10
Fluorescent Proteins in Animal Cells for Process Development: Optimization of Sodium Butyrate Treatment as an Example Lisa Hunt, 1 Pascal Batard, 2 Martin Jordan, 1 Florian M. Wurm 1 1 Laboratory of Cellular Biotechnology, Department of Chemical Engineering, Swiss Federal Institute of Technology, 1015 Lausanne, Switzerland; telephone: +41 21 693 61 42; fax: +41 21 693 61 40; e-mail: Martin.Jordan@ep¯.ch 2 Institute Ludwig, Division D'Onco-Immunologie Clinique, Hopital Orthopedique, Ave P. Decker 4,1005 Lausanne, Switzerland Received 14 May 2001; accepted 28 August 2001 Abstract: Fluorescent proteins expressed in mammalian cells can be quanti®ed quickly and noninvasively with a standard ¯uorescence plate reader. We have previously exploited this quality in cell growth assessment Hunt et al., 1999b). In this work, different CHO cell lines constitutively expressing ¯uorescent proteins were eva- luated as model systems for process development and optimization. Our results demonstrate that the ¯uores- cence of these cell lines quickly reveals conditions that might improve the overall productivity. Sodium butyrate, a well-known yet unpredictable en- hancer of production, was chosen for this study. Due to the competing effects of sodium butyrate ``butyrate'') on expression and cell number, the maximal overall productivity represents a compromise between en- hancement of production and toxicity. Based on ¯uo- rescence only, it is possible to separate effects on cell number and speci®c production by combining micro- plate ¯uorescence measurements with data obtained by ¯ow cytometry. This allows for rapid screening of dif- ferent clones without counting cells or quantifying the recombinant protein, a highly attractive feature if the expression of green ¯uorescent protein GFP) was cor- related to that of a protein of interest. For all clones tested, negative effects of butyrate on proliferation were similar, while net enhancement of expression was characteristic for each clone. Therefore, it is necessary to optimize treatment for each individual clone. This work demonstrates that, based on the ¯uo- rescence of GFP-expresssing cell lines, it is possible to examine noninvasively three critical, generic parameters of butyrate treatment: butyrate concentration, exposure time, and culture phase at the time of addition. ã 2002 John Wiley & Sons, Inc. Biotechnol Bioeng 77: 528±537, 2002; DOI 10.1002/bit.10108 Keywords: CHO cells; ¯uorescent proteins; GFP; process development tool; recombinant protein production; so- dium butyrate; YFP INTRODUCTION Most process development teams are ultimately inter- ested in increasing the ®nal recombinant protein titer, which depends on cell density, speci®c productivity, and run time. Common approaches for maximizing volu- metric productivity of an established cell line focus mainly on increasing cell mass or speci®c productivity. Many compounds or parameters are known to aect productivity, though often their mechanisms are not fully characterized, and, therefore, the net eect cannot be predicted. Thus, in reality, process development de- mands empirical testing of many variables, in often overwhelming permutations. For suspension cells, lim- ited testing can be carried out in spinner ¯asks, while more extensive screening is possible in smaller-scale systems with a higher throughput Girard et al., 2001). Regardless of the scale, two of the most important pa- rameters for characterizing a process constitute major bottlenecks: cell counting and quanti®cation of product titers are both time- and labor-intensive. While mea- surements such as O 2 uptake Ducommun et al., 2000), heat ¯ow Guan et al., 1998) or culture aroma Ba- chinger and Mandenius, 2000) can be correlated with biomass or cell metabolism, the quanti®cation of re- combinant proteins is more tedious. Most cases require a speci®c assay that can distinguish the recombinant protein from the large quantity of other proteins in the culture. Only a few proteins, such as cytochromes and those with heme groups, are easily and visually detect- able within a complex sample due to their absorption of light in the visible range. However, these proteins have not been used as models of gene expression. Fluorescent proteins permit sensitive detection and oer the potential to overcome the bottlenecks in pro- cess characterization and optimization. The green ¯uo- rescent protein GFP) Cormack et al., 1996) and its variants hereon referred to generally as XFP, unless Correspondence to: Martin Jordan Contract grant sponsor: Biotechnology Priority Program, Swiss National Science Foundation ã 2002 John Wiley & Sons, Inc.

Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

��������� ������ � ���� ����� ���������� ���������� ��������� �������� ������ ������ ��� �������

���� �!" ������ �����!# $��� %����!" ������ $& '���"

����������� � ��� ��� �������������� ���������� � ������� ����������������� ������� ������ �� � ����������� � �! �� ������ ����"������#���������$ %&� '� ()* (� &'# �+$ %&� '� ()* (� & # �,����$-�����./�����0��1.��'������ �� � ����� ��2����� �34���,��� ������� ����5 �� 6������4��������5 �� 72� 8. ���9�� &�� ! �� ������ ����"������

:����2�� �& -�� ' �# �������� '; 7 � �� ' �

(����� ��������� ������ � ������� � ������������� �� �� ������� ������� �� ���������� ��� ������� ���������� ���� ������� �� ���� ����������� ������ ��� ������ � ���� ����� �������� ���� ���� !!!�"� # ��� ����� ��$$��� %�& ���� �������������� � ������� �������� ������ ���� ���'����� �� ����� ������ $�� ������� ��������� �������(���� &�� ������ �������� �� �� ������'���� �$ ���� ���� ���� ������� ������� ������� ������ ������� �� ������� �����������)����� ������� � ����'��� �� ����������� �'

����� �$ ��������� ��� ����� $�� ��� ����� *�� ��� ������� �$$��� �$ ������ ������ �++������,,"� � ������� �� ���� ������ �� �� ���� ����������������� �������� � ���������� ����� �'������ �$ �������� �� � ����� -���� � ���'������� ���� � �� �������� � ������� �$$��� � ��������� �� ������� �������� �� ������� �����'���� ���������� ���������� ��� ��� ������ ����� �������� .��� ������ $�� ����� ������� �$ ��$'$��� ����� ����� ����� ����� �� ����$��� ���������� ������ � ������ ������� $����� �$ ��� ������� �$ ���� �������� ����� �/�0" ��� ���'������ � �� �$ � ����� �$ ��������� ��� ����� ����� ������ �$$��� �$ ������ �

�����$����� ���� �������� ����� � ������� �$� ������� ��� ������������ $�� ���� ����� .����$����� �� �������� � �����(� ����� $�� ���� �������������� .��� ���� ��������� ��� ����� � �� ���'������� �$ /�0'� �������� ���� ����� � �� �������� �� ���� ���������� ���� �������� ������ ����������$ ������ �����1 ������ ��������� � ���������� �� ������ ����� � �� ��� �$ ������� � 23324�� ����� 5 )��� #�� ���������� ������ ))� 627869:� 2332;*&# 3� 332<��� 3 37*��+����� %�& �����; �������� ������; /�0; ���������������� ���; �������� ����� ��������; ��'���� ������; =�0

,-�.��/��,�-

���� ������� ������� � ����� ��� ���������� � �������� � � ������ � ��� � �� ������� � � ������ ����������� ��� � � ���� � ����� ������� ����������� � �� ����� ����� ���������� ��� �������� � ���������� ���������� �� � ���������� ���� �� � �������� �� � � ������ � ���� ���� �� ������� ������������� � ������ � �� ���������� ��� � �� �� ���������������� ������ ���� ����� ����� ���� ��� ������� ������������� � � ���������� ��� �� ����� �� ���� �������� ���� � �������� ������� ������� � ���� � ��������� ����� � �� �� � ��������� � ���� ��������� � ���������� �� !�� ����� ��� ������ ������� ����� � �� �� ������ ��� � ��� �� "����� ��������� ���� ��� ����� � � �� �������� � �������������������� ���� � ������ ���������� #$���� �� ���� %&&'(�)�������� �� ��� ������ ��� �� ��� ���� ������� � ����������� ��� ������������ � � ������� �� ������� ��*�������� ����+ ���� ��� �� � � ,�� �������� �� ������������ ��� ���� ����� � ������� �� ���� -���� ���������� �� ���� �� .% ������ #/������ �� ���� %&&&(����� "�� #$�� �� ���� '001( �� ������� ����� #2����� ��� � �� � ���� %&&&( �� �� ��������� ����������� �� ���� ����������� ��� ,�� �������� �� �������� � � ������ � �� ���� ������� ���� ����� ��,����� ������� ����� ���� �� ���� ����� ��� ������� � ������� ���� ��� ����� ,�� ���� �� ����� ������ � � ����������� . �� � ��� ������ �� ���� �� ����������� � ����� ���� ���� ������� ��� ������ � ������� ���������� ����� � ������� ������ �� �� ����� ��������� ������� � ��� ������ �� ��� 3������ ����� ������ � ��� �� ��� ��� �� ����� �� �� � ��������� �!�������� � ������ � ������ �� ����� ������� �

���� ��� ���� ���� �� ������� ��� ������ ���� � �������� ��������������� � ����������� � �� ���� "�������� � ������ #$!4( #������� �� ���� '005( � ������� �� #����� ������� �� �� ������ �� 6!4� � ����

������������� �� ����� 7���

�� ����� ��� � ��� ���+ 2������ ����� 4������� 4������� 8����

9���� �� 8��� �� !�� ����

� 2332 4�� ����� 5 )��� #��

Page 2: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

��������� �������( ���� �� ��� ������ "������� � ������� #:!4( ��� ��� �������� � �� � ���� ���� � ���� ����� #������ � ;�� � '001(� 6!4 �� ���� ����������� �� � � � ���� ��� �� �� ���� �� � ��������� � ��� ��� � ��������� � ��� � ��� ���� �� �� � �������� ���������� �� ��������� #������ �� ���� '00<�;�� �� ���� '00=> 4���� ���� �� ���� '00?(� @� ��� ��� ���� ���� "������� �� �� � ,�� ������� ������� ��� ����������� $!4 � �� ��� ����� #A� �� ���� %&&&� 8������� �� � 8��� �� '005(� �� ��,�� ���� ,�� �������� �� �������� ���� � ���� � � �� �� ��� � �� � ����������� #9���� �� �� ���� '00=(� � ���������� "�������� �� ������ �� � "�� ��������� #)��� �� ���� '00=(�-��� ��� ���� ���� ��������� ����� �� �� ,�� ���� � � ������� -� ��� ��������� ��� ������ ������� "������� �� �� ����� ������ �������� � $!4 �� ����� �� � � � ���� ��������� � �� ���� ������� � ��� ������ ���� �������� ����� � �� ���� �������#3� � �� ���� '000�> 3� � �� ���� '000�(�@ ���� ����� �� ����� "������� � ����� �� �������

������� �+ ��� ����������� �� ����� ��������������� �� 8���� �������� #����� ������� �� �� ������� �� ��������( �� � ������� ���������� � �� ��� ���� ��� �� �������� �� !/B������� �3. ��������C �� ���� � �� ����� �������� ��� ��� ������ � �� � ���� �� ��� ������ ���������� � ������� ���#2����� '001> ������� � ����� %&&&> !� �� ���� '000>$���� �� ���� '01D> 3��� � 3������ '01%> �������� ���� %&&'> .� �� ���� '00D> 4������ �� ���� '00<(� �� ���������� ������������� � ����������� ���������� � ����� �� �������� ��� ��� ������� #������� ;���� '01%(� ����� ����� ����� /9B �� ���������� ������ �� ������ �� �� ��� #2��� �� ���� '01'(�2������� ��� ���� ��� ������ �� � ����� ���� ������#.��������� �� ���� '010> 4������ �� ���� '00'(� � �� � ��� ��������� #���������� �� ���� '00<> �������� ���� %&&'(� /������� � �� �� �� � �� ��� ������������ ��� ��� ��� ������ #2���� '001> /EB � ������ '01&(� /�� �� ����� ������� � ������� ��� ����������� �� ����� �������� � �������� �� �� �������������� �� �� ������ �������� � 6!4 ���� � ��� �� ���

�� ����� ���� ��� ����� �� ����� �������� �� ��������������� ���� ������ "������� �� ��������� ��� ������� � ���� ��� ������� ��� ������� � �� "�������� � ���� �� �� �� �� ��� �� �� ���� � ��������

��������� ���������� �� � ����� �������� ������� ����������

$ ��., �� -� $�� ���

���� ���� �� 0�����

B�� ������� ������� � � ���� �� �� ���� ���������� ��������� ��������� ��� ������� #7��� �� ���� '005( ����� ���� ���� ��� �3. /$<< �� � #F����� �� ���� '015(������������� �������� ������ ��� � ��� ��� � �� ������ � ������ "������� � ������ � #�C$!4�9' � �C:!4�9'� ������������ ��� ����� 4��� B���� �B( ������� �� ������ ��� ���� �� �� ����� �� � ���� @� 8�����6!4 ��������� � � ��� ���� �� �� � ���������� ����� ���� ��������

���� ������

����� ���� ���� � ����� � ������� � "���� �� ���������� ������ # 44� ����� �� � 8�������� ( � /�C�G!'% '+' ����� #A��� ��� �������� 2�����8�������� ( �������� �� ���� =� ����� ���� �����#!�8( #8���� ���� H�������������� 4������ $��3� 8��8������� $���� �(� � ���� � ������ �� D?�� � �������� =� �.% ����������� ���� � ����� ��������� ������ �� ������� � ���� ������ �C/ B #A��� ��� �������(� ��� ��� � ���������� �� ������ ������� '+= � '+%&� I�������� � ���� ����� ���� ������� � ��� � ��� ����� ���� �������� ����� � �9������� ������������� #!����� 8��� ����� -���� �8�������� (� ���� � ���� ��� ���� ������� ���� ��B8: ' � ���� ��� ��� #8���J ��� 8������ )����� �� �$���� �(�C������� �� ���� ������ ��� � '% ���� ������ ����

' � '&= ����� ���� ��� ���� � ' �A ������ F ����� �� �� ���� �� ����� ������ �� "�� �� �������������� D ��� ������ C��� ������ ��� ����� �� ����� � ��������� � ���� �������� � ��� ��������B ' � ����� ������� �� ����� �������� #2�=11?�

8����� 8�� A����� �.( ��� ������� � ����� ���� ������������� ������ ����� �� ���� � ����� �� <�� ��� ��� 5�� ��� ������� ��������� ���� �� �������� 2������� ��������� �� �� ����� ������ ������ �� ���� � �� ����� ����� ��� ��� $������ �� �� ������ #��GA( ���������� ���� � %D&& 8 B ���� � ������ #:8@� :�����

����� �� ���� ����� �� "������� � �3. ���� �� �� ��� � ���� �����

6!4 ���� �� �� ����� ��

$!4 @ ����� ��� � '5' #!���� 'K<( ��� � '5' �� � ������ � ����������������� ���� �� � ��� �������

#3� � �� ���� '000�(

:!4 '% ��� ���� �� �� # ���� @@( C��������� � � ��� � � ��� ������� �

:!4 � @�$ = :@�$ ���� �� �� #!���� <K=� ���� @@@( �� ���� �� � �/71 #�������� �� ���� %&&&( ������ �������� � � ��

)�/�@�$ ��� ����� ������ ���� �C:!4�9' �� ������ ���� �� ��

�������� � ���� :!4 � � �����

�>?. @. AB�1 /�0'@C0D@))#?/ %@BB) #? 0D&%@)) *@E@B&0F@?. 62!

