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Road map through different laboratorial techniques Fluorescence

Spectroscopy

Gonalo Figueir1

1Departamento Cincias da Vida, Faculdade de Cincias e Tecnologia, Universidade de Coimbra.

Resumo: O estudo da biodisponibilidade de uma molcula (como por exemplo um frmaco) pode ser feito atravs da interao desta com protenas e biomembranas. Esta parte do projeto tem como objetivo estudar a

interao de uma amina gorda fluorescente, em que uma poro fluorescente de 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-

ilo (NBD) se encontrava ligada covalentemente a um grupo amina, a butilamina (NBD-C4), com a protena BSA

usando a espectroscopia de fluorescncia. Foi determinada a constante de ligao do NBD-C4 BSA, Kb, cujo

valor foi de 1,96x104 M-1, na mesma ordem de grandeza de outros estudos, o que indica que esta molcula anfiptica interage eficientemente com a BSA. Foi tambm analisado o processo de quenching de fluorescncia

da BSA o que permitiu calcular constante de Stern-Volmer e as constantes de ligao para diferentes percursos

ticos (10 mm: Kb=4,51x104 M-1; 5 mm: Kb=0,0508x10

4 M-1; 3 mm: Kb=0,0336 x104 M-1), que diferem do calculado

pelo mtodo anterior. Assim utilizando mtodos diferentes podemos chegar a concluses diferentes, e por isso

necessrio ter ateno a certos parmetros.

Palavras-chave: Fluorescncia, NDB-C4, BSA, Ligao BSA NBD-C4, Efeito de Filtro Interno, Quenching.

Introduo A emisso de luz a partir de qualquer

substncia designada de luminescncia, e ocorre

atravs da passagem de estados eletronicamente

excitados para o estado fundamental. A luminescncia

dividida em duas categorias, dependendo do estado

natural do estado excitado: Fluorescncia e

Fosforescncia. Num estado excitado singleto, o

eletro que se encontra na orbital excitada apresenta

um spin oposto ao eletro na orbital do estado

fundamental. Consequentemente, o regresso do

eletro ao estado fundamental permitido pelo spin e

ocorre rapidamente pela emisso de um foto. Atravs

do diagrama de Jablonski (Figura 1) consegue-se

ilustrar os processos que ocorrem entre absoro e

emisso de luz. No diagrama aqui apresentado so

excludas as interaes (como o quenching, a

transferncia de energia e as interaes do solvente)

que podem ocorrer em soluo e influenciar o

processo de fluorescncia [2].

Figura 1 Diagrama Jablonski. Legenda: A Absoro do foto; F Fluorescncia (emisso); P Fosforescncia; Sn Estado singleto nvel n; Tn Estado tripleto nvel n; IC Converso interna; ISC Cruzamento inter-sistema.

Adaptado:[http://sp3.fotolog.com/photo/35/46/88/pety18rbf/1227507197144_f.jpg]

Pelo diagrama de Jablonski, para ocorrer

fosforescncia necessrio transies eletrnicas

permitidas entre o estado fundamental singleto (S0) e

o estado excitado singleto (Sn), aquando da excitao.

Aps isto, verifica-se uma converso interna (internal

conversion IC) entre os estados singletos de mais alta

energia, que levam o eletro a um estado menos

energtico. Posteriormente, ocorre um cruzamento

intersistemas (intersystem crossing - ISC) deste ltimo

estado singleto para um estado tripleto de menor

energia (T2). A partir deste estado vai ocorrer ento

uma IC para um estado tripleto de mais baixa energia

(T1), e a partir daqui vai ser emitida a fosforescncia.

A fluorescncia semelhante fosforescncia.

No entanto em vez de se suceder um ISC para um

estado tripleto, ocorre uma transio do estado

singleto (S1) para o estado singleto fundamental (S0)

levando emisso de fluorescncia. A luz produzida na

fluorescncia e fosforescncia vai possuir um

comprimento de onda maior (menos energtica) do

que a que foi absorvida. A esta diferena entre o

comprimento de onda mximo a que o fluorforo

absorve e emite designada de desvio de Stokes [2].

