Exploratory Research Project (PCE) Novel Innovative Chemical, Electrochemical and Optical Sensor Platforms for Reliable and Sustainable Real-Time

Implementation in Automated Data-Intensive Process Systems

Contract Nr. 45/2017: Noi platforme inovatoare bazate pe senzori chimici, electrochimici si optici pentru

implementarea fiabila si durabila in timp real in sisteme de proces intensive de date automate

PN-III-P4-ID-PCE-2016-0050

PL’s Project Leader (PL): Prof. Dr. CS1 Jacobus (Koos) Frederick van Staden

PL’s Project Laboratory: PATLAB, Bucharest of INCDEMC, Timisoara

Host Institution for the project: National Institute of Research and Development for Electrochemistry and Condensed

Matter (INCDEMC), Timisoara

Project duration in months: 30 months (July 2017-2019) Project budget: 850.000RON Project Summary

The purpose of this extended scientific research and development project is to enhance the design, preparation, characterization and development of micro-/nanotech-based multi-parameter sensors further to a higher dimension with new novel innovative high-based technology with implementation as fast-responding highly sensitive and cost-effective interactive chemical, electrochemical and optical sensors platforms for reliable and sustainable real-time integrated implementation in automated data-intensive process systems. Due to latest new

developments in fields of modern microsystems technology in nano-structured/-porous materials) with UV/Vis, fluorescence,chemiluminescence (quantum dots), NIR, Raman, AFM, main idea is to move research of technical chemical process (micro/nano) systems engineering further with optical devices into photonics subdomain. Main targets are an innovative modern strategic approach of basic knowledge research, design and evaluation of various possible new analytical techniques and methodologies with downscaling to very small miniature sensor detection devices to be able to perform the real-time automated data-intensive processing on-site. Overall strategic research scenarios will include the identification and efficient quantification of analytes, substances, groupings (processes) from toxic (e.g. pesticides, toxic metals, organic and inorganic substances in food, beverages, water, soil) to healthy substances (e.g. vitamins, mineral, antioxidants in food, pharmaceutical) tailored to selected specific dedicated number, most needed within ability/feasibility of SPRADIPS. Objective is to go well ahead of current state-of-art with the design/ development of fast responding, smart intelligent interactive sensors (arrays), to achieve sustainable assessment, monitoring and control of target substances with a vision of exploitation in industrial production and environmental technology integrated with data base adaptive resource management systems.

Team Members

Name Role in the project

Jacobus Frederick van Staden, DSc, Prof., CSI

Director of Project

Raluca-Ioana van Staden, PhD, CSI

Principal Researcher

Dr Ionela-Raluca Stancu Postdoc Researcher

Dr Georgiana Luiza Arnold-Tatu

Postdoc Researcher

Dr Catalina Negut Postdoc Researcher

Dr Roxana Luisa Popescu Postdoc Researcher

Luciana Gherghina Doctorand

Alexandrina Lungu-Moscalu Doctorand

Roxana Nuta Masterand

Ioana Rodica Serban Doctorand

Cristina Stefanov Postdoc Researcher

Elena Stefan Postdoc Researcher

Ramona State Postdoc Researcher

Damaris Gheorghe PhD Student

Objectives

The main objective of this extended scientific research and development project is to enhance the design, preparation, characterization and development of micro-/nanotech-based multi-parameter sensors further to a higher dimension with new novel innovative high-based technology with implementation as fast-responding highly sensitive and cost-effective interactive chemical, electrochemical and optical sensors platforms for reliable and sustainable real-time integrated implementation in automated data-intensive process systems. Due to latest new developments in fields of modern microsystems technology in nano-structured/-porous materials) with UV/Vis, fluorescence,chemiluminescence (quantum dots), NIR, Raman, AFM, main idea is to move research of technical chemical process (micro/nano) systems engineering further with optical devices into photonics subdomain. Main targets are an innovative modern strategic approach of basic knowledge research, design and evaluation of various possible new analytical techniques and methodologies with downscaling to very small miniature sensor detection devices to be able to perform the real-time automated data-intensive processing on-site. Overall strategic research scenarios will include the identification and efficient quantification of analytes, substances, groupings (processes) from toxic (e.g. pesticides, toxic metals, organic and inorganic substances in food, beverages, water, soil) to healthy substances (e.g. vitamins, mineral, antioxidants in food, pharmaceutical) tailored to selected specific dedicated number, most needed within ability/feasibility of SPRADIPS. Objective is to go well ahead of current state-of-art with the design/ development of fast responding, smart intelligent interactive sensors (arrays), to achieve sustainable assessment, monitoring and control of target substances with a vision of exploitation in industrial production and environmental technology integrated with data base adaptive resource management systems.

Specific objectives are:

1. O1-Applicable system specifications for reliable sustainable resource, environmental and industrial production management;

2. O2-Further development with extensive characterization of fast responding smart intelligent interactive sensors systems with special attention to optical (photonic systems) devices;

3. O3-Integration into platforms for reliable and sustainable real-time implementation for monitoring and control with innovative decision-making tools;

4. O4-Real-time data base adaptive resources management information systems in Romania and Europe (Worldwide) for risk analysis and for interpretative inter-operative technical solutions and services;

5. O5-Progress evaluation and assessment and dissemination of results.

Methodology

The following intermediate milestones (MS) are proposed:

MS1. Applicable Systems Specifications

MS2. Materials Selection, Sensor technology design, validation and evaluation of different individual sensors, Laboratory trials.

MS3. Cost-effective, portable interactive sensor platform systems

MS4. New toolkit named Real-time Quality Data Management System (RQDMS).

MS5. Management (Throughout)

MS6. Dissemination (Throughout)

The scientific work and technological development are structured distributed into SIX (6) core workpackages (WP’s):

WP1: Applicable Systems Specifications coupled to objective O1 and to intermediate milestone 1.

WP2: Materials Selection, Development of sensor technology. Laboratory trials. coupled to objective O2 and to intermediate milestone 2.

WP3: Integration into platforms for reliable and sustainable real-time implementation for monitoring and control with innovative decision-making tools coupled to objective O3 and to intermediate milestone 3.

WP4: Real-time data base adaptive resources management information systems coupled to objective O4 and to intermediate milestone 4.

WP5 will be used as management and risk assessment of the project.

WP6 will form the dissemination and exploitation of results as well as integration of knowledge with training/education of students/young researchers.

The workpackages (WP’s) are divided into the following tasks(activities):

WP1:

1.1 Setup of applicable system specifications with strategic planning for research studies needed to obtain reliable and sustainable sensors/probes/devices.

1.2 Preliminary investigation of various innovative pathways in terms of selection of proper sensor materials and detection devices for each of the sensors/probes/devices.

WP2:

2.1 The research activities will concentrate on finding and selecting the most promising (nano) materials for modified electrochemical, optical or spectroelectrochemical sensors for the selected target substances for efficient implementation. This will be done in step-by-step tasks and activities for synthesis, functionalization, build-up and testing for proper incorporation into the individual sensors on the laboratory scale.

2.2 The objective of this task is to realize the development of basic new innovative individual sensor technology architectures and to design, develop, characterize, optimize, validate and evaluate each individual sensor for individual single selected analyte/selected groups of analytes from selected target substances. Limits of detection (LOD) in the pg mL-1 range will be achieved.

2.3 This task (activity) is to test the stability of the final individual sensors and to find the most appropriate sensors for further work.

2.4 The task is to integrate the individual sensors into portable, fast responding smart and interactive sensor arrays with laboratory trials, making use of modern nano-/microsystems technology.

WP3:

3.1 This task activity) will focus on integrating the individual sensors (sensor arrays) for the different target substances into portable platform systems.

3.2 The main idea of this activity is to couple the portable platform system with an interactive mobile phone into a fast responding highly sensitive and cost-effective, interactive sensor platforms with RFID PID control coupled with mobile wireless networks with miniaturized integrated process data treatment systems (for dynamic info, spatial resolved info, and data management) for fast monitoring and control.

3.3 The system will be tested and validated for reliable on-site real-time control with the innovative decision-making tools at suitable sources of data-intensive process systems.

WP4:

4.1 Inclusion of the new portable/handheld sensing platform system in specific procedures within the new proposed decision-making management systems along chosen distribution networks with integration into interactive mobile phone wireless sensor networks with RFID PID control.

4.2 Real-time data supplied via transfer from the real-time integrated monitoring will be continuously supplied to data base adaptive water resource management information systems in Europe (-and Worldwide-) for risk analysis and for interpretative inter-operative technical solutions and services.

4.3 Achievement of a new toolkit named Real-time Quality Data Management System (RQDMS) with piloting activity concerning the implementing and functioning on a specific chosen distribution network.

WP5:

5.1 Continuous progress evaluation and assessment of the project.

5.2 Continuous proper coordination and project management.

WP6:

6.1 Dissemination with a website, flyers and of results through patents, published papers in ISI peer-reviewed journals, presentations at workshops, conferences, seminars

6.2 Integration of knowledge with training/education of students/young researchers.

Dissemination

Lucrari publicate:

1. Molecular Recognition of Nitrites and Nitrates in Water Samples Using Graphene-Based Stochastic Microsensors, Raluca-Ioana Stefan-van Staden, Mariana Mincu, Jacobus Frederick van Staden, and Livia Alexandra Gugoasa,

Analytical Chemistry, 90(16) (2018) 9997-10000. (with front cover)

2. Fluorimetric Determination of β-Carotene in Food Samples Using a Fluorescence Dye, C. Negut Cioates, J. F. van Staden, Analytical Letters, 2019, doi.org/10.1080/00032719.2019.1641110, FI=1.248;

3. Fluorimetric determination of nitrate in water catchments using a fluorescence tracer dye, C. Cioates Negut, J. F. van Staden, G. L. Arnold Tatu, Revue Roumaine de Chimie-Special Issue of ROICAC 2018, 2019, FI=0.395, acceptat pentru publicare;

4. Molecular recognition of aflatoxin M1 in water and milk samples M. Mincu, R.I. Stefan-van Staden, J.F. van Staden

Electroanalysis, 31(6), 1034-1039, 5. Pattern Recognition of Melatonin Using Stochastic Sensors

RI Stefan-van Staden, A. Lungu - Moscalu, J.F. van Staden2019 New J Chem, 43(13), 5196-5201, 2019

6. Electroanalysis of Bisphenols A, F, and Z Using Graphene Based

Stochastic Microsensors RI Stefan-van Staden, M Mincu, JF van Staden Electroanalysis, 31(7), 1842-1846, 2019

7. Nanostructured Materials Used for Pattern Recognition of Bisphenols in

Waste Waters RI Stefan-van Staden, A. Lungu - Moscalu, J.F. van Staden J Electrochem Soc, 166(12), B903-B907, 2019

8. Pattern recognition of sweeteners in biological fluids, beverages, and

ketchup using stochastic sensors RI Stefan-van Staden, A Moscalu-Lungu, JF van Staden Electroanalysis, 00, 000, 2019

9. Determination of Bisphenol F in Mustard using Fluorescence. Alexandrina Moscalu-Lungu, Raluca-Ioana Stefan-Van Staden and Jacobus Frederick van Staden

U.P.B. Sci. Bull., Series B, 81 (3) (2019) 131-138 Lucrari trimise la publicat in reviste ISI 1. Determination of β-carotene in soft drinks using a stochastic sensor based

on a graphene-porphyrin composite RI Stefan-van Staden, A Moscalu-Lungu, JF van Staden

2. Nanocarbon Materials Modified with a Complex of Protoporphyrin IX, Recognized Antibiotics in Water Samples RI Stefan-van Staden, M Mincu

Participari la conferințe

Tubular Reactors as Chemical Sensors, Jacobus F. VAN STADEN (Keynote), 4th International Conference on Analytical Chemistry, September 1 – 3, 2018, Bucharest, Romania Sensitive detection of melatonin based on stochastic sensors in pharmaceutical formulations and infant formulas - prezentare orală, Alexandrina Lungu (Moscalu), Raluca-Ioana van Staden, Jacobus Frederick van Staden. 4th Romanian International Conference on Analytical Chemistry, (RO-ICAC’2018) 1–3 September 2018, Bucharest. Detection of melatonin based on fluorescence method using a suitable chromphore in infant formulas and pharmaceutical drugs-poster, Alexandrina Lungu (Moscalu), Catalina Cioates-Negut, Raluca-Ioana van Staden, Jacobus Frederick van Staden, 4th Romanian International Conference on Analytical Chemistry (RO-ICAC’2018), 1–3 September 2018, Bucharest. Simultaneous detection of bisphenols in biological and water samples using stochastic sensors-poster, Alexandrina Lungu (Moscalu), Raluca-Ioana van Staden, Jacobus Frederick van Staden 4th Romanian International Conference on Analytical Chemistry, (RO-ICAC’2018) 1–3 September 2018, Bucharest. Environmental emerging pollutants from our ecosystems resources! Do we still have safe and secure sustainable water systems to supply suitable drinking water?, Jacobus F. van Staden, 21st INTERNATIONAL SYMPOSIUM – SIMI 2018 “THE ENVIRONMENT AND THE INDUSTRY”, September 20-21, 2018, Bucharest, Romania (Invited lecture) Hightech-based Multimode Analytical Devices/Robotic Systems for Sensitive and Selective Real-time On-site High-performance Process Monitoring and Control in Real Case Challenges for Industries, Manufacturers and Pollutant Areas. Jacobus (Koos) Frederick van Staden (Keynote Lecture) EUROANALYSIS2019, Istanbul, Turkey. 1-5 September 2019

