylepis: P. pauta de la localidad dePapallacta, Páramo de Guamaní y P.incana de los Illinizas. El cálculo del



Especie Localidad Puntos GPS Muestra

P. incana Illinizas S 00 º12' 8.56''W 68 º40' 24.65'' Plántulas,Botón floral

Papallacta S 00 º19' 01.0'' W 78 º13' 28.6'' Plántulas,Botón floral

El Ángel, Potrerillos N 00 º48' 31.6'' W 77 º58' 31.9'' PlántulasMojanda N 00 º08' 18.9'' W 78 º5' 17.4'' Plántulas,

Botón floralP. pauta Papallacta S 00 º20' 41.5'' W 78 º12' 2.0'' Plántulas,

Botón floralMojanda N 00 º08' 07.4'' W 78 º15' 22.5'' Plántulas,

Botón floral

Tabla 1. Muestras de las especies del género Polylepis con sus detalles de localidad, puntos de localizacióngeográfica (GPS) y tipo de muestra colectada.


37


tamaño la muestra “n” o número decélulas en mitosis a analizar por cadahora de colección, fue determinadomediante la fórmula del tamaño mues-tral para la estimación de la proporciónpoblacional (18).

Donde la expresión correspon-de al percentil de la ley normal estándarcuyo valor es de 1.96 para un 95% deconfianza en el estudio, S2 es la varian-za de la proporción, su valor es de 0,25,ya que la varianza se maximiza con unaproporción poblacional estimada de0,5, debido a la ausencia de estudiosprevios en el género y E2 es el errormáximo permitido del 5%.

Para calcular el tamaño muestraltotal a analizar que incluye células eninterfase, se realizó una prueba pilotoen P. incana con un total de 3.751 célu-las de las cuales 1.332 eran mitóticas,esto nos indica que por cada 2,82 célu-las una se encuentra en mitosis. En con-secuencia, se debe multiplicar 2,82 porel tamaño muestral mitótico (385),determinado mediante la ecuación paraobtener el número de células totales quese deben contabilizar por cada hora decolección para obtener resultados conel 95% de confianza, el resultado es de1.085 células. Los datos tomados de laprueba piloto demuestran que se puedeencontrar en promedio 6,76 células en

mitosis por cada imagen proyectada,por lo que para lograr obtener las 385células mitóticas y por ende las 1.085células totales, 60 imágenes diferentesfueron analizadas.

Preparación de las placas. Para elestudio del ciclo celular se colectaronde tres a cuatro raíces meristemáticasde 1 a 2 cm de longitud directamente enel fijador Carnoy (etanol:ácido acético1:3; 19), cada 30 minutos, desde las7:30h hasta las 18:00 h. Después dehidrolizar con HCl (ácido clorhídrico)1N durante 25 minutos a 60 °C y teñircon aceto-carmín al 1% durante almenos tres horas a temperatura ambien-te, se prepararon las placas para suobservación.

Recopilación de datos. Fueron pre-paradas al menos tres placas, para exa-minar un total de 60 imágenes (20 porcada placa). Se anotaron las frecuenciasde interfases, profases, metafases, ana-fases y telofases encontradas en cadaimagen y se capturaron aquellas dondese observaron las mejores células encada fase. Las microfotografías fuerontomadas con una cámara fotográficadigital de 20 MPX adaptada al micros-copio invertido marca LOMO con unaumento de 1.040 X.

Análisis de los datos. Los cálculosdel índice mitótico (IM) y los índices defases (IF), parciales y totales se llevaron

S2a/2n=

Z

E

2

2

2

2a/2Z





a cabo mediante las ecuaciones utiliza-das por Matos & Molina (1997) (22) entrabajos realizados con Aloe vera.

PretratamientoMeristemo radicular. Una vez

conocida la o las horas apropiadas parala recolección de las muestras, se colec-taron meristemos radiculares limpiosde 1 - 2 cm de longitud en microtubosque contenían los diferentes agentesantimitóticos, permitiéndonos variartanto la concentración, como la tempe-ratura y el tiempo de aplicación para laestandarización del proceso (Tabla 2).

También fueron probadas temperaturasbajas durante 4 horas antes de usar losagentes químicos.

Botones florales. Las muestrasfueron pretratadas a diferentes horasdel día en los sitios de colección en 8hidroxiquinolina 2mM y agua heladadurante 24 horas a 4 °C (20, 19),razón por la cual no se determinó lahora de colección.

FijaciónMeristemo radicular. Se usaron

diferentes soluciones de fijación: ácidoacético, etanol (1:3; 26) ácido acético,cloroformo, etanol (1:3:6; 19) y meta-nol, ácido propiónico, cloroformo(6:3:2; 21). Los meristemos radicularesdespués de varios lavados con agua

IM= x100

x100

No. células en mitosisNo. células totales

IF=No. células en fase

No. total de células en mitosis

Tabla 2. Agentes inhibidores de la mitosis, con sus detalles de variación en la concentración, tiempo y tem-peratura utilizados para estandarizar el proceso de pretratamiento en muestras de meristemo radicular.

Agente Tratamiento

Concentración Periodo Temperatura

Agua helada 24 horas 4 ˚C48 horas 0 ˚C4 horas

8-hidroxiquinolina 2mM 3 horas 4 ˚C

4 horas RT*

5 horas24 horas

1 hora RT más 24 h a 4 ˚C

Colchicina 0,2 % 1 hora RT0,5 % 2 horas

3 horas

*RT, Temperatura ambiente (16 – 18 °C).



destilada fueron fijadas en dichas solu-ciones ensayándose diferentes tiempos:4, 21, 22, 23, 24 y 48 horas, a diferen-tes temperaturas: 4 ºC y a temperaturaambiente. En caso de no usarlas inme-diatamente, luego de la fijación se repi-ten los lavados y se preservan en alco-hol al 70% a -20 ºC, hasta su posterioruso.

Botones florales. Las muestras pre-tratadas en el lugar de colección, fueronfijadas en una solución de etanol, ácidoacético (3:1; 19) durante 24, 48 y 72horas a 4°C. Posteriormente fueronlavadas para ser preservadas en etanolal 70% a -20 °C, hasta su posterior uso.

HidrólisisMeristemo radicular. Después de

lavar la muestra se utilizó una hidrólisiscon HCl 1N a 60 °C (11), ensayandodiferentes tiempos (5, 10, 15, 20, 25,30, 40 y 60 minutos).

Botones florales. Fueron retiradosdel etanol al 70% y disectados para obte-ner los ovarios y estambres (Figura 1),los cuales fueron lavados para someterlosal proceso de hidrólisis en HCl 1N a 60°C (11), ensayando diferentes tiempos (5,10, 15, 20 y 25 minutos).

Tinción y preparación de placas.Fueron probados diferentes colorantes:aceto-carmín/orceína 1%, aceto-car-mín/orceína 2%, propiónico car-

mín/orceína 1%, lacto-propiónico orce-ína 2% (26, 27) y Reargent Shiff (10).Después de hidrolizar y lavar la mues-tra, se colocó el colorante en el micro-tubo, durante diferentes periodos detiempo: 1, 2, 3 y 24 horas, a temperatu-ra ambiente y 60 °C. Una vez teñidaslas muestras, se prepararon las placascon la técnica convencional del aplasta-do o squash (11).

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEstudio del ciclo celular. El estu-

dio microscópico de las células mitóti-cas e interfásicas en meristemos radica-les permitió conocer cuantitativamenteel proceso de división mitótica en lasdos especies del género Polylepis: P.incana y P. pauta cuyos resultados yanálisis son presentados por primeravez para estas especies.

39

Figura 1. Botón floral de P. incana disectado paraobtener el ovario y los estambres (2.5X).



40


La determinación del ciclo celular yde la hora mitótica constituyen lasherramientas principales para aumentarla efectividad de los métodos químicosy físicos usados en la preparación yvisualización de los cromosomas enespecies vegetales, así como la elimina-ción del azar, utilizando criterios objeti-vos para la toma de las muestras. Deigual manera permiten determinar lapresencia de poliploidía como un pro-ceso de diversificación de las especiespropias de zonas montañosas (13, 11).La información obtenida en esta inves-tigación en relación al ciclo celularofrece la oportunidad de investigar pro-cesos de poliplodía en este género, nosolamente en las especies ecuatorianassi no a nivel regional.

Para la estimación del ciclo mitóti-co en las dos especies del géneroPolylepis, P. incana y P. pauta, fueron

analizadas un total de 55 200 células,discriminadas en células en interfase ycélulas en mitosis. En base a la eva-luación de un período de 12 horas delos índices de fase (IF) e índice mitó-tico (IM) parciales y totales, se esta-bleció que la mejor hora para la prefi-jación de las muestras de meristemoradicular en P. incana, está compren-dida entre las 08:00h y 08:30h(IM=57,50 %). Durante las demáshoras los IM fueron bajos, fluctuandoentre el 9 % (14H30) y 28 % (11H00)de la población celular (Figura 2). Esposible observar que el porcentaje deprofases ocupa la mayor parte de lapoblación celular en división, espe-cialmente entre las 08:00h y 08:30h.Durante las otras horas, las fases res-tantes (metafases, anafases y telofa-ses) se presentan en pequeña propor-ción, en forma irregular (Figura 3).

Quija-Lamina, P., Segovia-Salcedo, C. Jadán, M. & Proaño K.

Figura 2. Secuencia del ciclo celular en P. incana de los Illinizas en un periodo de recolección de12 horas


41


La mejor hora para la prefijación delas muestras de meristemo radicular en P.pauta, está comprendida entre las 8:00hy 9:30h (IM = 43,08 – 49,00 %), obser-vando un pico mayor a las 8:30h (IM =53,92%). Durante las demás horas los IMfueron bajos, fluctuando entre el 14 %(17:00 h) y 37 % (10:00 h) (Figura 4).

De igual manera, es posible observarque el porcentaje de profases ocupa lamayor parte de la población celular endivisión, especialmente entre las 08:00hy 10:00h. Durante las demás horas, senota una acumulación leve de telofases.Las fases restantes (metafases y anafa-ses) se presentan en pequeña proporción,en forma irregular (Figura 5).

Figura 3. Secuencia de los índices de fase en P. incana de los Illinizas en un periodo de recolección de12 horas.

Figura 4. Secuencia del ciclo celular en P. pauta del Páramo de Guamaní - Papallacta, en un periodo de reco-lección de 12 horas.



42



Las horas de colección obtenidaspara las dos especies son consistentescon otras investigaciones donde el mayornúmero de células en mitosis se observanen las primeras horas de la mañana hastaaproximadamente las 11:00h. Sin embar-go, es importante tomar en cuenta que elmomento del día en el cual las células semultiplican con mayor rapidez varía deuna especie a otra (22).

La curva de la Figura 2 nos permiteasumir un valor medio de 2 horas paraun ciclo de división celular completo enP. incana, por lo que la duración delciclo mitótico en base a la evaluaciónde los índices de fase (IF) e índicesmitóticos (IM) totales es de 29 minutos,de los cuales 18 minutos son ocupadospor la profase; cuatro minutos por lametafase, tres minutos por la anafase ycuatro minutos por la telofase. En P.pauta la Figura 4 nos permite asumir unvalor medio de tres horas para un ciclo

de división celular completo, por lo quela duración del ciclo mitótico en base ala evaluación de los IF e IM totales, esde 53 minutos, de los cuales 35 minutosson ocupados por la profase; seis minu-tos por la metafase, cuatro minutos porla anafase y siete minutos por la telofa-se. En las Figuras 6 y 7 se muestranfotografías de fases mitóticas observa-das en las especies evaluadas.

Se destaca un mayor tiempo para lascélulas en interfase, aunque una vez ini-ciada la actividad mitótica, las célulaspermanecen más tiempo en profase, laanafase dura un lapso más corto, lo queconcuerda con Raven, Evert & Curtis(1976) (23) quienes señalan que lasfases de la mitosis son variables en lon-gitud siendo la profase la más larga y laanafase la más corta. En este sentido,las frecuencias de las fases mitóticaspermanecen dentro de los rangos nor-males reportados (23, 24).

Figura 5 Secuencia de los índices de fase en P. pauta del Páramo de Guamaní-Papallacta, en un periodo derecolección de12 horas.


43


La variación presentada tanto en lahora de colección como en la duracióndel ciclo mitótico y sus distintas fasesen P. incana y P. pauta, se debe posible-mente a la propiedades celulares decada especie y a su distinta reacciónante la acción de factores ambientales(11), probablemente se obtendrán resul-tados diferentes en las mismas especiesbajo diferentes condiciones.

En las dos especies se registra cier-ta irregularidad en el curso del ciclocelular, caracterizado por un mayorporcentaje de profases dentro de lapoblación celular en división y a unaacumulación de telofases en P. pauta,indicándonos la presencia ciclos irregu-lares. La alternancia de interfases nor-males con mitosis irregulares en otrasespecies analizadas como oca y olluco,constituyen uno de los probables meca-nismos de poliploidización (11).

Estandarización de la metodolo-gía. La metodología que se logró estan-darizar para el conteo cromosómico uti-lizando muestras de meristemo radicu-lar y botón floral, para las especies delgénero Polylepis, no se basó en un pro-tocolo específico, sino sobre la base delas características de los cromosomasdescritos por Kessler (1995) (28) entres especies de Polylepis: P. neglecta,P. triacontandra, P. tarapacana, quienobservó numerosos cromosomas (2n =82) de tamaños sumamente pequeños,los que se confundían con las partículasde colorante (3).

Pretratamiento de las muestras.Otro factor crítico, a más de la determi-nación de la hora de colección apropiada,para mejorar los resultados del procesode pretratamiento, es el tipo de agenteinhibidor de la mitosis que se utiliza (25).

Figura 6. Algunas de las fases mitóticas observadasen P. incana de los Illinizas. (a) Interfase, (b) Profase,(c) Metafase, (d) Anafase, (e) Telofase. Barra repre-senta 5 μm.

Figura 7. Algunas de las fases mitóticas observadasen P. pauta del Páramo de Guamaní. (a) Interfase, (b)Profase, (c) Metafase, (d) Anafase y (e) Telofase.Barra representa 5 μm



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En los pretratamientos con agentes quí-micos no se obtuvo buena condensacióny dispersión de los cromosomas como seobservó al utilizar temperaturas bajaspositivas de 4 °C (Figura 8). La utiliza-ción de frío o calor, previo al tratamientocon sustancias químicas, ayuda a deses-tabilizar los microtúbulos. Además, eltratamiento previo de meristemos radicu-lares con frío induce la acumulación decélulas en metafase (26) condición dese-able para la realización de pretratamien-tos con agentes químicos. Sin embargo,en este caso la utilización de frío noayudó a mejorar la acción de la 8-hidro-xiquinolina. Por lo que se sugiere utilizarcomo pretratamiento, agua destilada a 4°C durante 24 horas, la cual se recomien-da cuando las especies a estudiar poseennumerosos cromosomas (19), como es elcaso del género Polylepis.

Se deben usar períodos de al menos24 horas y no más de 26 horas en aguadestilada a 4 °C, ya que la longitud delos cromosomas se acorta considerable-mente (19) y las células se destruyen.Los periodos cortos (cuatro horas) tam-poco arrojan buenos resultados, no seobserva destrucción celular pero tam-poco cromosomas claros e individuales.Con la utilización de la temperatura decongelación, se destruyen las células ysus componentes. Para las muestra debotones florales funcionan bien los pre-tratamientos utilizados en meristemoradicular.

Fijación de las muestras. Las tresmezclas de fijación, ensayadas durante24 horas a 4 °C proporcionaron buenosresultados en la interrupción de los pro-cesos vitales de la célula sin dañar suestructura (4). Se prefirió usar Carnoy(ácido acético:etanol 1:3; 19) ya que lasotras mezclas contenían cloroformo, elcual es un químico nocivo para la saludy el medio ambiente.

Hidrólisis de las muestras. El pro-ceso de hidrólisis con HCl 1N a 60 °Cfue estandarizado para las muestras demeristemo radicular, ovario y estambre,obteniéndose diferentes períodos detiempo, los cuales dependen de la natu-raleza del tejido (20). En las muestrasde ovario y estambre se obtuvo unabuena separación de las células sin des-trucción de las mismas con cinco y diez


Figura 8. Cromosomas metafásicos en muestras demeristemo radicular de P. microphylla de la localidadde Achupallas. Barra representa 5 μm.


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minutos respectivamente, tiempomenor al utilizado con raíces meriste-mos radiculares (25–30 minutos), debi-do probablemente a que tanto el tejidodel ovario como el del estambre sonblandos y están protegidos por las otrasestructuras florales externas a diferen-cia de la raíz que está expuesta directa-mente al suelo.

Tinción de las muestras. Lasuperposición, la pobre coloración yel tamaño extremadamente pequeñode los cromosomas son factores quehan limitado los estudios citogenéti-cos (27). Sin embargo, el uso deaceto-carmín o aceto-orceína ha faci-litado la obtención de buenos resulta-dos (28) en las especies donde se hanobservado dichos factores como es elcaso de las del género Polylepis (3).En el presente estudio, de todos loscolorantes probados, sólo el uso delaceto-carmín al 1% permitió obteneruna tinción adecuada de los cromoso-mas, fases celulares y citoplasmasclaros en las muestras de meristemoradicular y ovario.

La partículas del colorante quepueden confundirse con los cromoso-mas han impedido también obtenerconteos exactos en ensayos anterio-res en algunas especies de Polylepis(15, 16), ésta dificultad fue superadausando el colorante en baja concen-tración (1%) y filtrándolo, cada vezantes de utilizarlo, aunque esto impli-

caba un mayor tiempo de tinción, elcual se reduce calentando las mues-tras en el colorante. Cabe recalcarque concentraciones mayores delcolorante destruyen el tejido. Unavez teñidas las muestras pueden per-manecer en el colorante, debido a queel ácido acético del mismo actúa tam-bién como fijador (20), pero se debenevitar dejarlas durante largos perio-dos de tiempo ya que las partículasdel colorante tienden a sedimentaracumulándose en el tejido. Se reco-mienda mantener las muestras enrefrigeración para evitar la prolifera-ción de bacterias.

Números Cromosómicos. Los cro-mosomas son reconocidos por suimportancia en los estudios taxonómi-cos y evolutivos. El número cromosó-mico, teniendo en cuenta dos variables:el número básico y el nivel de ploidía,constituyen datos relevantes para laresolución de problemas taxonómicos yla comprensión de las tendencias evolu-tivas (29, 11). A pesar de esta importan-cia, los estudios cromosómicos comple-tos en las especies del género Polylepisno han sido realizados, se han intentadoconteos cromosómicos desde 1979 sinresultados específicos (3).

En el presente trabajo, se presentanpor primera vez los números cromosó-micos (2n) de la especies del GéneroPolylepis presentes en el Ecuador(Tabla 3), iniciando de esta manera el



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Especie Muestra Localidad No No. Cromosomas 2ncélulas

P. incana Meristemo El Ángel 2 38(1), 40(1) 38-40radicular Illinizas 23 38(11), 39(5), 40(4), 41(1), 42(2) 38-42

Papallacta 25 39(2), 40(7), 41(9), 42(7) 39-42

Ovario Papallacta 15 40(7), 41(3), 42(5) 40-42

P. pauta Meristemo Papallacta 1 71(1) 71RadicularOvario Papallacta 25 67(9), 68(2), 72(2) 73(2), 67 - 83

74(1) 75(1), 76(3), 77(1),78(1), 80(1), 81(1), 83(1)

Mojanda 12 70(6), 71(1), 72(1), 73(1), 70 - 8475(1), 78(1), 84(1)

P. sericea Ovario El Ángel 8 37(5), 39(2), 40(1) 37 - 40Fierrourco 25 39(10), 40(6), 41(7), 42(2) 39 - 42Yanacocha 9 59(2), 64(1), 66(1), 10(1), 59 - 77

71(1), 74(1), 76(1), 77(1)

P. microphylla Meristemo Achupallas 25 70(3), 71(1), 72(1), 73(2), 70 - 82radicular 74(4), 75(2), 76(1), 77(5),

78(2), 79(2), 82(2)

P. weberbauri Meristemo Zhud 10 37(9), 42(1) 37 - 42Radicular

Ovario Zhud 16 37(7), 38(1), 39(4), 40(2), 37- 4241(1), 42(1)

P. lanuginosa Meristemo Zhud 25 38(2), 39(8), 40(5), 41(5), 38 - 42radicular 42(5)

P. reticulata Meristemo Oyacachi 15 87(2), 94(1), 96(1), 104(3), 87 - 118radicular 108(2), 109(2), 111(1), 114(1), 118(2)

Ovario Soldados 11 36(5), 38(1), 39(1), 40(2), 36 - 4241(1), 42(1)

P. racemosa Meristemo Oyacachi 25 69(9), 70(4), 71(3), 72(2), 69 - 80Radicular 74(3), 76(2), 78(1), 80(1)

Ovario Oyacachi 2 72(1), 77(1) 72 - 77

Tabla 3. Números cromosómicos somáticos de las especies del género Polylepis con detalles de muestra uti-lizada, localidad y número de células metafísicas analizadas.