O quenching, isto a diminuio da

intensidade de fluorescncia, pode ser causada por

vrios fatores, como por exemplo pela interao entre

o composto fluorescente e outras substncias

presentes em soluo, pela temperatura, pelo efeito de

filtro interno, pela presena de oxignio ou de

impurezas na soluo [2]. A medio do quenching da

fluorescncia intrnseca protena permite analisar a

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interao de frmacos com protenas, descobrir a

acessibilidade dos quenchers aos grupos fluorforos da

protena; e ajuda a perceber o mecanismo de ligao da

protena a frmacos [4].

A espectroscopia de fluorescncia apresenta

inmeras aplicaes, sendo que pode ser usada, como

por exemplo, na monitorizao da conformao de

protenas (saber se uma determinada protena se

encontra no estado nativo ou desnaturado), no estudo

da interao de molculas com protenas e na

microscopia de fluorescncia (em que a fluorescncia

aplicada ao nvel microscpio permitindo o estudo de

tecidos, clulas e estruturas intracelulares, sendo, por

isso, de grande importncia).

O NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo)

uma sonda fluorescente muito utilizada no estudo de

propriedades das membranas e de protenas, j que a

sua fluorescncia depende da polaridade do meio em

que se encontra. Atravs de uma substituio

nucleoflica (de um cloreto por um grupo amina ou

tiol), esta sonda pode-se encontrar ligada a diversos

compostos, como por exemplo colesterol e ceramida,

tendo por isso vrias aplicaes. Estas aplicaes

incluem o estudo do complexo de Golgi, da

distribuio e organizao espacial de lpidos e

protenas na membrana biolgica, de monocamadas

lipdicas, e de muito mais [3]. Neste trabalho utilizou-

se o NBD ligado a uma amina primria com uma

cadeia hidrocarbonada com 4 carbonos (butilamina),

designada por NBD-C4. Todavia poderia ter sido

usado uma cadeia com mais ou menos carbonos

(Figura 2), influenciando o carcter hidrofbico da

molcula e da vrios parmetros que j foram

estudados, como por exemplo o Kb e o H da ligao

[1].

Figura 2 - Estruturas qumicas da molcula de NBD-Cn (em que n varia de 4 a 16).Adaptado de [9]. A protena mais abundante no plasma a

albumina do soro e produzida pelo fgado. Esta

responsvel por inmeras funes, entre as quais

transportar cidos gordos, ies, nutrientes, frmacos e

eliminar radicais livres de oxignio. Assim, o estudo

desta protena ao nvel da sua biodisponibilidade e da

taxa a que chega a um local ativo de grande

importncia. A albumina do soro humano (HSA)

apresenta uma estrutura constituda por trs domnios

homlogos (I, II e III) e tem a capacidade de se ligar a

7 cidos-gordos (FAs), pelo que os locais de ligao

so designados de FAn, onde n varia de 1 a 7. Estes

locais no possuem apenas afinidade pelos cidos

gordos, podendo tambm ligar-se a outra molculas

como por exemplo a varfarina que actua como um

anticoagulante e apresenta afinidade pelo local FA1

[10]. Sendo a estrutura entre a albumina do soro

bovino (BSA) e a HSA ser muito semelhante e o custo

da BSA ser muito menor, utilizou-se,

preferencialmente, a BSA como protena neste estudo

[5].

A albumina do soro emite fluorescncia

quando excitada a 280 nm, que o comprimento de

onda () a que se observa o mximo de absoro

devido principalmente a resduos aromticos na sua

estrutura. Essa fluorescncia apresenta um mximo na

regio dos 350 nm, pelo que se encontra associada aos

aminocidos triptofano, tirosina e fenilamina da sua

estrutura. Dos trs aminocidos, a emisso por parte

dos resduos de triptofano da BSA (o Trp-134, que se

encontra superfcie, e o Trp-212, localizado dentro

de uma bolsa hidrofbica) e da HSA (Trp-214) a mais

significativa, devido natureza qumica do

microambiente ao redor desses resduos (Figura 3) [4].