Nanocarbon Materials Modified with a Complex of ProtoporphyrinIX, Recognized Antibiotics in Water Samples Mariana Mincu, Raluca-IoanaStefan-Van Staden, Jacobus Frederick van Staden EUROANALYSIS2019, Istanbul, Turkey. 1-5 September 2019 DETECTION OF SWEETENERS IN BIOLOGICAL FLUIDS AND FOOD SAMPLES USING STOCHASTIC SENSORS Alexandrina Lungu - Moscalu, Raluca-Ioana Stefan-van Staden, Jacobus Frederick van Staden1 EUROANALYSIS2019, Istanbul, Turkey. 1-5 September 2019 ELECTROCHEMICAL DETERMINATION OF MONOBENZYL-PHTHALATE IN BIOLOGICAL SAMPLES Cristina Stefanov, Jacobus (Koos) Frederick van Staden, Catalina Negut Cioates EUROANALYSIS2019, Istanbul, Turkey. 1-5 September 2019 ELECTROCHEMICAL SENSORS FOR DETERMINATION OF L-TYROSINE IN PHARMACEUTICAL SAMPLES Catalina Negut Cioates*, Jacobus (Koos) Frederick van Staden EUROANALYSIS2019, Istanbul, Turkey. 1-5 September 2019 Fluorimetric Determination of β-Carotene in Food Samples Using a Fluorescence Dye Catalina Negut Cioates, Jacobus (Koos) Frederick van Staden EUROANALYSIS2019, Istanbul, Turkey. 1-5 September 2019 Tubular Reactors as Chemical Sensors in the Environment and Industry. Jacobus (Koos) Frederick van Staden (Keynote Lecture) 22-nd International Symposium “The Environment and Industry” - SIMI 2019, 26-27 September 2019, Bucharest, Romania Raportari:

UNITATEA EXECUTIVĂ PENTRU FINANŢAREA ÎNVĂŢAMÂNTULUI SUPERIOR, CERCETĂRII, DEZVOLTĂRII ŞI INOVĂRII PROGRAM PN-III CONTRACTOR PN-III-P4-ID-PCE-2016-0050 Institutul Naţional de Cercetare

Dezvoltare pentru Electrochimie si Materie Condensata

Nr. Contract 45PCE/2017

Noi platforme inovatoare bazate pe senzori chimici, electrochimici si optici pentru implementarea fiabila si

durabila in timp real in sisteme de proces intensive de date automate

SPRADIPS

Raport ştiinţific în extenso

Etapa 1 - Identificarea specificatiilor sistemului inovativ- 2017

Director de proiect CSI, Prof. Dr. JACOBUS FREDERICK VAN STADEN

Pentru atingerea obiectivelor din cadrul fazei 1 a proiectului de cercetare

45PCE/2017, in anul 2017 s-au realizat urmatoarele activitati de cercetare:

- A fost realizat un studiu de literatura cu privire la determinarea poluantilor

din diferite probe de apa prelevate.

- Au fost prelevate mai multe probe de apa din diferite surse (apa potabila, apa

uzata, apa de suprafata, apa geotermala, etc.).

- Pentru probele prelevate au fost urmariti indicatori de calitate fizico-chimici,

cum ar fi: azotati, azotiti, fosfor total, fosfati, cupru, nichel, cadmiu, plumb

si mercur si substante organice cum ar fi bisfenoli, melatonina, aminoacizi,

vitamine.

- Pobele prelevate au fost initial analizate prin metodele standarde utilizate in

laboratoarele de mediu, iar ulterior au fost stabiliti parametrii pentru

analizele prin metode electrochimice si optice.

- Cateva din rezultatele obtinute prin metode standard de analiza sunt

prezentate in Tabelul 1.

Tabelul 1. Rezultatele analizelor fizico-chimice obtinute prin metode standard analizate

Nr.crt.

Incercari executate

proba de apa

U.M. Simbol proba/ Valori determinate Metoda de incercare 449RV 450RV 451RV 452RV 419RV 410RV 409RV 373RV 374RV 377RV 385RV

Tipul probei Apa subterana

Apa subterana

Apa subterana

Apa subterana

Apa uzata Apa uzata Apa uzata

Apa uzata Apa uzata

Apa uzata

Apa uzata

1 pH Unit. pH 7.74 7.48 7.83 7.73 - - - - - - 7,35

SR EN ISO 10523:2012

2 Azotati mg/l 10.27 1.32 9.39 9.79 - - - - - - 0,945 SR ISO 7890-3:2000

3 Azotiti mg/l 0,13 0,20 0,52 0,082 - - - - - - 0,068 SR EN 26777:2002 SR EN 6777:2002/ C91:2006

4 Fosfati mg/l 0,30 0,30 0,26 0,33 - - - - - - - SR EN ISO 6878:2005 5 Fosfor total mg/l 16,87 1,23 20,14 19,12 1,54 12,78 0,406 0,46 4,91 2,98 1,26 SR EN ISO 6878:2005, pct. 8

Nr.crt.

Incercari executate

proba de apa U.M.

Simbol proba/ Valori determinate Metoda de incercare Apa potabila Apa

subterana Apa retea Apa retea Apa

potabila Apa

upotabila Apa

uzata Apa uzata Apa

potabila 614RV 615RV 617RV 618RV 619RV 620RV 621RV 646RV 662RV

1 Azotati mg/l 0,21 1,66 0,405 0,12 0,49 2,70 1,67 1,88 1,66 SR ISO 7890-3:2000

2 Azotiti mg/l 0,003 0,006 0,019 0,011 0,0042 0,28 15,8 0,034 0,004 SR EN 26777:2002 SR EN 6777:2002/ C91:2006

Nr.crt.

Incercari executate

proba de apa U.M.

Simbol proba/ Valori determinate Metoda de incercare Apa potabila Apa

subterana Apa retea Apa retea Apa

potabila Apa

upotabila Apa

uzata Apa uzata Apa

potabila GEO-I -1 GEO –I -2 GEO-I-3 SE –II-1 SE –II-2 SE –II-3

1 Azotati mg/l 1,47 0.36 21.22 0.26 0.41 15.09 SR ISO 7890-3:2000

2 Azotiti mg/l 0,078 0.182 0.042 0.089 0.102 0.14 SR EN 26777:2002 SR EN 6777:2002/ C91:2006

Nr.crt.

Incercari executate

proba de apa

U.M. Simbol proba/ Valori determinate Metoda de incercare 280RV 281RV 282RV 284RV 285RV 383RV 384RV 497RV 498RV 499RV 500RV 501RV 502RV

Tipul probei Apa uzata geotermala

Apa suprafata (Raul OLT)

Apa uzata menajera

Apa uzata menajera

Apa suprafata (Raul OLT)

Apa uzata geotermala

Apa uzata menajera

Apa potabila din izvor

Apa potabila din izvor

Apa potabila

din izvor Apa

potabila din izvor

Apa potabila din izvor

Apa potabila

din izvor

1 pH Unit. pH 7.33 6.96 7.50 7.53 7.11 6.95 7.43 6.91 6.89 7.14 6.48 7.53 7.39

SR EN ISO 10523:2012

2 Azotati mg/l 3.55 0.171 0.134 4.34 6.16 2.43 0.313 28.12 16.82 20.23 44.16 12.11 40.48 SR ISO 7890-3:2000

3 Azotiti mg/l 0.431 0.09 0.186 0.04 0.101 3.95 0.11 0.003 0.010 0.062 0.003 0.014 0.003 SR EN 26777:2002 SR EN 6777:2002/ C91:2006

4 Fosfati mg/l - - - - - - - 0.53 0.43 1.59 0.97 0.15 0.62 SR EN ISO 6878:2005

5 Fosfor total mg/l 0.07 0.041 0.67 0.73 0.039 0.45 1.40 0.685 0.43 0.52 0.49 0.29 1.64 SR EN ISO 6878:2005, pct. 8

1. Fosfati. Forme in care se regasesc si metode de analiza.

Fosforul este un element chimic cu simbolul P și numărul atomic 15. Acesta a fost

descoperit de alchimistul german Hennig Brand din Hamburg [1]. Ca element, fosforul există în

două forme majore: fosforul alb și fosforul roșu, dar deoarece este foarte reactiv, fosforul nu este

niciodată găsit ca un element liber pe Pământ. La 0,099%, fosforul este cel mai abundent

pnictogen [2] din scoarța Pământului. Denumirea de ”fosfor” provine de la termenul de origine

greacă ”phosphorus”, ce înseamnă ”purtător de lumină”. Termenul de "fosforescență", adică

strălucirea după iluminare, derivă inițial din această proprietate a fosforului, deși acest cuvânt a

fost folosit de atunci pentru un proces fizic diferit care produce o strălucire. Stralucirea fosforului

provine din oxidarea fosforului alb, un proces numit acum chemiluminescenta.

Dupa calciu, fosforul este cel mai abundent element mineral din organism, aflandu-se in

orice tesut, astfel ca fosforul reprezinta 1% din greutatea corpului, ceea ce inseamna ca in

organismul unui adult se gasesc cca. 600-700 g P sub forma de diversi fosfati anorganici si

organici. Din aceasta cantitate, 85% intra in constitutia scheletului, 6% in muschi, iar 9% in nervi

si sange. Aproximativ 70% din fosforul din sange este prezent in forma organica, in principal

fosfolipide, restul fiind fosfor anorganic, sub forma de ortofosfati (H2PO4–, HPO42-), care rezulta

din ionizarea secventiala a acidului fosforic [3]. In celula, fosforul este in principal implicat sub

forma de fosfor organic in metabolismul glucidic si lipidic sau este legat de proteine si doar o

mica parte este prezenta ca ion fosfat [3]. Fosforul intra in compozitia oaselor si a dintilor, fiind

unul dintre constituentii acizilor nucleici, nucleoproteinelor, fosfolipidelor din membranele

celulare. De asemenea este implicat in mentinerea echilibrului acido-bazic, in stocarea si

transferul de energie [4], in procese enzimatice, stimuleaza contractia musculara si este necesar

pentru mentinerea activitatii neuronale [5].

Desi fosforul este un macronutrient vital necesar tuturor celulelor vii, elementul fosfor

este foarte puternic reactiv, exploziv, ce nu apare in mod normal in natura sub forma lui

neoxidata, ci tot timpul ca fosfat, unde atomul de fosfor este inconjurat de patru atomi de oxigen

(PO4); astfel ca fosfatul este transmis mai departe nealterat in diverse transformari prin care trece

fosforul, fie anorganic, mineralizat, fie organic, inclus in molecule organice gigant.

Fosfatii organici sunt esentiali: ei formeaza o parte din ADN si ARN; fosfatul este folosit

in fotosinteza si in sange; iar fosfolipidele sunt componente majore ale membranei celulare.

Fosfatul de asemenea participa in fiecare celula vie, prin ATP (adenozin-trifosfat), molecula

energetica de baza in organismele vii [6].

Analiza cantitativă a acizilor nucleici a devenit din ce în ce mai importantă în domeniile

biologiei moleculare, diagnosticării medicale și asupra mediului. Au fost studiate metode

analitice pentru analiza cantitativă a acidului dezoxiribonucleic (ADN): spectrofotometria [7,8],

spectrofluorometria [9,10], împrăștierea luminii de rezonanță (RLS) [11-13], chemiluminescența

(CL) [14,15] și electrochimia [16-18]. Metoda spectrofotometrică [7,8] are avantajul reacției

ADN-ului cu diferiți coloranți organici pentru a forma derivați colorați, iar metodele

spectrofluorometrice și RLS se bazează în general pe efectul de amplificare sau stingere a

probelor cum ar fi coloranții [9,10], complex metalic [11] și chiar nanoparticule [12,13]. Metoda

CL [14,15] măsoară emisia de lumină care apare în procesele chimice, având astfel o sensibilitate

excelentă, o limită de detecție scăzută și un domeniu liniar larg. Metoda electrochimică este

adesea folosită pentru studierea interacțiunii moleculelor mici, cum ar fi metalele [16],

medicamentele [17] și coloranții organici [18] cu ADN, iar determinarea cantitativă poate fi

realizată prin interacțiunile specifice. Spectroscopia cu infraroșu apropiat (NIR) a fost dovedită o

tehnică convenabilă, rapidă și nedistructivă pentru analiza complexă a eșantioanelor și a fost

adoptată pe larg în diverse domenii [19,20]. Absorbția în combinație cu spectroscopia de reflexie

difuză (NIRDRS) a fost utilizată pentru determinarea componentelor cu conținut scăzut în soluții

sau a probelor reale cu matrice complexă [21].