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conocimiento cromosómico de estegénero y contribuyendo a su delimita-ción taxonómica. La variación presen-tada en los números cromosómicosdentro de las especies y entre poblacio-nes de la misma especie nos confirma,por primera vez, la presencia de poli-ploidía en el género en poblacionesnaturales, lo cual estaría indicando laimportancia de los cambios cromosó-micos numéricos en la diversificaciónde las especies de este género, posible-mente debido a causas, entre ellasmedioambientales, que aún no estánmuy claras.

Teniendo esta diversidad denúmeros cromosómicos y niveles deploidía, es obvio que tanto la aneu-ploidía como la poliploidía han juga-do un rol importante en la evolucióndel género Polylepis, así como enotros, lo cual lo convierte también enun género atractivo para el análisis dedichos eventos (25 ). En el futuro,sería interesante estudiar los cromo-somas de un mayor número de pobla-ciones, establecer las relaciones entrelos niveles de ploidía y su localiza-ción geográfica, hábitat, etc. Además,sugerir modelos evolutivos para lasespecies de este género cuyo rol eco-lógico es fundamental para el ecosis-tema en donde habita. En la Figura 8se presenta una fotografía de cromo-somas metafísicos de P. microphylla,resultado de la utilización de la meto-dología antes descrita.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio se realizó gracias alapoyo económico del Proyecto Pára-mo Andino, Tropical Developmentand Conservation Program y la Escue-la Politécnica del Ejército con su pro-grama de iniciación científica ESPE2008.

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Análisis RAPD de la diversidad genéticade Theobroma cacao L. de una población

del Litoral Ecuatoriano

Mercedes Carranza1, Emmerick Motte2, Virna Cedeño2, Orly Cevallos1, Silvia Saucedo1,Hayron Canchignia 1, Ariel Escobar1.

1Unidad de Investigación, Laboratorio de Biotecnología, Universidad Técnica Estatal de Quevedo.Quevedo, Los Ríos, Ecuador. [email protected]

2Laboratorio del Programa de Biotecnología. Universidad de Guayaquil. Guayaquil(Guayas, Ecuador)


RESUMEN.- En este estudio, los análisis con marcadores RAPD (Random Ampli-fication of Polymorphic DNA) fueron usados para estimar la diversidad genética yla relación de 20 accesiones de Theobroma cacao L. de la variedad Nacional en lafinca (La Buseta) ubicada en la Parroquia Tenguel provincia del Guayas. Las plan-tas fueron seleccionadas con criterios de productividad, resistencia, susceptibilidada enfermedades causadas por hongos como Ceratocystis fimbriata, Moniliophtoraroreri y Crinipelis perniciosa. Se utilizaron 14 primers, de los cuales nueve ampli-ficaron, generando 67 bandas de las cuales 59 (88%) fueron polimórficas. Losresultados indican la formación de dos grupos de accesiones A y B, en el grupo Ase incluyen dos accesiones y, en el grupo B se encuentran 18 de los cuales inclu-yen 2 subgrupos B1 y B2. E el subgrupo B1 se incluye la accesión (L-22-H-40), yen el subgrupo B2 están incluidas las accesiones que poseen características de pro-ductividad. El nivel de diversidad génica más alto se obtuvo con los primers OPC04 (0,80), OPC 07 (0,82) y el nivel más bajo fue OPC 01 (0,37). Las accesiones (L-22-H-40; 0,75; L-34-H-07; 0,86) y el (L-42-H-60; 0.72) presentaron los niveles devariabilidad génica más altas, siendo los valores más bajos los mostrados por lasaccesiones (L-26-H-64; 0,48) y (L-23-H63; 0,47). El valor de la diversidad total(Ht) obtenida para las 20 accesiones de T. cacao L. mediante RAPD fue de 0,636.

PALABRAS CLAVE: accesiones, génica, polimórficas, subgrupos.

ABSTRACT.- In this study, the analysis with RAPD (Random Amplification ofPolymorphic DNA) was used to estimate genetic diversity and relationships of 20accessions of Theobroma cacao L. National variety on the farm (the minibus)located in the parish Tenguel province of Guayas. Plants were selected on criteria


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Análisis RAPD de la diversidad genétic de Theobroma cacao L. de una población delLitoral Ecuatoriano

of productivity, resistance, susceptibility to diseases caused by fungi such as Cer-atocystis fimbriata, Moniliophtora roreri and Crinipelis perniciosa. We used 14primers, nine of them amplified, generating 67 bands of which 59 (88%) werepolymorphic. The results indicate the formation of two groups of accessions A andB. The group A includes two accessions while in B are 18, divided in two sub-groups B1 and B2. The subgroup B1 includes the accession (L -22-H-40) and thesubgroup B2 includes accessions that have productivity features. The highest levelof genetic diversity was obtained with the primers OPC 04 (0.80), OPC 07 (0.82)and the lowest was OPC 01 (0.37). Accessions (L-22-H-40; O.75; L-34-H-07;0.86) and (L-42-H-60; 0.72) had levels of genetic variability quite large, reachingthe lowest values shown by the accessions (L-26-H-64; O.48) and (L-23-H63;O.47). The value of the total diversity (Ht) obtained for the 20 accessions of T.cacao L. RAPD was 0.636.

KEYWORDS: Accessions, gene, polymorphic, subgroups

INTRODUCCIONEl cacao (Theobroma cacao L.) es

una de las principales plantas perennesde uso agroindustrial que se cultiva enla mayoría de países que se encuentranen la zona intertropical; tiene granimportancia dentro de la economía delEcuador que es exportador desde 1830del cacao fino de aroma a base de lavariedad conocida como Nacional (1).En la actualidad la superficie cultivadaen el país de cacao se estima en aproxi-madamente 362 120 hectáreas, con unaproducción anual de 95 000 TM y unrendimiento de 0.27 TM/ha-1, lo quesignifica 5,40 quintales por hectárea alaño (2). El Banco de germoplasma decacao variedad “Nacional” existente enla finca experimental “La Buseta”, pro-piedad de la Universidad Técnica Esta-tal de Quevedo, es el resultado de la

colección sistemática de muestrasrepresentativas de cacao Nacional exis-tentes en la región desde la década del40 por la United Fruit. Sin embargo,esta caracterización se ha basado encaracteres fenotípicos, directamenteinfluenciados por factores ambientales,herencia multigénica, herencia cuanti-tativa y por la dominancia parcial dealgunos caracteres, la cual puede con-fundir la expresión de un rasgo genéti-co (3).

El mejoramiento genético en culti-vos perennes puede tomar varios años yen el caso del cacao puede llevar de dieza doce años hasta lograr un nuevo culti-vo; este proceso puede ser aceleradomediante el uso de técnicas moleculares,las cuales han demostrado ser herra-mientas útiles para el mejoramientogenético y para la selección de varieda-


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des con características importantes Conla identificación de marcadores molecu-lares asociados a loci que codifican tantopara características cualitativas comocuantitativas (QTL´s), por su acrónimoen inglés, es posible realizar una selec-ción asistida por marcadores (4).

El presente trabajo busca identificary caracterizar clones de cacao de lavariedad Nacional de las cuales existenregistros de comportamiento en campo,utilizando marcadores molecularesRAPD´s, la cual es una herramientaadecuada para estudios genéticos, yaque destacan en la mayoría de los casoslas limitaciones de los métodos tradi-cionales (5); además, se lograría unamejor reclasificación de los materialesen grupos de determinadas tendencias ysería de incalculable ayuda para traba-jos a mediano plazo en la obtención deprogenies con características estabiliza-das gracias al descarte de plántulas

inestables con las cuales se podría ini-ciar programas de mejoramiento gené-tico. El objetivo de este estudio fue esti-mar la diversidad genética de unacolección de Theobroma cacao L.variedad Nacional usando marcadoresRAPD´s.

MATERIALES Y METODOSLas muestras foliares de las 20

accesiones de cacao fueron recolecta-das e identificadas en la Finca “LaBuseta” ubicada en la Parroquia Ten-guel provincia del Guayas, Ecuador,Figura 1; posteriormente llevadas alLaboratorio del Programa de Biotecno-logía de la Universidad de Guayaquilpara la extracción de ADN. Las acce-siones fueron seleccionadas en base alos siguientes criterios: productivo,tolerante, susceptible y resistente aMonillia, susceptible y resistente aCeratocystis y susceptible a Crinipellis.

Figura 1. Ubicación geográfica de los principales bancos de germoplasma de cacao Nacional y plano dela finca La Buseta (centro de cacao de aroma Tenguel) Provincia del Guayas de donde se seleccionaron lasaccesiones de Theobroma cacao L.

Mercedes Carranza, Emmerick Motte, Virna Cedeño, Orly Cevallos, Silvia Saucedo,Hayron Canchignia , Ariel Escobar


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El análisis estadístico se basó en lacodificación de cada banda polimórfi-ca representada a través de las varia-bles presencia (1) o ausencia (0) losmismos que fueron procesados con elmétodo de agrupamiento UPGMA(Unweighted Paired Prouping Methodwith Arithmetic Average) y el coefi-ciente de similitud de Nei & Li (1979)(6). Se registraron por inspección enuna matriz de datos binarios en el pro-grama Ntedit del paquete estadísticoNtsys pc ver. 2,0 (Applied Biostatis-tics Inc, 1998). No se tomaron encuenta polimorfismos que involucrendatos dudosos.

Para la extracción de ADN decacao se probaron algunos protocolosaplicados a tejidos vegetales, con lafinalidad de obtener ADN de buenacalidad y aplicable a todas las mues-tras sometidas al proceso de extrac-ción. El protocolo modificado (Doyle& Doyle 1990) (7) fue el que mejoresresultados dio en cuanto a la calidad yconcentración del ADN. La integridady concentración del ADN fueron ana-lizadas por electroforesis en minigelesde agarosa al 1,2% en tampón TAE1X. La electroforesis se realizó a 90 Vpor 30 min. (8).

Las muestras de ADN fueron ampli-ficadas utilizando el protocolo propues-to por Faleiro (2001) (10); 40 cicloscada uno constituido por el primer seg-mento 94º C 4’, segundo segmento 15´´a 94 ºC, 30´´ a 36 ºC 90 ´´ a 72 ºC, ter-

cer segmento 7 minutos a 72 ºC, y Con-servación a 4 ºC). A cada muestra secolocó 3 ml de una mezcla de azul debromofenol (0,25%; 10). Para la mez-cla de la AP-PCR en cada tubo de reac-ción se colocó una alícuota de lossiguientes componentes: ADN (5ng/ml) 1,00 ml 10X buffer, 5 ml 50mMClMg, 5 ul primer (1,0 mM), 2,00 mldNTPs (2,5 mM cada uno), 4,00 ml Taqpolimerasa Invitrogen (5 U/ml) 0,2 ml,agua ultra pura 31,8m volumen final:50,00 ml. Se probaron 14 primers(OPA-02, OPA-04, OPA-07, OPA-12,OPA-15, OPA-16, OPC-01, OPC-04,OPC-08, OPC-09, OPC-10, OPC-07,OPC-13, OPC-14), mismos que hansido empleados en trabajos anterioresde caracterización y diversidad genéti-ca de cacao realizados por (Faleiro etal. 2002 y Araujo et al. 1999) (9), res-pectivamente.

RESULTADOS Y DISCUSIONLa extracción de ADN de cacao se

la realizó a partir de hojas de cacao enestado intermedio de madurez, las cua-les mostraron los mejores resultados,con el protocolo modificado de Doyle yDoyle (1990), se obtuvo ADN de buenacalidad y cantidad, sin degradación,que migró en el gel de agarosa comouna banda única de alto peso molecular(Figura 2).

Utilizando las condiciones óptimasde amplificación fue posible analizar ladiversidad genética de 20 accesiones de

Análisis RAPD de la diversidad genétic de Theobroma cacao L. de una poblacióndel Litoral Ecuatoriano


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cacao. De los nueve primers utilizadosse generaron un total de 67 bandas conun buen nivel de repetitividad. De ellasel 88% (59) bandas mostraron perfilespolimórficos (Tabla 1).

Sobre los 14 primers probados sepudo obtener marcadores RAPD´s diri-gidos a tres de las 20 accesiones, de loscuales nueve primers (OPA-15, OPC-07, OPC-9, OPC-4, OPA-O3, OPC-1,OPA-12, OPC-13 y OPA-7) amplifica-ron bandas claras y reproducibles.

Estos primers fueron aplicados a las 20accesiones con dos repeticiones mos-trando perfiles polimórficos. (Figura 3).

Los datos obtenidos con los nueveprimers permitieron la construcción deun dendrograma que mostró las relacio-nes génicas entre las 20 accesiones decacao (Figura 4). Este dendrogramamostró dos grandes grupos A y B, elgrupo A se incluyó a las accesiones (L-30-H-62) que fenológicamente poseencaracterísticas de susceptibilidad a Cri-

Figura 2. Bandas de ADN a partir de la extracción de 10 accesiones de Theobroma cacao L con el méto-do modificado de Doyle y Doyle (1990).

Código Operón Productos amplificados PolimorfismoMonomórficas Polimórficas (%)

OPA-15 1 8 87OPA-03 2 9 77OPC-04 2 3 33OPC-13 1 5 80OPA0-07 0 6 100OPC-09 1 7 85OPA-12 0 8 100OPC-01 1 7 85OPC-07 0 6 100

TOTAL 8 59

Tabla 1. Productos RAPD amplificados con nueve primers decaméricos en 20 accesiones de Theobromacacao L. existentes en la finca la Buseta.



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nipellis y la accesión (L-34-H07) resis-tencia a Ceratocystis, y en el grupo B seencuentran las 18 accesiones restantes elcual incluye dos subgrupos B1 y B2, enel subgrupo B1 se incluye la accesión(L-22-H40) el cual fenológicamenteposee características de resistencia aCrinipellis. Y el subgrupo B2 en dondeestán incluidos las accesiones que pose-en características de productividad. Losprimers que produjeron los niveles másaltos de diversidad fueron OPC 04(0,80) y OPC 07 (0,82). El primer quereportó el nivel más bajo fue OPC 01(0,37). Las accesiones que presentaronlos niveles de variabilidad más altos fue-ron (L-22H-40; 0,75; L-34-H07; 0,86) y(L-42-H60; 0,72) mientras que los valo-res más bajos los mostraron las accesio-nes (L-26-H64; 0,48) y (L-23-H63;0,47). La diversidad génica total (Ht)obtenida para las 20 accesiones de cacaomediante RAPD´s fue de 0,636.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos permitenconcluir que el mejor protocolo deextracción de ADN de Theobromacacao L. fue el propuesto por Doyle yDoyle (1990) con modificaciones des-arrolladas en nuestro laboratorio.

Los primers OPC-4 y OPC-7 mos-traron los niveles de diversidad másaltos. Los niveles de diversidad mediapara los primers usados en todas lasmuestras fue de (Ht=0.63). Los por-centaje de bandas polimórficas paralas 20 accesiones de cacao fue 88%con los nueve primers. Las accesionescon características de productividadmediante el análisis RAPD fueronagrupadas en el mismo grupo B2.

Con el propósito de contribuir conla selección asistida por marcadores(MAS) es imperioso desarrollar otrosmarcadores moleculares hasta alcanzarla cobertura completa del genoma de

Figura 3. Perfiles RAPDs obtenidos con el primer OPA- O3. Carril 1 al 20 accesiones de Theobromacacao L Se marcan con una flecha algunas bandas Monomórficas ( Ver tabla 1 para la identificación de lasaccesiones) .

1 5 10 15 18 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 16 17 19 20



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Theobroma cacao L. como los AFLP(Amplificación de fragmentos de longi-tud polimórfica) y SSCP (Polymerasechain reaction single- strand conforma-tion polymorphism).

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2. SICA. 2005. Servicio de informa-ción agropecuaria del Ministerio deAgricultura y Ganadería del Ecua-


Figura 4. Dendrograma de las 20 accesiones de Theobroma cacao L. basado en los RAPDs obtenidos conel coeficiente de similitud de Nei y Li y el método de agrupamiento UPGMa (los números indican a cada acce-sión, las letras A y B representan cada una de los grupos principales del árbol y las letras B1 y B2 correspon-den a los sub grupos). RCr resistencia Crinipellis, RC resistencia a Ceratocystis, P Productores, SC suscepti-ble a Ceratocystis, SCr susceptible a Crinipellis, RM resistencia a Monillia TM Tolerante a Monillia, SM sus-ceptible a Monillia



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dor. Ecuador: Producción mundialde cacao. Fuente:1991-1995- Siste-ma Estadístico Agropec. Nacional -INEC-1996-1999 Direcciones Pro-vinciales -MAG- DIA *ProyectoECUANECACAO- Elaboración:Proyecto SICA/MAG- Ecuador(www.sica.gov.ec) 14/septiem-bre/2005.

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Control de nemátodos en maracuyáusando benzimidazoles en ácidos húmicos

Carlos A. Soria

Laboratorios Labitech Cia. Ltda., Quito. Pontificia Universidad Católica del Ecuador, [email protected]

Recibido: 2010-04-19, aprobado 2010-08-25

RESUMEN.- Los nemátodos son un problema fitosanitario en los cultivos demaracuyá. Su presencia se asocia, generalmente, con el aparecimiento de nódulosradiculares que obstruyen el flujo savial, disminuyen la vida de la planta y afectanconsiderablemente su producción. Del estudio fitonemático del maracuyá, se des-cubre su susceptibilidad al ataque de géneros polifitófagos encontrados, comoMeloidogyne, Helicotylenchus y Rotylenchus.

Los benzimidazoles son compuestos orgánicos cíclicos nitrogenados con acti-vidad antiparasitaria. Bioterr de Labitech, un nematicida formulado con derivadosde benzimidazol, nos permitió estudiar su efecto novedoso en el control de nemá-todos, más aún, si se administra acompañado de ácidos húmicos (Orgánica, Labi-tech), conocidos como modificadores de los corpúsculos de suelo y como acarrea-dores moleculares, en presencia de saprófitos poco afectados por el benzimidazol.Los controles indicaron una infección significativa con nemátodos, algunos, forma-dores de nódulos radiculares, pocas raicillas nuevas, menor peso radicular y menorproducción. Mientras que en los cultivos tratados, se observó lo contrario: dismi-nución significativa de nemátodos, presencia de más raicillas, mayor peso radicu-lar y aumento significativo de la producción.

PALABRAS CLAVE: maracuyá, nemátodos, control, benzimidazol, rendimiento.

ABSTRACT.- Nematodes are a very common phytosanitary problem for pas-sion fruit, causing the appearance and proliferation of typical root nodules whichobstruct sap flux, reduce yield production and plant’s life expectancy. Susceptibil-ity of this crop is mainly to the attack of phytonematodes belonging to the genera:Meloidogyne, Helicotylenchus and Rotylenchus.

Benzimidazoles are cyclic nitrogenated organic compounds with anti- parasiteactivity. Bioterr from Labitech, formulated with types of benzimidazole, allowedus to study its novel effect in phytonematode´s control when administered with


59Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicos


humic acids, known as soil corpuscle modifiers and molecular carriers. Little effectwas found in saprofites also considered as soil modifiers. Controls indicated a sig-nificant nematode infection, evidenced by the presence of root nodules, absence ofsecondary roots, lower root weights and scarce production, contrary to the resultsobserved after treatment, evidenced by a significant reduction of numbers of nema-todes, presence of secondary roots, increased total root weight and better yields.

