EXTRACCIN DE DNA PLASMDICO

EXTRACCIN DE DNA PLASMDICOTitular : Dr. Quintn Rascn

Presenta: QBP Silvia Ivonne Arzola Rodrguez

Chihuahua, Chihuahua a 12 de febrero, 2011

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIHUAHUAFACULTAD DE CIENCIAS QUMICASIntroduccinMateriales y mtodosResultadosBibliografaNDICE

Clonacin Tcnica de produccin de copias de una regin de DNA especficaCelular (in vivo) o Acelular (in-vitro)Rondas de replicacin en clula anfitrionaInserto fragmento de DNA a clonarVector de clonacin otro DNA con secuencia y mapa de restriccin conocido, pequeo y fcil de aislarINTRODUCCININSERTOVECTORDNA RECOMBINANTEEnzimas de restriccin fragmentan DNAINTRODUCCIN

Vector transporta DNA extrao a una clula husped adecuada; capacidad de replicacin autnoma

Clasificacin:ProcedenciaTipo de molcula que se usa para prepararlosTipo de clula anfitrionaGen de resistenciaTamao de DNA que acepta como insertoINTRODUCCIN

Esquema general del procedimiento de clonacinINTRODUCCIN

Preparacin de DNA y vectorDNA recombinanteTransformacin (Incorporacin de rDNA)Propagacin celular y seleccinExpresin del DNA clonado

INTRODUCCIN

Plsmidos - vectores; Fragmentos de ADN a clonar;Fragmentos de ADN se insertan en plsmidos; Se transforman clulas y se cultivan en placas de Petri y se seleccionan por su resistencia a un antibitico. Se forman colonias de clones (bacterias idnticas) resistentes al antibitico y que incorporaron el plsmido.

PLSMIDOSINTRODUCCIN

Molculas de DNA bicatenario circularPequeos (2-5 kb)Libres en citosol en bacterias (1 a 3000 plsmidos/clula) y en algunos eucariotes unicelulares (crculo de 2 m levaduras)Fcil de purificar a partir de cultivos bacterianosIncorpora insertos de mx. 10 kbReplicones transmisibles

PLSMIDOSINTRODUCCIN

DIANAS PARA 13 ENDONUCLEASASGEN DE RESISTENCIAORIGEN DE REPLICACINPLSMIDOSINTRODUCCIN

Dependen de enzimas del husped

Utilizacin de polimerasas (III para elongacin y I para sntesis de primers)

Direccionalidad de la replicacin (unidireccional o bidireccional)

Terminacin

Modo de replicacin (forma de mariposa)

MATERIALES Y MTODOS

Solucin I: Solucin de lisozimaTris HCl 25 - 50 mM (pH 8)Glucosa 50 mMEDTA 10 mM (pH 8)Lisozima 100-200 ng/mL

Solucin II: Solucin de lisisNaOH 0.2 NSDS 1%

Solucin III: High Salt solution147 gr. Acetato de K26.25 mL Ac. FrmicoAgua hasta 500 mLMATERIALES Y MTODOS

MATERIALESTubos Eppendorf Micropipetas Puntas estrilesPipetas PasteurMicrocentrfuga

MEDIOS DE CULTIVOMedio lquido y/o slido LB (Luria Betani) adicionado con antibitico de intersMICROORGANISMOSBacterias de la familia EnterobacteriaceaePlesiomonas shigelloides

MATERIALES Y MTODOS

BOILING . Holmes y Quigley (1981)Incluye someter la muestra a extraer a 100 C por 15 minutos (lisis celular por calentamiento). Rosende et al., 2006

LISIS ALCALINA. Sambrook y col. (1989)Inocular 2 mL de medio LB suplementado con el antibitico apropiado con una colonia transformada.Incubar a 37 C con agitacin fuerte (200 r.p.m) durante 15-20h.Traspasar 1,5 mL de cultivo a un tubo Eppendorf y centrifugar 1 min a 13.000 r.p.m.Decantar el medio de cultivo, dejando el sedimento celular lo ms seco posible.Resuspender bien el sedimento en 200 L de Solucin I. Mezclar con la punta de la pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

MATERIALES Y MTODOS

MTODOS

Aadir 400 L de Solucin II ( Lisis) hasta aparecer translucido (Desnaturalizacin DNA). Aadir 300 L de Solucin III (Neutralizacin). Mezclar por agitacin (no en vortex)Incubar en hielo 20-30 minutos.Centrifugar durante 10 min a 13.000 r.p.m.Tomar el sobrenadante (DNA plasmdico) y precipitar con 0.6 volmenes de isopropanol (conservado a -20C), mezclar invirtiendo el tubo varias veces y dejar precipitar a -20C durante 10 minutos.Centrifugar 10 min a 13.000 r.p.m.Lavar con etanol 70%Centrifugar y decantar eliminando restos de etanol.Resuspender en 50 L de tampn TE o agua estril durante 15 min a temperatura ambiente

lvarez-Fernndez et al., 2003 / Bravo et al., 1998MATERIALES Y MTODOS

Se logr el aislamiento e identificacin de bandas de inters para sus respectivos estudios. El mtodo ms utilizado es el de lisis alcalina (miniprep, minialcalino o rpido)

En particular, lvarez-Fernndez et al. (2003) lograron asociar la presencia de integrones en bacterias Gram negativas con la presencia de plsmidos conjugativos que les confieren resistencia a diferentes antibiticos.

Bravo et al.(1998) confirmaron que la resistencia de las cepas aisladas de Plesiomonas shigelloides esta asociada a la presencia de plsmidos semejantes

RESULTADOS Y DISCUSINAnlisis plasmdico; marcador de peso molecular fago Lambda digerido con enzima Hind III (Bravo et al., 1998)RESULTADOS Y DISCUSIN

Aislamiento de plsmido con miniprep y digestin con enzimas de restriccinLuque J., Herrez . (2001). Texto Ilustrado de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica. Conceptos,, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Espaa: Elsevier.Karp G. (2005). Biologa celular y molecular. Conceptos y experimentos. Cuarta edicin. Colombia: Mc Graw Hill.Freifelder D. (1988). Fundamentos de Biologa Molecular. Espaa: Acribia.Gua de Prcticas de Biotecnologa Microbiana. Departamento de Microbiologa II. Facultad de Farmacia. (2010). En lnea. Internet. 11 de febrero, 2011. Disponible en: http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/guias/Guia_Biotec.pdfBravo L., De Paula O., Maestre J., Ramrez M., Garca B. (1998) Susceptibilidad antimicrobiana y aislamiento de plsmidos en Plesiomonas shigelloides. Revista Cubana Med Trop; 50. 3: 203-206Bimboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 1979;7. 6:1513-1523

BIBLIOGRAFAlvarez- Fernndez M., Rodrguez-Sousa T., Brey- Fernndez E., Lpez- Melndez C., Pieiro L. (2003). Asociacin entre integrones de clase 1 con resistencia a mltiples antimicrobianos y plsmidos conjugativos en Enterobacteriaceae. Rev Esp Quimioterapia; 16.4: 394-397