Organofosfatul sau ester fosfatul este denumirea generală a esterilor acidului fosforic.

Organofosfații sunt baza multor insecticide, erbicide și agenți neurotoxici. Agenția Statelor Unite

pentru Protecția Mediului enumeră organofosfații ca fiind extrem de toxici pentru albine,

animale sălbatice și oameni [22].

Exemple de organofosfați:

• Insecticide - Malation, paration, diazinon, fention, diclorvos, clorprifos, etion

• Gaze neurotoxice –soman, sarin, tabun, VX

• Agenți oftalmici - Ecotiofat, izoflurofat

• Antihelmintice – Triclorfon

• Erbicide - Tribufos (DEF), merfos

• Plastifianti - Tricresil fosfat

Semnele și simptomele otrăvirii cu organofosfati pot fi împărțite în trei mari categorii: (1)

efectele muscarinice, (2) efectele nicotinice și (3) efectele sistemului nervos central (SNC).

Toxicitatea organofosfatilor este un diagnostic clinic. Confirmarea otrăvirii cu organofosfati se

bazează pe măsurarea activității colinesterazei; dar de obicei, aceste rezultate nu sunt ușor

disponibile. Tratamentul începe cu decontaminarea. Principalele componente ale terapiei

farmacologice includ atropină, pralidoximă (2-PAM) și benzodiazepine (de exemplu, diazepam)

[23].

Studii recente sugerează o posibilă legătură dintre efectele adverse ale dezvoltării neuro-

comportamentale a fetușilor și a copiilor, chiar și la niveluri foarte scăzute de expunere.

Organofosfații sunt utilizați pe scară largă ca solvenți, plastifianți și aditivi.

Organofosfații sunt utilizați pe scară largă atât în aplicații naturale, cât și în cele sintetice, din

cauza ușurinței cu care grupurile organice pot fi legate între ele.

Polifosfații formează de asemenea esteri; un exemplu important al unui ester al unui

polifosfat este ATP, care este monoesterul acidului trifosforic (H5P3O10). Cuvântul

"organofosfați", care apare în comunicări (de exemplu, din presă sau din partea guvernului), în

domenii precum agricultura, mediul și sănătatea umană și animală, se referă foarte des la un grup

de insecticide (pesticide) care acționează asupra enzimei acetilcolinesterazei. Astăzi,

organofosfații reprezintă aproximativ 50% din agenții de ucidere din pesticidele chimice [24].

Pesticidele organofosfatice, ca și unii agenți neurotoxici, inhibă enzima neuromusculară,

care este în mare măsură esențială pentru funcționarea normală a insectelor, dar și pentru oameni

și multe alte animale[25].

Parationul, unul dintre primele pesticide organofosfatice comercializate, este mai bun

decât malationul, un insecticid folosit în combaterea insectelor de fructe mediteraneeni și a

țânțarilor care transmit virusul West Nile [26]. Expunerea oamenilor și a animalelor la acestea

poate fi prin ingerarea alimentelor care le conțin sau prin absorbția prin piele sau plămâni [25].

Pesticidele organofosfatice se degradează rapid prin hidroliză prin expunerea la lumina

soarelui, aerului și solului, deși cantități mici pot fi detectate în alimente și apă potabilă.

Abilitatea lor de a se degrada sunt o alternativă atrăgătoare in fata pesticidelor organoclorurice,

cum ar fi DDT, aldrin și dieldrin. Cu toate că organofosfații se degradează mai repede decât

organoclorurile, creșterea toxicității acute a pesticidelor organofosfatice are ca rezultat riscul

crescut asociat acestei clase de compuși.

Multi "organofosfați" sunt agenți puternici ai nervilor, care funcționează prin inhibarea acțiunii

acetilcolinesterazei în celulele nervoase. Acestea sunt una dintre cele mai frecvente cauze ale

otrăvirii la nivel mondial și sunt frecvent utilizate în mod intenționat în sinucideri în zonele

agricole. Pesticidele organofosfatice pot fi absorbite prin toate căile, inclusiv prin inhalare,

ingestie și absorbție dermică. Efectele lor inhibitoare asupra enzimei acetilcolinesterazice conduc

la un exces patologic de acetilcolină din organism. Toxicitatea lor nu se limitează la faza acută,

totuși, și efectele cronice au fost de mult observate. Neurotransmițătorii, cum ar fi acetilcolina

(care este afectată de pesticidele organofosfatice) sunt profund importante în dezvoltarea

creierului, iar multi organofosfați au efecte neurotoxice asupra organismelor în curs de

dezvoltare, chiar și datorită nivelurilor scăzute de expunere. Alti organofosfați nu sunt toxici, dar

principalii lor metaboliți, precum oxonii lor, sunt. Tratamentul include atât un liant de

pralidoximă cât și un anticolinergic, cum ar fi atropina.

Chiar și la nivele relativ scăzute, organofosfații pot fi periculoși pentru sănătatea umană.

Pesticidele acționează asupra acetilcolinesterazei [27], o enzimă găsită în substanțele chimice din

creier strâns legate de cele implicate în ADHD [28]. Acestea pot fi absorbite prin plămâni, piele

sau prin consumul de hrană. Potrivit unui raport din 2008 al Departamentului Agriculturii al

SUA, au fost găsite urme detectabile de organofosfati într-un eșantion reprezentativ de produse

testate de agenție, 28% din afinele congelate, 20% telina, 27% boabe verzi, 17% de piersici, 8%

din brocoli și 25% din căpșuni [29].

O dietă ecologică este o modalitate eficientă de a reduce expunerea la pesticidele organofosforice

utilizate în mod obișnuit în producția agricolă. Nivelele metaboliților organofosfatici scad rapid,

iar pentru anumiți metaboliți, devin nedetectabili în urina copiilor atunci când se consumă o dietă

organică [30]. Acest lucru este o speculatie bazata pe un scurt studiu pe 23 de copii, în care doar

câțiva compuși organofosfatici au fost potențial redusi, niciun efect nu a fost demonstrat pentru

majoritatea celor care au fost găsite în eșantioane.

Agenția Internațională pentru Cercetare în domeniul Cancerului (IARC) a constatat că unii

organofosfați pot crește riscul de cancer [31]. Tetraclorvinfosul și parationul au fost clasificati

drept "eventual carcinogeni", în timp ce malationul și diazinonul au fost clasificati ca fiind

probabil carcinogeni pentru oameni[32].

Conform EPA, utilizarea organofosfatului în 2004 reprezenta 40% din totalul produselor

insecticide utilizate în Statele Unite33. Motivele de îngrijorare privind potențiale pericole ale

expunerii organofosfatului la dezvoltarea copilului, EPA a început să elimine treptat formele de

organofosfați utilizați în interior în 2001[33]. Deși este utilizat în silvicultură, pulverizarea în

mediul urban și public (programe de reducere a țânțarilor etc.), populația generală a fost

observată ca având o expunere scăzută[34].

Potrivit organizației nonguvernamentale Pesticide Action Network, parationul este unul dintre

cele mai periculoase pesticide[35]. Numai în SUA, peste 650 de lucrători agricoli au fost otrăviți

din 1966, dintre care 100 au decedat.

În afară de utilizarea agricolă, diazinonul organofosfat a fost interzis în SUA. Mai mult de un

milion de lire sterline au fost folosite în California pentru combaterea dăunătorilor din

agricultură în anul 2000. Zonele și culturile pe care diazinonul se aplică cel mai puternic sunt

controlul structurii dăunătorilor, salata verde, salata verde si prune uscate[36].

În mai 2006, Agenția pentru Protecția Mediului (EPA) a revizuit utilizarea diclorvosului și a

propus vânzarea în continuare, în ciuda preocupărilor legate de siguranța sa și a dovezilor

considerabile care sugerează că este cancerigenă și dăunătoare creierului și sistemului nervos, în

special la copii[37].

O metoda de determinare a fosfatului este electroforeza capilara echipată cu un detector de

fluorescență indusă de laser

Cea mai mare parte a fosfatului organic se găsește în fracția de amilopectină [38]. La nivelul

unității de glucoză, fosforilarea are loc la poziția C6 sau C3 și au fost raportate și urme de D-

glucoză-2-fosfat (Glc-2-P) în amidonul din cartof [39,40]. Conținutul de fosfați din amidon

variază remarcabil în funcție de originea botanică. Dintre amidonurile obișnuite, amidonul din

cartofi prezintă unul dintre cele mai ridicate conținuturi de fosfat (adică până la 0,09%), al doilea

după amidonul din șoarece (Curcumazedoaria) care conține 0,18% fosfat organic [41].

Electroforeza capilară echipată cu un detector de fluorescență indusă de laser a fost utilizată

pentru determinarea fosfatului în amidon. Metoda este simplă și oferă avantaje majore, inclusiv

cost-eficiență, sensibilitate ridicată și este adecvată pentru o determinare a performanței ridicate

a fosfoesterilor C3 și C6 [42].

2. Nitriti. Forme in care se regasesc si metode de analiza.

Azotul este considerat a fi descoperit de Daniel Rutherford în 1772, care l-a numit aer fix.

Azotul este cea mai mare componentă a atmosferei Pământului (78,084% după volum, 75,5%

după greutate) și este obținut pentru scopuri industriale prin distilarea fracțională a aerului

lichefiat sau prin mijloace mecanice (de exemplu, prin membrană de osmoză inversată prin

presiune) [43].

Formele sub care apar compuşii de azot sunt: formele organice (aminele, amidele,

aminoacizii) şi formele anorganice (nitriţi, nitraţi). [44] Nitritii sunt utlizati in industria

alimentara, sol.

Nitriţii în cantităţi mari produc boli pentru om, aceştia combinându-se cu pigmenții din

sânge formând meta-hemoglobina în care oxigenul nu mai este disponibil pentru

tesuturi. Se poate combina, de asemenea, în stomac cu amine și

amide pentru a produce compuși N-nitrozaminici foarte carcinogeni. [45]

Nitriții sunt conservanți importanți în unele produse din carne, aceasta

inhibă creșterea a mai multor bacterii nedorite, cum ar fi Clostridium

Perfringens și Clostridium botulinum. Cu toate acestea, utilizarea de nitriți

pot prezenta unele riscuri pentru sănătate cauzând formarea

nitrozaminele carcinogene din alimente. [46]

Alte surse de poluare cu nitriți sunt industriile textile, metalice, petroliere și farmaceutice.

În ceea ce privește nitrații, cea mai importantă sursă de poluare provine din utilizarea intensivă a

îngrășămintelor în activitățile agricole și în condiții anaerobe care se pot transforma cu ușurință

în nitriți. [47]

Concentraţia maximă admisă de nitriţi în România este de 0,5 mg/L, iar în cazul WHO

(World Health Organization) concentraţia este de 1 mg/L. Nivelul maxim de concentraţie al

nitriţilor în apă (MCL), conform EPA (Agenţia Naţională de Protecţia Mediului) este 1mg/L.

[48]

Concentraţiile de nitriţi din apă se determină prin metode spectrofotometrice (reacţia

Griess), [49,50], electrochimice [51,52], cromatografice [53,54], electroforeza capilară [55,56],

chemiluminescenţă [57,58], spectrofluorimetrice.