KEYWORDS: passion fruit, nematodes, benzimidazole, control, better yields.

INTRODUCCIONLos nemátodos fitófagos, phylum

Nematoda, clase Secernentea del ordenTylenchida, son las plagas que más dañocausan a la agricultura (1) ocasionandoproblemas como pudrición o daños a laraíz de más de 2 000 especies de hortali-zas, leguminosas y frutales (2, 3).

Cuando el parásito daña los tejidosexternos de la raíz o avanza hacia elconducto interno radicular, inyecta sustoxinas esofágicas y puede transmitirvirus, bacterias u hongos que ingresan através de las heridas ocasionadas. Sereporta, por ejemplo, infecciones conFusarium oxysporum a través de lesio-nes causadas por Pratylenchus sp. (4) oMeloidogyne sp. (5).

El ataque del género Meloidogyne esel más común (5) y se caracteriza por elaparecimiento de nódulos o agallas en laraíz que obstaculizan el flujo de nutrien-tes y pueden causar necrosis tisular.

Pero los nematoparásitos son diver-sos, algunos de vida libre o ectoparási-tos (Trychodoridos) fáciles de contro-lar; otros facultativos (ecto o endopará-

sitos), productores de huevos conmatrices gelatinosas (Meloidogyne,Tylenchus, Rotylenchus) o quistes (Glo-bodera, Heterodera) difíciles de elimi-nar; y, además, otros endoparásitos exi-gentes (Pratylenchus, Rodopholus),cuyo control resulta aun más difícil porestar protegidos dentro de tejidos radi-culares, por ende, difíciles de ser alcan-zados y fácilmente transmisibles de unaplantación a la siguiente (1).

Estos diferentes tipos de parasitis-mo, solos o en sinergismo entre ellos,debilitan a las plantas huéspedes, oca-sionando pérdidas económicas calcula-das en miles de millones de dólares anivel mundial, ya sea por mermas en laproducción, aumento de la mortalidaddel cultivo o por la suma de las dos (2,5, 6).

Productos fosforados o carbamata-dos, tóxicos tanto para el usuario comopara el medio ambiente, se han utiliza-do por mucho tiempo en controles fito-sanitarios. En humanos y animales, elefecto de los organofosforados se midepor la inhibición de la colinesterasa,



enzima que interviene en la hidrólisisde la acetocolina, en las sinapsis neuro-nales colinérgicas. El uso continuo deestos organofosforados se asocia condaños neuronales (2, 7, 8).

El benzimidazol y la úrea sustituidason los componentes principales delBioterr de Labitech Cia. Ltda., unanueva alternativa para control fitone-mático, libremente soluble en el aguade riego y de fácil migración en elsuelo, por difusión y convección.

En el Ecuador, el cultivo de maracu-yá, Passiflora edulis, se ha extendido aaproximadamente 30 000 ha, principal-mente en las provincias de Los Ríos,Guayas, Manabí, Bolívar, Esmeraldas ySanto Domingo de los Tsáchilas (9). Losnemátodos están entre los problemas fito-sanitarios más comunes de este cultivo.

Durante este estudio, se probaría laeficacia antinemática de una formula-ción con derivados de benzimidazol yácidos húmicos, en maracuyá. Se reco-nocería y cuantificaría los diferentestipos de nemátodos en muestras desuelo control y tratado. Se estudiaría losdaños ocasionados a la raíz y se asocia-ría este parasitismo con disminución enlos niveles de producción.

MATERIALES Y METODOS

CultivosSe utilizaron 6 ha de cultivos

comerciales de maracuyá en cinco fin-cas pequeñas de Chone. Cada ha enproducción constaba de 750 plantas

adultas de dos años de edad. Tres de lasfincas, totalizando 4 ha, fueron asigna-das para recibir tratamiento; las otrasdos no recibieron ninguno y sirvieronde control.

TratamientoBioterr (Labitech Cia. Ltda.) es un

nematicida consistente de 150 g de deri-vados de benzimidazol y 820 g de úreaamoniacal más excipiente, por kg. Orgá-nica (Labitech) es un desestresante yactivador de suelos que contiene 150 g deácidos húmicos por litro de producto.

Las plantas tratadas recibieron 188mg de Bioterr (benzimidazol) y 188 mgde Orgánica (ácidos húmicos), aplica-dos en 250 cc de agua de riego porplanta. El producto fue aplicado unasola vez, en drench, de acuerdo con lasinstrucciones del fabricante. Previo a laaplicación, el suelo debe estar húmedoa capacidad de campo, para favorecer lapenetración del producto hacia el sectorde las raíces secundarias donde se loca-liza mayormente la infección (10). Elresultado que se obtenga, dependerátotalmente de esta condición.

Conteo e identificación denemátodosMuestras de 100 g de suelo colecta-

das al azar, totalizando aproximada-mente 1 kg por cada finca, por control opor suelo tratado, fueron mezcladas enuna funda plástica, separado los contro-les de los suelos tratados.

60 Carlos A. Soria


61Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicos


De cada total de muestra provenien-te de cada finca, se pesaron 20 g desuelo, cantidad que fue suspendida conagitación continua durante dos min, en250 cc de agua de la llave reposada(durante la noche) en botellas cilíndri-cas de boca ancha, de 500 cc de capaci-dad. Luego se dejó decantar durante 1minuto y el sobrenadante fue filtradopor malla de tela fina.

A continuación se pasó por unamalla de 40 um, y lo que quedó en lamalla fue recolectado y lavado con 20cc de agua en un vaso de precipitación.De esta fracción, se tomó una muestravolumétrica de 5 cc, la cual fue deposi-tada en una caja petri para el conteo oidentificación de nemátodos en 25 cam-pos, usando un estéreo microscopio con50 aumentos.

Se reportó el total observado porgénero, incluyendo estadíos larvales yadultos por volumen de muestra. Elresultado obtenido en cada muestra semultiplicó por 20 y se reportó comonúmero total por género (o grupo desaprófitos y otros) por 100 g de suelo.Los conteos corresponden al promediode 3 repeticiones.

Nódulos en las raícesSe estudiaron los nódulos radicula-

res en las raíces colectadas a 20 cm deprofundidad, de cada una de las 20plantas que sirvieron de control y porseparado, de otras 20 que recibierontratamiento.

Las raíces de cada grupo (15 g porplanta) fueron mezcladas manualmenteen fundas separadas, luego se pesaron100 g de cada grupo y se contaronnódulos de 3 mm o más de diámetro.Los muestreos y conteos de los contro-les y de las plantas tratadas se hicierona los 30 días posteriores a la aplicacióndel tratamiento; los nódulos encontra-dos se reportaron por 100 g de raíces encada grupo y para cada uno de tresensayos o repeticiones.

Desarrollo radicularSe seleccionaron al azar y en forma

separada tres plantas adultas tanto delcultivo control como del que recibiótratamiento. Se sacrificó cada una deestas plantas, se extrajo completamentela raíz y se procedió a pesarla y a repor-tarla en gramos, tanto el peso de las rai-cillas como el de la raíz total, incluidosu peso promedio.

ProducciónDurante tres semanas se registró la

producción semanal de maracuyá tantoen los cultivos que recibieron trata-miento como en los que no recibieron,y el resultado se reportó como kg deproducción semanal por ha; se calculótambién la producción promedio sema-nal. Los datos extrapolados de la pro-ducción en kg por ha fueron obtenidoscontabilizando el peso de la producciónsemanal de las dos fincas control, com-parado con la producción de las tres fin-cas que recibieron tratamiento.



EstadísticaSe realizaron análisis de varianza

para detectar diferencias estadísticas enlas muestras ensayadas y adicionalmen-te pruebas de significación de Tukey al0,05.

RESULTADOSLos resultados obtenidos (Figura

1, cultivo tratado) se expresaron comonúmero de nemátodos por género ypor muestra en 100 g de suelo, tantopara los controles como para lasmuestras tratadas. Muestreos y conte-os se realizaron 30 días después deaplicado el nematicida con los ácidoshúmicos.

Del conteo realizado en los sueloscontroles (Tabla 1), se pudo observaruna infección considerable de nemáto-dos parásitos (entre 160 hasta 400 indi-viduos por 100 g de suelo), de los géne-

ros Meloidogyne, Pratylenchus y Heli-cotylenchus, así como una poblaciónnumerosa de saprófitos (entre 300 y360). También se detectaron númerosmenores de Radophylus y Rotylenchus(entre 40 y 80) y de otros nemátodos(entre 100 y 160) que no pudieron seridentificados.

En las muestras de suelos que reci-bieron tratamiento, se notó una dismi-nución significativa (p < 0,05) en elnúmero de nemátodos de casi todos losgéneros parásitos con la excepción deRadophylus (p=0,058). Con el trata-miento, también se encontró una apa-rente disminución de saprófitos (de unpromedio de 330 a 293), pero esta dife-rencia en los resultados no fue signifi-cativa (p > 0,05).

Se reportaron nódulos en las raícestanto de los controles como de las plan-tas tratadas (Tabla 2). Se contaron de

125 a 155 nódulos(Prom = 138) por100 g de raíces con-troles. Y en lasplantas tratadas, elnúmero fue de 120a 150 (Prom =133); por lo tanto,tampoco hubo dife-rencias significati-vas (p >0,05) entreel número de nódu-los en las raícescontroles y losencontrados en lasplantas tratadas.

62 Carlos A. Soria

Figura 1. Cultivo de maracuyá tratado con benzimidazoles y ácidos húmicos (Fotode Abdón Tapia).


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Tres plantas adultas del grupo con-trol y 3 tratadas fueron sacrificadas parapoder observar completamente sus raí-ces (Figura 2, Tabla 3). Se encontródiferencias significativas (p<0,05) en elpeso promedio de raicillas nuevas enlas plantas tratadas (Prom = 8 g porplanta), comparado con el de los con-troles (Prom = 3 g por planta). De igualforma, el peso total de las raíces sin tra-

tamiento varió entre 197 y 210 g (Prom= 203 g) en comparación con las plan-tas tratadas que mostraron pesos entre250 y 281 g (Prom = 262 g), un resulta-do significativamente más alto que elreportado para los controles (p<0,05).

La producción semanal de las dosfincas sin tratamiento fue comparadacon la de las otras tres fincas que sí fue-ron tratadas. Cada una de estas produc-

Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicos

Género/ grupo Controles Tratados1(b) 2(b) Prom(c) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c)

Meloidogyne 400 360 380 80 100 60 80Pratylenchus 320 300 310 60 20 40 40Helicotylenchus 160 180 170 40 20 20 27Rodophylus 80 60 70 20 40 0 20Rotylenchus 40 60 50 20 0 0 7Otros 160 100 130 20 40 40 33Saprófitos 300 360 330 280 340 260 293

Tabla 1. Efecto del tratamiento con derivados de benzimidazoles y ácidos húmicos (a) sobre el númerode nemátodos en 100 g de suelo cultivado con maracuyá.

Número Número nódulos / 100 g de raíces

Ensayo Controles Tratados

1 155 1302 125 1503 134 120

Tabla 2. Efecto del tratamiento con derivados de benzimidazoles y ácidos húmicos (a) sobre el númerode nódulos en 100 g de raíces de maracuyá.

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta;(b)Repeticiones: 1,2,3; (c)Prom: promedio

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta.



ciones semanales (tres semanas) fueextrapolada y reportada como produc-ción semanal de maracuyá por ha (750plantas adultas por ha) en kg ( Tabla 4).Se encontró una producción promediode 245 kg semanal por ha comparadacon una producción significativamentemayor (p<0,05), promedio de 287 kg enlas fincas tratadas.

DISCUSIONLos benzimidazoles son compues-

tos orgánicos cíclicos nitrogenados,derivados de los imidazoles, con inten-sa actividad antiparasitaria en animalesy en el hombre. El tratamiento aplicadocon benzimidazoles y ácidos húmicos,para uso agrícola, nos permitió estudiarsu efecto novedoso en el control de losnemátodos del suelo (11).

La capacidad del tratamiento paradisolverse totalmente en el agua de

riego, facilita su uso. A esto se suma elhecho de ser aparentemente un produc-to no tóxico, de sello verde, cuyasmoléculas activas, además de actuarpor contacto, probablemente pueden serabsorbidas o acarreadas a través de laraíz hacia los tejidos infectados cerca-nos (12). Los otros componentes incor-porados, por ejemplo, la úrea sustituidaamoniacal y/o los ácidos húmicos,actuarían como moléculas catiónicascon poder surfactante y tensoactivo,que probablemente ayudarían en lapenetración o acarreo del benzimidazoly de los nutrientes del suelo.

Se sabe que la absorción radicularde un pesticida en solución acuosa,dependerá de su formulación y entreotros, de la presencia de los ácidoshúmicos y fúlvicos (13), como losadministrados, cuya incorporación alsuelo también ocasionan soltura cor-

puscular, oxigena-ción por aereacióny solubilización porquelación de salesinsolubles u otrosprincipios activosno disueltos (datosno reportados).

De lo encontra-do, se desprendeque estos cultivosde maracuyá sonbastante suscepti-bles al ataque devarios géneros de

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Figura 2. Raíces de maracuyá (Foto de Abdón Tapia)


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nemátodos polifitófagos (Tabla 1), delos cuales, los géneros Meloidogyne,Pratylenchus y Helicotylenchus fueronlos más abundantes en el estudio de losgrupos control. Otros, como Radophy-lus y Rotylenchus, se encontraron ennúmeros significativamente más bajos(p<0,05), comparados con Meloidogy-ne, por ejemplo, pero no por eso puedenser considerados infectivamente menosimportantes, ya que algunos son endo-parásitos portadores y transmisores deinfecciones virales (14).

Fue claro el control de la infeccióndespués del tratamiento, evidenciado

por la sanidad del cultivo (Figura 1) y lareducción significativa (p<0,05) en elnúmero de los nemátodos encontrados(Tabla 1). El benzimidazol, mejor aca-rreado parcialmente por los ácidoshúmicos, en contacto con el nemátodo,sea afuera en el suelo o dentro en laraíz, probablemente es absorbido a susistema muscular, por contacto externoo con el alimento, provocando parálisispor inhibición enzimática e incapacidadpara metabolizar la glucosa muscular.Interacciones del benzimidazol con lasglicoproteínas o con los esteroles de lasmembranas parasitarias (15), podría


Peso Sin tratamiento Tratados

(g) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c)

Raicillas 3 4 2 3 8 10 7 8

Raíces 203 197 210 203 255 250 281 262

Tabla 3. Efecto del tratamiento (a) sobre el peso de las raicillas y raíces de plantas de maracuyá.

Tabla 4. Efecto del tratamiento con benzimidazoles y ácidos húmicos (a) sobre la producción extrapoladasemanal de maracuyá en kg/ha/750 plantas.

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta;(b)Planta número: 1,2,3; (c)Prom: promedio.

Sin tratamiento Tratados

1(b) 2(b) 3(b) Prom(c) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c)

265 240 230 245 280 300 280 287

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta.(b)Semana número: 1,2,3.(c)Prom: promedio.



desencadenar en catástrofes metabóli-cas suficientes como para causar sumortalidad (16).

La poca mortalidad observada enlos saprófitos después del tratamiento,también resulta interesante (Tabla 1).Esta selectividad podría explicarse por-que éstos, al alimentarse de tejidosmuertos, en vez de tejidos vivos, comoes su hábito, no ingieren los antiparasi-tarios incorporados sistémicamente a lasavia (1, 12).

La presencia de saprófitos es unaventaja para el cultivo porque al serconvertidores de tejidos muertos ensubstratos, algunos asimilables, sevuelven remodeladores y acondiciona-dores iónicos de los suelos, más aun, enpresencia de ácidos húmicos (13). Es laactividad fisiológica de estos nemáto-dos, más la presencia de los ácidoshúmicos que actúan como quelantes oacarreadores iónicos, lo que permite laliberación de nutrientes que puedenestar localizados en algunos nichos y noen otros (17), causando, además, unmejor aprovechamiento del agua y deloxígeno del suelo (8).

El ataque del género Meloidogyne especuliar en más de 3.000 variedades decultivos (18) y se caracteriza por estimu-lar una multiplicación de células gigan-tes y aledañas, formadoras de nódulos,donde se acumulan toxinas, celulasas,proteinasas o radicales oxigenados dealta reactividad que suprimen procesosfotosintéticos y de respiración.

El cultivo queda disminuido en elflujo de nutrientes y agua por necrosisradicular y por el aparecimiento deinfecciones bacterianas, fungosas yvirales (5) que ocasionan bajos rendi-mientos, como se pudo observar en loscultivos control. Estos últimos mantu-vieron poblaciones altas de nemátodos(Tabla 1) y baja producción (Tabla 4).

Al estudiar las raíces control y lasdel grupo tratado (Figura 2), se encon-tró en ambos la presencia de agallas(Tabla 2) en números similares; esdecir, en cifras estadísticamente no sig-nificativas (p>0,05). Pero sí se observóuna renovación significativamenteabundante de raicillas (Tabla 3) en losgrupos tratados (p<0,05).

Estos resultados se explican porqueuna vez iniciado el daño del tejido conel aparecimiento de los nódulos (6),éstos permanecen temporalmente aunen ausencia de nemátodos que podríanhaber sido ya controlados por el trata-miento (12).

El número bajo de nemátodos que seencontraron en el suelo tratado 30 díasatrás, podría explicarse porque los ben-zimidazoles no sufren fácilmente bio-transformaciones (19) por descarboxili-zación, debido a su estructura anilladaque les confiere estabilidad; esta propie-dad, permite que estas moléculas puedanpermanecer activas en el suelo por másde 30 días, quizá al mantenerse débil-mente queladas a los ácidos húmicos.Esta característica de los derivados ani-

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llados imidazólicos se traduce en laobtención de mejores cosechas (Tabla4), debido, entre otros, al control fitone-mático prolongado, a la disponibilidadde nutrientes acondicionados por losnemátodos saprófitos y por los ácidoshúmicos, así como al mejoramiento de laabsorción que pudiera explicarse por elaumento de la masa radicular, especial-mente de las raicillas absorbentes(Tablas 1,2,3). Además del ahorro queocasiona la implementación de trata-mientos menos seguidos requeridos pararomper ciclos nemáticos (5) que ocurrenaproximadamente cada 30 días.

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68 Carlos A. Soria



Un método cuantitativo para medir el área detubérculo dañado por larvas de Tecia solanivora

(Lep.; Gelechiidae) a través de análisisde imágenes digitales

Carlos Carpio 1*, Jean-Louis Zeddam 1,2, Álvaro Barragán1, Gustavo Nuñez3,Marcelo Patiño3 & Olivier Dangles1,2

Escuela de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Pontificia Universidad Católicadel Ecuador, Apartado 17-01-2184, Quito, Ecuador.

[email protected] IRD-LEGS and University Paris-Sud 11, Gif-sur-Yvette, Francia.

3 Carrera de Ingeniería en Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencias de la Vida, EscuelaPolitécnica del Ejército, Apartado 171-5-231B, Sangolquí, Ecuador.


RESUMEN.- Se desarrolló un nuevo método de evaluación del nivel de daño pro-vocado a los tubérculos por las larvas de polillas de la papa. El método se basa enel análisis de imágenes digitales, mediante la utilización de herramientas tecnoló-gicas como son los paquetes libres: Gimp 2.6.4 y Scion Image. Se hizo una com-paración entre la metodología propuesta y la metodología convencional basada enuna evaluación visual de los daños. Se encontró que el nuevo método es particular-mente confiable para medir los niveles de daño intermedios que son difíciles deestimar de manera visual. Finalmente, se determinó que con el uso de la metodolo-gía propuesta se pueden obtener datos más objetivos y precisos debido a que noestán sujetos a interpretaciones humanas.

PALABRAS CLAVE: Gimp 2.6.4, índice de daño, polilla de la papa, Scion Image.

ABSTRACT.- This study presents a new method to evaluate the level of tuberdamage caused by potato moth larvae. This methodology was based on analyses ofdigital images through the use of technological tools available on the market suchas the free softwares: Gimp 2.6.4 and Scion Image. A comparison was madebetween the proposed methodology and the conventional one based on a visualassessment of damage. It was found that the new method is particularly reliable formeasuring intermediate levels of damage that are difficult to estimate visually.