Page 3: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

8��� ��� .3(� �� ������� �� ������� ��� ��� ���������� �� ��������� � ��� � �� ������� �� �� ������ ���� ��� �� �� ������ �� ������� � ����� ������

.����(�� ����� 1���2����

!�������� �� � ��������� ������ ��� ������� ���� �����"��� � <&&& ���������� � "��������� #4��8�����2���������� @ ��� !���� ����� �B( �� ��� 1&� ���������� �� ���� ��� ������� � ����� ����� ��+ ��������� ��<1= � ���� � ���� �� ���� �� %& �� � ������� ��=D& � ���� � ���� �� ���� �� %= �� !�������� ��� �� ���� �� ��� � ������� "������� �� � ��� #���(� B��� � ����� ����� �� ��� ������ ��� �� �� ����� �� ���� � � ����� ��� � ������ ��� ��������� �� ��� ���"������� �� ��� �� ������� ��� ��� ������ @� ��� ���������� ��� � ������ � "������� �� ���� ��� ����� ��������� � ���������� ���� ,�� ���� �� 6!4 ����������� � ��� �������� �� � ��������� ��� � ������ #����� ������� �� ������ �� "������� �� ��� �������(� ��� � �����"������� �� ��������� � ��� ��������� ���� ������,�� � ��������� ��� ���� ��� "������� �� �� ��� ������� �������� ������� � ��� ���� #!���� ' � =(� 2�������� �� ���� � ��� ��������� �� ��� "������� �� �� ��������� ������ ��� �� ��� "������� �� �� ��� � ������� �� �����!�������� �� ��� ���� ��� � ����� � � 4B8@@@ "��

��������� #4������ ��J ����� $���� �(� .������ ���� ��� � ��� �� ������ ����� �� � ������ ���� D�&��� !������������ ���� #L'115'� 4������� ���� -���� ��� � 4B(�6!4 "������� �� ��� �������� ���� ��� =%=� � ������/��� ������� �� � �� ����� '&�&&& �� �� ���� ��������� � ����� ��� � !����� �������� #4�����(� B ����������� ���� ,�� ���� �� � ����� �� ���� CA@8B ��������� ��������� #7��� �� ���� '000(�

.��/���

�� ���� ������ �� �������� �� ���� �� �� ���� ����������� ������� � ���������� ���� ���� ��� �������6!4 ��������� � ������ � ���� ��������� ����������������� ���� "������� ��� 2��� � ��������� �� ��"������� �� ���� � ����� ������ �������� �� �� ������ ��������� ����� � ����� ���� ���� �������� ������ � '5'� 2������� ������� � ��� ��� ����� � �����"������� � �3. ���� �� ���

������ ������ �������� ��� ���34������������� 5 �34�� ���� ��������6

!�������� � ����� #��� � '5'( ���� ���� � �� ����� '%���� ������� ���� ��� ������ ��� � ����� ��� ����������� ����� ����� �������� �� ���� ����� ���������� �� �� ������ � �� �� � ���� &K'& ��� �� "�������� �� ��� ��� ������� ����������

!����� '� ����� ��� � ������ � ��� "������� �� �������� ����� ����� �� �� � �� ���� �� �������� �� ��� ������ � @ ����� �� ��� � ����� ��������� � *�������� ��� ����� ����� ��� "������� �� ��� ������������ '� D� � < ���� C��� �� ����� ����� � ������������� �� ������� �� �� � �� � � ��� ������ 2� �������� � ��� "������� �� �� ��� ������ ����� �� ���� �� ����� ����� ����� �� �� �������� ��� ������ �������������� ' �� ��������� ����������� �������� �� �������� ������ ���� ����� ������ �� �������� ���� �� ���� ��� �� ��� �� ���� ������ �� ���� � ������� ���������� � #-������ '0?D(� ������ � ���� 'K% ���������� ����� ��� ���� ���� "������� ��� �� �������� ��� ��� ���� ������� ����� D���� ��������� ��

���� � #�( !�������� �� ��� � �������� �� ��������� /����� �

�� �� ������ � #&K'& ��( �� �������� ���� �� �� ������� �� ��� �

'5' �� �� "�� ��� ��� ������ ���� ������� ����� ����� � ��������

����� #&� '� D ���(� C��� �� ����� �������� ����� �� ������� �� �� �

�� � � ��� ������ �� � ����� "������� �� ��������� � ��� ��� �� �

��� � ��� ��� �����,�� � ��������� ��� 8�� �� ������ � ����

��������� �� � ����� ���� �� ��� ������ #� M D( ����� ��� ��� #�(

2������� � �� ���� � #"������� �� �� ��� ������ ������ ��� ��

���� �� ��� � ������ �� ����(� 2������� ��� �� ������ �� �� "�� �

������� #����� ���� ����� &K'& ��� ���� ��� �� !��� ��( �� �� �������

���� ������� #���� �������� &K= ��(� !��� �� �� ���� ��� ����� ��

����� ' �� ��������� � ���� �� �� ��� ����� �� ����� D ����

693 -#&.@%�?&B&/= A?* -#&@?/#?@@D#?/� E&B� ::� ?&� 6� FAD%� 6� 2332

Page 4: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

��� �� �� ��� ������ $!4 � �� ������� � ������ ���� �� D # ����� �� ����� ��� ��� ��� �� D � <� ������ (� B���� �� D� ������� �� ���� ���� ���������� � �� �� ��������!����� '� ����� ��� � �� ���� � �� "������� ��

������� �� ��� & �� �������� �� ����� �� � !����� '������ �� � ������� �� � ����� � �������� ����� ������ ����� 'K% �� �������� �� �� "�� �� ����� <&� ����"������� �� ����� ' �� ��������� � ��� ?&� ��������� D ���� !�� ������ �������� �� �� ������ �� � ��� ���� � ��� ���� ��� �� ���-�� �������� ��� �� �� ������� ���� ������ ���

����� �� ���� � ������� �� �� ������ ���� ��������� ����� ������ ��� �������� ��� �� �� �� "��� ��+ ��� �� �� ������ ����� � ��� ���� ���� "�������� �� ��� �� ��� ���� ' ��� ��� ���� ���� ��� ������� ������� ����� D ���� � ��� "������� �� ����������������� ������� ��� ������ ��� ��� �� ���� ����� �� �� ������ � � ���� ��� �� #��� �� ���� (�3������ � �� ����� �� ��� ��� ������ � !����� '���� �������� ��� �� ������ � �� ���� � ��� ������� �� �� ����� ' �� �������� ��� ����� D ����!�� ��������� � ��� ������� ��� ��� �������

��� �������� ��� �� ���� � ����� ��� �� ���� "�� �� ���� ������ #� ��� �� �� �� ?&�&&&K1&�&&&���( ��� ��� �������� ��� �� �� ��� ���� �� ���� �#'=�&&&K%&�&&& ���(� �� ��,�� ���� �� ��� ����� ���� ����� �� ��� ���� � �� �������� ����� � !�� ���������� ����� �� % �� ��� ��� �� ��� ��� �� ���������� �� ������ ��� ��� �����,�� � �������� ���

���� �� ������ ����� ,� ������� ���$������ ��������

4������� �������� ����� �� ' � '&= �����G�A ���� ��������� �� � ����� ��� �� ���� �� ������� % �� ��������� ����� %� %�=� D� �� D�= ��� � �������� !����� %�������� ��� ������� "������� �� ��� �� # �� ��� � �������( �� ����� �������� @ ��� ������ ��� ����� �� ���������������� ������� ���� ������ ��� ����� �� ���� ������ ������ 3������ � ������� ��� ������� �������� ��� ���� ��� �������� ������ � ��� �� ���� ��� ������� � ��� ������ � �� D� ��� ���� ��� � �������� � �� ��� ���� � ���� ����� �� ������� �� ������� � �� "������� �� #3� � �� ���� '000�(� �� ������ �������� ����� ���� ������ ��� � �� � ����������� �� ��� ����� ���� �� ��� :@�$D � :@�$=+ ��������� � ������ ��� ����� ��� �� �� �� "�� ��# ���� @@@(� � ������� ��� ����� ��� �� ������� � #!��� =�(� �� �������� �� ���� ��� ������ ���� ���� �� ��

���������� �������� � $!4 ����� � ���� "������� ����������� � �� �� ��� �� ,������ ������ � ����������� �� �� � �������� � �� ��� ���� �� ����� ���������� 3������ ���� � "������� �� � ��� ��� ������������� �� �������� � ������ ��������� �� �� �� ���

�� ������ ���� ��� ����� � �� ������� ����� ���� � �"�� �� ��� ������ ������

������ ,������� �����2� ����������� � ����7������ '��

� ����� ������� ��� ������ ������� "������� �� ��������� � �� � � ������ � ������������ �������� � ���"������� �� ��� ���� ��� � ����� �� "�� ����������2��� � ��� ������� � !������ '� � '�� ���������� �� ������ � �� �� 1 �� ���� ������ �� "�� � ��������� ������ �� �������� ��� < ��� ���� ������� � � ������ ������������ "������� �� � ������� ���� � ������� � �������� �� �� ������ #!��� D(� ��� � ������

���� �� !�������� �� ��� ���� �� � �� ���� �� �������� �� �� ����

��� � 8������ #� M %( ���� � ����� �� "�� ��������� ����� < ���

�������� �� ��������� �� ��� "������� �� #���( ��� ��������� ����

� � ������� ���������� � ��� ��� �� ��� ���� �� ��� & ��

�������� �� ���� �� ��� ��� �������� "������� �� ��� ����� /�� ��

��� � �� ���� �� ����� ������ ��� ������ �� ��� ��� �� �� ������� ��

����"������� �� �� ����������

���� �� ������� "������� �� #� M %( ��� �������� ������� �

��� ������ ����� %� %�=� D� �� D�= ��� � �������� B� ��� ����� �� ���

������ ������� �� ��� � ����� ��� ������� �� ����� ����� ����

����� �� ���� % �� ��������� �� �� ���� ������� �� � �� �����

����� ��� �� ������� ����� �� ��������� ������� ��� ��� # ��

� ������( ���� ������ %KD ��� ������

�>?. @. AB�1 /�0'@C0D@))#?/ %@BB) #? 0D&%@)) *@E@B&0F@?. 69

Page 5: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

���� �������� ���������� ��� ��������� �� 6!4 � �������� � � ����

������ -�3������ ����� �����������

-������ ��� ������� ����� "������� �� � ������ �� ������� �� 'K% �� �������� #!��� '(� ��� ���� "����������� ���� ���� �������� � ������� ��� "������� ����� ���� #!��� D( �� �� �� ����� ? ��� ��� � �� ������� ������ ����� ���� ������� �� � �� ������ ��� ����������� �� ������ ����� �� �������� � ������������ �� �� �� ��������' � '&= ���� � ������ ����� � ����� ���� ���� � ��

����� ����� �������� �� ���� �������� �� �� ������� � �� �� � ���� &K= ��� 8������ ���� �� �������� �� ��� �� ���� �������� ������ �� "�� ���!����� <� ������ ��� ����� ����� � ���� �� ��� ��� ����

� ������ ����� � ����� D ��� � ������� �� ����� ��������� �� �� ������ �� 4����������� ��� ������������� �� ��� �������� �� �� ������ � �����> ��� ������������� ��� ���� ��� �� �� ��� ������ ���������� � '5' ���� ���� ��� � ����� ���� � ���� �� ' � '&=

�����G�A �� � ��� �� ������� � ���� �� �������������� ' � '&5 �����G�A #& ��(� ��� � �� < � '&= �����G�A �� % �� �������� � % � '&= �����G�A �� < ��� ��� �������� � �� ���� ��� D ��������� ����� ��� D ��� ������� ��������� ������������� % �� % ���� � �� ' �� < ��� -� ���� ������ ���� ��� ��������� �������� �� �� ������ � ��� ��� �� ��� ������������� ��� �������� ���� ����� #��� �� ���� (�8������ ������ ������ ���� ������ ��� ��� ������3. ���� �� �� #:@�$' � :@�$=(� ���� ������� �� ���� ��� ������� � � ����� �� �������� � ���� ������������� ��� ��� ����� �3. ���� �� �� ����� ��@ ��������������� ��������� � ����� � �� ���� �� �

�� ������ ��� ������� �� �� � ��������� ���� ������������ �� ������� ����� D ��� � �������� !����� <������ ��� ����� ���������� ������ ����� ������� �� �������� � � �� ���� ������ �� ����� �� ��� �� ������������� ��� �������������� ��� ���� ���� �� ��

����� 0������ � -� ���������� �4�����

@ ���� �� ������ ��� ��� �� ������� � ����������� �� ���� �� �������� ������� � ��� ������ �� ������� ��� �� ����� � ��� � �� "������� � �3. ������ ��� B� ���������� % �� �������� ��� �� ���� ������ ��� �� �� �� "�� ��� 2��������� �� �� ���������� ����� ���� ���� �� ��� �� ��� #���� �������� �� ��� ���� �� �� � ���� @@ � ��� �� ������ � ���� @@@(�!�� ����� �� ��� ���� �� ��� ��� �������� � :!4� ���

������ "������� �� ��� ���� � ��� ���� �� �� ����������� ������� �� "�� ���������� ��� ���� ��� ��� ������� �� ��� ������� "������� �� ��� �� �������

���� ��� "��������� � ��������� ������� ���� @@ ����������� ��� ������������ "������� �� ��� ����� ����� ������ ��� �� ���� �� ��� ������� "������� �� ���� ��������� ��������� B� �������� � ���������� ������ "������� �� ��� ���� � ��� ������� "������� �� � ������ ��� ������ ��� ����� 2������� � �� ���� ���� �������� ������ ��� ������ ���� �� ���

�4����� �� ��������� �� ,�����������������! ����������� ������

� ���� ��� ����������� �� �������� � 6!4 "������� ���� �������� �������� ������� � �� ���� � � � ������

���� �� #�( C���� �� �������� � ������������ � . �� &� ' � '&=

����� ���� ���� � �� ����� ����� �������� �� ���� ��������� B����

D ��� � �������� �� & �� �������� �� ���� ������� ���� ������ �

�� "�� ��� ����� ���� ������� � ��� ��� �� � �� ���� ������

��� ������ �� ����� �������� �� ���� ��� ����� "������� � ���� �� ��+

��� � '5'� :@�$'� � :@�$=� #�( ���������� ������ ������� �� �

������� � � �� ���� ����� #)% M &�00(� ���� ������� �� ���� ��

��� & ��� �������� �� ���� #��� �,��� �� '(� 8��� �������� � ��

!����� <�� B� ��� ���� �� ������� ����� D ��� � �������� ��� �� �� �

������ �� ������� � ��� ����� ��� � ��� ��������

692 -#&.@%�?&B&/= A?* -#&@?/#?@@D#?/� E&B� ::� ?&� 6� FAD%� 6� 2332

Page 6: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

����� �������� ���� �� �� :!4 ��� � ������ � ���/71�� � �3. ���� �� � ������ ������ � � �������� � � ���� � ����� #�������� �� ���� %&&&(� !�� �������� ������� ���� �� �� ���� ����� � ��� �������� ��������� � -���� ��� � ����� ��������� ����� ������������ � � ��� �� �� �� ��������� �� ��� ���� ������� �� � #:@�$D � �/71� ������ ������� ������ � ��������� ��� �� ���� (� ��� "������� �� �� �� ����%�?&& �� '&�&&& ��� �� �� "�� ��� ���� ���� �� �� ������ �� �� ������� ��� ��������

����� �� �� ��� � ��� � ��� ��� ������� ���������������� �� � ���� � � ��� �������� ������ �� "�� ���% �� �������� ��� �� ���� � ����� ��� ��� ����@@@ ���������� ��� �������� 2������� ��������� � ������� ��� � ����� ������ ��� ��� ��� ��� �� ��� ��� ������ ��� ��� ���� ��� ���� �� �� . ��� ����� �� �� �� ���� � �� ��� ���� ������ #:!4( ���� ����� ��� ���� � #:@�$=( �� � ���� ��� '=���� � ������#:@�$'(� �� ������ ��� �� ����� � ���� ���� ������ ��� �������� ��� ���

������ ,������� �����2� ���������� ���+� ,�������� ,������� ����3���

�� �� ��� ���� ���� �� ��� ���� ����� � ����� ����� ��"������� ��� ���� ������� � ��������� �� ������� "�������� �� �� :@�$= �� ������������� ����� ����� ������

��� ���� �� :@�$'� ����� ���� ������� ��� � ����� ��������� ������ B� � ��� ��������� ������� ������������� �������� �� &K= �� �������� ��� �� �� ' � '&=

