Forward Genetic Screens:Strategies and challenges

HarwinGoFish

22 July 2015

Forward genetics

Phenotype  Gene

Several advantages:‐ Starting point is a strong phenotype

‐ Unbiased approach  possibility to find new regulators of certain process

‐ Able to obtain large number of genes involved in the same process

Things to consider

1. Phenotypes to screen for2. Methods of mutagenesis3. Identification of mutagenized gene4. Degree of saturation5. Proof of candidate gene

1. Phenotypes to screen for

1. Morphology, lethality2. Maternal phenotypes3. Specific embryonic phenotype (Ab staining, 

ISH, nervous and hematopoietic systems)4. Modifier screens5. Temperature sensitive screen6. Regulatory elements

2. Methods of mutagenesis

Gamma‐ray irradiation

Chemical mutagenesis

Insertional mutagenesis

Gamma‐ray irradiation

Kimmel, 1989

Time: Mutagenized sperm or embryos at mid‐blastula stage

Effect: Large deletions / translocations

Pros:Relatively fastHigh mutagenic rate  (~1.2 hit per 100,000 genome/rad, higher with increasing rad)

Cons:High lethality (non‐specific)Hard to map/maintain lines

Gamma‐ray irradiation

Chemical mutagenesis

Lawson and Wolfe, 2011

Chemical mutagenesisTime: Premeiotic sperm

Effect: Point mutations

Pros:Fast mutagenesis and family generationHighest mutagenic rate (3 hits/gene/1000 genomes screened)More random than insertional mutagenesis

Cons:Lots of silent missense mutationsPositional cloning takes FOREVERNeed multiple outcrosses to divergent background for mapping

Insertional mutagenesis

Lawson and Wolfe, 2011

Insertional mutagenesis

Amsterdam et al., 1999

Insertional mutagenesisTime: Midblastula embryos

Effect: Large insertion and gene silencing

Pros:Positional cloning is super easyEvery integration results in silencing

Cons:Mutagenesis rate is lower than ENUMutagenesis is very labor intensiveSlight bias towards open regions of the genome (higher insertion rate at 5’ ends)

Summary: mutagenesis methods

Amsterdam and Hopkins, 2006

3. Identification of mutagenized gene

Insertional mutagenesis has the upperhand!

Inverse PCR + BLASTing known sequence = rapid mapping!

Some technical problems with highly similar regions in the past, but with better genome sequence this is minimized

Amsterdam and Hopkins, 2006

Positional Cloning

3. Identification of mutagenized gene

Chromosomes with mutation

mutation

‐ Polymorphic markers close to mutation will segregate with mutation more frequently than markers further away

= Simple Sequence Length Polymorphisms (SSLPs)

Positional cloning

Zhou and Zon, 2011

• Labor intensive• Need ~2000 mutants to be able to map to 0.1cM

• With better genome, still needs ~400 mutants to map to 1cM, and sequence genes in between

• There are sites with minimal recombination in the genome!

Positional cloning

Mutagenesis + Whole genome‐seq

Zebrafish Mutation Project (ZMP)

Problems with ZMP

1. Low depth of sequence‐ Sequencing gametes is less sensitive

2. Difficulty in recovering found mutations, husbandry

3. Space constraints

Positional cloning + Seq: A better approach?

Obholzer et al., 2012

4. Degree of SaturationA. How efficient is the mutagenesis?

Mullins et al., 1994B. How many hits on the same gene? 

Also depends on the gene size

5. Proof of Candidate Genes

1. In case of multiple alleles: complementation2. Rescue assays3. Morpholino4. Reverse genetics