70Carlos Carpio, Jean-Louis Zeddam, Álvaro Barragán, Gustavo Nuñez,

Marcelo Patiño & Olivier Dangles

Finally, we discuss how the use of this methodology could be more objective andaccurate to quantify by eliminating human interpretations.

KEY WORDS: Damage index, Gimp 2.6.4, potato moth, Scion Image.

INTRODUCCIÓNEl complejo de las polillas de la

papa, Phthorimaea operculella (Zeller),Tecia solanivora (Polvony) y Symme-trischema tangolias (Gyen, 1913)(Lepidoptera: Gelechiidae), es uno delos grupos de plagas que causa mayordaño a este cultivo, tanto en campocomo en almacenamiento (1). T. solani-vora fue introducida a Ecuador en1996, a través de una importación desemilla no certificada proveniente deColombia, con destino a las zonaspaperas del Carchi (2). La larva se ali-menta inicialmente encima de la pieldel tubérculo, para luego barrenar másprofundamente y formar galerías sinuo-sas (3).

La estimación visual del daño cau-sado por las plagas ha sido uno de losmétodos utilizados históricamente porlos investigadores y extensionistas paraevaluar la eficiencia de los diferentescontroles usados para el manejo deestos insectos (4, 5). En este tipo deevaluación se realiza una estimaciónvisual del porcentaje de daño del tubér-culo y se aplica un sistema de puntajebasado en los valores propuestos porArias et al. (6) o Murcia y Barreto (7),con valores que van de 0 (0% de daño)

a 4 (entre 76% a 100% de daño); el pro-blema con este tipo de evaluación esque puede ser subjetivo y tiene limita-ciones en cuanto a precisión (8).

Los avances en el procesamiento deimágenes digitales, en las metodologíasusadas para los análisis y en cuanto a latecnología de las computadoras, hanexhibido un crecimiento impresionanteen las pasadas décadas (9). Todo esto seconstituye en tecnologías que lideranimportantes áreas; por ejemplo, teleco-municaciones digitales, radiodifusión,imágenes médicas, biología, cienciasde los materiales, sistemas multimediay sensores remotos; esto se refleja en laexistencia de un gran número de publi-caciones en revistas científicas interna-cionales, así como en libros especiali-zados (9).

El software de dominio públicoSCION IMAGE es utilizado para reali-zar análisis de imágenes digitales y hasido aplicado dentro de una ampliagama de novedosos métodos de investi-gación en agricultura aplicada, comopara medir el área de las hojas, la defo-liación y el impacto de insectos fitófa-gos sobre las hojas (10, 11); el porcen-taje de cobertura de plagas invasivas(12); la senescencia de las hojas (13,


71


Un método cuantitativo para medir el área de tubérculo dañado por larvas de Teciasolanivora (Lep.; Gelechiidae) a través de análisis de imágenes digitales

14), el estado del nutriente foliar (15).Sin embargo, SCION IMAGE no habíasido utilizado para estudios relaciona-dos con tubérculos y más específica-mente para análisis de daños provoca-dos por polillas de la papa.

Los entomólogos agrícolas siemprehan tenido el reto de estimar con preci-sión el daño causado por las plagas enlos cultivos (10, 16). Aunque la papa(Solanum tuberosum) es uno de losprincipales cultivos de la región andina,sorprendentemente, no existía unametodología que permita evaluar deuna manera cuantitativa y objetiva eldaño provocado por las plagas en lostubérculos. Este trabajo tiene comoobjetivo específico el validar una meto-dología que se basa en el análisis deimágenes digitales para la determina-ción precisa del nivel de daño produci-do por T. solanivora,

MATERIALES Y MÉTODOS

Establecimiento del ensayoSe utilizaron 30 cajas de cartón

corrugado de 20 cm de ancho, 20 cm delargo y 25 cm de altura. Cada cajarepresentó una unidad experimentaldonde se depositaron diez tubérculos dela variedad de papa Leona Blanca, loscuales fueron infestados con 60 huevosde T. solanivora. El ensayo se ubicó enuna bodega del cantón Salcedo, provin-cia de Cotopaxi (Ecuador), a una altitudde 2.729 msnm. La temperatura media

al interior de la bodega se registró usan-do un termómetro máximo-mínimo(Ertco, Dubuque, IA), fue de 14,5 ºC(min = 9,5 ºC; máx = 20 ºC). Despuésde 50 días se retiró el ensayo de labodega y los tubérculos fueron llevadosa los laboratorios de la Pontificia Uni-versidad Católica del Ecuador en Quitopara ser evaluados.

Estimación visual del índicede daño provocado porT. solanivora en tubérculosde papaEn total se evaluaron 300 tubércu-

los. Cada tubérculo fue cortado longitu-dinalmente en cuatro partes; en cadaparte se estimó visualmente la intensi-dad del daño evaluando el área afectadapor las larvas (Figura 1A). La sumato-ria de daño de cada parte representa laintensidad total del daño por papa quevaría entre 0 (ningún daño) y 100 (papatotalmente dañada). Luego, este por-centaje fue transformado a un índiceque va de 0 a 1 (6).

Adquisición de la imagen digitalde los tubérculosSe tomaron fotografías de las cua-

tro partes en las que fue cortada cadauna de las papas con una cámara digi-tal Canon Power Shot S40 (Canon,Tokyo, Japón). Se usó un soporte paraubicar la cámara a una altura de 21cm y un negatoscopio a manera decaja de luz para evitar las sombras.



Como fondo, se utilizaron hojas cua-driculadas A4 (0,5 cm), para teneruna medida conocida de referencia.Las fotos fueron exportadas a uncomputador. Con ayuda del programade libre acceso GIMP 2.6.4 (SpencerKimball, Peter Mattis and the GIMPDevelopment Team), se estandarizó elbrillo de las fotos, se definió algunosmárgenes en los bordes de los tubér-culos y se cambió de formato de jpg atif para que las fotos puedan ser ana-lizadas con el programa de libre acce-so Scion Image 4.0.2. Las fotos fue-ron editadas para generar dos tiposdiferentes de imágenes; una para cal-cular el área dañada de los tubérculos(Figura 1B-1) y otra en la que seinvirtieron los colores para poder cal-cular el área total de la papa (Figura1B-2).

Procesamiento de las imágenescon Scion ImagePara determinar el índice de daño

provocado por las larvas de T. solanivo-ra se utilizó el software de dominiopúblico Scion Image 4.0.2 para Win-dows (National Institute of Health,Bethesda, MD,

www.scioncorp.com/pages/scionimage_windows.htm).

El programa permite analizar lasimágenes en color (Figura 1B-1) o enescala de grises (Figura 1B-2). Se utili-zó la versión a color para establecer la

escala real. Se utilizó la hoja cuadricu-lada A4 para establecer cuantos pixelescorrespondían a un centímetro. Luegose escogió del menú: Analize > Setscale y se ingresó la equivalencia de 1centímetro en pixeles. Luego, se cerróla imagen a color y se continuó traba-jando con la imagen en gradación degrises (Figura 1B-2).



Figura 1 (A).- Foto de tubérculo cortado en cua-tro partes usado para el análisis del daño provocadopor larvas de T. salanivora. (B) Secuencia seguidadurante el manejo del programa SCION IMAGE: (1)foto del tubérculo a color, (2) foto de la papa en esca-la de grises, (3) visualización del área del tubérculodañada mediante la aplicación de la función Thres-hold, (4) nivel donde se ubicó la función Thresholdpara realizar el análisis, (50 área del tubérculo daña-da, calculada (66) cuadro de los resultados corres-pondientes al área de daño calculada, (7) área total depapa calculada, (8) cuadro de los resultados corres-pondientes al área calculada.


73


Posteriormente se escogió delmenú: Analize > Options > Area > OK.Luego se seleccionó del menú: Options> Threshold y se comenzó a bajar elcontraste hasta que el umbral llegue a155, una medida previamente estableci-da para todas las imágenes (Figura 1B-3, 1B-4). Con este valor se consigue elóptimo de contraste entre las zonasdañadas y las zonas sanas de la papa (ennegro en la Figura 1B-3). Seguidamen-te, se escogió del menú: Analyze >Analyze particles y el programa proce-de a señalar las área que se va a calcu-lar (Figura 1B-5). Finalmente, se esco-gió del menú: Analyze > Show resultsdonde apareció en un recuadro losresultados de las áreas calculadas

(Figura 1B-6). Esta información fuecopiada y exportada a una plantillahecha con el programa Excel (Micro-soft, USA). Este procedimiento sesiguió para calcular el área de daño pro-ducido por las larvas (Figura 1B-5, 1B-6) y un procedimiento similar se aplicópara calcular el área total de cada tubér-culo (Figura 1B-7, 1B-8). Para determi-nar el índice de daño de cada tubérculo,se dividió el área dañada para el totalfotografiado. El tiempo total para pro-cesar cada foto fue de aproximadamen-te cuatro minutos.

Análisis estadísticoPara evaluar los métodos (visual vs.

análisis de imágenes digitales) de esti-mación del daño se hizo un análisis deregresión usando Minitab (Versión 1.5).Se asumió que los datos obtenidos a tra-vés de la evaluación de las imágenesdigitales corresponderían a los valoresobservados y los datos obtenidos a tra-vés de la evaluación visual correspon-derían a los valores esperados. Siguien-do las recomendaciones de Piñeiro etal. (17), se ubicaron los valores espera-dos en el eje de las X y los valoresobservados en el eje de las Y. Se calcu-ló la pendiente y la intersección.

Se calculó el coeficiente parcial dedesigualdad de Theil (Usesgo, Upendiente,

Uerror), el cual separa el error real de lapredicción (la suma de cuadrados delerror predicho), en diferentes compo-nentes y complementa la evaluación


Figura 2.- Relación entre el área evaluada con elmétodo SCION IMAGE y el área evaluada con elmétodo visual. La línea punteada representa unalínea de relación 1:1 que ayuda a visualizar mejorrelación entre los dos métodos evaluados. La líneacontinua representa la linea de la regresión (Y =0.758 * X - 0.029. P. 0.001)



hecha con la regresión (18, 19). El coefi-ciente de Theil divide la varianza de losvalores observados no explicados por losvalores predichos (llamado la suma decuadrados del error predicho), siendoUsesgo, la proporción asociada con ladiferencia de las medias entre los valoresobservados y los valores predichos,Upendiente, la proporción asociada con lapendiente del modelo ajustado y la línea1:1 y Uerror, es la proporción asociadacon la varianza inexplicada (18).

Para observar la tendencia en la dis-tribución del error se graficaron losvalores promedio de los pares de losvalores esperados y los valores obser-vados en el eje de las abscisas y lasdiferencias en el eje de las ordenadascon el software Grapher (Versión 4.00).Para hacer un análisis del error se hizouna correlación de los datos obtenidospor el Scion Image y la raíz cuadrada

del error medio o RMSE (la diferenciaentre los datos obtenidos por el métodovisual y el Scion Image).

RESULTADOS Los valores de la estimación visual

y de la estimación por análisis de imá-



Figura 3.- Distribución del error. Los puntosrepresentan las diferencias entre lo evaluado con elanálisis visual y el análisis de imágenes digitales.

Figura 4.- Análisis de la relación del área eva-luada con SCION IMAGE y el RMSE (raíz cuadra-da del error medio). (B) Frecuencia de la distribucióndel error RMSE que cuantifica la diefrencia entreambos métodos.


75


genes digitales muestran una buenacorrespondencia (Figura 2, n= 300, r2=0,79, P <0,001). La intercepción y lapendiente fueron significativamentediferentes de 1 y 0 (p < 0,001). La faltade ajuste fue principalmente relaciona-da al sesgo o a la diferencia media entrelo observado y lo esperado (Usesgo=0.48; Upendiente= 0.13; Uerror= 0,35).

La distribución del error sugiere quehay una subestimación cuando aplicamosla evaluación visual para determinar elporcentaje de daño (Figura 3). Este errores mayor en los valores intermedios. Ladesviación estándar de la estimaciónvisual del porcentaje de daño fue de 0,22y de la evaluación a través del análisis deimágenes digitales fue de 0,19.

El análisis del error producido alusar el método de la evaluación visual(RMSE) confirmó que la diferenciamás grande entre los dos métodos demedida se presentó cuando se evalua-ron niveles de daño intermedio, queestán entre 0,3–0,7 (Figura 4A) y no enlos casos extremos (0–0,3 ó 0,7–1).Con respecto a la distribución del error(Figura 4B), se observó que el gruesode las diferencias entre los dos métodosfue concentrado al inicio del cuadro debarras (0 – 0,2). En el 53% de las mues-tras evaluadas, se presentó una diferen-cia en el índice obtenido de 0,1; mien-tras que en el 84% de las muestras eva-luadas existió una diferencia en el índi-ce obtenido de 0,2. Los datos se ajusta-ron a una curva normal (n = 300; =0,1164; SD = 0,091).

DISCUSIÓNUna buena correspondencia de la

estimación visual del porcentaje dedaño con la evaluación de imágenesdigitales ya ha sido reportada en traba-jos anteriores en estudios realizadoscon enfermedades de plantas (6), en laevaluación de daño causado por plagas(20, 21) y en la evaluación de lesionesgástricas (22). En cuanto a la distribu-ción del error, éste es mayor en losvalores intermedios, lo que se explicaa través de la ley de Weber-Fechner,que propone que el ojo humano estimadaños altos o bajos con mayor preci-sión que rangos medios de severidad(23).

En la práctica, la existencia de unadistribución normal es de especialimportancia. De hecho, se da mayorpeso a los resultados correspondientesa estos niveles intermedios, que sondifíciles de medir o donde existemayor probabilidad de cometer erroresde apreciación. Esta situación puedeser importante al momento de tomaruna decisión para recomendar un con-trol enfocado en mejorar el manejo dela plaga.

Los resultados obtenidos apuntan aque con el procesamiento de imágenesdigitales se pueden obtener datos másprecisos y se eliminan errores origina-dos por subjetividad. Esto concuerdacon resultados obtenidos por otrosinvestigadores (10, 20, 24, 25).




CONCLUSIONESEl análisis de imágenes digitales

se ha utilizado con éxito desde hacealgún tiempo atrás en investigacionesrelacionadas con agricultura aplicada.Esta es la primera vez que se proponeun método cuantitativo, con un proce-dimiento de evaluación más objetivo ypreciso para evaluar niveles de dañoprovocados por las polillas de la papay en particular T. solanivora. Sepodría también usar en el caso deotros insectos plaga de la papa o deotros tubérculos. Esta metodologíadeja de lado la percepción humana yda paso al uso de herramientas tecno-lógicas que están a nuestro alcance ynos permiten tener mayor precisión.La evaluación de los daños medianteel método presentado en este trabajorequiere de un poco más de tiempo yesfuerzo que la evaluación visualpero, en contraparte, sin gastos exce-sivos (por el uso de acceso libre), seobtienen datos más depurados y con-fiables. Además, hay que mencionarque el SCION IMAGE tiene otrasopciones, como la de poder medircada una de las partículas dañadas.Esto permitiría cuantificar, por sepa-rado, el daño producido por variasplagas en un mismo tubérculo. Estaposibilidad parece muy interesante, enparticular en la zona andina, conside-rando que diferentes especies de poli-llas de la papa se encuentran en sim-patría.

AGRADECIMIENTOSLos autores agradecen a la Funda-

ción McKnight por el financiamientode este estudio a través del proyectoInnovative Approaches for IntegratedPest Managment in the Andes (Grant09-022). Gracias a Omar Torres por loscomentarios y sugerencias que ayuda-ron a mejorar este manuscrito.


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Estudio preliminar sobre la comunidadde primates en el bosque protector del Oglán Alto.

Arajuno-Pastaza

Gabriel Alberto Carrillo Bilbao1,2,3,4 & Sarah Martin-Solano1,5

1 Estación Científica Amazónica de la Universidad Central del Ecuador, Quito, [email protected]

2 Escuela de Biología y Química, Universidad Central del Ecuador, Quito, Ecuador.3 Universidad Internacional Menéndez Pelayo, Madrid, España.

4 Ecociencia, Quito, Ecuador.5 Unidad de Biología del comportamiento, Universidad de Lieja, Lieja, Bélgica.

[email protected]


RESUMEN.- Los primates juegan un papel ecológico crucial en los ecosistemasdonde se encuentran, por lo tanto los esfuerzos que se realicen para su conserva-ción apoyarán de manera directa la preservación de otros elementos del mismo eco-sistema. La Reserva Amazónica del Oglán Alto es, en su mayoría, un bosque pri-mario piemontano y de tierras bajas, entre 420 y 1.100 m.s.n.m., de donde se regis-tran ocho especies de primates, de las cuales cinco se encuentran en el Libro Rojo(1) y además cuatro están bajo presión de caza. Por tal razón, es imprescindibleconocer el estado real de la comunidad de primates presentes en esta reserva. Gra-cias a la elaboración de un sistema de senderos y a la creación de tres transectos,se registró seis especies de primates de las ocho mencionadas en el plan de mane-jo. Los índices de diversidad sugerirían una diversidad considerable. En el Ecua-dor, además, existen muy pocos estudios de primates en bosques de estribacionesamazónicas, por lo que estos resultados aportarán datos a las comparaciones ycorrelaciones tanto ecológicas como etológicas con estudios de primates de ama-zonía baja y de occidente.

PALABRAS CLAVE: Amazonía, diversidad, ecología, Oglan Alto, primates.

ABSTRACT.- Primates play a crucial ecological role within the ecosystems theyinhabit; therefore any effort done in favor of their conservation, will also support


the preservation of the other elements of their ecosystem. The Amazonian Reserveof Oglán Alto is in its majority, a lowland forest and a piemontano primary forest,between 420 and 1100 m.s.n.m. Eight species of primates are registered, five ofthem are in the Red Book of Ecuador (1) and other four are under hunting pressurewhich makes it critical to know the real status of the primate community in thisreserve. Thanks to the creation of a trail system and three transects, we have regis-tered six of the eight registered species according with the environmental manage-ment plan from the Reserve. The diversity index suggests a considerable diversity.Considering that up to date, there is little data recorded in this region, these resultswill contribute to comparative research, ecological as well as ethological studies,on primates from the low Amazonia and the West.

KEY WORDS: Amazon, diversity, ecology, Oglan Alto, primates.


Gabriel Alberto Carrillo Bilbao & Sarah Martin-Solano80

INTRODUCCIÓNLa Amazonía, considerada el bos-

que tropical más extenso del planeta,abarca alrededor de 6,6 millones dekilómetros cuadrados, lo que representael 53 % de las selvas tropicales (2). Losbosques amazónicos se extienden ennueve países: Ecuador, Brasil, Surinam,Guyana, Guayana Francesa, Venezuela,Perú, Bolivia, y Colombia, presentandoaltos niveles de diversidad y endemis-mo (2) y la más alta diversidad de pri-mates en el mundo, siendo así que porlo menos seis nuevas especies de pri-mates se han descubierto en los diezúltimos años (3) .

A partir del análisis de los rangos dedistribución de primates, se ha divididola Amazonía en cuatro áreas o distritosde endemismo (Guayana, Ecuador,Perú y Brazil). Esto, a su vez, ha sidovalidado por estudios en otros gruposde vertebrados y por el análisis de los

rangos de distribución de primates (4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). El distrito de Ecua-dor se encuentra dividido en dos zonas,Imeri y Napo que al igual que la deGuiana, mantienen más del 40 % deltotal de su extensión en áreas protegi-das (12).

Las actividades antropogénicas sonimportantes en la pérdida de hábitatsen la Amazonía ecuatoriana, especial-mente por la conversión de bosques entierras dedicadas a la agricultura,ganadería o industria (13, 14). En elcaso de los primates, la destrucción desus hábitats, la caza y la captura deejemplares vivos para su exportación yuso local son las mayores amenazaspara su conservación (15, 16). Comoproducto de la explosión demográfica,que coincidencialmente es mayor enpaíses tropicales, se sabe que entre1985 y 1995 América Latina y el Cari-be han perdido el 9,7 % de bosques.