����� ��� ���� �� ����� �� 9�� ������ � ������� �� �������� � ��� ����� �� �� �������� ���� ������� ��� ������ ���� �� �� ����� #!��� <�(�!������ =�K= ���� ��� �� � ������� ����� ��� �

���� "������� �� � � ����� ������ �� ����� ��� ������ �� ����� D ��� �������� �� ����� � �������� �� ��� ������ �� 2������� ������� � � �� �� ��� ����������������� �� ���� ������ � � ���� ���� �� ��� ���� ���������� ���� �� ������ ������� �� ������� ��� ������ ��� �� ���� �� ��� ���� �� ������ ��!�� ���� ���� �� ��� �������� �� �������� ��� D ���

� ������ ��� ������� � ����� ���������� #!��� =( ����� ��������� �� <K= ��� � ��� ������� ��� ������ ����� ����� #!��� =�(� �� "������� �� ��� ���� � ������� ���� � ������ � �������� �� �� ������ #!��� =�(>���� ��� ��� :@�$'� � � �� ��������� ��� :@�$=�3������ ��� �� "������� �� ��� � �� �� � �� � :@�$' #!��� =�(� �� "������� �� ��� ���� �� :@�$������ ������� � ���� = �� �������� ��� ����� ����������� ��� ��� �� ����� �� ����� � ��� ������ ������� ���� ������ ���� ����� �������� � �� � ���� ��� ��� ��� � �� ���� � �� �� 6!4 ��������� � !��:@�$=� ��� ����� "������� �� ������� �� ����� �������� �� ��� �� ���� � ����� �� �� ��������� �� �������"������� �� ��� �� ���� � ������ �� � ������ �� %�

����� ��� 4��������� � �� ���� � �� ���� �� �� ��� ������ ���� ����������

���� �� �

!�������� ��G���� � ������

#���� "�� ���������(

������� "������� ��

� ������ #���� ����"���(

������� "������� �� N % ��

�������� #���� ����"���( 2������� � �� ���� �

���%5 '15 1�&?1 <0�<D1 5�' ����D< %=& '?�D?< =?�<11 D�D ����%= %?< '<�?0D =0�'?' %�1 ����%1 D?D %D�??' ??�D5% D�D ����D& <'D ''�001 <D�D&0 D�? ����%? =0D D1�D=0 0=�<0% %�5 ����D% 5D? <=�<01 1?�D'= '�0 ����%0 0'0 %�??0 ''�1'D D�1 ����D' '&?& ?=�D'& '<0�0<' '�? ����DD '&?5 51�'05 %%%�?0= %�= ����%= '=?< '&5�5'? '1%�<<D '�? ����%D '1?1 5%�'&& '5D�=0= %�5 �

�!�� ����� � ��� � � :!4��������� � ��� ��+ ������ ������� "������� �� �� � ������ ������ ������� "������� �� � ��������� ������

#����� ��� �� �� �� "�� �� ���� �� ������� %�� ��������(� � ��������� �������� � �� ���� � �������

����� ���� 4��������� �� �� � ��� � � :!4��������� � ������ �� �� � � �������������� � ���� �� � � ����� �� �� �������� ������� ���

���� �� �

B ����� �����

� ������ #��GA(

2������� � �� ���� �

�� � ����� �����

!�������� ��

� ������ #���(

2������� � �� ���� �

�� "������� ��

:@�$' %�% '�' � %�?&& '= �:@�$% '�D '�1 � %�&&& '% �:@�$D '�D '�? � '%�&&& % �:@�$< '�D '�? � ''�&&& % �:@�$= %�% %�' � '&�&&& O' �

�B� �� "�� ��� ����� ��� ��� �� � % �� �������� ��� !�������� �� ��������� �� #����"���( � ������� ��� � ����� ����� ����

���� % ��� ������

�>?. @. AB�1 /�0'@C0D@))#?/ %@BB) #? 0D&%@)) *@E@B&0F@?. 699

Page 7: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

�,��/��,�-

�� ���� ����� �� ���� ����� ������ �� ����� ������ �� �� �� ���������� �������� � 6!4 ��� ������� ������������ � F�� � ����� �������� �� � ������� �� ��������� � �� ���� �� ��� ������ ���� � � ����������� ��� ����� "������� �� �� �������� 6!4� ������������� �������� � ����������� �� �������� ������������������ � ��� "������� �� �� �������� 6!4 �������� ,������ �� �� ������ � ������ � ������ ����� ���� ����� �������� ��� ������� � � �������� ������� ������� !����������� ������� ������� � ����� �� � ������ ��� ����� "������� �� ��� � ����� ���������� �������� �� �� ������ � � ����� ��� ������� �� ��� ����� � ��������� ��� ����� 8��� ������"������� �� ��������� �� �� ���� ������� ����������� �������� � ������� ������� � � ������ ��������� � ���� � ����� � � ������� � � ������ #/EB ��� ���� '01&> .��������� �� ���� '010(� @ ��� ���� ������ ��� ������ ����� � ����� ���� ���� � �� ����#������ ���� ��������� � ���������� ���� ������������ ������������� 9���� � ������������� �� ����( ���������� �� �� ������ ������ �� �� �������� � "������� � ������ � ���� � ����

�� � ����� ���� �� ����� ������� ������� � ���������� ������ ������ �� �� ������ �� ���� ������ 2������� ��� ������ �� ������ � ����������� ����� �������� � � � ����� �� 6!4 ��������� ���� �� � ��� ��

� ������� "������� �� ���� �� �� ,�� ���� �� "������������ ������������ 6!4 "������� �� ��������� ��#!��� D( ��� ������� ��� ��������� �������@ ��� �������� �� ��� �� ����� �� �������� ������

�� �� ������� ��� ������ ����� � ���� ����� �� ���� �������� ��� ������ ��� ����� �� �������� �� �������� � �� ��� ������+ ��������� � ������ ������� B����� ���� � � ����� ���� ����� ���� � � ����� %<���������� �� = �� �������� ��� ��� ������� #��� ��� ���� '000(� !�� �� �� ������ � ��� % ��� �� ������� � ��� ���� �� ������� � � ������� � ���� ����� #�� �� 0&� ��� '& ��( ����� D ��� ���������

���3 ������ � ��� �������� ������������ 4� -�3���� ������

@� �������� �� �� �� ��� �� ������ ������ �������� ���� ������ ������ � ����� ����� �� ������� �� ������� ����� �� �������� � ���� ����� ��� ��� ���� �#!��� <�( ��� ��� ����� ���� �� �� ������ B� � �� ���� �� ������� ���� �������� ��� ���� ��� ���� � ����� '�� �������� ��� ����� D ��� #!��� '�(� �� ����� ������������ �� ��������� ��� � ��� ���� ��� ��� ����� ����� ���� ������� ��� �������� ��� �� �� �� "�� ���������� � ����� � ���� ������ ������ � ������������ ���� ���� ��� � � � �� ����� �� ���� �� 4������ � �� �� ��� � �� ���� � ����� � ������ ������������ ���� �������� �� ��� ������ ������� "������� ��

���� �� I��������� � ������� ������������ �� @�$ � :!4 �� ��� ������� ����� ��� ��+ :@�$' #�( � :@�$= #�(� /����� � �� �� ������� � �� �������� ���� �� �� ����� �� !������ =� � =� ���� ��� ������ "������� �� � � ������ ������������ �� � �� ���� �� ��������

�� �� ������ � !������ =� � = ���� ��� ������� ������������ ��� "������� �� � � ������ ������������ 8������ ������������� ��� ��

������ ������ ��� ���� ��� ��� ���� ��������� ���� � �������� � ������ ���� ���� #��� ������ �� ��� � ����� � � �� ��� �� ���� �����

��������� �� ��� ����� �� ���(� � ������ � ����� ����� �� "������� ���

69G -#&.@%�?&B&/= A?* -#&@?/#?@@D#?/� E&B� ::� ?&� 6� FAD%� 6� 2332

Page 8: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

#!��� %( ������ ��� �������� ������� � ���� � �� ������� ���� ��� � �� ��� ���� � ���� �����+ � ����� ������� ��� ������� ���� � ���� ��� ����� �� ��� ���� ������� ������� � ���� #%&&&( ������� � ��������������� ��� �������� �� ���� �� � ����� �������� � ������������ ���������� ������ ��� ������ ������ ���� ��� � �� �� ��� �� ������ � ����� ���� �� ������ � �������� �� �� ������ �

8������ �������� ��������� +�4���� ���� -��(��

-� ������ ���� ������� �� ������� ���� � ����������� �� � �� ���� ����� #!��� <�(� B ������� ��� ���� �� ���� � ��������� �� ���� ���� ��� ������� ��� ������ ��������� � ��� ���� ������� ���� �� ������� �� ��� ��� ��� �� ��� ���� ��� �� ��!����������� ������� �� "������� �� ��������� ������������ ������� ��������� �� ��� ���� ��� � �� ��������� � ������ � ����� ��� �� ��� ��� �� ��@� ��� ��� ���� ����� ����� ��� ������� �������

�� ������� ���� ��� � � ��� ������� �� �� ������ ��� �� ���� �� ���� �� ��� � ��� ������� �� �� ������ ����� &�0 �GA #���� �� ���� '000(� �� � �� ��������� �� ������ ��� ������ ���� ���� ����� � ��� ������������� �������� ��� C���� ������� � ��� ������ �������� � ������� ��������� ������ ������ ���� �������� ������� #3����� �� ���� '00'(� �� ������� �� �������� #��� �� ���� (�

$��4����� �� �4�����

2��� � ����� "������� �� ��� ���� ��� ��� ����� ��� �� ������ ���� ��� ����� ��������� ���� ����������� � �� ������� ���� ��� �������� � �� ���� � �������� ����������� �� �� ���� ���� �� � �� ���� � ����������� �� �� �������� ������� � �� �� �� �� �������� �� ������� ���� � ����� ��������� ������@� � �� ��� ��� � ��������� ���� ������ ������ ����

����� ����� ��� � �� ���� � �� ����������� ��� ������� � �� ���� � ���� �� ������� ��� ��� ����� ������ �� � !����� <� ������� ��� ����� �� �������� � ������������ ��� �������� ��� ��� �� ��� ����> � ������ �� �� % �� ��������� ��� "������� �� �� :@�$'��� � �� �� '=����� � ���� �� :@�$= �������� ��������� 8��� ��� ��������� � �� ���� � ��� � ������ � ����� ���� � �� ������� � �� ���� � ������� �� �������� ��

���� ��������� ���� ����� � ���������� #���������� ���� '00?(� 2������� �� ���� �������� ��������� �� ������ � ���������� � ������� #��� � �� ���� '00?> 8������ ���� '000(� ��������� ��� ���� ����������� B� 2����� ��� #'01'( ��� ������ ��������� � �� ����� ��������������� � ���������� � � ����� �� ����������� � ����� �������� ������� �� 8��� ��������� ��� �� �� /9B ���� ���������� �� ��� ��� �������� ����� ��� #3���� � ��� '000(�

�� �������� ����� �� ����� ��������� � � �� � ���������� �� �������� ���� ��� ��� � � � ��� ���� ��� �������� �� ��� ������� � � /9B � �� ��� �� ��� ����� ���� ����� @� ���� �� ����� �������� ����� ������������ �������� �� ������� � � �� �� � ������� � �������� ����� ����� � �� ��� ����������� .�� ��� �������� �������� ��� �� ������ ������� ����� � �������������� �� ��� �� �� ���� ��� ����� �� �� ������� ���� ��� � �������� ��������� �� �� ������ ���� ���6!4 ��������� ��������#�( � ������� �� ���� � �� ������� � ����� � ��� �� ��� ��� ���� �� ��� ��� �� ������/�� �� ��� �� ���� �� � ������� �� ��� ��*����� �� /9B� ��� ���������� �� ���� ���� ��� ��� ������ �� ���� ����� ��,�� �� � �� ��� ���� �� ��� #A� �� �� ����%&&'(� �� �� ������ �������� ���� ��� 6!4 �� � � �������� �� ����� �� ��� ��� �������� �� �������� �� ��� ��������� �� ������� ��� ���� ��� � ��� ���� �� �� ������ ��� � ���� ������ ����� ����� �� B�� ����� ����� ������ ������ ��� ������� ����� �� �� ��� � ��� � ���� ��� �� ������ � !����� =+ �� �� ��� ��� ����� �������� � � ������ �� � ����� � ��� � ��� � �� ������� ���� �� �� ����� � ��� � ��� �� ���������/������ ����� ��� �� ����� ��� � �� � ����� � ���

��� ���� ������� ���� ����� ����� ���� ����� � ������ ���� ����� �� �� ��������� �� ����� � ��� ��� ������� � :!4 ��� �� ���� ���� � ��� � � ��� �������� �� �� �� � ������ ���� ���� ��� � �� � ������ �� ������ ��� ���� ��� � � ��� ���� �� � �������� � ���2������ ��� � ������������ � ���� � ���� �� � ��� ��������� #�=( �� ���� ���� � ����� ���� � #����� ������� ������ � �� ;���(� �� ������ ���� ���� ����������� � �������� ���� ���� �� ������ -���� �� � ����� �� � ����� ��������� ��� ������ ������������ ��������� ��� ������� � ������ �� �������� #!��� =(� �������� �� ���� �� �� �� ��� ������ �� �������� � ������� ������@� ��� ��� ���� ���� ������ �� �3. ����� �� ���

����� ����� ��� ���� % ��� �� �������� �� ��������#��� � �� ���� '000(� � ���� ��� ������ ��� �� �� ������� �� ��������� ��� ��� �� �� ������ #/EB � �� ����'01&(� -� ������ ���� ��� � �� ���� ����� �� � ������� ��������� �� �� ��� �������� �� �� ������ �� �� ����� "�� � �������� #!��� <�(� 2��� � /9B�� �� �� /EB � �� ��� #'01&( ����� ���� � ������������� �� �� ����� = �� �������� ��� %< �� ��� ���������� �� ����� � $' ��� 1&�� ���� ������ � � � 8�� ���� �������� ���� ������ ��� ���� �� ���������� ������� $%G�� B ������� ���������� ��� ������ � �������� ���� �� ���� ��� D?�� #;����� �� ���� '000>����� �� ���� '00?(� � � ����� �������� #9���� �� ���� '01<(� -� �� ���� ���� ��� ��������������� ������������� �� ������� �� ���� ���������� ������������� ����� �� �� ��� ������� #��� �� ���� (� F�� �"�� ��������� �� ��������� /9B ��� ���� ���� ������ ��� ����� �� ������ ���� �������� � ������� ��� �������������� �� �� � � ���� ��� $&G$' � ��� $%G� �������� ��� ���� ����� #����� �� ����� ������ � �� /�������(�

�>?. @. AB�1 /�0'@C0D@))#?/ %@BB) #? 0D&%@)) *@E@B&0F@?. 696

Page 9: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

@� �� ������� ���� ������ �������� �� � �� �� � �������������� ����� ������� ���� �������� ��������� ������� �� �� ������ �� �������� ���������� �������� ��� ��� �������� � ����� � ����� � ���� � ������������ ����� #;����� �� ���� '000( � ���������� �� ���� � #!���� ����� �� ���� '001> ����� �� ����'000(� �� ������� �� �������� �� ����� ������ ��� ��� �������� �� �� ����� �� �� � � ����� ������ ������� ��� � �������� �� � #4������ �� ���� '00'(�

������������ �������3 ��������������� � ������� ���������

2������� ���� �� �� ����� �� � ����� ���� �� ������� ���� � ���� �� � ������� � ���������� ���� � �� � ����������� � -��� � �������� ����� � � ���������� � $!4 ��������� � � ����� ����� �� ��� ������ �� ����� ��� ����� ��� ��� ������ �� ������ ���� �������� ��� �� @� � �� ���� � ���� �������� ���� ����� ��� ��� � �� �������� �� ���� ������ �� � ����� ����� � ���� �� � �������� � -�� ��� � ����������� ���������� �� ��� � �� �������� ��� � �������� � � ��������� ����� �� � ���� ���� ���� ��� �� ��������� �� ������� ����������� ��� ������ ���������������� ����� �� � �� � ����� ���������� ������ ������ ��� ��� �� �������� � ����� ��������� ����� B����� ����� ������ ������������������ ���� �� ��� ������������������ ��� �� ������� ����� �� �� ��������� ���� �� � ��� � � �� ���� ������ �� � "�� �� �� ����� �������� #���� �� ����� � ����

������� ����� � ����� ����� ��� ������� �������� ������� � ����� �� ��� ����� �� �� �����( � ��� ���������� �� ���������� �� �������� ������ ������� ���� ��� �B ��*�� �� ��� ��� ���� ���� � 6!4 ���������

���� �������� ����� ��������� �� ��� ������ �� � �������� @ �������� �� :!4 � �� � ���������� ��������� ���� �� � �� � �� �� ���� ��������� �� ���������� � � ������ � �� �������� ������� ���������� �B ����� ��������� �� ��� ������� ���� �� �� ���������� �� ���� �� ��� ������ ���� �� �� :!4 ��������� ����� ���� ��� � ��� ������� ���� �� ��� ���� �� �������� ���� � � ����� �� �� �������� # ���� @@@(� 2������� ��� � ����� � 6!4 �� �� ���� � ������ ������� � ����� � �� ��� :@�$ ���� �� ��� �� �� �� ��������� � ���� "������� �� ��� ��� �� ���� � ������ � ��������������� ������ � �� ��������� ������� ����� ����� �������A� �� � 6!4 �� ��� ������ �� � ������ ����� ���

���� ��� �������� ������� �� ��� "������� ��� �� ���������� �� ��� ������ � �� �� �� �� �� ������� ����������� ������ � �������� ������ ��� �� ������� �� ��������� � ���� ���� ��� ���� �������� � � �������� �������� !�� ��� ������ ��������� � ���������� ������ ���"������� �� �� $!4 � ��� ���� �� � ����� �������� � � ������ ��� ��� ������� #B��� � �� ���� '001> A���� ���� %&&&(� B� � �� �� ���� �� ����������� � ���"������� � ������ ���� �� ��� �� ��� �������� ������

*��� ����� ��� ������� #�� � �� ���� %&&&(� B �� ������� �� � ��������� ��� ������� �� ������� ��� "�������� � �������� ������ ���� ����� �� ������ ����� � ������� ����������� � �� �� ��� ��� �������

-� ���� ���� �� ��� � ���������� ������ � /�� �����

/�7���� ��� ��� ���� �� ���

.��������

B��� � �)� )� ����C������ A� 2� ���� -C� )�� $� '001� $���

"������� � ������ �� � ���� ���� ,�� ������� �������� �� ���

���������� ������ �������� � 2������ �� 4��� '<#%(+D='KD=<�

2���� ��� � �� � ��� �� %&&&� 8������ � ��� ������� � �������� �

��� ����� �� ���� ��������� �� � 2������ �� '1#'%(+<0<K=&&�

2���� � '001� C���� �� ����� �������� � ��� ��������� �� �� ��

��� ���� �� �������� ������� 7 ���� 2������ 50+%&'K%'&�

2��� A�� $���� )7� B������ I$� '01'� �� ���� ������ �� �����

�������� � ������ �� ���� � 8������� � ��������� � ������� ��

�������������� �� ����� �� 3' � 3%B � ������� �������

���� �� ���� � � ���� � � ������� � ������ ������ ������� �� 7

2��� ���� %=5#'1(+05'%K05%'�

���������� �� I� ���� � A� )� �� $� I���� 4� /���� A� 2������� /�

������ � �� '00<� 8������� � ����� �� ��������� � ������

�������� ���� �� �� �� �� ������ � ��������D ��������� 2������

2������ )�� ����� %&'#'(+%55K%1D�

������ �� ;�� 8� ������� '001� 4���� D� B��������� � �� ���� "���

����� � ������ � ���� "������� � ������ + ����������� ��������

��� � � ���������� 9�� :���+ -�����A���� � '%'K'51�

������ �� � :� C�������� $� -�� --� 4������ /�� '00<� $���

"������� � ������ �� � ������ ��� �� � ��������� � 8��� ��

%5D+1&%K1&=�

��� � ;3� ;�� ;8� ;�� 73� '000� ������������� � � ������� ���

����� ������ �� ������� � � C4. � ��������� ��� ��� �������

���� ������ !��� )��� )�� D&#%(+1=K0'�

������� �� ���� B� %&&&� 8��������� �� �� ���� �� � ����� ����

����� �� �������� ����� �� ��������+ �������� �� � ���� �

�������� � ��������������� �� ���� �������� �������� �����

D%+'?K%0�

������� 24� I����� )3� !����� 8� '005� !B�8��������� ���� ��

�� ��� ���� "������� � ������ #$!4(� $� � '?D+DDKD1�

���� 37� !������� B8� !������ ��� ������� 7A� ����� � �7� '000�

��������� ����� ��� �� ����� � ������� � ������� � ����� �

���� ������� �� �� ���� �������� B��� ��������� 2������ ��

='#=(+=?0K=1=�

/EB � 7B� ���� )B� $����� A)� '01&� �� �� ������ ���� � �

������ �� ����� �������� � ��� ��� ������� �����+ ����������

���������� � � �������� � ���������� � ����� � 3' ���������

������� � � � ����� �� � 3'����� ������ � 2�����������

'0#'%(+%5=5K%5?'�

/������ 4� )�P��� 4� !����� �� ������ @� � 8������ F� %&&&�

B �� ����� ��� � ��� � ��������� � �� ��� ��������� �����

������ ���� � ������ � ������ � ���� ���� ��������� 7 2������ ��

?1#%(+'D0K'<?�

!� �3� $��� � ��� ;����� /$� 4���� 7�� '000� )������ ����

������ ������� � � ������� ������ � �������� ����� �

�)9B ����� � ���� ������� �� �� ������ 2������ �� 2��� �

5D#<(+<5=K<?%�

!���� ����� �� 8�������� 8� /������� /� ����� 6� 2����� 7C� '001�

�� ������ ������������ �� ������� � ��������� � �� ���� � � �

�� ��� ��� ���������� �� ��� ��� ������� ���� ������ 9�����

2������ '5+<51K<?%�

$���� 4� 7��� �� ��� �� -��� !�� %&&'� 8���������� ����������

������ ��� ������� ������� � � ����������� � 2������ C � 7

?#%(+''?K''0�

69H -#&.@%�?&B&/= A?* -#&@?/#?@@D#?/� E&B� ::� ?&� 6� FAD%� 6� 2332

Page 10: Fluorescent proteins in animal cells for process development: Optimization of sodium butyrate treatment as an example