O espectro de emisso destes aminocidos um

indicador da conformao de uma protena j que

altera com a polaridade do solvente utilizado, sendo

que a emisso pode ser desviada para comprimentos

de onda menores se encontrarem no interior de uma

protena ou pode ser desviado para comprimentos de

onda maiores se forem expostos ao solvente. Como a

BSA possui um triptofano superfcie um desvio para

comprimentos maiores no espectro de emisso poder

ser devido a este aminocido e no a uma alterao

conformacional, com o caso de uma desnaturao.

Figura 3 Estrutura tridimensional da BSA e HSA e representao dos triptofanos responsveis pela fluorescncia. [http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/198/3344939/3344939_pone.0036723.g001.png]

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Com isto tudo em mente e utilizando espectroscopia de fluorescncia fomos descrever

cineticamente a interao do NDB-C4 com a BSA, pela

fluorescncia do NBD-C4 e pelo do quenching da

fluorescncia intrnseca BSA em diferentes percursos

ticos.

Materiais e Mtodos Reagentes. A albumina do soro de bovino (BSA) sem lpidos, HEPES, EDTA bem como NaCl, NaN3, HCl e NaOH foram obtidos da Sigma-Aldrich Qumica S.A. (Sintra, Portugal). O composto NBD-C4 foi sintetizado no grupo de Qumica Biologia do Centro de Qumica de Coimbra, de acordo com o protocolo estabelecido [1] e gentilmente cedido pela Dr Maria Joo Moreno. importante referir que a BSA no possua lpidos, de maneira a que NBD-C4 interagisse simplesmente com a BSA. Soluo tampo HEPES. Pesou-se 0.596 g

de HEPES, 2.1915 g de NaCl, 73.1 mg de EDTA e 50

mg de NaN3, com o objetivo de fazer uma soluo de

HEPES 10mM com 0.15M de NaCl, 1mM EDTA e

0.02% NaN3. Aps a dissoluo, procedeu-se ao acerto

do pH a 7.4 com uma soluo de NaOH 2.5M.

Soluo NBD-C4 em soluo tampo. O

NDB-C4 fornecido encontrava-se em metanol, pelo

que foi necessrio evaporar esse mesmo de forma a

diluir o fluorforo em soluo tampo, obtendo uma

concentrao inicial de 200 nM.

Estudo da ligao de NBD-C4 Albumina

do Soro Bovino. Com a finalidade de estudar a

afinidade que o NBD-C4 tem pela BSA, variou-se a

concentrao de BSA (de 0 a 150 M) e manteve-se a

concentrao de NBD-C4 constante, no valor 100 nM.

As amostras controlo no possuam NBD-C4 somente

BSA. Antes de realizar a medio da fluorescncia das

amostras, procedeu-se incubao das mesmas

durante 1-2 horas a 25C. A quantidade de NBD-C4

ligada albumina foi avaliada pelo aumento da sua

fluorescncia aps a ligao.

Estudo do quenching da protena. Neste

estudo, alterou-se a concentrao de NBD-C4, variar

de 1 a 68.2 M, e usou-se uma concentrao constante

de BSA, 5 M. As amostras de controlo no

continham BSA mas apenas as diferentes

concentraes de NBD-C4. Quando da obteno dos

espectros de fluorescncia, fez-se variar o percurso

tico (10 mm, 5 mm, 3 mm) influenciando a obteno

dos vrios parmetros e permitindo uma anlise do

quenching pela relao de Stern-Volmer. Tal como na

experincia anterior, antes das medies de

fluorescncia incubou-se as solues a 25C e durante

1-2 horas.

Espectroscopia de Fluorescncia. Os

espectros de fluorescncia foram obtidos num

espetrofotmetro de fluorescncia Cary Eclipse

equipado com um suporte de mltiplas clulas,

controlo de temperatura e um polarizador automtico.

Os espectros foram adquiridos entre 475 nm e 650 nm

utilizando um exc de 460 nm para NBD-C4 ( a que

esta molcula absorve mais), e, tambm, entre 285 e

500 usando um exc de 280 nm para BSA, usando

cuvettes de quartzo de percurso ptico 10 mm, 5 mm

e 3 mm. Os espetros de absoro foram obtidos num

espectrofotmetro Uv-Vis Unicam UV500 entre 200 e

800 nm.

Resultados e Discusso Estudo ligao da NBD-C4 Albumina do Soro Bovino.

Antes da realizao dos seguintes estudos

obtiveram-se espectros de absoro do NBD-C4 e da

BSA, em que se observou que o mximo de absoro

ocorria para um de 460 nm e 280 nm, respetivamente

(Figura 4).

A biodisponibilidade de uma molcula

determinada atravs da sua ligao a protenas

presentes nos fludos biolgicos. A albumina a

protena mais no soro pelo que muitas vezes utilizado

A)=)

B)=)

Figura 4- Espectro de absoro para a BSA (A) e para o NBD-C4 (B).

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como protena modelo para estudos relacionados com

a biodisponibilidade. Neste trabalho medida que a

concentrao de BSA na amostra foi aumentando, a

fluorescncia do NBD-C4, quando excitada a 460 nm,

tambm foi aumentando, demonstrando que ocorria

ligao do NBD-C4 BSA, como podemos ver pela

Figura 5.

A ligao entre o NBD-C4 e a BSA, a pH 7.4 e

a 25C, pode ser observada na Figura 6. Atravs do

melhor ajuste das equaes (1) e (2) [1], conseguiu-se

calcular a constante de ligao, Kb, entre a BSA e o

NBD-C4. Este valor foi de 1,96x104 M-1, que apesar de ser ligeiramente superior ao calculado em [1], est

na mesma ordem de grandeza.

A albumina apresenta um papel muito importante na homeostasia dos cidos gordos,

transportando-os do tecido adiposo para rgos que os

utilizam para obteno de energia [7]. Para tal a

albumina necessita de ligar com grande afinidade s

cadeias hidrocarbonadas dos cidos gordos e como

podemos constatar pelo Kb obtido e pelos valores

conseguidos no trabalho da professora Maria Joo

Moreno [1], isso acontece, sendo que para uma cadeia

hidrocarbonada maior a constante de ligao ,

tambm, maior e que na presena de um cido gordo

(FA-Cn) a constante de ligao para o NBD-Cn

maior do que se esperava, o que mostra a existncia de

alosterismo [1].

Sendo a concentrao fisiolgica de cidos

gordos na gama dos 5 - 10 nM e a concentrao de

albumina no sangue cerca de 640 M (superior que

estamos a utilizar) [6, 7], surge uma questo de como

que tecidos, como o corao e o msculo, conseguem

obter, com alta eficincia, os cidos gordos do plasma.

Ao entender melhor este processo torna-se mais fcil a

concepo de um frmaco que utiliza a albumina do

soro como meio de transporte para atingir o seu alvo

de ao.

Quenching da protena.

A intensidade de fluorescncia proporcional

concentrao do fluorforo em solues muito

diludas (absorvncia muito baixa). Para absorvncia

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Figura 5 Variao da intensidade de fluorescncia da BSA com a absorvncia a 280 nm (proporcional [BSA]) - Efeito de filtro interno.

Para interpretar os dados de estudo da extino de fluorescncia (quenching), importante

compreender que tipo de interao ocorre entre o

fluorforo e o quencher. Existem duas formas de

quenching, de acordo com a natureza do fluorforo e

o quencher: esttico e dinmico. O quenching esttico

resulta da formao de um complexo no fluorescente

no estado fundamental entre o fluorforo e o

quencher. Enquanto o quenching dinmico o

resultado de encontros colisionais entre fluorforo e

quencher [9]. Em ambos os casos, necessrio

contacto molecular entre o fluorforo e o quencher

para ocorrer quenching da fluorescncia. A anlise dos

resultados de quenching normalmente realizada

atravs das relaes de Stern-Volmer para o quenching

dinmico (equao 3) e esttico (equao 4), onde F0 e

F representam a intensidade da protena na ausncia e

presena de quencher, respetivamente, [Q] a

concentrao de quencher, KSV/S a constante de Stern-

Volmer para o quenching dinmico e esttico, 0 e o

tempo de vida do estado excitado na ausncia e

presena de quencher, respetivamente.