Prin metode electrochimice se determina NO2 cu ajutorul electrodului de carbon vitros

(GC) modificat cu: carbon nano-onions bearing electroactive moieties [59]; modified with

composite films made from gold nanoparticles (AuNPs) and a carbosilane-dendrimer

possessing peripheral electronically communicated ferrocenyl units (Dend), cu o limită de

detecţie de 2*10-7M din proba de apă [60]; tionina a fost electro-polimerizată pe suprafața

carbonului sticlos modificat din nanotuburi de carbon (CNT) (GC) pentru fabricarea electrodului

politionină (PTH) /CNT/GC având limita de detecţie de 1.4×10−6 M [61];

alternated layers of iron (III) tetra-(N-methyl-4-pyridyl)-Porphyrin (FeT4MPyP) and copper

tetrasulfonated phthalocyanine (CuTSPc) din probe de mâncare cu o limită de detecţie de

0.1µmol l-1 [62]; acerium dioxide reduced grapheneo oxide din proba de apă cu limită de detecţie

1.4 µM [63]; paladiu (Pd/Grp) pe suport de grafit (Pd/Grp) cu o limită de detecţie de 0.071µM

[64]; palladium nanoparticles (PdNPs) decorated functionalized multiwalled carbon nanotubes

(f-MWCNT) [65]; high surface area nanoporous Cu film (NPCF) has been successfully

synthesized using a hydrogen bubble dynamic template on the graphene nanosheets (GNs) în

probe de apă de rău/robinet cu limită de detecţie 8.8 × 10−8mol L−1[66]; study between cerium,

titanium and selenium dioxide doped reduced graphene oxide cu o limită de detecţie 1.4 din

proba de apă de la robinet. [67]

În cazul electrodului pasta de carbon modificat cu: two different Toluidine Blue (TBO) în

probă de apă cu limită de detecţie 1.6 µM [68]; an aminophenol-formaldehyde

polymer/phosphomolybdic acid nanocomposite are limită de detecţie 9.8 μM [69];

CuII-(N, N'-bis (2,5-dihydroxybenzylidene)-1,2-diaminoethane) (CuII-DHB) aş a new

synthesized copper Schiff base complex cu limită de detecţie 1.5nM [70]; cu complexe de cupru

(II) formate cu acizi humici comerciali (PFHA) și algerieni (YHA) și compuși modificați cu

etilendiamină (EDA) sau trietilentetramină (TETA) cu limită de detecţie 1.46 μmolL-1din proba

de apă [71]; cu polivinilimidazol (PVI) cu limită de detecţie 9*10-8 molL-1 din proba de carne

[72]; Ru (III) utilizând electrodul CPE/Ru (III) -BSAP-PLA având limita de detecţie 1.39×10-

6molL -1[73]; cu magnetite nanospheres as nanostructured materials and a newly synthesized

cobalt (II)-Schiff base complex cu limită de detecţie de 1.5×10−2µmolL−1 în probe de apă [74].

3. Determinarea melatoninei și a bisfenolului A prin metode optice

3.1. Introducere

Din punct de vedere chimic melatonina este o N-[2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)etil] acetamida

utilizată clinic în tratamentul cancerului, tulburării imune, bolilor cardiovasculare, depresiei și

disfuncției sexuale. Melatonina (N-acetil-metoxitriptamina) este un hormon natural secretat în

principal de glanda pineală în timpul fazei întunecate a ciclului lumină-întuneric. Odată eliberată,

melatonina poate acționa asupra diferitor organe prin receptorii specifici și direct pe hipotalamus,

influențând ritmurile "circadiane". Din acest motiv, melatonina este considerată a fi potențial

utilă în tratarea diferitelor forme de insomnie și tulburări de somn. Melatonina acționează ca un

puternic antioxidant și ca agent de captare a radicalilor liberi de hidroxil, radicali peroxil și

anioni de superoxid [75].

Fig 1: Structura chimică a melatoninei.

Rata de biosinteză a melatoninei la plantele superioare, similar mamiferelor, urmărește o

fluctuație ritmică zilnică și sezonieră, cu un maxim nocturn, fiind implicată în semnalizarea și

înflorirea fotoperiodică. Activitatea sa antioxidantă protejează diferite țesuturi vegetale și organe,

țesuturi reproductive în special, fructe și țesuturile embrionare ale semințelor, de stres oxidativ

din cauza tensiunilor abiotice și de mediu, cum ar fi seceta, caldura, frigul, lumina ultravioletă și

ozonul. Alte funcții biologice ale melatoninei în plante includ activitatea antiapoptotică [76].

Deoarece melatonina este, de asemenea, ingerată în alimente cum ar fi legumele, fructele, orezul,

grâul și medicamentele pe bază de plante, din punct de vedere nutrițional, melatonina poate fi, de

asemenea, clasificată ca o vitamină. Inițial melatonina a evoluat ca un antioxidant, devenind o

vitamină în lanțul alimentar, iar în organismele multicelulare, unde a fost produsă, a obținut

proprietăți autocoide, paracoide și hormonale [77].

Bisfenolul A (2,2-bis (4-hidroxifenil) propan, BPA) este o substanță chimică industrială

importantă datorită utilizării sale largi ca intermediar în fabricarea materialelor plastice din

policarbonat, rășinilor epoxidice, substanțelor ignifuge, rășinilor poliesterice nesaturate,

poliacrilat, și rășinilor polisulfonice. BPA poate fi eliberat în mediul înconjurător dintr-o mare

varietate de materiale care intră în contact cu alimentele, cum ar fi sticle, ambalaje, locuri

amenjate pentru depozitarea deseurilor, hârtie și plante artificiale. BPA implică, în principal,

riscul potențial de sănătate umană datorat activităților sale estrogenice, care pot interfera cu

activitățile hormonale și, prin urmare, a fost identificat ca fiind un compus important care

distruge sistemul endocrin. S-a constatat că BPA poate provoca diverse tipuri de cancer, acțiuni

pleiotropice în creier și în sistemul cardiovascular [78].

Fig 2: Structura chimică a Bisfenolului A (BPA)

Studiile efectuate asupra bisfenolului A au arătat potențialele efecte negative asupra funcției

de reproducere a animalelor sălbatice și a omului prin afectarea funcției endocrine și poate

împiedica creșterea și dezvoltarea prin interferarea cu producerea, eliberarea, transportul,

metabolismul, legarea și reglarea proceselor de dezvoltare [79].

Conform studiilor de laborator BPA este un compus care distruge sistemul endocrin, datorită

faptului că se leagă de receptorii estrogeni. Deși s-a descoperit că BPA are o afinitate mai

scăzută față de receptorii estrogenici nucleari în raport cu beta estradiolul (E2), influența sa

estrogenică este egală cu E2 pentru răspunsurile mediate de receptorii estrogeni fară nucleu. BPA

poate acționa ca un antiestrogen, blocând răspunsul estrogen prin competiție cu acțiunea endogen

abeta estradiolul (E2). BPA este detectabil în urina majorității adulților și copiilor testați, precum

și în serul femeilor însărcinate, laptele matern, lichidul folicular și amniotic, sângele din cordonul

ombilical și țesutul placentar și ficatul uman, ceea ce indică faptul că expunerea la BPA este

prevalentă în uter la dezvoltarea fetușilor. Din cauza acestei expuneri pe scară largă și zilnică,

este esențial să se determine dacă BPA provoacă efecte negative asupra sănătății omului [80].

3.2. Metode optice

3.2.1. Metode de determinare a melatoninei

Melatonina în probele biologice poate fi detectată prin mai multe metode, cum ar fi

HPLC, UV, fluorimetrie și RIA. Au fost utilizate câteva metode de chemiluminiscentă pentru

determinarea melatoninei și a derivaților acesteia, cum ar fi HPLC UV, fluorimetrie și RIA.

Unele metode chemiluminescente au fost utilizate pentru determinarea melatoninei și a

derivaților săi. Comportamentul chemiluminiscent al melatoninei și a derivaților săi în mediu

acid permanganat-formaldehidic a fost investigat în detaliu și relația dintre caracteristicile

structurale ale acestor compuși și comportamentul lor chemiluminescent a fost de asemenea

investigată prin spectrometrie UV, FL și CL [81].

Fig. 3 Spectrul fluorescent al melatoninei. Fig. 4 Spectrul UV al melatoninei. a [MT]=1.0×10–4 mol l–1, a [MT]=1.0×10–4 mol l–1, H2SO4=1 mol l–1; 1 mol l–1 H2SO4; b [KMnO4]=6×10–4 mol l–1, b [MT]=1.0×10–4 mol l–1, H2SO4=1 mol l–1, 30% formaldehidă, [MT]= 1.0×10–4 mol l–1, 30% formaldehidă, [KMnO4]=6×10–4 mol l–1; 1 mol l–1 H2SO4; c [KMnO4]=1.2×10–3 mol l–1, c [MT]=1.0×10–4 mol l–1, H2SO4=mol l–1, 30% formaldehidă, [MT]=1.0×10–4 mol l–1, 30% formaldehidă, [KMnO4]=1.2×10–3 mol l–1 1 mol l–1H2SO4

Tabelul 2 Spectrul fluorescent și UV al melatoninei în KMnO4-MT și formaldehidă, MT-H2SO4.

Substanță Fluorescent

Spectrum

UV spectrum

Melatonin 225-281nm

KMnO4-MT

Formaldehyde

640 nm 305 nm

MT-H2SO4 345 nm

KMnO4-MT Formaldehyde 410 nm

3.2.2. Determinarea bisfenolului A

Tehnicile analitice clasice sunt utilizate în prezent pentru a determina BPA, inclusiv

fluorescență, cromatografie lichidă cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS), cromatografie în

fază gazoasă cuplată cu spectrometrie de masă de masă (GC-MS), teste de imunoabsorbție legată

de enzime (ELISA) și senzori electrochimici. Chemiluminiscența (CL) ar trebui să fie o tehnică

promițătoare, cu avantajul fiabilității, răspunsului rapid, instrumentului ieftin, costului redus,

operării simple și a sensibilității ridicate. Este raportat faptul că bicarbonatul poate reacționa cu

peroxidul de hidrogen (H2O2) pentru a forma peroximonocarbonat instabil (HCO4 -) și a fost

observat un semnal chemiluminiscent foarte slab în timpul descompunerii (HCO4-). Semnalele

chemiluminiscente generate de HCO4 - sunt prea slabe pentru a fi detectate prin tehnicile directe

de chemiluminiscentă. Prin urmare, este necesară utilizarea unor reactivi sau catalizatori de

amplificare a semnalului chemiluminiscent, cum ar fi clorura de aur (AuCl4-), pentru a spori

considerabil emisia chemiluniscenței generată prin descompunerea HCO4 -, iar BPA poate inhiba

foarte mult intensitatea semnalului chemiluminiscent a sistemului AuCl4-HCO4 -.

Fig 6: Inhibiția chemiluminiscenta a sistemului Fig. 7. Spectrul de emisie al BPA, AuCl4 −–HCO4 − prin adăugarea diferitor concentrații BPA–HAuCl4, BPA–HCO4−, de BPA. Curba de calibrare pentru detectarea de BPA BPA–AuCl4−–HCO4−, respectiv, Y = 17.069 ln(X) + 22.665 (R = 0.9958), unde Y racordat la £ex= 278 nm. Condiții: este intensitatea CL relativă (ΔI = I0 − I) și X este 5 µM BPA, 80 µM HAuCl4, concentrația of BPA (Fig. 6). Limita de detecție 0.008 M H2O2 și 0.3 M NaHCO3. (S/N = 3) a fost 0.08 µM BPA. Deviația standard relativă pentru 12 măsurători repetate de 1.0 µM BPA a fost 2.9%.

Spectrele de fluorescență soluției BPA au fost prezentate în Fig. 7. Prin adăugarea

HAuCl4, HCO4- sau AuCl4-HCO4 -, intensitatea fluorescenței la 307 nm a scăzut. Este de

remarcat faptul că, scăderea intensității fluorescenței în prezența HCO4 - era aproape aceeași ca și

în cazul sistemului AuCl4 -HCO4 -. Aceste rezultate au demonstrat că descompunerea

intermediarului (CO3 • - și HO •) de HCO4 - au contribuit în principal la degradarea BPA [78].

3.3. Concluzii

O serie de studii controlate au implicat melatonina în diverse funcții fiziologice variind

de la îmbătrânire la agresiune, acțiunea sa neutralizantă asupra radicalilor liberi, somnului,

stresului, și chiar la mai multe tulburări fiziopatologice precum imunodepresie si cancer. Studiile

cu privire la diferite populații umane au arătat în mod clar că abilitatea endogenă a biosintezei

melatoninei scade treptat odată cu înaintarea în vârstă, și care oferă o explicație pentru

sensibilitatea crescută la boli la persoanele vârstnice.

Evident, luând în considerare multiplele sale acțiuni în organism, melatonina pare a fi o

moleculă cronobiotică puternică în îngrijirea sănătății umane și vindecarea mai multor boli.

Eficacitatea și siguranța acesteia pot conduce în cele din urmă la utilizarea sa în aplicații clinice

universale eficiente, fiind o terapie auxiliară în tratamentul ulterior al diferitelor boli

reprezentând o moleculă de susținere care să acționeze împreună cu alte medicamente [82].

A fost înregistrată o creștere rapidă a numărului de studii evaluate de experți care au

corelat în ultimii câțiva ani expunerea BPA la 16 efecte negative asupra sănătății. Potrivit

studiilor, expunerea la BPA poate avea implicații semnificative asupra sănătății umane și a

fertilității, în special în perioada sensibilă a populației. Autoritățile de reglementare din guvern

au început să ia masuri de precauție - Administrația pentru Alimentație și Medicamente a numit

BPA un "produs chimic de importanță", iar recent în (iulie 2012) au interzis utilizarea acestuia în

sticle pentru bebeluși și căni cu cioc(sippy), cu toate acestea, marja de siguranță nu a fost redusă

sub 50 μg / kg / zi. Literatura actuală indică faptul că BPA în mediul înconjurător poate

reprezenta un risc pentru sănătatea oamenilor. În plus, s-a recomandat ca regulamentul BPA să

fie revizuit pentru a proteja sănătatea umană [80].

4. Aminoacizi. Caracterizare si metode de determinare.

Aminoacizii (SAA) sunt blocuri esențiale ale moleculelor biologice și joacă un rol cheie

în multe mecanisme de răspuns neurochimice, cum ar fi memoria, controlul apetitului.

Determinarea exactă a aminoacizilor poate îmbunătăți înțelegerea rolului său biologic și de a

facilita tratarea bolilor cauzate de perturbarea acestuia [83]. Aminoacizii, care sunt unitățile de

bază ale peptidelor și proteinelor sunt constituenți vitale ale biosintezei proteinelor în organism.

Pe baza producției acestor substanțe în corpul nostru, aminoacizii pot fi împărțiti în: esențiali, nu

au fost produşi în corpul nostru și neesențiali produşi în corpul nostru [84]. Aminoacizii joacă un

rol esenţial ca intermediari în metabolismul organismului, astfel dezvoltarea unor noi metode

eficiente pentru determinarea lor cantitativă sensibilă este de mare interes și importanță. Ele sunt,

de asemenea, cunoscute sub numele de surse de energie, cum ar fi grăsimi și carbohidrați. Cu

toate acestea, aminoacizii conțin în structură azot (N), în timp ce carbohidrați și grăsimile nu.

Astfel, aminoacizii sunt singurele specii care intră în compoziţia țesuturilor, mușchilor,

organelor, părului și pielii.

În eucariote, există doar 21 de aminoacizi proteinogenici, cei 20 din codul genetic

standard, plus selenocisteina. Oamenii pot sintetiza 12 dintre acestea. Celelalte nouă trebuie să

fie consumate (de obicei, ca și derivații lor de proteine) și astfel ei sunt numiţi aminoacizi

esențiali. Aminoacizii esențiali sunt histidină, izoleucină, leucină, lizină, metionină, fenilalanină,

treonină, triptofan și valină. Există mai mult de 200 de aminoacizi diferiți, cei mai cunoscuţi sunt

așa numiţi aminoacizi proteinogenici, dintre care am ales arginina (semiesențial), alanina

(neesențial) și cisteina (semiesențial) [85,86]. In 1806 Vauquelin și Robiquet a izolat primul

aminoacid ca o substanță din Asparagus sativus, care au numit asparagina. Câțiva ani mai târziu

Braconnot a descoperit glicinadintr-un hidrolizat de acid din gelatină. Treonina a fost descrisă de

Rose și colab. ca ingredient esențial alimentar în 1935 și selenocisteine și pirolizina, ultimele

două din cele 22 de aminoacizi proteinogenici, au fost raportate în 1986 și respectiv 2002, acidul

aspartanic, acidul glutamic, selenocisteina sunt aminoacizi neesențiali, și glutamina, prolina,

serina, tirozina, asparagina, sunt aminoacizi semiesențiali. Pirolizina este considerată „a 22-

aminoacid“, nu este utilizat de oameni [87,88].

Tirozina (Tir), un constituent esențial al proteinelor este indispensabilă în nutriția umană

pentru stabilirea și menținerea unui echilibru pozitiv de azot. Tirozina este precursorul

dopaminei și epinefrina și este obținut în principal din fenilalanina. hormoni vitale, cum ar fi

tiroida, noradrenalina, epinefrina si dopamina sunt convertite din L-dopa, care este derivat din

tirozina. Absența Tir ar putea provoca hipocondria, depresie şi alte boli psihice [89]. O deficiență

de Tir poate conduce la boli, cum ar fi albinism, ipohondria, sau depresia. Cu toate acestea, o

concentrație mare de Tir de multe ori poate induce hipertiroidism. Prin urmare, este substanțială

pentru a detecta concentrația Tir, în diferite fluide biologice. Tir este abia prezent în legume, prin

urmare, de multe ori este adăugat în produsele dietetice și alimentare de asemenea în formulările

farmaceutice. Epuizarea la nivel Tir ar putea duce la albinism, alkaptonuria, precum depresia și

alte tulburări psihologice, în timp ce excesul de Tir promovează boala Parkinson și crește șansele

de schimburi de cromatide surori. Astfel, este evident că Tir este de mare importanță în domeniul

farmacologiei, subliniind astfel necesitatea de a monitoriza pentru a asigura un stil de viață

sănătos și de boală [90, 91].

Triptofan (TRP) este unul dintre aminoacizii care are o structură de bază pentru proteine.

Aceasta se numește aminoacid „esențial“, deși; organismul nu îl poate produce și trebuie să fie

obținut din surse externă. Triptofanul pot fi găsit în multe proteine vegetale şi animale. Este

necesar pentru creșterea normală la sugari și pentru echilibrul de azot la adulți. Organismul

foloseşte triptofan pentru a-l ajuta să producă niacină si serotonină. Serotonina produce somnul

sănătos şi o stare de spirit stabilă. L-triptofan este utilizat pentru insomnie, apnee de somn,

depresie, anxietate, durere facială, o forma severă de sindrom premenstrual numit tulburare

dysphonic premenstruală (PMDD) [92].

L-metionina (2-amino-4- (metiltio) butanoic) este un aminoacid esențial ce conține sulf

furnizat cu produsele alimentare. Consumul intensiv de metionină este urmat de o creștere

lineară a concentrației de metionină în plasmă. Aminoacidul L-metionină este ușor oxidat la

sulfoxid de metionină, iar reducerea acesteia este catalizată de o familie de enzime numite

reductaze metionină sulfoxid (MSRS). Ciclul de oxidare-reducere a MSRS a fost postulat de a

acționa ca un sistem antioxidant catalitic, protejează celulele de la daune oxidative. Sistemul

MSRA ar putea avea succes în prevenirea sau întârzierea bolii Parkinson. Datorită importanței

clinice a Lmetioninei, a fost determinată folosind o varietate de metode analitice cantitative [93].

Fenilalanina (Phe) este un aminoacid nepolar esențial și prezintă caracteristici hidrofobe

datorită grupărilor sale aromatice. Este, de asemenea, precursor metabolic al aminoacizilor

neesențiali, tirozina și derivații. Acesta este utilizat în industria farmaceutică, pentru a fabrica

unele antibiotice, cum ar fi bacitracină, gramicin, tirocidin și în industria alimentară utilizat ca

îndulcitor, aspartam. Acesta este convertit la tirozină (Tir) în prezența enzimei hidroxilaza

fenilalanina (HAP).

Tirozina este precursorul neurotransmiţătorilor monoaminici, cum ar fi dopamina,

epinefrina si norepinefrina, care sunt asociate cu depresia și lipsa de motivație. De aceea Phe este

important să se mențină nivelului adecvat de neurotransmițători monoaminici în creier. Când L-

fenilalanină traversează în creier, în prezența HAP, acesta este convertit la L-tirozină și apoi la

L-dopa, care este convertit mai departe în cele trei neurotransmițătorii menționaţi mai sus.

Adrenalina și noradrenalina sunt sintetizate de dopamină, care este ea însăși făcută din

aminoacidul fenilalanina via tirozina. Este bine cunoscut faptul că Phe are un rol semnificativ în

starea de spirit, depresie și anxietate. Deci, în cazul în care medicamentele care blochează

descompunerea acestor neurotransmițători ridică starea de spirit, memoria și apoi ar putea lucra

mări concentraţia aminoacidului fenilalanina sau tirozină [94].

Arginina este unul dintre aminoacizii indispensabili pentru corpul în stare de stres.

Funcţional, aceasta afectează metabolismul proteinelor și a fost implicat în sinteza proteinelor

[85].

Alanina joacă un rol semnificativ în ciclul de glucoză-alanină în țesuturi și ficat. Ciclul

de glucoză-alanină elimină piruvatul și glutamatul din mușchi la ficat [85].

Există multe rapoarte pentru determinarea individuală și simultană a TRP în literatură,

folosind diferite metode analitice cum ar fi spectrofotometria, spectrometrie de masa,

fluorometria, electroforeză capilară, chemiluminiscență, cromatografia și senzori electrochimici

[95-108].

Dintre aceste metode, metode electroanalitice au atras mai multă atenție, deoarece acestea

sunt simple, sensibile, precise și instrumentele au un cost redus. Prezența unor concentrații

relativ scăzute de aminoacizi în probele de micro-dializă necesită o metodă analitică sensibilă

pentru determinarea lor. Micro dializa este o tehnică puternică care permite determinarea

concentrației extracelulare a neurotransmițătorilor de aminoacizi în timpul diferitelor manipulări

farmacologice sau fiziologică. Detectorul amperometric combinat cu FIA prezintă multe

avantaje, cum ar fi o sensibilitate ridicată, răspuns rapid și simplitate în procedura de operare, și

o mare atenție a fost acordată dezvoltării de detecție electrochimică a aminoacizilor. Cu toate

acestea, mulți aminoacizi sunt non electoactivi cu electrozii de carbon convenționali. Electrozii

cu metal nobil prezintă un grad mai mare de activitate față de oxidarea aminoacizi, dar suprafeța

lor se murdăreşte rapide. Metoda alternativă este utilizarea de metal de tranziție ne-nobil, cum ar

fi nichel și cupru, electrozi modificați chimic pot mediaza transferul de electroni rapid între

aminoacizi si substractul electrodului si poate reduce murdărirea suprafeței. Aceste matrice cu

nanoparticule de cupru nemodificate și oxid de zinc nanorod, aliaj de cupru-mangan, Cu2V2O7,

aliaj de nichel-cupru, nanoflakes hidroxid de nichel, cupru microparticulei, Cu2O, cobalt și

cadmiu dopat hidroxid de nichel, andnickel-curcumina complex. În plus, nanotuburile de carbon

(CNT) au proprietăți electrocatalitice bune. Fierul este, de asemenea, un element de tranziție, ar

trebui să aibă proprietăți similare cu nichel și cupru. Nanoparticulele de fier sunt centre

complexe, cum ar fi Cu NPs AA, în timp ce MWCNTs pot dispersa nanoparticule de fier pentru

a evita reunirea transferului electronilor de la electrodul AA. Stratul depus pe suprafaţa

electrodului pentru detectare este convenabil pentru repetabilitatea electrodului. Astfel, Fe NPS

și MWCNTs au fost utilizate pentru a fabrica un sensor pentru detecţia AAs. Comportamentul

electrochimic al Fe NPs / electrod MWCNTs și oxidarea complexului AA cu Fe NPs au fost

investigate prin metode electrochimie. Mai mult, electrodul combinat cu metoda și separarea

tehnologiei FIA a fost propusă pentru determinarea cu un răspuns rapid AA, stabilitate bună și

sensibilitate [83]. Electrozii, cum ar fi platină și aur sunt utilizaţi în general în detecția

electrochimică. Cu toate acestea, acești electrozi pot fi solubilizaţi cu faza mobilă și își pierd

activitatea catalitică datorită speciilor de adsorbție de pe suprafață. În mod alternativ, electrozii

modificați chimic (CEM-uri) au apărut pentru a depăși aceste neajunsuri. În general CME, au o

suprafață mai mare, sensibilitate, selectivitate ridicate și cel mai important de stabilitate în

comparație cu electrozii metalici convenționali, atunci când este vorba de analiza aminoacizilor

HPAEC în mediu alcalin. Metalele tranziționale nenobile și oxizii lor, cum ar fi cobalt, fier,

cupru și nichel au atras un interes considerabil ca materiale modificatoare, ca urmare a

proprietăților lor electrocatalitice în mediu alcalin în raport cu aminoacizii oxidării acizilor.