$���� ��� 3���� 23� )���� )� '01D� C�������� �� ��������

� � ������� � �������� ����� �� � �� �� �� ����� ���������

9������ B��� )�� ''#%'(+?5D'K?5<1�

$�� :� C� � 4�� ;��� )2� '001� 8������ ���� "�� ����+ � � �

�� � �� ���� � ���� ���� �� ���� ������� �� ������� ���������

���� � � ���� ���� ������� ���� ����� �� ���������������� ����

��������� ������������� 2������ �� 2��� � =1#=(+<5<K<??�

3���� �� '000� 3�� �������� ��� ��� ��� ������ 8��� ��

%1=+'%&&K'%&D�

3����� 4�� ����� � C�� 2�� �� B7� 7� �� � 9� 8���� @� 8��� �� 4$�

2��� B � '00'� ��� ��� ������� ���� ���� ������ � � �������

�������� �� ����� � ������ ����� �������� B��� ��������� 2���

���� �� D<#=(+==0K=5<�

3��� !� 3����� �� '01%� 8� �������� � ����� �� ������ � �����������

� ���� �� ����� ��� ����� �� ����� �������� � �����������

������ 2������ 2������ B��� ?'1+%%&K%%D�

3� � A� 7��� �� /� 7���� �� -��� !� '000�� $����� �� ����

������ #� �����( ���� � ��� "������� �� �� ������� $!4����

������ � �3. ������ @ + 2�� �� B� $��P��� 2� 9�� -� -��� !�

������� B ���� ���� ���� �����+ ������� ���� ������ ����� ��

�������� /�������+ ;����� B������ 4���������� � ''0K'%'�

3� � A� 7��� �� /� 7���� �� -��� !�� '000�� $!4��������� �

�������� ����� ��� ���� �� ������ � � ���� ���� ������ ���

������ � � � �� ���� ���� 2������ �� 2��� � 5=#%(+%&'K%&=�

7��� �� !�������� /� !����������� $� -��� !�� !������ )�

'000� 8� ���� CA@8B ����+ ������ ��� �� �������� ����� ������

��� � ����������� @ + 2�� �� B� $��P��� 2� 9�� -� -��� !�

������� B ���� ���� ���� �����+ ������� ���� ������ ����� ��

�������� /�������+ ;����� B������ 4���������� � ''0K'%'�

7��� �� 8�������� B� -��� !�� '005� �� ������ � ��������

�����+ ����������� �� �������� ���������� ������ � �������������

����� ����������� �������� � 9������ B��� )�� %<#<(+=05K5&'�

;�� 8)� ;� ���� B� :� � � -�� --� ;���� 4� '00=� $���

"������� � ������ �� � �������� �� �� � ��������� � ������

����������� � 2�� ��� �,��� '0#.������(+5=&K5==�

;����� 3� ����� 6� !���� ����� �� 2����� 7C� '000� @ "�� �� ��

��� ����������� � ����������� �������� � ������ �����

���������� �� �3. ������ 2������ �� 2��� � 5D#=(+=?DK=1%�

;��� 7� '01%� C����� �� ����� ��������� � �� ���������������

��� �� � ����� � �������� ��� ���� 2������ <%+5=K1%�

A� �� C8� A� �� A�� 2���� 2� 9������ �� H�� ��� 2���� 7�

/�� ;� /���� ;� )�� $� %&&'� @ ����� ��,�� �� � � � ������

�� ��� ���� �� ���� 9����� <&0#5(+15&K0%'�

A� 7� -� � 8� I� /��� -7� 8������ A/� $����� 3B� 3����� -;�

���� 37� 2� ���� -C� �� ��� %&&&� $��� "������� � ������ �

���������� ���������� ��������� ������ �� ��� $B@' ���������

2������ �� 2��� � ?&#%(+'1?K'05�

A�� 6� �� ��� �� ���� 89� 8� :� 2��� 78� 3����� /� -�� ���� )B�

A���� 3!� %&&&� $� ������ �� �������� ����� ������ ��������

� � �������� �� �� �� ��������� � ������ B �� 2������ %1&+

%&K%1�

����� 6� C��� ������ 3�� 2����� 7C� !���� ����� �� '000� B ���

������������ ������������ ��� ������ �������� ������� ��� �

������� � � �3. ������ 2������ �� 2��� � 5=#%(+'<<K'=&�

�������� 4$� 9������ /B� !����� C� :����� �� 8� �8� '00?�

@ ����� �� ����������� �� ����� � ���������� � ���������

2��� 0&#=(+%&?=K%&1D�

��� � I� C�� � 2� :�� � $4� 7���� )� B������ 8� H�������

4/� '00?� @ ����� �� ��������D �������� ������� � ���������

�� �������� � ����������� B #� �������� �� ����� � ����������(+

��� � �� � ������ �� ������ � �� ���� ���� � ������� �

����G���������� ����� � � �������� �� ��� )�� =?#'?(+D50?K

D?&?�

�� � :$� A�� � 7� -� � -A� �������� I� %&&&� $��� "������� �

������ �� � ���� ���������� ������ ��� �������� �� ����

������ � ��� �� ���� ��� ������ �3. ������ $� � %<%+%&'K

%&?�

�������� 8� H�� �H���� �� /� 7���� �� ����� )� !���� @� I���� ��

;��� �� @���� �B� ;����� C� 2������ 7� ����� 9� 8�����

2�� B������ 3� -��� !� %&&&� �3. ��������� �� � ��� ���

�� ������� � � @�$' � ���)�/ � ����� ������� �� �����

������� 2� 7 3������� '''#'(+'=?K'55�

������ :� A� 7� ������ 8� /� � 8� A� 7� $����� �� 7������ )�

%&&'� 2������� � ������� �������� �� ���� �������� @�$ �

�3.�;' ����� ������ ��� ��� � � �� ���� � ��������� ������� 7

@��� �� ������ %<?#'K%(+%&=K%'5�

����� B� ������ 7� /��� � $� /� ���� �7� 2���� ;/� ������ 74�

C�������� � )��� � '00?� C����� �� ����������� ����� � ����

������ ��������� � �������� ����� � �3. ���� ����� ���������

�������� ����� %D+<?K=<�

9���� 7�� � 4� ����� � 9!� '01<� ;� ���� ����� ��� ������

�� � ����� ��� ��� ������� ���� ������ ���� ����� ;� ��

'?#<(+<''K<%=�

9���� �� ;/� 2������ 8�� )��� A� ��� ��� �B� 4���� /-�

'00=� Q�� ������� ����� � �� ���� "������� � ������ � �������

�����+ ��������� �� ����������� ���� �,���� ���� � ����� ������ �

� ������� ������� 7 ������� '1&#4��� %(+'&0K''5�

.� 8;-� I�� 4� ���� !� �� -;� :�� �$8� '00D� 8����� ����

����������� �� � ������� �� ������ � ������� �������� �

����� ��������� 2������ �� 2��� � <%+5&'K5'&�

.��������� ;� ;� �R � � B������ 3� '010� C���� �� �������� �

��� ��������� �� ��� ���� ����������� ��� �� � � ������

� �� ��� ��� ������� ���� ������ ���� 8����� !� �� '<+=?0K=15�

4������ /4� /�$���� �2� ������� ;)� )������ C� 4��� AC� '00'�

4������� �� � �������� ,�� ������ �� ������� � � ������ � �

��� ��� ������� ���� ����� ��� � ����� �������� �� ������ �� �

��������� � 7 2������ �� '0+D=K<1�

4������ � @ �� 7� ����� 8� '00<� B��������� �� �������� � ������

��������� �� � '�� �������� � ��� ������ �3. ������ B���

��������� 2������ �� <&+50'K501�

4���� ���� A� !����� ;� !������� C� '00?� �� ���� "������� �

������ �� � �������� �������� ��� ���������� �� ����� �� 7 2���

���� �� =1+?0K11�

)��� 7/� /� ���� �7� -����� ��;������ /� 3����� 77� ��� 7:-�

3���� )B� ���������� )B� 2���� ;/� '00=� B�,����� ����

"������� � ������ � ������ �� "�� ���������� ��������� %'+D&0K

D'?�

8���� B� :�������� � ������ :� 9����� :� ������� ;� B � �

8����� � ����� � 9��� ���� .� '000� B �� ������ � ������� ��

����� � ����������� �8�%?�%?=� ���� ����� � �� � �������

������� ���� �� ���� ������� 4��� 9��� B�� 8�� F8B 05#1(+

<=0%K<=0?�

8������ �� 8� 8��� � !� '005� Q�� ������� � ������ �� ��� ��� � �� �

��������� � �������� ����� ��� � ��� ���� "������� � ������ �

7 2������ �� <0#'KD(+'D?K'='�

F����� $� ������� 47� ;�� C� ����� AB� !� � ��� IA� ���� �

3���� 7� '015� C���� �� ����� ���� �� ��� ����������� ���

������ �����+ ������ � � � ����� �� 8���� ���� ��� $� ��

'%#5(+===K=55�

-����� 7B� '0?D� ���������� � ������ ���� ��� ��� � ��� ���

������� ����� ������� � ����� �� �� ����� ��������� C�� ����

)�� ?1#%(+<=5K<5&�

�>?. @. AB�1 /�0'@C0D@))#?/ %@BB) #? 0D&%@)) *@E@B&0F@?. 69: