生体成分の分析

臨床検査において生体成分・薬剤は、さまざまな方法で分析されます。これらの成分には高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分析可能なものが数多く存在します。しかし、従来の方法では保持が小さい、分離が悪いなどの問題が発生する場合があります。今回は従来とは異なる手法による効率的な分析法について紹介します。

1. 代謝物の分析

(1) ビタミン D と代謝物ビタミン D は、骨疾患をはじめ、さまざまな疾患と関わっています。検査方法として競合的蛋白結合測定法（CPBA法）が簡便であることから、臨床分野において汎用的に用いられています。しかし、CPBA 法はサブタイプ別に測定できないなどの問題があり、近年では HPLC を利用した分析法が増加しています。HPLC による分析法では、代謝物である 25- ヒドロキシビタミン D2 や D3 だけでなく、ビタミン D2 や D3、ジアステレオマーである C3- エピマー体を一斉分析することが可能となります。

・HPLC によるビタミン D2 と D3 の分析

COSMOSIL Application DataCOSMOSIL Application Data

NACALAI TESQUE, INC

Column: Column size: 4.6mmI.D.-150mmMobile phase: Methanol Flow rate: 1.0 ml/min Temperature: 30°CDetection: UV265nm

Sample: 1; Vitamin D2 [Calciferol] (0.3μg) 2; Vitamin D3 (0.1μg)

AP-1035

5C18-MS-II Cholester

2. VitaminD3 1. VitaminD2

HH

H

OHH

HH

H

H

OHH

・UHPLC によるビタミン D2 と D3 の分析 ・UHPLC によるビタミン D と代謝物の一斉分析

NACALAI TESQUE, INC

AP-1515

Column: COSMOCORE 2.6CholesterColumn size: 2.1mmI.D.-150mmMobile phase: MethanolFlow rate: 0.4 ml/min Temperature: 30°CDetection: UV265nm

Sample: 1; Vitamin D2 [Calciferol]2: Vitamin D3

Data courtesy of a customer

3 分以内に分析可能

NACALAI TESQUE, INC

AP-1514

Column: COSMOCORE 2.6CholesterColumn size: 2.1mmI.D.-150mmMobile phase: A; 0.1% Formic acid-H2O

B; MethanolB conc. 75→82% (0→11min), 95% (11→25min)

Flow rate: 0.3 ml/min Temperature: 50°CDetection: UV265nm

Sample: 1; 25-Hydroxyvitamin D32; 3-epi-25-Hydroxyvitamin D33; 25-Hydroxyvitamin D24; 3-epi-25-Hydroxyvitamin D25; Vitamin D2 [Calciferol]6: Vitamin D3

Data courtesy of a customer

Featured Applications6

2

(2) 尿酸などプリン体代謝物尿酸は、プリン体代謝異常や腎機能障害などの疾患と関わっています。検査方法として還元法やウリカーゼ法が汎用的に用いられています。HPLC による分析法では、尿酸だけでなく尿酸代謝物（イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン）も検出することが可能となります。

・核酸誘導体

= 10/90

COSMOCORE Application Data

Column: COSMOCORE **Column size: 2.1mmI.D.-100mmMobile phase: Methanol/ 100mmol/l Phosphate buffer(pH2.5) Flow rate: 0.4 ml/min Temperature: 40°CDetection: UV240nmSample: 1; Allantoin (2.0mg/ml)

2; Guanine (0.05mg/ml)3; Hypoxanthine (0.05mg/ml)4; Uric Acid (0.1mg/ml)5; Xanthine (0.2mg/ml)6; Adenosine (0.2mg/ml)7; Inosine (0.1mg/ml)

Inj. Vol: 1.0µl

NACALAI TESQUE, INC

NH

ONH2

NH

HN

O

O

N

HN

NH

N

O

H2N

N

HN

NH

N

O

NH

HN

NH

HN

O

O

O

NH

HN

NH

N

O

O

N

O

OH

HO

OH

N

N

N

NH2

N

O

OH

HO

OH

HN

N

N

O

1; Allantoin

2; Guanine

3; Hypoxanthine

4; Uric Acid

5; Xanthine

6; Adenosine

7; Inosine

COSMOCORE

2.6PBr

COSMOCORE

2.6C18

AP-1497

2. 生理活性物質

(1) カテコールアミンなどモノアミン類カテコールアミンは、褐色細胞腫、神経芽細胞腫などさまざまな疾患と関わっています。検査方法として酵素アイソトープ法や HPLC が汎用的に用いられています。HPLC カラムとしてコスモシール PBr を用いることにより、簡便な方法でカテコールアミンなどのモノアミン類を一斉分析することが可能となります。

・カテコールアミン

AP-1318

NACALAI TESQUE, INC

5C18-PAQ PBr

Column: Column size: 4.6mmI.D.-150mmMobile phase: 20mmol/l Phosphate buffer(pH2.5)Flow rate: 1.0 ml/min Temperature: 30°CDetection: UV280nm

Sample: 1; L-Noradrenaline (0.5mg/ml)2; L-Adrenaline (0.5mg/ml)3; Dopamine (0.5mg/ml)4; L-DOPA (0.5mg/ml)

Inj.Vol.: 1.0µl

1.L-NoradrenalineOH

OH

NH2HO

2.L-Adrenaline

OH

OH

NH

HO

3.DopamineOH

OH

NH2

4.L-DOPA

OH

OH

OHO

NH2

・マウス脳組織抽出液中のモノアミン類の LC-MS/MS 分析

汎用的な方法であるクロロホルム・メタノール抽出法では夾雑物によるピーク形状の乱れが発生しました。今回、抽出物の前処理には前処理用のスピンカラムを用いて行いました。前処理後、コスモシール PBr を使用し、ドーパミン、アドレナリンとセロトニンの定量を行いました。

NACALAI TESQUE, INC

Column: PBrColumn size: 2.0mmI.D.-150mmMobile phase: 10mmol/l Ammonium Formate(pH 4.0)Flow rate: 0.2 ml/min Temperature: room temperatureDetection: ESI-MS/MS, Positive, MRM

Sample: Monoamines in mouse brainDopamineL-NoradrenalineSerotonin

Serotonin

Q1 177/ Q3 115.1

L-Noradrenaline

Q1 169.9/ Q3 107

Dopamine

Q1 154.0/ Q3 91.0

Data courtesy of Takuya Yamashita, Ph. D., Biochemical Toxicology Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, Kobe Gakuin University

Sample preparation

500μl

LC/MS/MS analysis

MonoSpin® PBA

Wash with 1% Acetic Acid 500μl,Centrifuge(10000 rpm, 1min, r.t.)

Wash with 100mmol/l HEPES buffer(pH8.5)500μl, Centrifuge(10000rpm, 1min, r.t.)

Centrifuge(5000 rpm, 2min, r.t.) 2times

Wash with 100mmol/l HEPES buffer(pH8.5) 500μl, Centrifuge(10000 rpm, 1min, r.t.)

Elute with 1% Acetic Acid 100μl,Centrifuge(10000 rpm, 1min, r.t.)

Centrifuge(13000 rpm, 30 min, 4°C)

Mouse brain tissue (Xg)

0.05% Triton-X , 10mmol/l Ammonium Formate(pH 4.0) (X 10ml)

Supernatant

Chloroform/Methanol = 2/1 (Y ml)

Homogenize (Total Yml)

Homogenize

Centrifuge(1500 rpm, 30 min)

Supernatant (Z ml)

1.5mol/l HEPES buffer(pH8.5) (Z 0.1ml)

Sample solution

3

3. 薬剤

(1) 5- フルオロウラシル5- フルオロウラシルは、抗がん剤として知られています。コスモシール PBr を用いることにより、ウラシル誘導体の保持が大きくなります。

・ウラシル誘導体

NACALAI TESQUE, INC

Column: Column size: 4.6mmI.D.-150mmMobile phase: 20mmol/l Phosphate buffer(pH2.5)Flow rate: 1.0 ml/min Temperature: 30°CDetection: UV210nm

Sample: 1; 5,6-Dihydrouracil (0.005mg/ml)2; Uracil (0.005mg/ml)3; 5-Fluorouracil (0.005mg/ml)4; 5-Bromouracil (0.005mg/ml)

Inj.Vol.: 10µl

5C18-PAQ PBr

2.Uracil

NH

NH

O

O

3.5-Fluorouracil

NH

NH

O

O

F

4.5-Bromouracil

NH

NH

O

O

Br

1.5,6-Dihydrouracil

NH

NH

O

O

(2) サプリメント10 種の脂溶性ビタミンは、コスモシール 2.5Cholester を用いることにより、15 分以内に完全に分離することが可能となります。

・脂肪性ビタミン

NACALAI TESQUE, INC

Column: 2.5CholesterColumn size: 2.0mmI.D.-50mmMobile phase: A; 0.1% TFA-Methanol/ H2O = 90/10

B; 0.1% TFA-MethanolB conc. 0%(0-5min)-100%(10min)-100%(15min)

Flow rate: 0.4 ml/min Temperature: 40°CDetection: UV280nmSample: (Standard)1; Vitamin A Acetate, all trans (0.06mg/ml)2; Vitamin D2 [Calciferol] (0.30mg/ml)3; Vitamin D3 (0.06mg/ml)4; Vitamin E Succinate [D-α-Tocopherol Succinate] (0.60mg/ml)

(0.18mg/ml)6; Vitamin E [DL-α-Tocopherol] (0.60mg/ml)7; Vitamin E Acetate [DL-α-Tocopherol Acetate] (0.60mg/ml)8; trans-Vitamin K1 (0.18mg/ml)9; cis-Vitamin K110; Vitamin A Palmitate (0.18mg/ml)Inj. Vol: 2.5µl AP-1262

Standard Supplement

Vitamin D3 (Neat)

Supplement

Vitamin E (4mg/ml)

Supplement

Multi Vitamin(56mg/ml)

5; Vitamin K2 [Menatetrenone]

(3) 放射性薬剤（PET）[11C]ABP688 は、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 5 選択的 PET 用リガンドです。Ｚ体が含まれることにより、測定感度の低下するおそれがあります。コスモシール Cholester を用いることにより C18 カラムと比べて分離度が大きくなり分取効率が高くなりました。

UV

E/Z mixture

UV

Retention time (min)

Z-isomer

E-isomer

min Retention time (min)

UV Z-isomer

E-isomer

NACALAI TESQUE, INC

Column: Column size: 10mmI.D.-250mmMobile phase:Flow rate: Temperature: room temperatureDetection: UV310nm

Sample: E-[11C]ABP688 / Z-[11C]ABP688

COSMOSIL Cholester

(Acetonitrile/ H2O = 50/50,

7 ml/min)

Competitor C18-B

(Acetonitrile/ H2O = 50/50,

5 ml/min)

Competitor C18-A

(Acetonitrile/ 0.1% H3PO4

= 30/70, 6 ml/min)

AP-1427Data courtesy of a customer ref. Nuclear Medicine and Biology, 41 (1), p17-23, 2014

NH3CNO11CH3

NH3CN

O11CH3

E-[11C]ABP688 Z-[11C]ABP688

Retention time (min)

4

※記載の内容は、'16 年 7 月現在の情報に基づいております。※価格には消費税は含まれておりません。

1607T

4. 掲載論文

(1) コスモシール Cholester の掲載論文コスモシール Cholester を 2005 年に発売以来、多くの研究者にご愛用いただいています。掲載論文数も 2014 年時点で 100 報を超えています。（論文数検索：Google Scholar）生体成分の分析でご使用された例もありますので、紹介します。

AUTHOR TITLE JOURNAL YEAR ISSUE PAGEShizuma Ishikawa, Takahiro Taira, Takeshi Niki, Kazuko Takahashi-Niki, Chinatsu Maita, Hiroshi Maita, Hiroyoshi Ariga and Sanae M. M. Iguchi-Ariga

Oxidative Status of DJ-1-dependent Activation of Dopamine Synthesis through Interaction of Tyrosine Hydroxylase and 4-Dihydroxy-l-phenylalanine (l-DOPA) Decarboxylase with DJ-1

J. Biol. Chem 2009 284 (42) 28832-28844

Tingli Bai, Daozhong Zhang, Shuangjun Lin, Qingshan Long, Yemin Wang, Hongyu Ou, Qianjin Kang, Zixin Deng, Wen Liu and Meifeng Tao

Operon for Biosynthesis of Lipstatin, the Beta-Lactone Inhibitor of Human Pancreatic Lipase Appl. Environ.