Podemos constatar pela Figura 8 que medida

que a concentrao de NBD-C4 (quencher) foi

aumentando, a fluorescncia intrnseca BSA foi

diminuindo, ocorrendo, por isso, quenching. Isto

acontece porque a molcula de NBD-C4, para alm de

absorver a 460 nm, vai tambm absorver a

comprimentos de onda semelhantes emisso da BSA,

isto , cerca de 350 nm (Figura 9). Assim, a ligao da

NBD-C4 BSA poder promover a uma proximidade

a resduos de triptofano da BSA, que permitir a uma

absoro da luz emitida por estes aminocidos. de

notar que a diminuio da intensidade de fluorescncia

com a diminuio do percurso tico deve-se,

simplesmente, ao facto de existir menos BSA na

cuvette (Figura 8).

285 335 385 435 485

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

nm

If

285 335 385 435

0

50

100

150

200

250

nm

If

0 M 1 M 3 M5 M 10 M 15 M20 M 30 M 40 M50 M 68,2 M

Figura 8 - Espectros de fluorescncia da BSA (exc=280nm e

em=350nm) com a concentrao de NBD-C4, numa cuvette de A) 10, B) 5 e C) 3 mm de percurso de ptico.

285 335 385 435 485

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

nm

If

A)

C)

B)

0,218; 54,839

0 1 2 3 4

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Abs 280 nm

If

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Figura 9 Espectro de Absoro da NDB-C4 a laranja e do Espectro

de Fluorescncia da BSA a azul.

Ao analisarmos o quenching da protena pela

relao de Stern-Volmer (Figura 10), apercebemo-nos

de uma relao linear at aos 20 M de NBD-C4 e de

um desvio na linearidade que se move para cima para

alm desta concentrao. Ao realizar a regresso linear

dos dados de quenching da protena (Figura 9),

conseguiu-se calcular a constante de quenching de

Stern-Volmer (Ksv) para os diferentes percursos ticos

pelo declive da reta. Assim, verificou-se que esta

constante varia com o percurso tico: 3 mm:

Ksv=0,0148 M-1; 5 mm: Ksv=0.0195 M

-1; 10 mm: Ksv=

0.0263 M-1. No entanto como o erro das regresses

lineares, nomeadamente para cuvette de 3 mm e 5 mm

foi elevado, ter-se-ia de realizar mais experincias de

forma a confirmar se varia ou se mantm constante, j

que se encontram na mesmo ordem de grandeza.

importante referir que os valores de menor

concentrao de NBD-C4 foram repetidos por estarem

fora da linearidade, assim escolheu-se os melhores

pontos que definiam uma reta para estudar o

quenching da protena.

Podemos observar, ainda, na Figura 10, que

para todas as cuvettes, a curva de Stern-Volmer

apresenta uma curvatura para cima, cncava na direo

do eixo dos ys para concentraes superiores a 20 M

de NBD-C4. Isto ocorre porque o quenching do BSA

est a ocorrer quer por coliso quer pela formao de

um complexo fluorforo-quencher, mas tambm

porque est acontecer efeito de filtro interno

secundrio.

Figura 10 Curvas de Stern-Volmer que descrevem o quenching da BSA causado pelo NBD-C4 e a regresso linear para concentraes de NBD-

C4 baixas. 10 mm: y = 0,0263x - 0,0136, R2= 0,9772; 5 mm: y =

0,0195x + 0,0375, R = 0,8258; 3 mm: y = 0,0148x + 0,0202, R = 0,7511.