En concreto, los países en los que seregistran poblaciones de primates, per-dieron 125 140 km2 de bosques anual-mente, lo cual no sólo afecta a los pro-pios primates, sino a todos los compo-nentes del ecosistema (16, 14). Porotro lado, el avance del desarrollosocial, petrolero y minero, la creaciónde proyectos de construcción de carre-teras, colonización, proyectos hidroe-léctricos y tala de bosques, entre otros,han causado que el Ecuador pierdaanualmente alrededor del 1,8 % de sucobertura boscosa original (14). Portanto, priorizar en el desarrollo eimplementación de planes efectivos deconservación es fundamental paradetener la fragmentación de estos bos-ques (12).

El Ecuador, hasta la fecha, registra20 especies de primates distribuidas encuatro familias: Cebidae, Atelidae,Pitheciidae y Aotidae (17, 1, 18). Untotal de 15 especies se encuentran enlos bosques tropicales de la Amazoníaecuatoriana.

Existe poca información acerca delos aspectos ecológicos y etológicos demuchas de las especies de primates pre-sentes en el país (19, 20). Prueba deesto es que la mayoría de los recursosbibliográficos existentes sobre los pri-mates ecuatorianos está basada en fuen-tes extranjeras (14); por tal razón, esnecesario obtener datos relevantessobre el estado actual de las poblacio-nes de primates (21), tomando en cuen-

ta que el Ecuador registra el 40 % deltotal de especies de primates del NuevoMundo (Platyrrhini) y el 10,7 % deltotal de especies a nivel mundial.

Existen numerosas razones por lascuales se deben realizar esfuerzos en laconservación de los primates. Los pri-mates juegan un papel ecológico cru-cial en los ecosistemas donde estos seencuentran, y su pérdida causaría dra-máticos efectos; por ejemplo, todas lasespecies de primates forman parte delas cadenas alimenticias actuando comopresas o predadores y son también dis-persores de semillas. Para tener unaidea de la importancia que tienen losprimates como dispersores en los bos-ques tropicales, más del 90 % de lasplantas leñosas dependen de especiesfrugívoras para dispersar sus semillas, ylos primates comprenden la mayor por-ción del total de la biomasa de los fru-gívoros neotropicales (22, 23, 17, 16,24, 25). Dada la diversidad de primatesen el Ecuador, su importancia en ladinámica de los bosques tropicalesamazónicos es alta y su ausencia causa-ría un efecto cascada en la dinámica delos ecosistemas (26). Recordemos queusualmente tienen bajas tasas de creci-miento, una reproducción con largosintervalos entre nacimientos y un tiem-po largo de desarrollo (27), lo cual indi-ca que sus bajas densidades poblacio-nales en bosques intervenidos o en peli-gro los hacen indicadores muy sensi-bles del estrés antropogénico (21).


Estudio preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto.Arajuno-Pastaza 81


Finalmente, las similitudes genéti-cas y ecológicas entre los primates nohumanos y los humanos pueden permi-tir dar paso a la necesidad instintiva yética de conservar y preservar los hábi-tats de nuestros parientes cercanos (25).Por lo tanto, los esfuerzos satisfactoriosque se realicen para su conservaciónapoyarán de manera directa a la preser-vación de otros elementos del mismoecosistema (24).

AntecedentesLa Reserva Amazónica del Oglán

Alto es un área de 3 344 ha ubicada enlas coordenadas 0º5’19,9”N - -80º30’46,0”O, entre los 420 y 1.000m.s.n.m. en el Cantón Arajuno, Provin-cia de Pastaza. En su mayoría es bosqueprimario piemontano y de tierras bajassegún la clasificación vegetal de Sierra(28). Estos bosques reciben una pluvio-sidad de 2.000–4.000 mm anuales y nose registran más de cuatro meses conse-cutivos con una pluviosidad menor alos 100 mm. Este bosque se caracterizapor grandes árboles, llegando en algu-nos casos a cincuenta o sesenta metros(1, 20, 29, 30).

El tipo de ecosistema presente en lareserva se extiende a lo largo de la líneaecuatorial, en las áreas con tierras bajas.La gran diversidad de especies vegeta-les es otra característica de estos bos-ques; de 400 individuos muestreados sehan registrado 200 especies de árbolesen 128 géneros y 49 familias (31). Ade-

más, la gran variedad de especies vege-tales no arbóreas son las que conformanla mayor porción de la biomasa vegetal,lo cual es un verdadero potencial ali-menticio para las distintas especies quese desarrollan en este tipo de ecosiste-mas (32).

El plan de manejo ambiental de laReserva, realizado previamente a esteproyecto (29), fue la base para la deci-sión de estudiar las poblaciones de pri-mates, ya que se registraron ocho espe-cies: Callithrix pygmaea, Saguinus fus-cicollis, Cebus albifrons, Saimiri sciu-reus, Lagothrix poeppigii, Ateles belze-buth, Alouatta seniculus y Pitheciamonachus, de las cuales cinco (Lagoth-rix poeppigii, Ateles belzebuth, Alouat-ta seniculus, Cebus albifrons y Sagui-nus fuscicollis) se encuentran incluidasen el libro rojo de mamíferos ecuatoria-nos (1) y cuatro (Alouatta seniculus,Ateles belzebuth, Lagothrix poeppigii yCebus albifrons) se consideran comoespecies sometidas a presiones de cazasegún Redford y Robinson (33). Por talrazón fue imprescindible conocer elestado real de la comunidad de primatespresentes en esta reserva. En abril de2006 se inició el Proyecto PrimatesOglán con una salida de prospección.En julio de 2006 se realizó la socializa-ción del Proyecto frente a representan-tes de ACIA (Asociación de Comunida-des Indígenas Arajuno), logrando laaceptación por parte de las comunida-des para la ejecución del proyecto.


Gabriel Alberto Carrillo Bilbao & Sarah Martin-Solano82


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MÉTODOSEste estudio se llevó a cabo desde

enero del 2007 a noviembre del 2008,para lo cual se destinaron diez días decada mes para la apertura y mapeo desenderos y transectos y diez días para labúsqueda, habituación y recolección dedatos.

Se establecieron tres transectos: unode tres kilómetros, otro de 1,5 km y otrode 300 m. Además de los transectos, seconstruyó una red de senderos de alre-dedor de 17 km, los cuales abarcan elárea de una manera espaciada y hetero-génea evitando así el re-conteo de indi-viduos (Figura 1).

Cabe recalcar que este estudio seapoya en la metodología de “Roadsidecounts” (34) para monitorear siguiendoun sistema de senderos, el cual utilizazonas heterogéneas donde los senderosmantienen distancias óptimas de sepa-ración para evitar el reconteo de indivi-duos. Para minimizar el sesgo en lasobservaciones se tomó muy en cuentael protocolo del método de “Traversingthe area and detecting animals” (35) y“Line Transect Sampling from a Cur-ving Path” (36) que básicamente essimilar al de “Roadside counts”, peropone énfasis en variables como condi-ciones del hábitat respecto a variacio-

Figura 1. Avistamientos, transectos y senderos del Proyecto Primates Oglán

Estudio preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto.Arajuno-Pastaza


84 Gabriel Alberto Carrillo Bilbao & Sarah Martin-Solano


nes estacionales y condiciones climáti-cas. Por la dificultad propia asociada alas características geográficas de lazona las metodologías tradicionalesrequieren más tiempo y esfuerzo parasu construcción.

Los primeros diez días de cadames, dos grupos de observación (uninvestigador y un asistente) recorrie-ron los senderos y los transectos en unsentido entre las 6:00 h y 11:00 h y enel sentido contrario entre 13:00 h y18:00 h, abarcando los picos de activi-dad de los primates; la velocidad pro-medio fue de 1,2 km/h (36, 35) conparadas cortas cada 100 m. Se deter-minó la presencia de primates median-te rastros (fecas), audición y visuali-zación por medio de binoculares 8 x40 (37, 38).

Se tomaron datos de ubicación detodos los registros y el número total deindividuos observados; se siguió lamisma metodología de mapeo de sen-deros y transectos para marcar y grafi-car estos puntos en un mapa. Se usaronplanillas de avistaje para el registro dedatos del estudio de monitoreo queincluyeron: ubicación, fecha, hora deinicio y hora de finalización de laobservación, especie, número de indivi-duos, composición grupal y datos des-criptivos como observaciones y eventosinusuales.

El área de vida de los grupos estu-diados fue realizada mediante el pro-grama Arcview 3.2 con la extensión

Animal Movement 2.04 beta. Se gene-ró un “minumun convex poligon” quees el polígono que incluye a todas lasobservaciones de menor área y se cal-culó la superficie del polígono (20,39, 40).

El mapeo de los senderos y de lostransectos se realizó con brújula y fle-xómetro; los senderos fueron marcadoscada 25 m. Los datos de dirección ydistancia fueron transformados a coor-denadas UTMs usando un punto geo-referenciado con un GPS y trigonome-tría básica en hojas de cálculo deMicrosoft Excel; finalmente los mapasfueron elaborados en los programasArcview 3.2 y Arcgis 9.0. Se hanincluido en el mapa también caminosvecinales y árboles marcados así comolos puntos de avistaje de primates(Figura 1).

Los índices de diversidad fueroncalculados de acuerdo con Jost (41, 42,43). Para la estimación del número deespecies esperadas se utilizaron losíndices Chao1 y Chao1-bc.

Los paquetes estadísticos utilizadospara todos los análisis estadísticos fue-ron ESTIMATES, que se usó para esti-mar el número de especies totales,SPSS para los cálculos de la curva acu-mulativa, SPADE en el que se genera-ron los análisis de Chao1 y Chao1-bc; yDiversityCalculatorLJost500sp paracalcular los índices de diversidad.


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RESULTADOSSeis especies de primates se han

registrado en el área de estudio: trescorrespondientes a la familia Atelidae yuna especie de cada una de las familiasPitheciidae, Aotidae y Cebidae. De lasseis especies se obtuvieron 42 registros:Alouatta seniculus (20 registros),Saguinus fuscicollis (15 registros), Ate-les belzebuth (un registro), Aotus voci-ferans (un registro), Lagothrix poeppi-gii (dos registros) y Pithecia sp.(tresregistros) mediante el método de obser-vación directa, auditiva (Figura 1).

Se registraron seis grupos de A.seniculus (21 individuos), cuatro gru-pos de S. fuscicollis (16 individuos), ungrupo de L. poeppigii (≥ 35 individuos),dos grupos de Pithecia sp. (≥ 2 indivi-duos), un grupo de Ateles belzebuth (≥8 individuos) y un grupo de Aotus voci-ferans (≥ 1 individuo; Tabla 1).

El grupo A de A. seniculus estáconstituido por un macho adulto, unahembra adulta, un juvenil y un infanteindependiente; adicionalmente, se re-

gistró un individuo macho adulto soli-tario. El grupo A de S. fuscicollis estáconstituido ≥ 5 individuos siendo todossus integrantes de similar tamaño y sehan categorizado como adultos o sub-adultos. El área de vida preliminar parael grupo A de A. seniculus fue de 26,6ha y para el grupo A de S. fuscicollis fuede 46,8 hectáreas (Figura 2).

Un total de 807 minutos de observa-ción de primates se contabilizó hasta lafecha: 588 para Alouatta, 109 paraSaguinus, 62 para Lagothrix, 8 paraAotus, 10 para Pithecia y 30 para Ateles.(Tabla 2).

La curva de acumulación de espe-cies (Figura 3) muestra que la pendien-te aún se encuentra en ascenso, no seevidencia una tendencia a estabilizarse.

El índice de Diversidad Exponen-cial de Shannon (effective number ofspecies) es de 4,046. El índice Inversode Simpson (Diversity of order ) es de3,460. El valor del índice de Chao1(especies esperadas) es de 10,5 y delíndice del Chao1-bc es de 7,5.

n.o de n.o Especie Grupos Ind/solitarios ind/grupo Total ind

Alouatta seniculus 6 1 3.5 21Saguinus fuscicollis 4 0 4 16

Pithecia sp. 2 . ≥1 ≥2Ateles belzebuth 1 0 ≥8 ≥8Aotus vociferans 1 . ≥1 ≥1

Lagothrix poeppigii 1 0 ≥35 ≥35

Tabla 1. Avistajes de Especies según el Número de grupos (n.o de Grupos), solitario (ind/solitarios), mediade individuos por grupo (Ind/solitarios) y total de individuos (Total ind), en la reserva del Oglan Alto.





DISCUSIÓN YCONCLUSIONES Mediante la metodología planteada

se han observado seis especies de pri-mates, lo que difiere con respecto a losdatos incluidos en el plan de manejode la reserva, en el que se incluyeronocho especies, a partir de las encuestasrealizadas. Hay que destacar que lasestimaciones de la riqueza de especiesalcanzan diez (Chao1) y 7,5 (Chao1-bc) especies en la zona de estudio.Adicionalmente, basados en informa-ción bibliográfica sobre el área de vidade las distintas especies (44, 45, 46,47, 40), se podría sugerir que hasta lafecha se han registrado un total de 15

grupos de primates, datos que seránaceptados o rechazados a medida quese continúe con la toma de datosdemográficos. La curva acumulativade especies no se saturó con los datosrecogidos (Figura 3), lo que sugiereque el monitoreo tiene que continuar.Estos análisis permitirán en el futurorealizar y justificar comparaciones conanálisis de datos de un monitoreo alargo plazo o con estudios en otraszonas.

Los valores obtenidos con los dife-rentes índices podrían sugerir queexiste una diversidad considerable, loque podría ser producto de las caracte-rísticas de la reserva. El número deespecies registradas mediante métodos

Figura 2. Área de vida de Alouatta seniculus A1 y de Saguinus fuscicollis A1


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directos e indirectos para este estudioes de seis especies de primates, siendomayor al número de especies registra-das en los estudios llevados a cabo enel Parque Nacional Napo-Galeras y enel Parque Nacional Sangay con tres yninguna especie respectivamente (48,49). Al contar con escasos sitios decomparación en amazonía de estriba-ciones, podemos comparar con otrossitios de amazonía baja. Por ejemplo,en un estudio realizado por Heymanny Encarnación (50), encontraron en unmonitoreo realizado en el río Curarayy Napo de tres a cinco especies; sinembargo, hay que tomar en cuenta queestos monitoreos se realizaron a cortoplazo (menos de un mes). En el ParqueNacional Yasuní, los estudios a largoplazo han logrado identificar diezespecies de primates (51, 52), lo cual

reflejaría la importancia de realizarmonitoreos constantes y a largo plazo,minimizando el uso de registrosbibliográficos ya que esto no permiteevidenciar de manera concreta la pre-sencia o ausencia de primates de unsector.

En el futuro se monitorearán zonasmás bajas para abarcar la totalidad delrango altitudinal de la reserva y hacercomparaciones a lo largo de este gra-diente. Se predice que el número deespecie aumentará a medida que seincluyan más zonas de tierras bajas.

Esta reserva representa un refugiopara la fauna ya que, en las zonas ale-dañas, los primates y demás mesoma-míferos sufren una alta presión de caza(Bovy et al, en rev). De las seis espe-cies encontradas, según la IUCN (53),dos se encuentran amenazadas: L.

Especie Comportamiento Minutos Registrados

Alouatta seniculus Vter 140Vxx,Val,Esc 448

Saguinus fuscicollis Vxx,Val,Esc 108Vcon 1

Lagothrix poeppigii Vxx,Esc,Mxx 62Ateles belzebuth Mxx 30Pithecia sp. Esc,Val 5

NR 5Aotus vociferans Vter 8

Vter=vocalización territorial, Vxx=Vocalización desconocida, Val=vocalización alarma, Esc=escape,Mxx=Movimiento desconocido, Nr=no registra

Tabla 2. Comportamiento por minutos registrados





poeppigii (EN) y A. belzebuth (VU).Además, tres se encuentran también enel libro rojo de mamíferos del Ecuador(1). Esto es una razón más para conti-nuar con el monitoreo de la comunidadde primates de la Reserva del OglánAlto.

Basados en la cantidad de informa-ción recopilada, los grupos de prima-tes que mayor número de avistajes pre-sentaron fueron seleccionados comolos grupos de estudio. Según Emmons(46), el área de vida de la especie S.fuscicollis, puede ser de 16 a 100 ha.El área de vida del grupo de este estu-dio (46,8 ha) es mayor a los estudiosrealizados en Bolivia (15,25 ha) y enPerú (15,7 a 16,5 ha) (54, 55). Hay quetomar en cuenta que estos estudios sonrealizados en Amazonía baja. El área

de vida de A. seniculus (26,6 ha) esinferior a los estudios realizados enCaparú, Colombia (182 ha) y en Guya-na (45 ha) pero levemente superior alestudio de La Macarena, Colombia (25ha) (56, 57, 58). Es importante desta-car que las áreas de vida presentadasson propias para los grupos en estudiodentro de la reserva del Oglán Alto.

Durante el desarrollo de este estu-dio se registraron datos comportamen-tales, ocasionales, ya que en un 77,8 %son comportamientos de vocalizacio-nes de alarma y eventos de escape, loscuales son característicos de grupos deprimates no habituados, lo cual impidedeterminar las estrategias comporta-mentales de las especies en estudio(59).

En el Ecuador existen muy pocosestudios de pri-mates en bos-que de estriba-ciones amazó-nicas, por loque estos resul-tados permiti-rán compara-ciones y co-rre-laciones tan-toe c o l ó g i c a scomo etológi-cas con estu-dios de prima-tes de la Ama-zonía baja ytambién del oc-Figura 3. Curva Acumulación de Especies por jornadas de 3 meses de marzo

2007 a octubre 2008


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cidente del país.

RECOMENDACIONES– Dadas las condiciones geográfi-

cas de los bosques de estribación,la preparación de un transectolineal de más de un kilómetro ymedio requiere un incremento nolineal del esfuerzo hombre–tiem-po, y por lo tanto del dinero nece-sario. Por este motivo, se proponecomo forma de apoyo a estametodología clásica el recorridode senderos de una manera siste-mática, previendo variables comopicos de actividad y condicionesclimáticas, además de un análisisde datos apropiado, lo que se creees una alternativa para la determi-nación acertada de la densidadpoblacional de primates.

– Es imprescindible mencionar queal monitorear a largo plazo estarí-amos tomando constantementedatos demográficos sobre los gru-pos encontrados con el objetivode no subestimar o sobrestimar laabundancia de primates del sector(Jost, comm. pers.), lo que apor-taría confiabilidad a los análisis.

– No se debe realizar ningún análi-sis etológico mientras la habitua-ción de los grupos no esté conse-guida.

AGRADECIMIENTOSAgradecemos a nuestras institucio-

nes donantes FNRS, ECOCIENCIA,ORGÁNICA, AECID, UCE, así comoa nuestros mentores y tutores Dr.Anthony Di-Fiore, Dr. Eduardo Fernán-dez-Duque, Marie Claude Huynen; anuestra institución Universidad Centraldel Ecuador, a los investigadores y pro-fesores quienes nos han asesorado, LouJost, David Neill, Stella de la Torre,Esteban Suárez y un agradecimientoespecial a la comunidad Pablo Lópezdel Oglán Alto, a todos los pasantes,voluntariados y tesistas del ProyectoPrimates Ecuador.

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INTRODUCCIÓNLa Biología del Desarrollo analiza los

mecanismos celulares y moleculares dela embriogénesis en unas pocas especies,

a las que se les conoce como los organis-mos modelo del desarrollo embrionario(1). Así, en muchos laboratorios delmundo se analiza a fondo el desarrollo de

La gastrulación en ranas con diversos modosde reproducción

Eugenia M. del Pino1

1Escuela de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, [email protected]


RESUMEN.- Las características de la gastrulación fueron analizadas en lassiguientes ranas ecuatorianas Gastrotheca riobambae, Colostethus (=Epipedoba-tes) machalilla y Engystomops (=Physalaemus) randi en comparación con Xeno-pus laevis, la rana que se estudia como organismo modelo del desarrollo embrio-nario. Se han encontrado profundas diferencias en el proceso de gastrulación enestas ranas. La comparación señala que en C. machalilla y G. riobambae, ranascon desarrollo lento, la convergencia y extensión dorsales (CED) es un proceso queocurre después de la gastrulación mientras que en las de desarrollo rápido (X. lae-vis, y E. randi) la CED ocurre durante la gastrulación.

PALABRAS CLAVE: Gastrulación, Colostethus, Epipedobates, Engystomops,Physalemus, Gastrotheca, Xenopus.

ABSTRACT.- The features of gastrulation were analyzed in the following frogsfrom Ecuador Gastrotheca riobambae, Colostethus (=Epipedobates) machalilla,and Engystomops (=Physalaemus) randi in comparison with Xenopus laevis, themodel organism of frog development. There are major differences in the gastrula-tion process among these frogs. The comparison indicates that in C. machalilla andG. riobambae, frogs with slow development, dorsal convergence and extension(CED) occurs after gastrulation, whereas in frogs with rapid development (X. lae-vis and E. randi), CED occurs during gastrulation.

KEY WORDS: Gastrulation, Colostethus, Epipedobates, Engystomops, Physale-mus, Gastrotheca, Xenopus.

REVISIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS


95La gastrulación en ranas con diversos modos de reproducción


la rana acuática Xenopus laevis, el orga-nismo modelo de desarrollo para lasranas (1). El conocimiento del desarrollode las especies modelo nos brinda unmarco conceptual comparativo para elestudio de otras, cuya embriogénesispuede presentar modificaciones.

En nuestro laboratorio estudiamosel desarrollo embrionario de ranas condiversos modos reproductivos y locomparamos con la embriogénesis deX. laevis, pues las variaciones de losfenómenos del desarrollo en diferentesespecies corresponden a experimentosnaturales, cuyo análisis permite unmejor entendimiento de la embriogéne-sis. Nuestro propósito es avanzar en lacomprensión de los mecanismos deldesarrollo embrionario y a la vez con-tribuir al mejor conocimiento de lanaturaleza del Ecuador.

Para estudiar el desarrollo tempranose requiere mantener a las ranas en ellaboratorio y por tal motivo solamenteuna pequeña parte de la gran biodiver-sidad de anfibios ecuatorianos ha podi-do analizarse desde el punto de vista deldesarrollo embrionario. En nuestrosestudios hemos tenido la importantecolaboración del laboratorio de Herpe-tología de la Escuela de Ciencias Bioló-gicas de la Pontificia Universidad Cató-lica del Ecuador y de su proyecto“Balsa de los sapos”, cuya meta es lareproducción en cautiverio de numero-sas especies de ranas. Hemos estudiadoel desarrollo de la rana túngara Engys-

tomops (=Physalaemus) randi Leiupe-ridae, de la rana dendrobátida Coloste-thus (=Epipedobates) machalilla y dela rana marsupial Gastrotheca riobam-bae Hemiphractidae, entre otras. Eneste trabajo se resumen los avances enla compresión del desarrollo embriona-rio temprano de estas especies en com-paración con la rana X. laevis.

Muchas ranas, como es el caso de X.laevis, depositan los gametos en elagua, la fecundación es externa y alcabo de 24 a 48 horas eclosionan larvasde vida libre, los renacuajos (2). Estaslarvas crecen y durante la metamorfo-sis, el cuerpo se remodela. En la meta-morfosis se reabsorben la cola y lasbranquias, y se desarrollan las extremi-dades para dar origen a una nueva rana.La rana juvenil requiere crecer y madu-rar sexualmente para convertirse en unadulto (1). Cabe señalar que la repro-ducción acuática es solamente una delas 29 maneras diferentes de reproduc-ción que han sido detectadas en lasranas y que muchas especies de ranasque habitan en las regiones tropicalesdel mundo depositan sus huevos enambientes terrestres (3). La humedaddel bosque tropical ha permitido a lasranas experimentar con la reproduccióny evolucionar modos reproductivos ale-jados del agua (3). Cabe resaltar que loshuevos de las ranas carecen de meca-nismos que impidan su desecación, y espor eso que la humedad ambiental delos bosques húmedos ha sido un factor


96 Eugenia M. del Pino


determinante para la evolución demuchos modos reproductivos en lasranas que viven en tales regiones.

Las ranas del género Engystomopsprotegen a sus huevos y embriones tem-pranos en nidos de espuma que flotanen los charcos temporales en los queestas ranas se reproducen (4, 5). El nidode espuma se construye a partir de lagelatina de huevo y durante el ample-xus, o abrazo sexual, el macho bate consus patas ese material gelatinoso paraformar espuma en la cual los blancoshuevos se camuflan y se mantienen sus-pendidos sobre el agua, evitando deesta manera la depredación de huevos yembriones. Al cabo de aproximadamen-te 2 días, ocurre la eclosión y los rena-cuajos caen al agua subyacente (6).Hemos analizado el desarrollo embrio-nario temprano de E. pustulosus, E.coloradorum y E. randi (6).

El desarrollo a partir de huevosterrestres ocurre en las ranas dendrobá-tidas, entre otras. En C. machalilla, loshuevos son depositados en nidos terres-tres que son protegidos por el machohasta la eclosión de los renacuajos (7).En tal momento, el macho transporta asus renacuajos sobre su espalda hasta elagua en donde se completa el desarrolloy los renacuajos alcanzan la metamor-fosis (7). El desarrollo de C. machalillaen el nido terrestre dura 19 días yhemos podido analizar su desarrolloembrionario hasta la eclosión de losrenacuajos (8).

El caso de la rana marsupial G. rio-bambae, Hemiphractidae, es más com-plejo debido a que los huevos son aloja-dos en el cuerpo de la madre. Al momen-to del amplexus los embriones son depo-sitados en una bolsa especializada de lamadre (9). La hembra transporta a susembriones en la bolsa materna por apro-ximadamente 4 meses, al cabo de loscuales nacen renacuajos avanzados, losque completan su desarrollo en el agua(9). Cabe señalarse que las crías nacendirectamente como ranas en la mayoríade especies de ranas marsupiales. Entales casos se ha eliminado totalmente eldesarrollo acuático.

Hemos analizado la biología repro-ductiva de la hembra y las característi-cas de los embriones de la rana marsu-pial G. riobambae. La bolsa materna esuna especialización de la piel dorsal dela hembra y responde a una hormonasimilar a la progesterona, la hormonade la gestación, con la formación decámaras vascularizadas para cada unode los 120 embriones que por promediose alojan en la bolsa materna (9). Por suparte, las branquias, que en los renacua-jos de otras ranas corresponden aestructuras filamentosas que permitenel intercambio gaseoso en el agua, hansido modificadas notablemente. Lasbranquias de G. riobambae se denomi-nan branquias acampanadas debido a sumorfología, pues son dos discos queforman un saco altamente vasculariza-do alrededor de cada embrión. La circu-




lación sanguínea materna de las cáma-ras embriónicas de la bolsa materna y lacirculación embrionaria, presente en lasbranquias acampanadas, se encuentranen estrecha cercanía. El tipo de inter-cambios que ocurren entre la madre ylos embriones durante el largo períodode incubación es en gran parte descono-cido, pero la morfología sugiere unaestrecha adaptación morfológica yfisiológica entre la madre y embrionespara permitir la incubación en el cuerpomaterno. Las adaptaciones morfológi-cas y fisiológicas para la incubación deembriones de la rana marsupial G. rio-bambae representan un modo paraleloal de los mamíferos para la reproduc-ción terrestre (9). En este trabajo serevisan las modificaciones del desarro-llo embrionario temprano de la ranamarsupial G. riobambae, de la ranadendrobátida C. machalilla y de la ranacon nidos de espuma E. randi en com-paración con X. laevis.

Tamaño del huevo y velocidaddel desarrolloLos huevos de la rana X. laevis tie-

nen un hemisferio pigmentado de coloroscuro, el denominado “hemisferio ani-mal”; en tanto, el hemisferio opuesto,llamado “hemisferio vegetal”, tienecolor claro. El huevo de X. laevis mide1.2 mm de diámetro y en cada desove,la hembra deposita miles de huevos enel agua. Los renacuajos eclosionan alcabo de dos días desde la fecundación

(2). La velocidad del desarrollo de X.laevis es rápida en comparación conotras ranas.

Las ranas con nidos de espuma delgénero Engystomops presentan gransimilitud con X. laevis en cuanto altamaño del huevo y velocidad del des-arrollo. Los huevos de E. coloradorummiden 1.2 mm de diámetro, como en X.laevis. En contraste, el huevo de E.randi mide solamente 0.9 mm de diá-metro, lo que significa que el volumendel huevo de X. laevis y E. colorado-rum es superior en 2.3 veces al delhuevo de E. randi. Los huevos de E.coloradorum son uniformemente blan-cos a diferencia de X. laevis. Esta carac-terística ha sido observada también enE. randi, E. pustulosus (6) y otras espe-cies de Engystomops (trabajo en pro-greso). El color blanco tiene importan-cia para el camuflaje de los aproxima-damente 120 huevos en el blanco nidode espuma de estas especies. Aún cuan-do los embriones de Engystomops sonblancos, se encontró que no son albi-nos, pues tienen pigmento oscuro inter-no, que se distribuye alrededor de losnúcleos (6). La velocidad del desarrollode los huevos de E.randi y E. colorado-rum en el nido de espuma es similar a loobservado en X. laevis, y al cabo de 2días eclosionan los renacuajos. Esdecir, la estrategia reproductiva deEngystomops consiste en la formaciónde nidos de espuma con pequeños hue-vos dotados de rápido desarrollo (6).




Los nidos terrestres de la rana den-drobátida C. machalilla contienenentre 8 a 16 huevos con pigmentooscuro en el hemisferio animal, comoen X. laevis (8). El tamaño del huevovaría grandemente entre especies dedendrobátidos, así en C. machalilla elhuevo mide 1.6 mm de diámetro, enEpipedobates tricolor 2 mm de diáme-tro, y en Dendrobates auratus el diá-metro del huevo es de 3.5 mm de diá-metro (10). La relación de volúmenesseñala que el huevo de C. machalilla es2.3 veces más grande que el huevo deX. laevis, en tanto que el volumen delhuevo de D. auratus es 25 veces supe-rior al de X. laevis. A pesar de las dife-rencias en el tamaño del huevo, el des-arrollo embrionario de las ranas den-drobátidas es parecido entre sí en cuan-to a su morfología y a que requieren deaproximadamente de 19 días desde lafecundación hasta la eclosión de rena-cuajos avanzados (8, 10).

Los embriones de la rana marsupialG. riobambae tienen una aparienciablanco amarillenta uniforme, miden 3mm de diámetro y su volumen es apro-ximadamente 16-25 veces superior aldel huevo de X. laevis. En otras espe-cies de ranas marsupiales los huevosalcanzan hasta 10 mm o más de diáme-tro (11). El desarrollo embrionario pro-tegido en el interior de la bolsa maternaocurre lentamente y alrededor de 100renacuajos avanzados eclosionan des-pués de 120 días de incubación (11).

El desarrollo que alcanza el rena-cuajo al tiempo de la eclosión esvariable en las diferentes especies.Por tal motivo, consideramos que eltiempo requerido para que los embrio-nes avancen desde la fecundaciónhasta la culminación del proceso degastrulación brinda un mejor indica-dor de la velocidad del desarrollo. Losembriones de X. laevis requieren 14horas para este proceso (2). Las 24horas requeridas por los embriones deE. coloradorum es un tiempo ligera-mente superior a lo que necesitan losembriones de X. laevis para avanzarhasta el final de la gastrulación. (6).En cambio, los embriones de la ranadendrobátida C. machalilla requierende 4 días (8) y los embriones de larana marsupial G. riobambae toman14 días para el mismo proceso (12).De acuerdo a estas diferencias consi-deramos que X. laevis y E. colorado-rum tienen desarrollo rápido, en tantoque la rana dendrobátida C. machali-lla y la rana marsupial G. riobambaegozan de desarrollo lento. Cabe seña-lar que aunque el desarrollo embrio-nario de las ranas es influenciado porla temperatura, las diferencias tempo-rales en la embriogénesis de las ranasde desarrollo lento y rápido son extre-madamente grandes para que puedanhomologarse solamente con cambiosde la temperatura.




Patrones de gastrulaciónLa morfología de la gastrulación de

X. laevis al igual que la de varias espe-cies de ranas y urodelos ha sido amplia-mente analizada debido a la facilidad deobtener embriones para estudio. Duran-te el proceso de la gastrulación en lasranas se forma una hendidura, el labiodorsal del blastoporo, en la región sube-cuatorial. El labio dorsal del blastoporotiene la propiedad de duplicar los ejes alser transplantado al lado ventral de otroembrión. Por tal motivo se le conocecomo “el organizador”. Las caracterís-ticas moleculares del organizador hansido ampliamente estudiadas y se hanencontrado numerosos genesque se expresan en esta regióndel embrión y que tienen lapropiedad de duplicar los ejesdel embrión al ser expresadosen el lado ventral (13). Uno delos genes del organizador es elgen Lim1 (también conocidocomo Lhx1) (14).

Debido a que todas lasranas analizadas forman unlabio dorsal del blastoporo,era de importancia determinarla expresión del gen Lim1 enla gástrula temprana. Realiza-mos este análisis al nivel deproteína mediante inmuno-detección en montaje enterocon un anticuerpo contra laproteína Lim1. Determinamosque la proteína Lim1 se expre-

sa en el labio dorsal del blastoporo deX. laevis, E. randi, C. machalilla y G.riobambae (15). Estos descubrimientosseñalan que la expresión génica delorganizador es altamente conservada.No se ha determinado si el transplantedel labio dorsal del blastoporo en lagástrula de diferentes ranas produciríaduplicación de los ejes (15).

Una vez que se ha formado el labiodel blastoporo, se profundiza y extien-de lateral y ventralmente hasta formarun anillo alrededor del tapón de yema(Fig. 1). La formación del blastoporoobedece a movimientos morfogenéti-cos, entre los cuales cabe señalar el

Figura 1. Apariencia externa de la gástrula media de C.machalilla. El blastoporo rodea al tapón de yema. Conformeavanza la gastrulación el tapón de yema se reduce hasta ser com-pletamente internalizado cuando se cierra el blastoporo. Abrevia-tura: ty, tapón de yema.




proceso de involución que guía lainternalización de las células superfi-ciales, así como el proceso de CEDque cambia la forma del embrión de laesférica del huevo a la alargada delrenacuajo (16). Al completar la gas-trulación se establece el plan del cuer-po con sus tres capas germinales: electodermo, el mesodermo y el endo-dermo tanto en las ranas, como entodos los vertebrados (1).

En nuestro trabajo nos hemos cen-trado en el estudio de la gastrulaciónpor la importancia de este proceso yjustamente para contribuir a su mejorentendimiento. Todas las ranas estu-diadas (X. laevis, E. randi, C. macha-lilla y G. riobambae) forman un blas-toporo alrededor de un tapón de yema(Fig. 1). En todos los casos, se formaun labio dorsal del blastoporo en laregión sub ecuatorial del huevo. Elmismo es morfológicamente visible alinicio de la gastrulación. Sin embargohemos detectado sutiles diferenciasrespecto a la extensión del arquenteróny al inicio de la CED, como se señalaa continuación.

Uno de los descubrimientos mássignificativos de nuestro trabajo fuedeterminar el modo de gastrulación dela rana marsupial G. riobambae (17).Los grandes huevos de esta rana for-man un área de pequeñas células alre-dedor del blastoporo. Cuando al finalde la gastrulación se retrae el tapón deyema y se cierra el blastoporo, se

forma un disco embriónico alrededordel blastoporo cerrado (Fig.2). Elcuerpo del embrión se deriva de estepequeño disco de células (17). En elinterior, debido a los movimientos dela gastrulación se forma una nuevacavidad, el arquenterón o intestino pri-mitivo, la cual es muy pequeña y situa-da directamente por debajo del discoembriónico (Fig. 2). El desarrollo apartir de un disco embriónico es carac-terístico de las aves y no de las ranas yel modo de gastrulación de G. riobam-bae es el modo más divergente de gas-trulación que se ha detectado en lasranas (17).

Al comparar los embriones de G.riobambae con los embriones de X.laevis detectamos que la extensión delarquenterón se había retardado en lagástrula de G. riobambae (17). Mien-tras en X. laevis el proceso de gastrula-ción y extensión del arquenterón ocu-rren simultáneamente, en los embrio-nes de la rana marsupial G. riobambae,primero se completa el cerramiento delblastoporo y luego se inicia la exten-sión del arquenterón (Fig.2). De modosimilar a X. laevis, los embriones derápido desarrollo de la rana con nidosde espuma, E. randi, expanden elarquenterón durante la gastrulación, entanto que la rana dendrobátida, C.machalilla, cuyo desarrollo es lento,sigue un patrón similar al de G. rio-bambae con un retardo en la extensióndel arquenterón.




Varios movimientos morfogenéticoscontribuyen a la formación y extensióndel arquenterón, entre ellos la CEDjuega un importante papel. Los movi-mientos de CED se inician en la gástru-la media de X. laevis y son responsablesde concentrar a las células hacia el ladodorsal, mientras al mismo tiempo elembrión se alarga en sentido antero-pos-terior (18, 19). La CED permite el cam-bio de forma del embrión de la formaesférica del huevo a la alargada del rena-cuajo. Como resultado de proceso deCED, se forma el notocordio en la líneamedia dorsal del embrión de X. laevis(18, 19). La expresión del gen Brach-yury (Bra) en el notocordio temprano es

evidencia molecular de que se han ini-ciado los movimientos de CED (20).

Mediante inmuno-detección en mon-taje entero para la proteína Bra hemosdeterminado el inicio del alargamientodel notocordio, es decir el inicio de laCED en los embriones de diferentesranas (12, 21, 22). Los resultados seña-lan importante variabilidad. En las ranascon desarrollo rápido, X. laevis, y en larana con nidos de espuma, E. randi, elalargamiento del notocordio se inicia enla gástrula media (Fig. 3). En tanto en lasranas con desarrollo lento, C. machalillay G. riobambae, el inicio de la extensióndel notocordio se ha retardado hastacompletar la gastrulación (Fig. 3).

Figura 2. Esquemas de secciones sagitales de la gástrula media de G. riobambae y X. laevis. En G. riobam-bae el arquenterón se forma durante la gastrulación y se expande después del cerramiento del blastoporo. Encambio, en X. laevis la extensión del arquenterón está solapada con el proceso de gastrulación. Los dibujos estánrealizados a escala. Imagen modificada de la referencia (9). Abreviaturas: a, arquenterón; bl, blastocele.




Cabe preguntarse sobre el significa-do de las diferencias encontradas: enprimer lugar la comparación señala quelos movimientos de CED no son intrín-secos a la gastrulación. La CED es unmódulo del desarrollo que se encuentrasolapado con la gastrulación en ranasde desarrollo rápido (10, 22). Losembriones de X. laevis, que experimen-talmente tienen defectos en el gen dis-hevelled (dsh), cierran el blastoporo enausencia de alargamiento del notocor-dio y del cuerpo (23). El gen dsh esparte de la ruta metabólica de la polari-dad celular plana que es responsable de

la CED y los embriones defectuosospara dsh brindan una evidencia experi-mental de la modularidad de los proce-sos de desarrollo embrionario (23).

INTERPRETACIÓNY CONCLUSIONESDebido a que la CED alarga el cuer-

po del embrión, cabe suponer que enespecies con desarrollo acuático el rápi-do alargamiento del cuerpo es unanecesidad para el desarrollo del rena-cuajo, dicha larva puede nadar y asíocultarse de los predadores. En tantoque en aquellas ranas que tienen repro-

Figura 3. Comparación de la expresión de Bra en la gástrula de (A) X. laevis. (B) C. machalilla y (C) G.riobambae. La expresión de Bra se representa en color negro. Se muestra la expresión de Bra en células pro-fundas del mesodermo prospectivo, que aparece como un anillo alrededor del tapón de yema y en el notocor-dio en X. laevis (24). La extensión del notocordio se inicia durante la gastrulación en X. laevis (24) y está retra-sada hasta el cerramiento del notocordio en G. riobambae y C. machalilla (12, 21). Imagen modificada de lareferencia (25). Abreviaturas: n, notocordio; ty, tapón de yema.




ducción más lenta, no existe esa presiónde un rápido alargamiento del cuerpodebido a sus adaptaciones terrestres, yla CED ha sido retrasada hasta comple-tar la gastrulación.

Nuestros resultados señalan que latarea importante que se realiza durantela gastrulación es la internalización delas células para formar las tres capasgerminales. El alargamiento del cuerpoes otro proceso que puede o no estarsolapado con la gastrulación. La com-paración del desarrollo temprano dediversas ranas nos ha permitido alcan-zar esta conclusión.

Desde el punto de vista del mejorconocimiento de las especies ecuatoria-nas, es de resaltar que las adaptacionesterrestres en las ranas dendrobatidas(Dendrobatidae) y de la rana marsupialG. riobambae (Hemiphractidae) vanasociadas con lento desarrollo, en tantoque el desarrollo sobre el agua en losnidos de espuma de las ranas túngara(Leuiperidae) es acelerado, al igual queen el organismo modelo del desarrollo,la rana X. laevis.

AGRADECIMIENTOSSe expresan sinceros agradecimien-

tos a todos los estudiantes y colabora-dores del laboratorio de Biología delDesarrollo de la Pontificia UniversidadCatólica del Ecuador (PUCE) por suapoyo a lo largo de muchos años. Susaportes han permitido alcanzar esta sín-tesis. En particular se agradece a la Lic.N. Sáenz Ponce por sus comentarios

críticos. Se reconoce con gratitud ladonación de embriones de diferentesranas realizada por los Drs. L. Coloma,S. Ron, D. Almeida Reinoso, otrosmiembros del laboratorio de Herpetolo-gía de la PUCE y de su proyecto “Balsade los sapos”. Este trabajo se beneficióde las becas de investigación de laPUCE 2008 y 2009 y de becas de inves-tigación anteriores de la PUCE. Seagradece la beca de investigación otor-gada por la Academia de Ciencias parael Mundo en Desarrollo, TWAS 07-017LDC/BIO/LA.


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Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol.XXXI Números 1 y 2: 106-107, octubre 2010

A partir del siglo XV, llegaron aAmérica grandes exploradores europe-os que desafiaron temerariamente elrico legado natural y humano de lasnuevas tierras, desconocidas hastaentonces, guiados por intereses devariada índole.

El naturalista alemán, Alexandervon Humboldt fue un gran exploradorcientífico, un filántropo y humanistaque usó su fortuna personal para reali-zar sus exploraciones, de las cualesnacieron la geoecología y la climatolo-gía, disciplinas que iba desarrollandocon cada paso que daba en los más de10 000 kilómetros de recorrido porSudamérica en menos de un año.

Sus observaciones, colecciones yescritos de nuestros volcanes, páramos,altiplanos, trópicos y corrientes mari-nas describieron desde su cosmovisiónla existencia de geografías y ecologíasimpensables y desconocidas en la Euro-pa de hace doscientos años. Sus regis-tros sobre presión atmosférica, tempe-

ratura del aire y del mar, puntos de ebu-llición del agua, cambios de alturadesde el mar a las nieves perpetuas,duración solar diurna y refracción de laluz , la inclinación magnética o las con-diciones del suelo, entre las que puedocitar, fueron bases para el desarrollo desus conceptos sobre líneas isotérmicasy geomagnetismo.

Humboldt dio a entender desde esemomento que las variedades vegetalesencontradas respondían a la composi-ción volcánica de nuestros suelos y ver-tientes, a los microclimas creados porlos vientos alisios y rayos solares casiperpendiculares, a la altura de los reco-vecos de los Andes y a las corrientesmarinas de nuestra geografía.

Se sentaban las bases del Ecuadormega-diverso, cuyo territorio, a pesarde representar apenas cerca del 1 % dela superficie de la tierra, alberga más deveinte mil especies botánicas. Dentrode ellas, un sinnúmero de plantas medi-cinales de conocimiento ancestral, que

NOTAS CIENTÍFICAS

Simposio: 200 años de Humboldt

Carlos A. Soria

Escuela de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador,Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biológicas, núcleo de Pichincha

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107Simposio: 200 años de Humboldt


han inspirado a químicos, farmacéuti-cos, médicos y shamanes en el descu-brimiento, extracción y aplicación denuevos principios activos.

Hay mucho que explorar y escribirsobre estos temas: fibras maderablesdiversas, lignocelulosas, frutos exóti-cos, los aceites alimenticios o aromáti-cos perfumados y otros aceites linealesno saturados de alto y fino rendimientomecánico; los azúcares, amino- ácidos,péptidos, colorantes, vitaminas y antio-xidantes, por nombrar unos pocos, sonlos secretos moleculares que podríaninspirar a las nuevas generaciones decientíficos, ávidos por conocer nuestrariqueza genética, inicialmente reporta-da por pioneros como Humboldt.

El nombre de este naturalista sepuede encontrar en instituciones, fun-daciones, monumentos, parques, fenó-menos naturales o fauna que llevan sunombre; su paso fortuito dejó una hue-lla inmortal en América.

La Pontificia Universidad Católicadel Ecuador y la Sociedad Ecuatorianade Biología, Núcleo de Pichincha, aus-piciaron este simposio en honor a Hum-boldt, el cual se llevó a cabo el 19 deagosto del 2010. Su quehacer científicofue redescubierto por conferencistasecuatorianos y alemanes que refresca-ron el paso de este explorador porAmérica.

Fue un honor haber sido responsa-ble de la organización y moderación deeste simposio. Agradezco el apoyo

brindado por la Dra. Laura Arcos Terán,Decana de la Facultad de CienciasExactas y Naturales, y a la Mter. Mer-cedes Rodríguez-Riglos, Directora dela Escuela de Biología. Aprecio la cola-boración de la Dra. Eugenia del Pino enla organización del evento, a los pane-listas, otros colaboradores y al públicoque llenó nuestro auditorio con su pre-sencia y entusiasmo.

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Para entender la amplitud del pensa-miento científico de Alexander vonHumboldt y su proyecto científico espreciso mencionar la preparación aca-démica que recibió en la Universidadde Berlín, Gotinga, Hamburgo y en laEscuela de Minas de Freiberg. Estudiómatemática, botánica, zoología, anato-mía comparada, geografía, geología,vulcanología; minería, lenguas, historiade la cultura, economía política nacio-nal e internacional, además dibujo ygrabado. Se relacionó con las más dis-tinguidas personalidades de la cultura yciencia europea: Johann Goethe,Johann Blumenback (zoólogo), KarlLudwig Willenou (botánico), GeorgForster (geólogo), Cuvier(zoólogo),Gay-Lussac y Bethelot (quí-micos), Laplace (astrónomo).

Humbldt se preparó para su proyec-to científico. Sus primeros 30 años losdedicó a su preparación para el viaje deestudio en tierras equinocciales deAmérica que le tomaría cinco años; tra-bajó 50 años en el análisis e interpreta-ción de datos, la preparación y publica-ción de los libros que contienen su granobra científica. “Mi verdadera y única

finalidad es investigar cómo se entrete-jen todas las fuerzas naturales, lainfluencia de la naturaleza muerta sobreel mundo vivo animal y vegetal”. Elviaje a América tuvo lugar entre 1799 y1804, visitó Venezuela, Cuba, Colom-bia, Ecuador, Perú, México y EstadosUnidos. (Mayer-Abich, 1985).

Los conocimientos científicos deHumboldt fueron los más avanzadosde su época; a eso se sumó el dominiodel método y técnicas de investiga-ción científica. Sostuvo que no puedehaber conocimiento científico sindemostración verificable. Empleónumerosos instrumentos de observa-ción y medición geofísica: sextante,cronómetro, hipsómetro, barómetro,telescopio; inclinómetro y declinóme-tro; termómetro y aerómetro; eudió-metro, electrómetro y el higrómetro,cianómetro... Y estudió las plantas ylos animales en relación con las con-diciones ambientales. Además obser-vó y describió a las personas que viví-an en cada paisaje, en sus contextossociales, económicos, políticos e his-tóricos, con lo cual logró la aprehen-sión de la realidad total.

Unidad de la ciencia en el pensamientode HumboltOswaldo Báez Tobar

Universidad Central del Ecuador

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109Unidad de la ciencia en el pensamiento de Humbolt


Contribución científicaLa principal contribución a la cien-

cia consta en los textos sudamericanosy otras publicaciones:– Viaje a las regiones equinocciales

del Nuevo Continente. Obra en 35volúmenes, publicados en Parísentre 1805-1834. Incluye variasobras subordinadas, entre ellas:Ensayo sobre la geografía de lasplantas, acompañado de una tablafísica de las regiones equinocciales(1807), y Nova génera de especiesde plantas, que contiene la descrip-ción de más de 4 000 especies deplantas, Humboldt, Bonpland yKunth.

– Observaciones Zoológicas y Anato-mía Comparada, París, 1799-1803.

– Cuadros de la Naturaleza.Cosmos. Contiene una descripción del

mundo físico que había observado yestudiado durante 50 años; repre-senta la síntesis filosófica de todoslos conocimientos de su tiempo.

– Contribuciones a la cartografíamediante el levantamiento de mapasfísicos de algunas regiones visitadasy perfiles de mapas de asociacionesvegetales.

– Concepción de varios principioscientíficos: de la relación entre lalatitud y la altitud, unidad dinámicade la naturaleza y del principio de lacontinentalidad, este último luegode viajar a Rusia y comparar lasobservaciones de América y Asia.

Contribución a la Botánicay la FitogeografíaLos aportes a la botánica morfológi-

ca y botánica sistemática fueron impor-tantes; pero la contribución científicamayor está en la geografía de las plan-tas o fitogeografía. En el Ensayo sobrela geografía de la plantas (terminado enGuayaquil en 1803) Humboldt resumelas más innovadoras concepciones de lageología, historia de las plantas, taxo-nomía, ecología, distribución de lasplantas y el transformismo. (Zúñiga,1964). Es, por lo mismo, una síntesis deconceptos y principios de varias cien-cias naturales para explicar la regulari-dad en la distribución de las plantas ylas formaciones vegetales. “La geogra-fía de las plantas hizo visibles los varia-dos mosaicos paisajísticos y su interre-lación funcional y propuso la idea de launidad dinámica y variada de la natura-leza” (Castrillón, 2001).

Contribución a la EcologíaLa base conceptual inicial de la eco-

logía es otra de las contribuciones deHumboldt; está contenida en el entendi-miento humboldtiano de “las interrela-ciones entre los organismos entre sí ycon su entorno animado e inanimado”.En esta concepción se halla el núcleo dela ecología. Humboldt se propuso “reu-nir datos para ampliar una ciencia queapenas está en esbozo y falta defini-ción, que en ocasiones es llamada Físi-ca del mundo, Teoría de la Tierra, Geo-


110 Oswaldo Báez Tobar


grafía física”. (Holl, 2001). Esta con-cepción sustenta a la ecología, aunquela denominación de ecología se debió aErnest Haeckel en 1866.

El paisaje como término científico-geográfico fue también introducido aprincipios del siglo XIX por Humboldtal definir al paisaje como la totalidadde características de una región de laTierra, que abarca la fisiografía, geolo-gía y geomorfología regional. (Naveh& Lieberman, 1990). De la conjunciónde la ecología y el paisaje surgió laEcología del Paisaje, que es la descrip-ción de un área geográfica a base delos factores que lo generan: suelo, lati-tud y altitud, el clima y sus elementos:temperatura, pluviosidad, heliofanía,vientos, humedad ambiental, y la des-cripción de la cubierta vegetal como elreflejo de su ecología. Bajo el concep-to de paisaje, la naturaleza es concebi-da como un mosaico de unidades defi-nibles: el paisaje ecológico (cuya defi-nición global fue desarrollada en por elgeógrafo y botánico alemán Carl Trollen 1938).

Humboldt consideró al paisajecomo un espacio de interrelación den-tro de la naturaleza y también entre elser humano y la naturaleza. Así prefi-guró una visión integradora y globali-zante, que casi dos siglos después seconcretó en la macroecología, discipli-na que surgió de la necesidad de apre-hender la realidad regional y global delmundo viviente. La macroecología

tiene la virtud de ampliar la visión másallá del ecosistema, del paisaje, de laecorregión… para abarcar escalas supe-riores. La macroecología es una nuevamanera de estudiar las relaciones entrelos organismos y su ambiente; estoimplica caracterizar y explicar lospatrones estadísticos de abundancia,distribución y diversidad, para lo cualtrabaja a escalas espaciales y tempora-les grandes, según James Brown(2003). En los trabajos de Humblodt seencuentra el germen del enfoquemacroecológico para el estudio de lanaturaleza viviente.

La unidad de la Ciencia en elpensamiento de HumboldtHumboldt fue formado en la obser-

vación y experimentación científica deexigencia y reflexión newtonianas, dehondura y rigor kantianos, y amplitudenciclopedista. Hombre sabio con sen-sibilidad para lo natural y lo humano.Tuvo una capacidad intelectualextraordinaria para relacionar el mundonatural y humano. Humboldt logróconocer distintas ramas de la ciencia; sudeseo fue discernir los fenómenos físi-cos en su interconexión para compren-der a la naturaleza como un todo…(Meyer-Alich, 1985). La naturalezaaprehendida por la ciencia cultivadapor Humboldt aflora como una unidaden la diversidad de los seres y fenóme-nos que lo constituyen, entre los cualesexiste armonía.


111Unidad de la ciencia en el pensamiento de Humbolt


He aquí la clave para entender elpensamiento humboldtiano: la unidadde la naturaleza expresada en la unidady totalidad de la ciencia. Humboldtbuscó la comprensión integral de laTierra como un todo orgánico, comoun cosmos. Así la visión y compren-sión integral de la ciencia alcanzó conHumboldt su apogeo y su culminaciónhistórica.

“Sé muy bien que no estoy a la altu-ra de mi gran obra sobre la naturaleza.Esta empresa es un poco grande para unparticular, pero no es deshonra sucum-bir ante un gran proyecto. El ser huma-no debe querer lo grande y bueno” afir-mó Humboldt en el ocaso de su vida.Este es el mensaje del gran científico yhumanista. En esta frase expresa larelación necesaria entre las cienciasnaturales y las humanidades.

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Zúñiga, N. 1964. Humboldt y la Geo-grafía de las Plantas. Talleres Gráfi-cos Nacionales, Quito.



Asymmetry is a feature of animalbody plans, which often reveals itselfonly upon closer inspection. Whileasymmetric coiling of snail shells isobvious even to the untrained eye, seastars and sea urchins don't even seem toqualify as bilaterians at first glance, andvertebrate asymmetry is restricted tothe asymmetric placement of many ofthe inner organs of the chest and abdo-men.

In my talk I will present asymme-tries of animal body plans in protosto-mians and deuterostomians and discusstheir origin and functional relevance.As to the underlying molecular mecha-nisms, the asymmetric Nodal signalingcascade is a conserved prerequisite forasymmetric body plan specification inall cases. I will present evidence thatsymmetry breakage by cilia-driven left-ward flow presents an ancestral charac-ter of vertebrates, likely the chordatephylum and maybe all deuterostomes.In vertebrates, leftward flow occurs in atransient structure, a monociliated epi-thelium, which is derived from superfi-cial mesoderm and localizes to the

archenteron roof during gastrulation.The chick as an example for the highlyderived birds lacks superficial meso-derm and flow. This loss should besecondary, as flow is present from fishand amphibians to mammals.

As well established as leftward flowis as a mechanism of symmetry breaka-ge, as little understood are the exactevents around flow, i.e. whether a mor-phogen is asymmetrically transportedacross the ciliary field, or whether flowis sensed on the left side, and a cascadeof events set into action downstream offlow.

We have recently performed a num-ber of experiments in the South Africanclawed frog Xenopus laevis, which is aparticularly accessible model organismfor laterality studies, to get insight intothese questions. To that end we haveperformed gain- and loss-of-functionstudies in which particular componentshave been knocked down or misexpres-sed in defined tissues of the frog gastru-la and neurula embryo. Our resultsshow that asymmetric transport of amorphogen from right to left via flow

Animal Asymmetries:Evolution and Mechanisms

Martin Blum

University of Hohenheim, Institute of Zoology, Garbenstrasse 30, D-70593 Stuttgart,Germany

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113Animal Asymmetries: Evolution and Mechanisms


cannot account for symmetry breakage,as flow on the right side is dispensiblefor symmetry breakage. Rather, flowdown-regulates an inhibitor of Nodal,which in frog is called Coco (cerl2 inmouse, charon in zebrafish) specifical-ly on the left side of the ciliated epithe-lium. Thus, symmetry breakage occursby release of repression of the Nodalsignaling cascade.

Earlier components, which havebeen described to be asymmetricallylocalized in early Xenopus embryos,could not be confirmed in our experi-ments. Rather we could show that theseso-called early determinants (such asserotonin and the ion pump H-K-ATPa-se) are involved in the morphogenesisof the ciliated epithelium, most likelyby acting upon non-canonical Wntsignaling.

Finally, we have studied the mecha-nims by which the first asymmetric cueis transported to the left side, where theNodal cascade is activated and asym-metric heart looping is induced. Wefind gap junctional communications tobe at the center of this transfer. I willpresent a comprehensive model of sym-metry breakage in the frog Xenopus,which should serve as a reference pointto investigate symmetry breakage inother deuterostomians as well.

The insights gained in recent yearsinto evolution and mechanisms of ani-mal asymmetry have been made possi-

ble because of international collaborati-ons of scientists from different back-grounds and working on differentmodel organisms. What nowadays isconsidered standard for scientificresearch was uncommon in Alexandervon Humboldt's days. Humboldt him-self can be considered a pioneer of glo-balized research, as well as of researchacross discipline boundaries. It is there-fore with particular delight to be able topresent this lecture to an internationalaudience at the Symposium "200 añosof Humboldt" in Quito, the capital ofEcuador, where Humboldt has travelledand worked extensively, and to conductresearch in collaboration with Ecuado-rian scientists on Ecuadorian frog spe-cies.



Breve reseña sobre el viajede Humboldt a América

Alexander von Humboldt nace enBerlín en 1769 de una familia rica ynoble, su padre muere cuando aún esniño. En 1790, inicia sus estudios eneconomía en Göttingen; sin embargo,su interés fue siempre las ciencias natu-rales y termina especializándose enestas áreas. En 1796, mientras es direc-tor de una industria minera en Freiberg,su madre muere dejando una herenciaapreciable, la cual Humboldt posterior-mente usa para la gran expedición cien-tífica que había planificado a América.

En 1799, inicia su viaje a Américaen compañía del botánico francés Aiméde Bonpland, reciben un permiso espe-cial del rey de España para ser recibidosen las colonias españolas. Desde 1799hasta 1804 visitan los actuales países deVenezuela, Cuba, Colombia, Ecuador,Perú, México, Estados Unidos, y el 9 dejulio de 1804 regresan desde Filadelfiahasta Francia (Nelken, 1980).

Estadía de Humboldt y Bonplanden el EcuadorA fines de diciembre de 1801, Hum-

boldt y Bonpland llegan al Ecuador,atraviesan Carchi e Imbabura y llegan aQuito en enero de 1802, su anfitrión fueJuan Pío Montúfar, su estadía en Quitose prolonga hasta julio de 1802. Duran-te este período los dos científicosascendieron al Antisana, al Pichincha yposteriormente al Chimborazo, consi-derado en ese entonces el volcán másalto del mundo; otras montañas visita-das por ellos fueron Cotacachi, Imba-bura, Cayambe, Pasochoa, Atacazo,Corazón, Rumiñahui e Iliniza. Luegoviajan al sur del Ecuador, en compañíade Carlos Montúfar, ascendieron elCotopaxi y visitaron varias localidadespasando por Cuenca y Loja donde visi-tan y estudian los bosques de Cinchona,planta conocida como remedio paracurar la malaria; visitan además Zaru-ma, Gonzanamá hasta Macará. Enagosto de 1802, dejan el Ecuador y sedirigen al Perú, posteriormente el 9 deenero de 1803 regresan a Guayaquil,donde se reúnen con Juan Tafalla, botá-

El impacto de Humboldt en la Botánicay Fitogeografía del Ecuador

Katya Romoleroux

Escuela de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador

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115El impacto de Humboldt en la Botánica y Fitogeografía del Ecuador


nico español, y visitan Samborondón.Durante su estadía en el Ecuador reco-rren un total de 169 localidades, en lamayoría de éstas, Humboldt y Bon-pland, hacen colecciones de plantas yde otros organismos, además de valio-sas observaciones y gráficos que seránesenciales para el progreso de la botáni-ca y la fitogeografía (Sandwith, 1926).