Microbiol. 2014 80 (24) 7473-7483

Asami Ikeda, Hayato Ichino, Saori Kiguchiya, Petros Chigwechokha, Masaharu Komatsu and Kazuhiro Shiozaki

Evaluation and identification of potent angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptide derived from dwarf gulper shark (Centrophorus atromarginatus)

Journal of Food Processing and Preservation

2015 39 (2) 107-115

(2) コスモシール PBr の掲載論文コスモシール PBr を 2013 年に発売以来、多くの研究者からご評価いただいています。掲載論文数も増えてきています。（論文数検索：Google Scholar）

AUTHOR TITLE JOURNAL YEAR ISSUE PAGEK Nakamoto, T Nishinaka, N Sato, F Aizawa, T Yamashita, M Mankura, Y Koyama, F Kasuya and S Tokuyama

The activation of supraspinal GPR40/FFA1 receptor signalling regulates the descending pain control system

British Journal of Pharmacology

2015 172 (5) 1250-1262

Yoshio Fujita, Kazuyuki Hirai, Keigo Nishida, Hiroaki Taguchi

6-(4-Amino-2-butyl-imidazoquinolyl)-norleucine: Toll-like receptor 7 and 8 agonist amino acid for self-adjuvanting peptide vaccine

Amino Acids 2016 48 (5) 1319-1329

Motoi Kanagawa, Kazuhiro Kobayashi, Michiko Tajiri, Hiroshi Manya, Atsushi Kuga, Yoshiki Yamaguchi, Keiko Akasaka-Manya, Jun-ichi Furukawa, Mamoru Mizuno, Hiroko Kawakami, Yasuro Shinohara, Yoshinao Wada, Tamao Endo, Tatsushi Toda

Identification of a Post-translational Modification with Ribitol-Phosphate and Its Defect in Muscular Dystrophy Cell Reports 2016 14 (9) 2209–2223

5. 物性表

充填剤名称 COSMOSILCholester

COSMOSIL2.5Cholester

COSMOCORE 2.6Cholester

COSMOSILPBr

COSMOCORE2.6PBr

シリカゲル 全多孔性球状高純度シリカゲル Core-Shell 型シリカゲル 全多孔性球状高純度シリカゲル Core-Shell 型シリカゲル

平均粒子径 5μm 2.5μm 2.6μm 5μm 2.6μm

固定相構造

化学結合基 コレステリル基 ペンタブロモベンジル基使用 pH 2 ～ 7.5

カラム耐圧性 20MPa（内径 10mm 以上は 15MPa） 30MPa 60MPa 20MPa（内径 10mm 以上

は 15MPa） 60MPa

接続タイプ * HPLC 型 UHPLC 型 HPLC 型 UHPLC 型* 接続タイプは、弊社 Web ページ 「1．エンドフィッティングの形状の差と接続について」の項をご参照ください。　http://www.nacalai.co.jp/cosmosil/column/COSMOCORE.html

6. 価格表（一部）

コスモシール Cholester コスモシール 2.5Cholester コスモコア 2.6Cholesterカラムサイズ 製品番号 定価 カラムサイズ 製品番号 定価 カラムサイズ 製品番号 定価

2.0 × 150 05971-11 60,000 2.0 × 50 09000-01 68,000 2.1 × 50 12859-81 84,0004.6 × 150 05976-61 50,000 2.0 × 75 09047-11 68,000 2.1 × 100 12861-31 96,00010 × 250 05979-31 145,000 2.0 × 100 09048-01 68,000 2.1 × 150 12862-21 102,000

コスモシール PBr コスモコア 2.6PBrカラムサイズ 製品番号 定価 カラムサイズ 製品番号 定価

2.0 × 150 12392-81 60,000 2.1 × 50 13693-11 84,0004.6 × 150 12394-61 50,000 2.1 × 100 13695-91 96,00010 × 250 12397-31 150,000 2.1 × 150 13697-71 102,000