“Exposição à hiperoxia leva à morte celular no desenvolvimento cerebral”

Hyperoxic exposure leads to cell death in the developing brain

Uluc Yis a,*, Semra Hız Kurul a, Abdullah Kumral b, Serap Cilaker c,

Kazım Tug˘yan c, Sermin Genc d, Osman Yılmaz e

Brain & Development 2008 Oct ;30 (9): 556–562

Realizado por: Ana Graziela S. Antón1; Eduardo Carrari1; Rodolfo Bregion1.

Coordenação: Paulo R. Margotto

. www.paulomargotto.com.br

1 Ddos curso de medicina da Escola Superior de Ciências da Saúde – ESCS.

Obrigado!

Dr. Paulo R. Margotto, Ddo Eduardo, Dda Ana e Ddo Rodolfo

25-10-2008

Introdução• Evidências: prematuros apresentam elevada prevalência de

comprometimento cognitivo e motor devido a encefalopatia hipóxico-isquêmica, hemorragia intracerebral, infarto cerebral.

• Mas: uso de concentrações supra-fisiológicas de O2 em UTINeo (ressuscitação, desconforto respiratório...) altas concentrações de O2 exercem efeitos tóxicos;prematuros possuem menos antioxidantes enzimáticos;

• Hiperoxia: fator de risco aditivo para morte neuronal em RN que apresentaram asfixia intraparto;

• Poucos estudos analisaram os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento cerebral.

Objetivo

• “investigar os efeitos da hiperoxia em diferentes regiões do desenvolvimento cerebral”.

Materiais e métodos• Modelo animal:

– Em conformidade com as orientações do Laboratório Animal Experimental e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Animal do Dokuz Eylul University School of Medicine;

– Filhotes de ratos Wistar (IG semelhante) em 2 grupos acompanhados do nascimento ao 5º dia pós-natal P(5):caso (n=8): expostos, em câmara, a 80% de O2, com concentração do O2 controlada 2x/dia, umidade mantida a 80% e CO2 removido;controle (n=8): mantidos em local com ar ambiente (21% O2);

– Mães trocadas a cada 24h (prevenção de dist. respiratório no adulto);– Determinação da concentração sanguínea de O2 : coleta em cavidade

cardíaca esquerda (sob anestesia);– Em P(5): sacrifício dos animais animais pesados, anestesiados com

éter e tecidos cerebrais coletados.– Desenvolvimento cerebral desses ratos (nesta idade pós-natal) é

semelhante ao de um RN nascido com ± 24 sem de gestação.

• Avaliação histopatológica:– Realizada por investigador “cego” em relação

ao estudo;– Animais perfundidos por formalina, tecidos

fixados em formol, processados em blocos de parafina, cortados em 6µm e corados com cresilo violeta;

– Imagens analisadas em microscópio equipado com câmera de vídeo, computador e software (padronizados).

Materiais e métodos

• Estimativa do hipocampo, córtex pré-frontal, córtex parietal, subiculum e córtex retrosplenial :

– Estimativa das áreas cerebrais em toda as amostras (de acordo com Mouse Brain Atlas);

– Densidade/contagem de neurônios determinadas com uso de software;

– Procedimentos realizados às cegas.

Materiais e métodos

• Detecção de morte celular in situ :– Detecção de fragmentação de DNA com “deoxynucleotidyl

transferase-mediated dUTP nick endlabeling (TUNEL)”;• Morte celular detectada por ELISA:

– Para detecção de fragmentação de DNA;– Técnica utilizada para detecção específica de fração citoplasmática

de tecido cerebral;• Peso dos cérebros:

– Após removido da cavidade craniana, encéfalos pesados em balança com sensibilidade de 0,0001g;

• Análise estatística:– Valores apresentados como média ±SEM;– Comparações: teste Mann-Whitney U;– p<0,05: estatisticamente significativo.

Materiais e métodos

Resultados • Avaliação de pesos corporais e gasometria

sanguínea:

– Média do peso corporal: sem diferença estatística (12.14 ± 0.69 vs 12.57 ± 0.53; P = 0.318);

– PaO2 arterial: 82 ± 2 mm Hg nas crias expostas a 21% O2 e 324 ± 18 mm Hg naquelas expostas a 80% O2 (n = 2 por grupo);

• Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:– TUNEL: revelou típicas características morfológicas de

apoptose (condensação de cromatina e corpos apoptóticos);

– Seguem tabelas e figuras.

Resultados

• Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:

Resultados

Fig. 1: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL na região CA1 do hipocampo. Ampliações de secção coronal de CA1 tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo de hiperoxia (D) (setas).

Fig. 2: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex pré-frontal. Ampliações de secção coronal partir do córtex pré-frontal tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas significativamente reforçada no grupo de hiperoxia (D).

Fig. 3: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex parietal. Ampliações de secção coronal de córtex parietal dos tecidos cerebrais dos ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C e D) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo hiperoxia (E e F).

Fig. 4: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no subiculum. Ampliações de secção coronal de córtex parietal tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo de hiperoxia (D).

Fig. 5: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex retrosplenial. Ampliações da secção coronal de tecidos do córtex retrosplenial dos ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL reforçada nas células positivas grupo de hiperoxia(D).

• Efeitos da hiperoxia em quebra da fita de DNA:

Resultados

• Efeitos da hiperoxia sobre a morte celular no ELISA:

Resultados

Fig 6: Comparação dos resultados teste ELISA morte celular (grama / absorvância proteína) entre os grupos controle e hiperóxia.

• Peso dos cérebros:

Resultados

Fig 7: Comparação dos pesos dos cérebros entre controle e grupo de hiperoxia.

• Estudo:

– Concentrações suprafisiológicas levam a reação apoptótica e neurodegenerativas, morte celular e diminuição da massa cerebral alteração do desenvolvimento cerebral;

– Morte celular relacionada à hiperoxia em todas as regiões estudadas locais importantes de controle cognitivo, motor, sensorial, além de funções de memória e aprendizagem.

Discussão

• Animais selecionados devido à semelhança com o desenvolvimento pós-natal de um RN nascido com ± 24sem de IG:– Período crítico para o desenvolvimento cerebral;– RN comumente intubados e recebendo quantidades excessivas de

O2;• Estudos sobre os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento

cerebral são escassos;• Um estudo: exposição de prematuros à hiperoxia é

importante fator de risco para desenvolvimento de paralisia cerebral, piora o resultado em RN com asfixia;

• Lembrar que em UTINeo existem muitos fatores de risco que levam a morte neuronal silenciosa (sedativos, antiepiléticos), que somam os riscos com a hiperoxia.

Discussão

• Mecanismos da hiperoxia responsáveis pela morte celular no cérebro em desenvolvimento ainda não são conhecidos;

• Hiperoxia: produção de radicais livres: -danos ao DNA-mitocôndria- membranas; -mudança na expressão de

genes; -fosforilação de proteínas;

Discussão

Conclusão

• Hiperoxia:

– Capaz de produzir morte celular no cérebro em desenvolvimento, assim como no pulmão e na retina;

– Estudo sugere que a morte neuronal induzida pela hiperoxia pode ter parte na responsabilidade da deficiência cognitiva e motora desenvolvida posteriormente em prematuros.

Consultem também:

• Danilov CA, Fiskum G. Hyperoxia promotes astrocyte cell death

after oxygen and glucose deprivation. Glia. 2008 May;56(7):801-8

(A hiperoxia promove a morte celular do astrócito após deprivação de oxigênio e glucose)

Impacto das práticas clínicas no cérebro em desenvolvimentoAutor(es): Augusto Sola (EUA). Realizado por Paulo R. Margotto