Como o quenching da fluorescncia intrnseca do triptofano da BSA por NBD-C4 segue o tipo de interao esttica possvel calcular a constante de ligao (Kb) pelo seguinte mtodo. O equilbrio entre o NBD-C4 e a BSA pode ser

representado esquematicamente pelo equilbrio (5),

onde Q o NBD-C4, M o BSA, n representa o

nmero de locais de ligao na protena e M.Qn o

complexo entre o fluorforo e o quencher:

Assim, a constante de ligao (Kb) pode ser

calculada pela equao (6):

Sendo a concentrao de protena total (ligada

e no ligada) igual [M]0 e sabendo que

[M]/[M]0=F/F0, conseguimos calcular K pela equao

(7):

Na Figura 11 encontra-se a representao

grfica de aos resultados obtidos na gama de

concentraes baixas de NBD-C4, obtendo a constante

de ligao para cada percurso tico.

Pelas equaes adquiridas na Figura 10, conseguimos retirar a constante de ligao e o nmero de locais de ligao da interao entre o NBD-C4 e a BSA. Estes valores encontram-se organizados na Tabela 1 para cada percurso ptico. Tabela 1 Valores de constante de ligao (Kb) e locais de ligao (n) na interao da NBD-C4 com a BSA, para diferentes percursos ticos e obtidos pela Figura 10.

Pode-se constatar que os valores da constante

de ligao obtidos para os diferentes percursos so

muito diferentes entre si, sendo que para um percurso

tico maior, maior ser a constante de ligao.

Podemos, ainda, reparar que os resultados para o

nmero de locais de ligao no variam tanto. Em

teoria estes valores deveriam manter-se pois as

amostras em estudo so a mesma (s o nmero de

locais de ligao que se manteve constante). A

explicao deste acontecimento a existncia de um

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 20 40 60 80

(F0/

F)

-1

[NBD-C4] (M)

Percursos ticos Kb (x104 M-1) n

3 mm 0,0336 0,662

5 mm 0,0508 0,666

10 mm 4,51 1,054

300 350 400 450 500 550

Ab

sorv

ncia (U

.A)

nm

Flu

ore

scn

cia

(U.A

)

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efeito de filtro interno secundrio, isto o NBD-C4

que no se encontra ligado BSA absorve o que esta

emite fazendo com que parea que haja mais NBD-C4

ligado. Ento o quenching da protena vai ocorrer por

dois efeitos: o efeito de filtro interno secundrio e

transferncia de energia por ressonncia devida

ligao do NBD-C4 BSA.

O efeito de filtro interno secundrio tanto

maior quanto maior for a cuvette, porque existe mais

NBD-C4 no ligado em soluo que pode absorver o

que BSA est a emitir. Assim era de esperar obter um

valor de Kb mais correto na cuvette de 3 mm, mas

como R2 foi baixo ter-se-ia de realizar mais

experincias de forma a conseguir uma melhor

regresso linear.

Figura 11 Representao grfica de log([Q]) vs log(F0-F/F), para valores baixos de concentrao de NBD-C4 ([Q]= 4; 8; 9; 12; 16 M) e que permite determinar Kb e n. A) utilizao de uma cuvette de 10 mm, B) utilizao de uma cuvette de 5 mm e C) utilizao de uma cuvette de 3 mm.

Concluso 2 Nesta parte do projeto foi analisado a interao

da BSA e NBD-C4 foi analisado pelo aumento da

fluorescncia do NBD-C4 na presena de concentrao

crescente de BSA e por quenching da fluorescncia

intrnseco do triptofano da BSA em diferentes

percursos pticos pela adio de concentrao

crescente de NBD-C4.

Atravs dos resultados obtidos conseguiu-se perceber que o 1 mtodo (ligao albumina do soro bovino) era mais exato na obteno da constante de ligao (Kb) que o 2 mtodo (quenching da protena), uma vez que neste h a influncia do percurso tico a utilizar e da gama de concentraes de quencher (NBD-C4) que se usa. Assim necessrio ter em ateno estes dois parmetros, para que as medies no levem a artefactos. Apesar do mtodo de quenching no ser to exato na obteno de Kb, permite fazer outros estudos interessantes como a difuso de oxignio em membranas, localizar resduos de triptofano ligados a membranas e estudar o efeito das mudanas conformacionais na acessibilidade ao triptofano.

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A)=)

B)

C)