Resultados científicos del viajeHumboldt a América

Colecciones de plantas:Se colectaron más de 25 000 especí-

menes de plantas, además de datos cli-matológicos, geográficos y ecológicos

Las colecciones se hicieron por tri-plicado y fueron enviadas a París entres diferentes barcos para evitar perdi-das, todas llegaron.

Entre los años 1805-1825 Hum-boldt, Bonpland y Kunth, botánico ale-mán discípulo de Willdenow, trabajaronarduamente en la catalogación, identifi-cación y descripción en estas muestras.

Descripciones de plantas:Se realizan descripciones de 7 000

diferentes especies de plantas incluyen-do 4 000 nuevas especies para la cien-cia. De estas descripciones 5 500 fue-ron angiospermas (plantas con flores),de éstas 3 000 eran enteramente nuevas(Humboldt, 1807).

La diversidad de las plantas conoci-das en el mundo aumentó de 10 000 a

14 000 especies, ningún otro viajehabía añadido tantas nuevas especies deplantas.

Muchas de las especies descritaspor Humboldt, Bonpland y Kunth fue-ron anteriormente descritas e ilustradaspor el botánico español radicado enColombia José Celestino Mutis (1770-1806); sin embargo, los datos de Mutisno llegaron a publicarse sino muchodespués que los de Humboldt.

Una de las publicaciones más com-pletas con las descripciones de las plan-tas colectadas es la obra en siete tomos:“Nova Genera et Species Plantarum”descritas por Kunth, Bonpland y Hum-boldt (1815-1825).

Aporte de las colecciones realiza-das por Humboldt y Bonpland parala botánica del Ecuador

Humboldt y Bonpland fueron losprimeros botánicos que hicieron unacolección importante de plantas ecuato-rianas que fue transportada exitosamen-te a Europa. Sus colecciones fuerondepositadas en los principales herbariosde esa época París y Berlín y fueron labase para la publicación de muchosnuevos taxones ecuatorianos.

En la publicación en dos tomos de“Plantes Équinoxiales” (Humboldt yBonpland 1808, 1809), describen porprimera vez varias plantas americanasy más de 20 nuevas especies ecuatoria-nas con sus respectivas ilustraciones.Algunas de ellas muy útiles como es elcaso de Andromachia igniaria, cuya


116 Katya Romoleroux


corteza era utilizada para encender leña(Suplemento Ministerial, 2009); enLoja, Humboldt estudia las variedadesde Cinchona o quinina, la planta curati-va contra la malaria, descubre unavariedad nueva y mejor a la que nom-bran Cinchona condaminea (Minguet,1985). Aunque los duplicados de estasespecies tipo enviados a Berlín fueronquemados durante la segunda guerramundial, la mayoría de especies tipo seencuentran en la actualidad en el Her-bario de París y algunos herbarios esta-dounidenses y otros europeos, ya queen muchos casos se hicieron más de tresduplicados. Actualmente, se cuenta conimágenes digitalizadas de muchas deellas.

Aporte del viaje de Humboldtpara la Geografía de las Plantasy Ecología vegetalDespués de del viaje de Humboldt y

Bonpland y sus observaciones, prácti-camente fundan el nuevo campo de laciencia que es el estudio de la Fitogeo-grafía o Geografía de la plantas en lostrópicos. El concepto de Humboldtsobre geografía de las plantas fue bas-tante amplio e incluye distribución,ecología y biodiversidad, posterior-mente se diferenciaron como discipli-nas separadas.

Las dos principales publicacionesen las que Humboldt plasma sus estu-dios sobre la geografía de las plantasson:

1. “Ideas para una Geografía de lasPlantas” (1807), más un Cuadro dela Naturaleza de los países tropica-les, esta publicación contiene:

A. Descripciones de 17 diferentes for-mas de vida de las plantas; es decir,las adaptaciones ecológicas de lasplantas, este fue el primer sistemade formas de vida vegetales pro-puesto.

B. Descripción de la relación entreclima, elevación y distribución delas plantas en los trópicos plasmadoen su Cuadro de la Naturaleza, conel volcán Cotopaxi y el Chimborazocomo modelos. La distribución alti-tudinal de los taxones vegetales fuecorrelacionada con 14 diferentesparámetros abióticos. Fue la prime-ra descripción de cinturones altitu-dinales de vegetación de los Andesy de los trópicos.

2. “La distribución geográfica de lasplantas en relación al clima y a laelevación” (1817), esta publicacióncontiene:

A. Análisis de la distribución mundialde la riqueza de especies, basadosen las familias de plantas. Constitu-ye el primer análisis de biodiversi-dad.

B. Comparación latitudinal de los cin-turones altitudinales de vegetación,desde el ecuador hasta los polos,Humboldt demuestra que los cintu-rones altitudinales de vegetación,que incluyen las líneas de bosque,


117El impacto de Humboldt en la Botánica y Fitogeografía del Ecuador


decrecen hacia las latitudes másaltas. Los cambios latitudinales y deelevación en la vegetación son simi-lares y correlacionados con los cam-bios climáticos (temperatura). Estacorrelación entre temperatura y loscambios de latitudinales y altitudi-nales en la vegetación es llamada laLey de Humboldt.Se puede afirmar que Alexander

von Humboldt fundó las ciencias de laEcología vegetal y la Fitogeografíacomo resultado de sus viajes al Ecuadory otras regiones tropicales con Aimé deBonpland durante 1799 y 1804. Por lotanto, con la llegada de Humboldt, hace200 años, se iniciaron los estudios devegetación en el Ecuador y fueron elpuntal para varios botánicos que siguie-ron estudiando y publicando descrip-ciones de la vegetación y de la Fitoge-ografía ecuatoriana.

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The Berlin University was foundedby the linguist Wilhelm von Humboldt(WvH) in 1810 under a strong influenceof the philosopher Fichte and the the-ologian Schleiermacher. In the follow-ing years the University was greatlypromoted by the natural ScientistAlexander von Humboldt (AvH) whowas basically an interdisciplinary andinternationally active observer and col-lector. The young University acquiredand established great collections in thefields of botany, geology, mineralogy,paleontology, zoology etc. that arebased on AvHs own expeditions andresearch activities in South Americaand Russia, on his promotion of expedi-tians of other scientists world wide, but– equally important – on his and WvHsgreat political influence. The collec-tions have been steadily extended andmany of them are now unified withinthe Museum of Natural Science inBerlin, which is the second largest of itskind in Europe. The collections had astrong influence on many zoologists inEurope and in particular on the Charles

Darwin, who established the first con-sistent concept about “The Origin ofSpecies”.

The international and interdiscipli-nary perspective of both AvH and WvHand – for his time – exceptional inde-pendence of political supervision hasestablished the Berlin University as aparadigm for many other Universitiesworld wide. The highest proficiencylevel was reached around 1900 before itdeclined during World War I and duringthe Nazi Regime, and totally collapsedduring World War II. During the DDRtime a few branches again reachedworld standard but a broad internation-al cooperation and the reestablishmentof former cooperation has been possi-ble only after reunification of the coun-try. The Times that AvH has spent inSouth America, and in Ecuador in par-ticular, his excursions including theprofit that has been gained from itshould be reconsidered and the connec-tions he established in these lands.

Klaus Angerer of our group is work-ing on a project that traces and critical-

Two Hundredth Anniversary ofHumboldt – University,

time for new cooperations with old friendsPeter Hegemann

Instituto de Biología, Biofísica experimental, Universidad Humboldt de Berlin

[email protected]


119Two Hundredth Anniversary of Humboldt – University,time for new cooperations with old friends


ly analyses the modes of sample collec-tion and exploitation of biologicalmaterials (Biodiversity Prospecting),which is with the perspective of com-mercialization an extremely sensitiveissue, disregarding in past the interestof the home countries.

Daniela Selesi will consider andanalyze factors that determine the effi-ciency of a sustainable agriculture andthe perspective for ancient crops insuch context. This will involve specialconsiderations of the ethnic and cultur-al circumstances as well as the particu-lar climatic and logistic conditions ofEcuador. The aim of the study will be toshow the development of land use sys-tems in the context of cacao production.The focus will be on how traditionalagricultural systems are modified todayby combining existing and new knowl-

edge and how they contribute to a sus-tainable development of the region. Inthe Sumaco biosphere reserve, cacao isproduced in both forms of land use sys-tems, in monoculture and in the chakrasystem, which will allow her to com-pare both systems directly.

Other members of the group willfollow up AvHs climatology studies atdifferent altitudal levels around the vol-canos.

We will also briefly discuss currentprojects of our group at the HumboldtUniversity and discuss the potential forfurther cooperation with local universi-ties in Quite and in Ecuador in general.



El Chimborazo es la montaña másalta del mundo. En 1802 el científicoalemán Alexander von Humboldtascendió al coloso hasta una altura de5.881 metros sobre el nivel del mar ypor mucho tiempo fue el récord que unhombre había alcanzado.

Esto lo llevó a afirmar que el Chim-borazo era la montaña más alta delmundo. En 1852 se determinó que elEverest es la más alta. Pero consideran-do que el globo terráqueo es achatadoen los polos y ensanchado a lo largo dela línea equinoccial, la posición delChimborazo con 1,6° al sur de la líneaecuatorial es privilegiada frente al Eve-rest que se encuentra 28° al norte.Entonces la distancia desde el centro dela Tierra al Everest es de 6.382.478metros y al Chimborazo es de6.384.673 metros, lo que nos da unaaltura mayor de 2.195 metros. ¡Hum-boldt tiene la razón!

Todo depende de cómo se mida o semire. A nosotros los fotógrafos, como atodos los artistas, nos impresiona elChimborazo y lo plasmamos en nues-tras imágenes con la espectacularidadque se nos presenta: alto, majestuoso.

¡Aquí cuenta la primera impresión!

Y siempre me ocurre lo mismo, voy poruna calle, viajo por una carretera, ocamino por el campo y de repente ahíestá, la montaña, en su máxima expre-sión y mientras avanzo parece que laaltura disminuyera, la montaña se des-vanece en la cordillera entre los demáspicos. Pero nuestra imagen ya expresalo que sentimos.

Aquí varios ejemplos de cómodiversos artistas ven a nuestro Chimbo-razo, esta hermosa montaña que es unode los símbolos de nuestra Patria.

Bibliografía:Der Report-Nr.22 Magazin November

1977.

¡Humboldt tenía la razón!Christoph HirtzFotógrafo, Quito

[email protected]


121¡Humboldt tenía la razón!


Humboldt Atlas der kleineren Schriften

Del Viajero italianoOsculati


122 Christoph Hirtz


Anónimo

Emilio Moncayo 1940


123¡Humboldt tenía la razón!


Gottfried Hirtz 1942

Christoph Hirtz 2010



La Revista Ecuatoriana de Medici-na y Ciencias Biológicas es el órganooficial de divulgación científica de laSección de Ciencias Naturales, Bioló-gicas y Ciencias Exactas de la Casa dela Cultura Ecuatoriana y de la Socie-dad Ecuatoriana de Biología, Núcleode Pichincha. Sus objetivos son: divul-gar artículos científicos, presentarcasos médicos y publicar notas cientí-ficas en las áreas de ciencias biológi-cas puras, aplicadas y biomédicas; estarevista tiene tres secciones:

A) Artículos Originales, B) Revi-sión de trabajos y Notas Científicas yC) Hojas de Vida y Reseñas Institucio-nales. Las secciones B) y C) sonopcionales.

Los Artículos originales provienende trabajos de investigación científicarealizados por los autores, es responsa-bilidad de ellos el uso de datos de terce-ros. Los artículos originales constaránde las siguientes partes: Título,Autor(es), Afiliación Institucional,Resumen, Palabras Clave, Abstract,Keywords, Introducción, Materiales yMétodos, Resultados, Discusión, Con-clusiones, Agradecimientos y Referen-cias Bibliográficas.

Los Trabajos de revisión y notascientíficas, tendrán un formato perso-nalizado por sus autores, pero es obli-gatorio el uso de las siguientes seccio-nes: Título, Autor(es), Afiliación Insti-tucional, Texto y Referencias Biblio-gráficas.

Las Hojas de Vida de los miembrosde la Sección de Ciencias Naturales yCiencias Exactas de la Casa de la Cultu-ra Ecuatoriana y de la Sociedad Ecuato-riana de Biología Núcleo de Pichincha ylas Reseñas Institucionales de centrosde investigación adscritos a universida-des o independientes tendrán un formatolibre. Son un ensayo libre descriptivo deuna persona o institución que trabaje enáreas importantes de la medicina y de lasCiencias Exactas y Naturales.

Formato del manuscritoLos manuscritos deben ser presenta-

dos, en idioma español o inglés, enpapel A4, con los cuatro márgenes de2,5 cm, tipo de letra “Times NewRoman” 12 puntos, doble espacio, jus-tificado y páginas numeradas.

Título en minúsculas, con unaextensión ideal de 15 palabras, negrita,centrado, 14 puntos. Ejemplo:

INSTRUCTIVO PARA AUTORESREVISTA ECUATORIANA DE MEDICINA

Y CIENCIAS BIOLÓGICASDE LA CASA DE LA CULTURA ECUATORIANA


125INSTRUCTIVO PARA AUTORES


Preferencia de estratos boscososen la alimentación de Turdus fuscaterdel Pasochoa

Autor o Autores: Nombre(s), Ape-llido(s), en negrita, centrado, 12 puntos.Ejemplo:

Juan Eduardo Pueblo P.1 & Este-lita Estrella2

Afiliación institucional: Institución,ciudad, país, correo electrónico delautor encargado de la correspondencia:Si los autores representan a diferentesinstituciones indicar con un numeral, eltexto en 10 puntos, centrado. Ejemplo:

1Centro de Investigaciones Científi-cas del IASA, Facultad de CienciasAgropecuarias, ESPE, Sangolquí,Ecuador. [email protected].

2Departamento de Zoología, Escue-la de Biología, Universidad Amazónicadel Uruguay.

Para los nombres genéricos y espe-cíficos usar itálicas y al ser citados porprimera vez en el texto, se debe incluirel nombre del autor(s) y el año de publi-cación.

En los trabajos que así lo requieranes necesario presentar el listado delmaterial examinado, con las coordena-das de las localidades muestreadas(dentro de lo posible), asimismo citarlas instituciones depositarias de losespecímenes. Ejemplo:

Material examinado: Holotipo (disectado y guardado en microtubo),etiquetado D. quillu holotipo DVeladet. 2003/Pasochoa, Pichincha, Ecua-

dor DVela col., mar. 2001. Ocho parati-pos (disectados y guardados en micro-tubos), etiquetados D. quillu paratipo DVela det. 2003 / Pasochoa, Pichincha,Ecuador DVela col., abr. 2002. Holoti-pos y paratipos depositados en elQCAZ.

RESUMEN con una extensiónmáxima de 200 palabras. Palabrasclave: cinco palabras separadas porcoma, la primera letra en mayúscula yen orden alfabético

ABSTRACT (Título en inglés) tra-ducción del resumen, Keywords: pala-bras clave traducidas al idioma inglés.

Como se nota de los puntos 7 y 8 lostítulos de las secciones van en mayús-culas, negrita, 12 puntos. Si se requiereun subtítulo este va en el mismo párra-fo con negrita, separado del texto porpunto y raya.

Las figuras (esquemas, diagramas,dibujos, gráficos, fotografías y mapas)deben ser preparadas en formato JPG, ypresentase en hoja aparte y numeradas,adoptando el criterio de rigurosa econo-mía de espacio, considerando, que elárea útil de la página (16,5 x 24 cm) y lacolumna (8 x 24 cm) con el título al piede la figura en 12 puntos. La posible ubi-cación de las figuras deben señalarse enel texto del manuscrito con una cita enparéntesis. Ejemplo (Figura 1, aquí). ElComité Editorial se reserva el derechode ubicar las figuras, en función delespacio disponible, o solicitar a los auto-res hacer los cambios correspondientes.


126 INSTRUCTIVO PARA AUTORES


Las tablas deben presentarse con eltítulo en la parte superior, de un modoconciso y explicativo, en 12 puntos. Laposible ubicación de las mismas, igualdebe ser indicada como en el punto 10.

REFERENCIAS BIBLIOGRA-FICAS. Se prefieren a revisiones queprovengan de artículos publicados enrevistas científicas indizadas, librosreconocidos, tesis de doctorado, maes-tría o pre-grado que reposen en lasbibliotecas de las instituciones otorgan-tes. Los artículos en revisión o en pren-sa, así como las comunicaciones perso-nales se citarán en el texto, pero no for-marán parte de la bibliografía. Las refe-rencias, deben constar en el textonumeradas entre paréntesis y aparecerde acuerdo a la secuencia de citación.Ejemplos de referencias bibliográficas:

ARTÍCULO DE REVISTACIENTÍFICA DUCHICELA, E. J. I. 2004. Diversi-

dad funcional de las micorrizas arbuscu-lares asociadas a Brosimun utile en con-diciones naturales. Ciencia 7(8): 65-77.

STAIKOU, A. & LAZARIDOU-DIMITRIADOU, M. 1991. The lifecycle, population dynamics, growthand secondary production of the snailXeropicta arenosa Ziegler (Gasteropo-da: Pulmonata) in northern Greece.Zoological Journal of Linnean Society,London, 101: 179—188.

DYKE, F. G. V.; BROKE, R. H. &SHAW, H. G. 1986. Use of road trackcount as indices of mountain lions pre-sence. Journal of wildlife Management,Bethesda, 50(1): 102-109.

b) CAPÍTULO DE LIBRO EISENBERG, J. F. 1979. Habitat,economy and society: some correla-tions, and hypotheses for the Neotro-pical primates. En: Bernsteind, I.Sand O.E. SMITH. eds. Primates eco-logy and human origins: ecologycalinfluences on social organization:215- 262. Granland STPM Press.New York y London.

c) TESIS DE GRADO JIMÉNEZ P., P. J. 1995. Área de viday uso preferencial del hábitat deCebus albifrons (Primates: Cebidae)en Cuyabeno, Amazonía Ecuatoria-na. Tesis de Licenciatura, PontificiaUniversidad Católica del Ecuador.Quito, Ecuador.

d) LIBROS ENTEROS KREBS, C. H. 1985. Ecología: estu-dio de la distribución y abundancia.Segunda edición. Harla. Ciudad deMéxico. 340 pp.

e) INFORMACIÓNPROVENIENTE DE INTERNET Ciertas páginas que tengan informa-ción científica relevante puedencitarse así: DI FlORE, A. 2001. Pro-yecto Primates Ecuador.


127INSTRUCTIVO PARA AUTORES


Página de Internet:www.nyu.edu/projects/difiore Con-sultada 13-enero-2006.

En la presentación de casos, lasreferencias bibliográficas deben ir deacuerdo a la connotación editorial inter-nacional que consta en la página web:http://www.icmje.org/.

El autor principal deberá enviar elmanuscrito original (más dos impresio-nes, una copia electrónica del docu-mento en CD bajo el formato Word3000 o inferior y de ser factible por víaelectrónica), acompañado de una cartadirigida al Editor de la Revista, indican-do la originalidad del trabajo. Losmanuscritos serán revisados por árbi-

tros asignados por el editor, su aproba-ción estará sujeta al contenido científi-co, respaldado por el parecer de losárbitros y del comité Editorial. Se soli-citará a los autores realizar los cambiosy sugerencias pertinentes mediante ladevolución de los manuscritos o docu-mento electrónico, acompañados de lassugerencias.

Para la presentación de casos, notascientíficas, hojas de vida o reseñas ins-titucionales, igualmente dirigirse a loseditores de la Revista o al Presidentedel Núcleo de Pichincha de la SociedadEcuatoriana de Biología (SEB-P).Información disponible en el portal deInternet de la SEB-P http://www.sebpi-chincha.org/


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G.A. Carrillo-B, S. Martin-Solano. Estudio Preliminar