Dintre diversele materiale utilizate în modificarea electrozilor, grafenele a dus la o atenție mai

largă datorită proprietăților sale optice, chimice și electronice, în plus față de o gamă largă de

aplicații în nanomateriale, nanotehnologie și senzori electrochimici. Grafena este în esență un

monostrat bidimensional de atomi de carbon într-un fagure atent ambalate. Este dotat cu multe

avantaje, inclusiv proprietăți excepționale termice și mecanice, conductivitate electrică excelent,

rapid capacitatea de transport de electroni și o suprafață mare, care permite imobilizarea unor

cantități mari de substanțe și nanoparticule. Mai mult decât atât, nanoparticule metalice și oxizii

acestora au fost studiate dat proprietăți fizice, cum ar fi transportul de masă mai bun, cataliză,

suprafață mare și controlul efectiv al micromediul electrodului comparativ cu electrozi metalici

în vrac lor chimice. În virtutea proprietăților lor unice, grafenele si nanoparticule de metale

tranziționale nenobile au fost considerat noi materiale atractive pentru dezvoltarea unor senzori

electrochimici cu scopul de detecție de aminoacizi. Până în prezent, mai multe tipuri de materiale

funcționale, cum ar fi nanoparticule de cobalt (CoNPs), CoNPs în oxid de grafen (GO) și

nanoparticule de fier pe GO au fost aplicate pentru determinarea aminoacizilor, nanoparticulele

de nichel combinate cu electrozi modificați cu oxid de grafenă redusă poate spori detectarea

aminoacizilor în timp ce contribuie la îmbunătățirea cunoștințelor noastre despre acest subiect în

domeniul senzorilor și detectori [108].

Pentru a determina aminoacizi sunt folosite probele de urină, sânge uman, probă de ser,

fluid microdializă din porcuşor de guineea, hipotalamus, albuș de ou, pui, trestia de zahăr vinasă

obținut dintr-un zahăr și etanol, lapte, probe farmaceutice.

5. Vitamine. Caracterizare si metode de determinare.

Analiza alimentelor reprezintă un domeniu important de cercetare în chimie, în principal

datorită apariției continuă de noi alimente, suplimente, etc. Unele dintre principalele componente

benefice pe care consumatorii le caută în produse alimentare sunt vitaminele si antioxidanti.

[109].

Vitaminele sunt una dintre cele mai importante micronutrienţi cu roluri critice în timpul

mai multor procese biologice, inclusiv angiogeneza, în multe reacţii biochimice în interiorul

celulelor şi care afectează diferite funcții celulare [110] și joacă un rol semnificativ în funcțiile

de bază ale corpului uman, cum ar fi imunitatea, metabolismul și digestia [111]. Vitamina este un

nutrient care nu furnizează energie organismului, dar este un nutrient esențial. Este necesară

pentru creșterea organismului și, de asemenea, este asociată cu funcția enzimatică în organism

[112].

Produsele farmaceutice care conțin vitaminele solubile în apă sunt utilizate în mod

normal ca un supliment alimentar pentru a compensa deficienta. Concentraţiile de vitamine în

corpul uman pot fi identificate prin analizele de rutină/regulate ale probelor de sânge [113].

Vitaminele se împart în două categorii: vitamine liposolubile și vitamine solubile în apă.

Vitamine liposolubile - vitaminele A, D, E și K - se dizolvă în grăsimi înainte ca acestea să fiu

absorbite în fluxul sanguin pentru a-și îndeplini funcțiile lor. Excesele acestor vitamine sunt

stocate în ficat, și nu sunt necesare în fiecare zi, în dietă [114]. vitamine solubile în apă, B2, B6

și C sunt esențiale pentru organismul uman pentru sănătate, nutriție și creștere normală.

Deoarece aceste molecule active biochimice nu pot fi sintetizate de către organismul uman, sunt

necesare în dietă cantități mici. În contrast, vitaminele solubile în apă, se dizolvă în apă și nu sunt

stocate de către organism. Din moment ce acestea sunt eliminate prin urină, avem nevoie de o

aprovizionare continuă, zilnică, în dieta noastră. Vitaminele solubile în apă sunt ușor distruse sau

se pierd: prin spălare, în timpul depozitării alimentelor sau în urma procesului de preparare.

Depozitarea corespunzătoare și prepararea hranei poate minimiza pierderea vitaminelor [115-

116].

Unul dintre cele patru vitamine liposolubile, vitamina A sau retinol aparține unui grup

numit retinoizi. Există diferite forme de vitamina A, cum ar fi retinol, acid retinoic și a- și b-

carotene. Vitamin A (retinol) este un nutrient esențial necesar în cantități mici, pentru

funcționarea normală a sistemului vizual; crestere si dezvoltare și menținerea integrității celulare

epiteliale, funcţia imunitară si reproducere. Aceste nevoi dietetice pentru vitamina A sunt

prevăzute în mod normal pentru preformaţa retinolului (în principal, ca ester retinil) și

carotenoide provitamina A. Aproximativ 90% din vitamina A este absorbită din produsele care

conţin o conţin, în timp ce eficiența de absorbție a provitamina A carotenoizi variază foarte mult,

în funcție de tipul de sursă vegetală și conținutul de grăsime. Acolo unde este posibil, un aport

crescut de grăsimi alimentare este de natură să îmbunătățească absorbția vitaminei A în

organism. Preformaţa vitaminei A se găseşte aproape exclusiv în produsele de origine animală,

cum ar fi laptele uman, ficat și uleiurile din ficat de pește (în special), gălbenuș de ou, lapte

integral și alte produse lactate. Vitamina A este, de asemenea, utilizată pentru a fortifica

produsele alimentare prelucrate, care pot include zahăr, cereale, condimente, grăsimi și uleiuri.

carotenoide provitamina A se găseşte în legumele cu frunze verzi (de exemplu, spanac, amarant,

și frunzele tinere din diverse surse), legume galbene (de exemplu, dovleci suc de fructe și

morcovi), si fructe galben și portocaliu (de exemplu, mango, caise, și papaia). Uleiul de palmier

Red produs în mai multe țări din întreaga lume este deosebit de bogat în provitamina A [110,

117].

Opt dintre vitaminele solubile în apă sunt cunoscute ca grupul complex de vitamina B:

tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), niacina (vitamina B3), vitamina B6

(piridoxină), acid folic (acid folic), vitamina B12, biotină și acid pantotenic. Vitaminele B se

regăsesc în produsele alimentare, iar influența lor se face simțită în multe părți ale corpului.

Acestea funcționează ca coenzime care ajuta organismul să obtină energie din alimente.

Vitaminele B sunt de asemenea importante pentru pofta de mâncare normală, o vedere bună si o

piele sanatoasă, pentru sistemul nervos și formarea de celule roșii din sânge [114].

Vitamina C este utilizată pentru a preveni niveluri scăzute de vitamina C, în corpul

uman, care nu primesc suficiente vitamine din dieta lor. Cei mai mulți oameni care mănâncă un

regim alimentar normal nu au nevoie de suplimentare de vitamina C. Nivelurile scăzute de

aceasta poate duce la o afecțiune numită scorbut. Scorbutul poate provoca simptome, cum ar fi

slăbiciune musculară, erupții cutanate, dureri articulare, oboseală sau pierderea dinților. Vitamina

C este un important antioxidant, împreună cu vitamina E, beta-caroten și multe alte elemente

nutritive pe bază de plante. Antioxidanţii blochează o parte din daunele cauzate de radicalii

liberi, substanţe care distrug ADN-ul. Consumând alimente bogate în vitamine C este cea mai

bună metodă pentru a asigura un aport adecvat de această vitamină. În timp ce multe alimente

contin vitamina C, cele mai bune surse sunt fructele citrice. De exemplu, o portocală, un fruct de

kiwi, 6 oz sau suc de grapefruit sau 1/3 cană de ardei roșu tocat furnizează organismului doză

recomandată de vitamina C, timp de o zi. Doza zilnică recomandată (DZR) pentru vitamina C

este de 90 mg / zi pentru bărbați adulți și 75 mg / zi pentru femei adulte. Pentru cei care fumează,

DZR-ul, pentru vitamina C crește cu 35 mg / zi, pentru a contracara efectele oxidative ale

nicotinei. Deși rare în Statele Unite, deficit sever de vitamina C poate duce la boala cunoscuta

sub numele de scorbut, provocând o pierdere de putere de colagen pe tot corpul. Pierderea de

colagen este o consecinţă datorită pierderii dinților, sângerării și gingiile umflate și vindecarea

necorespunzătoare a rănilor. Mai frecvent, deficitul de vitamina C, se prezintă ca o deficienţă

secundară la alcoolici, persoanele în vârstă, și la fumători. În ciuda faptului că este o vitamină

solubilă în apă care corpul excretă excesul de vitaminăs, supradozele de vitamina C s-au dovedit

a provoca pietre la rinichi, guta, diaree și scorbut [114, 118].

Vitamina D se prezintă sub două forme: vitamina D2 şi vitamina D3, ambele sunt rareori

găsite în produsele alimentare. Ele provin din diferite surse; vit. D2 (ergocalciferol) este

sintetizată din ergosterol de drojdie, în timp ce vit. D3 (colecalciferol) este produs din 7-

dehidrocolesterolului (7-DHC) din lanolină. Vitamina D, identificată ca un hormon pentru a

menţine homeostazia calciului din sâng și de a promova mineralizarea scheletului, a demonstrat

că exercită funcții suplimentare, inclusiv anti-proliferativ, pro-diferențiere, pro-apoptotice, anti-

angiogeneza şi caracteristicile anti-invazive în celula canceroasă pe parcursul ultimelor două

decenii. Aceste activități antitumorale au condus la mai multe studii clinice. Datele

epidemiologice au indicat că scăderile concentrațiilor de vitamina D au fost asociate cu un risc

crescut de diferite tipuri de cancer ca colorectal, de sân şi cancerul de prostată. S-a sugerat că

nivelurile scăzute de vitamina D poate fi un factor de risc pentru carcinomul hepatocelular [119-

121].

Vitamina E este principalul antioxidant liposolubil în sistemul antioxidant celular de

apărare și este obținută exclusiv din dietă. Termenul „vitamina E“ se referă la o familie de opt

omologi în mod natural care sunt sintetizate de către plante din acid homogentisic. Absorbția

vitaminei E din intestin depinde de funcția pancreatică, secreția biliară. Condițiile de absorbție

sunt ca cele pentru lipidelor dietetice, adică, emulsificare eficientă, solubilizări mixte în cadrul

sărurilor biliare ce formează micelele, absorbția de enterocite și secreția în circulație prin

intermediul sistemului limfatic. Problemele musculare şi neurologice sunt, de asemenea, o

consecință a deficitului de vitamina E, din corpul uman. Deficienţele vitaminei E pentru oameni

este dată de semnele clinice foarte rar apărute, deoarece acestea se dezvoltă de obicei numai la

sugari și adulți cu sindromuri de grăsime-malabsorbtie sau boli hepatice, la persoanele cu

anomalii genetice în transportul sau legarea de proteine și, eventual, la copiii prematuri. Acest

lucru sugerează că dietele conţin suficientă vitamină E pentru a satisface nevoile nutriționale.

Analiza bilanțurile alimentare FAO a țărilor indică faptul că aproximativ jumătate din α-

tocoferol într-o dietă tipică nord europeană, cum ar fi în Regatul Unit, este derivat din uleiuri

vegetale. Grăsimi animale, legume și carne contribuie fiecare la aproximativ 10% din DZR și

fructele, nucile, cerealele și produsele lactate contribuie, fiecare, cu aproximativ 4% din DZR.

Ouăle, peștele și legumele uscate contribuie cu mai puțin de 2% fiecare din DZR [117].

Vitamina K (VK) este o vitamină liposolubilă care reglează producția de factor de

coagulare, acţionând ca coenzimă pentru un carboxilază-dependent VK care catalizează

carboxilarea resturilor de acid glutamic în acid γ-carboxiglutamic. VK pot fi împărțite în 2 grupe:

1) produsă în mod natural VK1 (fitonadiona) și VK2 (menachinonă) și 2) sintetizată chimic VK3

(menadiona). VK3 și derivații săi demonstrează efecte anti-proliferative împotriva liniilor

celulare tumorale in vitro. Vitamina K acționează ca o coenzimă în sinteza formei active biologic

a unui număr de proteine care sunt implicate în coagularea sângelui și metabolismul osos. Rolul

biologic al vitaminei K este de a acționa ca un cofactor pentru o reacție specifică carboxilării

care transformă reziduurile de glutamat selectiv (Glu) la resturile g-carboxiglutamat (Gla).

Vitamina K este metabolizat în ficat și excretat în urină și bilă. Sindromul deficienței este

cunoscut în mod traditional ca boala hemoragică a nou-născutului. Mai recent, pentru a oferi o

mai bună definire a cauzei, a fost numit sângerare datorită deficitului de vitamina K (VKDB-

vitamin K deficiency bleeding). În general, valorile relative în legumele confirmă asocierea

cunoscută a filochinona cu țesuturile fotosintetice, cu cele mai mari valori (în mod normal, în

intervalul 400-700mg / 100g) regăsindu-se în legume cu frunze verzi. Cele mai bune surse sunt

anumite uleiuri vegetale (de exemplu, soia, rapiță și de măsline), care conțin 50-200mg / 100g;

alte uleiuri vegetale, cum ar fi arahide, porumb, floarea-soarelui și de șofran, conțin cantități mult

mai mici de filochinona (1-10mg / 100g) [117, 119].

Unele vitamine (vitamina C, riboflavină, vitamina B1 si vitamina B2) pot fi analizate

direct prin detecție fluorometrică folosind HPLC. Metodele directe sunt robuste, precise și

permite determinarea vitaminei specifice. Numeroase metode HPLC au fost dezvoltate pentru

determinarea vitaminelor în probe biologice (urina, plasmă, sânge), produse alimentare, [109,

122-125]. Recent, multe metode au fost utilizate pentru a detecta în mod individual vitamina B2,

vitamina C și vitamina B9, cum ar fi spectroscopie de fluorescenţă, spectrofotometrie, metode

electrochimice și chemoluminiscență din probe farmaceutice, tesuturi animale, produse

alimentare sau sucuri [126-132].

Comparativ cu alte tehnici, metoda electrochimică are avantajele simplității, ușurinţa de

miniaturizare [126]. Dintre aceste metode, metoda electrochimică a primit tot mai mare atenție

datorită costului redus și datorită analizei şi fezabilăţii. Utilizarea electrozilor modificați chimic

asigură un instrument pentru îmbunătățirea performanței electrozilor solizi. Tot mai multe

materiale funcționale sunt folosite pentru fabricarea electrozilor modificați, o metodă

electrochimică pentru detecţia vitaminele B2, B6 si C bazată pe pretratatea electrochimică a

electrodului de carbon vitros. O altă metodă de determinare a vitaminelor se bazează pe un

senzor nou folosind un electrod modificat cu filme de tipul: tris ruteniu (2,2' ) bipiridil (Ru (bpy)

33+ sau 3-amino-5-mercapto-1,2-4-triazol (p -AMTa) [115, 132-134]. Pentru determinarea unor

vitamine sunt folosiţi electrozii serigrafiaţi de argint / carbon nemodificaţi sau CdO / NPs / ILS /

CPE (NADH folosind un electrod pastă de carbon modificat cu nanoparticulă CdO / lichid

ionic), sau grafenele oxidice reduce cu nanocompozite bimetalice PdAu. Probele pentru

determinarea unor vitamine sunt plasmă, tablete farmaceutice, suc de fructe, fructe, legume, etc

[111, 112, 135].

6. Evaluarea si planificarea conditiilor de lucru

S-au identificat noi materiale (matrici si modificatori) senzori stocastici, amperometrici care pot

fi utilizati pentru determinarea compusilor sus amintiti. Astfel, pentru matrice s-au identificat

materiale bazate pe diamant, grafene si grafit, iar pentru modificatori ftalicianine, porfirine si

oleamide. Microsenzori cu diametrele partii active cuprinse intre 100 si 380µm au fost construiti

pentru a fi testati in Etapa a 2a.

De asemenea s-a achizitionat pentru senzorii optici sisteme moderne de detectie, sisteme rapide

si fiabile de scanare.

Conditiile optime de lucru si toxicitatea acestor compusilor selectati pentru a fi determinati este

evidentiata in paragrafele 1-5 si in Tabelul 1.

Referinte

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Phosphorus

[2] Connelly, NG; Damhus, T, eds. (2005). "section IR-3.5: Elements in the periodic table".

Nomenclature of Inorganic Chemistry: IUPAC Recommendations 2005 (PDF). Cambridge,

United Kingdom: RSC Publishing. p. 51. ISBN 0-85404-438-8

[3] Lothar Thomas. Bone and Mineral Metabolism. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and

Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt

/Main, Germany, 1 Ed., 1998, 241-244.

[4] Frances Fischbach. Pulmonary Function, ANGs and Electrolyte Studies. In A Manual of

Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 999-1001.

[5] Iulian Mincu, Aurora Popescu, C. Ionescu Tirgoviste. Elemente de biochimie si fiziologie a

nutritiei, 1985.

[6] http://www.acvariu.ro/forum/posts/list/24047.page

[7] C.Z. Huang, K.A. Li, S.Y. Tong, Anal. Chim. Acta 345 (1997) 235–342.

[8] H. Wang, W.R. Li, Y. Lu, N.N. Fu, H.S. Zhang, Spectrochim. Acta, Part A 61 (2005) 2103–

2107.

[9] Y.L. Zhou, S.N. Mao, Y.Z. Li, W.B. Chang, Microchim. Acta 144 (2004) 191–197.

[10] H.R. Charlton, J.M. Relton, N.K.H. Slater, Biotechnol. Tech. 13 (1999) 681–688.

[11] J. Li, J. Kang, J. Lu, X.Z. Li, J.L. Tang, H.Q. Zhang, Y.H. Zhang, J. Lumin. 129 (2009)

906–911.

[12] Q.C. Zou, Q.J. Yan, G.W. Song, S.L. Zhang, L.M. Wu, Biosens. Bioelectron. 22 (2007)

1461–1465.

[13] Y.Q. Cheng, Z.P. Li, Y.Q. Su, Y.S. Fan, Talanta 71 (2007) 1757–1761.

[14] A.V. Yegorova, Y.V. Scripinets, A. Duerkop, A.A. Karasyov, V.P. Antonovich, O.S.

Wolfbeis, Anal. Chim. Acta 584 (2007) 260–267.

[15] S.W. Bae, J.-W. Oh, I.-S. Shin, M.S. Cho, Y.-R. Kim, H. Kim, J.-I. Hong, Analyst 135

(2010) 603–607.

[16] T. Selvaraju, J. Das, K. Jo, K. Kwon, C. Huh, T.K. Kim, H. Yang, Langmuir 24 (2008)

9883–9888.

[17] J.H. Chen, J. Zhang, Q. Zhuang, J. Chen, X.H. Lin, Electroanalysis 19 (2007) 1765–1772.

[18] Y.Q. Li, Y.J. Guo, X.F. Li, J.H. Pan, Talanta 71 (2007) 123–128.

[19] M. Blanco, I. Villarroya, TrAC, Trends Anal. Chem. 21 (2002) 240–250.

[20] J. Moros, S. Garrigues, M. de la. Guardia, TrAC, Trends Anal. Chem 29 (2010) 578–591.

[21] Y. Yang, J. Tu, W. Cai, X. Shao, Talanta 99 (2012) 871–874.

[22] "Basic Information" Clothianidin – Registration Status and Related Information. U.S. EPA.

27 July 2012.

[23] https://emedicine.medscape.com/article/167726-overview

[24] Organophosphates: Background, Pathophysiology, Epidemiology". 2016-11-29.

[25] B. Goodman, "Pesticide Exposure in Womb Linked to Lower IQ". Health & Pregnancy. 21

Apr 2011.

[26] "Malathion". Environmental Protection Agency.

[27] "Organophosphates FAQs". Centers for Disease Control and Prevention. DHHS Department

of Health and Human Services. Retrieved 6 February 2016.

[28] Jurewicz, J.; Hanke, W. International Journal of Occupational Medicine and Environmental

Health. Versita, Warsaw. 21 (2): 121–132. doi:10.2478/v10001-008-0014-z. ISSN 1896-494X.

PMID 18614459 (9 Jul 2008)

[29] Study: ADHD linked to pesticide exposure. CNN. 17 May 2010.

[30] Lu, Chensheng; Toepel, K.; Irish, R.; Fenske, R. A.; Barr, D.B.; Bravo, R., Environmental

Health Perspectives. (2006). 114 (2), 260–3. doi:10.1289/ehp.8418. PMC 1367841.

[31] "IARC Monographs Volume 112: evaluation of five organophosphate insecticides and

herbicides" World Health Organization.

[32] https://www.iarc.fr/en/media-centre/iarcnews/pdf/MonographVolume112.pdf

[33] Environmental Health Perspectives – Population-Based Biomonitoring of Exposure to

Organophosphate and Pyrethroid Pesticides in New York City". ehp.niehs.nih.gov. Retrieved

2017-04-24.

[34] IARC Monographs Volume 112: evaluation of five organophosphate insecticides and

herbicides.

[35] S. Kegley; B. Hill; S. Orme. "Parathion - Identification, toxicity, use, water pollution

potential, ecological toxicity and regulatory information". Pesticide Action Network.

[36] Diazinon, Agrochemicals. Great Vista Chemicals.

[37] Raeburn, P. "Slow-Acting". Scientific American., 14 Aug 2006.

[38] Abe, J.I., Takeda, Y., & Hizukuri, S. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)—Protein

Structure and Molecular Enzymology, (1982), 703(1), 26–33.

[39] Hizukuri, S., Tabata, S., Kagoshima, & Nikuni, Z. (1970), 22(10), 338–343.

[40] Tabata, S., & Hizukuri, S. (1971) 23(8), 267–272.

[41] BeMiller, J. N., & Whistler, R. L. (2009). Starch: chemistry and technology.

ElsevierScience.

[42] J. Verbeke, C. Penverne, C. D’Hulst, C.n Rolando, N. Szydlowski, Carbohydrate Polymers

152 (2016) 784–791.

[43] https://ro.wikipedia.org/wiki/Azot

[44] STUDY REGARDING THE EFFICIENCY OF CERTAIN PROCEEDINGS OF

REMOVING THE NITROGEN FROM THE WASTE MUNICIPAL WATERS .

[45] Wilney J.R. Santos, Phabyanno R. Lima, Auro A. Tanaka, Sônia M.C.N. Tanaka , Lauro T.

Kubota, Determination of nitrite in food samples by anodic voltammetry using a modified

electrode, Ed. Food Chemistry 113 (2009) 1206–1211;

[46] Gulcemal Yildiz , Nevin Oztekin, Ayca Orbay, Filiz Senkal,Voltammetric determination of

nitrite in meat products using polyvinylimidazole modified carbon paste electrode, Food

Chemistry 152 (2014) 245–250.

[47] Maria-Alexandra Cimpeana, Izabella Craciunescub, Delia Gligora*,Amperometric sensor

based on HEMA hydrogels modified with Toluidine Blue for nitrite detection in water samples,

Materials Chemistry and Physics-200- 2017-233-240;

[48] The Water Quality Association publishes this Technical Application Bulletin

[49] A.T. Mubarak, A.A. Mohamed, K.F. Fawy, A.S. Al-Shihry, A novel kinetic determination

nitrite based on the perphenazine-bromate redox reaction, Microchimica Acta, 157 (2007) 99-

105;

[50] T. TOMIYASU, Y. KONAGAYOSHI, K. ANAZAWA, H. SAKAMOTO, A kinetic

method for the determination of nitrite by its catalytic effect on the oxidation of chlorpromazine

with nitric acid, Analytical sciences, 17 (2001) 1437-1440;

[51] B.R. Kozub, N.V. Rees, R.G. Compton, Electrochemical determination of nitrite at a bare

glassy carbon electrode; why chemically modify electrodes?, Sensors and Actuators B:

Chemical, 143 (2010) 539-546.

[52] Y. Cui, C. Yang, W. Zeng, M. Oyama, W. Pu, J. Zhang, Electrochemical determination of

nitrite using a gold nanoparticles-modified glassy carbon electrode prepared by the seed-

mediated growth technique, Analytical Sciences, 23 (2007) 1421-1425.

[53] M.I. Helaleh, T. Korenaga, Ion chromatographic method for simultaneous determination of

nitrate and nitrite in human saliva, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and

Applications, 744 (2000) 433-437.

[54] S.B. Butt, M. Riaz, M.Z. Iqbal, Simultaneous determination of nitrite and nitrate by normal

phase ion-pair liquid chromatography, Talanta, 55 (2001) 789-797;

[55] N. Öztekin, M.S. Nutku, F.B. Erim, Simultaneous determination of nitrite and nitrate in

meat products and vegetables by capillary electrophoresis, Food chemistry, 76 (2002) 103-106.

[56] Y. Tanaka, N. Naruishi, H. Fukuya, J. Sakata, K. Saito,S.-i. Wakida, Simultaneous

determination of nitrite, nitrate, thiocyanate and uric acid in human saliva by capillary zone

electrophoresis and its application to the study of daily variations, Journal of Chromatography A,

1051 (2004) 193-197;

[57] D. He, Z. Zhang, Y. Huang, Y. Hu, Chemiluminescence microflow injection analysis

system on a chip for the determination of nitrite in food, Food Chemistry, 101 (2007) 667-672;

[58] Y. Kanda, M. Taira, Flow-injection analysis method for the determination of nitrite and

nitrate in natural water samples using a chemiluminescence NOx monitor, Analytical sciences,

19 (2003) 695-699.

[59] Electrochemical detection of nitrite and ascorbic acid at glassy carbon electrodes modified

with carbon nano-onions bearing electroactive moieties, Inorganica Chimica Acta-468-2017-

223-231;

[60] José Losada a, M. Pilar García Armada a,⁎, Esther García a, Carmen M. Casado b, Beatriz

Alonso b,Electrochemical preparation of gold nanoparticles on ferrocenyl-dendrimer film

modified electrodes and their application for the electrocatalytic oxidation and amperometric

detection of nitrite, Journal of Electroanalytical Chemistry 788 (2017) 14–22

[61] Chunyan Deng a,b, Jinzhuo Chen a, Zhou Nie c, Minghui Yang a,⁎, Shihui Si a,Electrochemical detection of nitrite based on the polythionine/carbon nanotube modified

electrode, Thin Solid Films 520 (2012) 7026–7029;

[62] Wilney J.R. Santos a, Phabyanno R. Lima a, Auro A. Tanaka b, Sônia M.C.N. Tanaka b,

Lauro T. Kubota a,* Determination of nitrite in food samples by anodic voltammetry using a

modified electrode, Food Chemistry 113 (2009) 1206–1211;

[63] Dalibor M. Stankovi´ca,*, Eda Mehmetib, Janez Zavaˇsnikc, Kurt Kalcherb ,Determination

Of nitrite in tapwater: A comparative study between cerium,titanium and selenium dioxide

doped reduced grapheme oxide modified glassy carbon electrodes, Sensors and Actuators B 236

(2016) 311–317;

[64] Jing-He Yang*, Haitang Yang, Shanhu Liu*, Liqun Mao Microwave-assisted synthesis

graphite-supported Pd nanoparticles for detection of nitrite, Sensors and Actuators B Chemical-

220-2015-652-658;

[65] Balamurugan Thirumalraj, Selvakumar Palanisamy, Shen-Ming Chen*, Duo-Han Zhao, An

amperometric detection of nitrite in water samples using palladium nanoparticles decorated

functionalized multiwalled carbon nanotubes modified electrode, Journal of Colloid and

Interface Science- 478- 2016-413-420;

[66] Mir Reza Majidi, Seyran Ghaderi ,Hydrogen bubble dynamic template fabrication of

nanoporous Cu film supported by graphene nanaosheets: A highly sensitive sensor for detection

of nitrite,Talanta-175-2017-21-29;

[67] Dalibor M. Stankovi´ca,*, Eda Mehmetib, Janez Zavaˇsnikc, Kurt Kalcherb , Determination

of nitrite in tap water:A comparative study between cerium,titanium and selenium dioxide doped

reduced graphene oxide modified glassy carbon electrodes, Sensors and Actuators B Chemical-

236- 2016-311-317;

[68] Maria-Alexandra Cimpeana, Izabella Craciunescub, Delia Gligora , Amperometric sensor

based on HEMA hydrogels modified with Toluidine Blue for nitrite detection in water samples,

Materials Chemistry and Physics-200- 2017-233-240;

[69] Gilani Muhammad Rehan Hasan Shah1,2,3, ZHAO Jian-Ming1,2, LOU Bao-Hua1,

ZHANG Wei1,Azizur Rehman3,*, XU Guo-Bao1,* , Electrochemical Sensing of Nitrite at

Aminophenol-Formaldehyde Polymer/Phosphomolybdic Acid Nanocomposite Modified

Electrode, Chinese Journal of Analytical Chemistry- 45-4-2017-1709-e1712;

[70] Ali Ouraria, Bouzid Ketfia, Seif Islam Rabie Malhaa, Aziz Amineb , Electrocatalytic

Reduction of Nitrite and Bromated and Their highly sensitive determination on carbon paste

electrode modified with new copper Schiff base complex, Journal of Electroanalytical

Chemistry-797-2017-31-36;

[71] Chafia Ait Ramdane-Terbouche, Achour Terbouche, Safia Djebbar, Didier

Hauchard,Electrochemical sensors using modified electrodes based on copper complexes formed

with Algerian humic acid modified with ethylenediamine or triethylenetetramie for

determination of nitrite in water, Talanta-119-014-214-225;

[72] Gulcemal Yildiz *, Nevin Oztekin, Ayca Orbay, Filiz Senkal,Voltammetric determination

of nitrite in meat products using polyvinylimidazole modified carbon paste electrode, Food

Chemistry-152- 2014- 245-250;

[73] Achour Terbouche, Siham Lameche, Chafia Ait-Ramdane-Terbouche, Djamila Guerniche,

Djahida Lerari, Khaldoun Bachari, Didier Hauchard ,A new electrochemical sensor based on

carbon paste electrode/Ru(III) complex for determination of nitrite: Electrochemical impedance

and cyclic voltammetry measurements , Measurement-92- 2016- 524-533;

[74] Mozhgan Parsaeia, Zahra Asadia,*, Saeid Khodadoustb,, A sensitive electrochemical sensor

for rapid and selective determination of nitrite ion in water samples using modified carbon paste

electrode with a newly synthesized cobalt(II)-Schiff base complex and magnetite nanospheres,

Sensors and Actuators B Chemical- 220-2015- 1131-1138

[75] Veerendra C. Yeligar*, Ravindra G. Gaikwad, Kavita D. Patil, Sanjay S. Patil and

Shitalkumar S. Patil, Development of spectrophotometric method and validation for melatonin in

tablet, world journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, Volume 5, Issue 6, 1440-

1451(2016).

[76] Marcello Iriti,1 Mara Rossoni2 and Franco Faoro3∗, Melatonin content in grape: myth or

panacea? J Sci Food Agric 86:1432–1438 (2006).

[77] Dun-Xian Tan1,2, Lucien C. Manchester1 , Ru¨diger Hardeland2 , Silvia Lopez-Burillo1 ,

Juan C. Mayo1 , Rosa M. Sainz1 and Russel J. Reiter1, Melatonin: a hormone, a tissue factor, an

autocoid, a paracoid, and an antioxidant vitamin, J. Pineal Res. 2003; 34:75–78.

[78] Chao Lua,∗, Jinge Li a, Yi Yanga, Jin-Ming Linb, Determination of bisphenol A based on

chemiluminescence from gold(III)–peroxymonocarbonate, Talanta 82 (2010) 1576–1580.

[79] Xu Wang, Hulie Zeng, Yanlin Wei, Jin-Ming Lin ∗, A reversible fluorescence sensor based

on insoluble β-cyclodextrin polymer for direct determination of bisphenol A (BPA), Sensors and

Actuators B 114 (2006) 565–572.

[80] Rochester JR, Bisphenol A and Human Health: A review of the literature., Reproductive

Toxicology (2013).

[81] Guo Nan Chen, Fu Xin Huang, Xiao Ping Wu, Zheng Feng Zhao, Jian Ping Duan,

Chemiluminescence determination of melatonin and some of its derivatives using potassium

permanganate and formaldehyde system, Anal Bioanal Chem (2003) 376 : 873–878.

[82] Saumen Kumar Maitra* and Kazi Nurul Hasan, Melatonin in the Care and Control of

Human Health, JOJ nursing& Health Care, Volume 4 Issue 3- September 2017.

[83]. Jing Wang, Xueying Liu, Yiting Wang, Lei Yu, Hui Peng, Jian-Zhong Zhu, Fe NPs and

MWCNTs based electrode as FIA detector for determination of amino acids in hypothalamus

microdialysis fluids, Sensors and Actuators B, 238, 2017, 834–841.

[84]. Sadegh Karimi, Maryam Heydari, Voltammetric mixture analysis of Tirosine and

tryptophan using carbon paste electrode modified by newly synthesized mesoporous silica

nanoparticles and clustering of variable-partial least square: Efficient strategy for template

extraction in mesoporous silica nanoparticle synthesis, Sensors and Actuators B, article in press,

accepted, 2017, doi.org/10.1016/j.snb.2017.11.014.

[85]. Sara Hooshmand, Zarrin Es’haghi, Simultaneous quantification of arginine, alanine,

methionine and cysteine amino acids in supplements using a novel bioelectro-nanosensor based

on CdSe quantum dot/modified carbon nanotube hollow fiber pencil graphite electrode via

Taguchi method, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 146, 2017, pp. 226-235.

[86]. https://en.wikipedia.org/wiki/Proteinogenic_amino_acid

[87]. Rainer Bischoff, Hartmut Schlüter, Amino acids: Chemistry, functionality and selected

non-enzymatic post-translational modifications, Journal of proteomics, 75, 2012, pp. 2275 –

2296.

[88]. https://en.wikipedia.org/wiki/Non-essential_amino_acid

[89]. Ponnusamy Kanchana, Mani Navaneethan, Chinnathambi Sekar, Fabrication of Ce doped

hydroxyapatite nanoparticles based non-enzymatic electrochemical sensor for the simultaneous

determination of norepinephrine, uric acid and Tirosine, Materials Science & Engineering B,

226, 2017, pp. 132–140.

[90]. Sayed Mehdi Ghoreishi, Mehdi Malekian, Curve resolution on overlapped voltammograms

for simultaneous determination of tryptophan and Tirosine at carbon paste electrode modified

with ZnFe2O4 nanoparticles, Journal of Electroanalytical Chemistry, 805, 2017, pp. 1-17.

[91]. Siddharth Shrestha, Ronald J.Mascarenhas, Ozma J. D'Souza, Ashis K. Satpati, Zineb

Mekhalif, DhasonA., Praveen Martis, Amperometric sensor based on multi-walled carbon

nanotube and poly (Bromocresol purple) modified carbon paste electrode for the sensitive

determination of L-Tirosine in food and biological samples, Journal of Electroanalytical

Chemistry, 778, 2016, pp. 32–40.

[92]. S. Bahmanzadeh, M. Noroozifar, Fabrication of modified carbon paste electrodes with Ni-

doped Lewatit FO36 nano ion exchange resin for simultaneous determination of epinephrine,

paracetamol and tryptophan, Journal of Electroanalytical Chemistry, article in press, accepted,

2017, doi:10.1016/j.jelechem.2017.11.073.

[93]. Elahe Molaakbari Ali Mostafavi Hadi Beitollahi, Simultaneous electrochemical

determination of dopamine, melatonin, methionine and caffeine, Sensors and Actuators B, 208,

2015, pp. 195-203.

[12]. Nihal Ermiş, Lokman Uzun, Adil Denizli, Preparation of molecularly imprinted

electrochemical sensor for l-phenylalanine detection and its application, Journal of

Electroanalytical Chemistry, 807, 2017, pp. 244-252.

[94]. H.Zeinali, H.Bagheri, Z.M.Khoshhesab, H.Khoshsafar, A.Hajian, Nanomolar imultaneous

determination of tryptophan and melatonin by a new ionic liquid carbon paste electrode modified

with SnO2-Co3O4@rGO nanocomposite Materials, Mater. Sci. Eng. C., 71, 2017, pp. 386–394.

[95]. J. Ren, M.Zhao, J. Wang, C. Cui ,B. Yang, Spectrophotometric Method for Determination

of Tryptophan in Protein Hydrolysates, Food Technol. Biotechnol., 45(4), 2007, pp. 360–366.

[96] M. Utrera, M.Estévez, Analysis of tryptophan oxidation by fluorescence spectroscopy:

Effect of metal-catalyzed oxidation and selected phenolic compounds, Food Chem., 135, 2012,

pp. 88–93.

[97]. [12] B.Williamson ,L. Benson , A.Tomlinson , A. Mayeno , G. Gleich , S. Naylor, On-line

HPLC-tandem mass spectrometry analysis of contaminants of L-tryptophan associated with

the onset of the eosinophilia-myalgia syndrome, Toxicol Lett., 92, 1997, pp. 139-48.

[98]. M. K. Gaitonde, A fluorimetric method for the determination of tryptophan in animal

tissues, Biochem., 139, 1974, pp. 625-631.

[99]. J. Zhao, H. Chen, P. Ni, B. Xu, X. Luo, Simultaneous determination of urinary tryptophan,

tryptophan-related metabolites and creatinine by high performance liquid chromatography with

ultraviolet and fluorimetric detection ,J.Chromatogr. B, 879, 2011, pp. 2720–2725.

[100]. B. J. de Kort , G.J. de Jong, G.W. Somsen, Native fluorescence detection of biomolecular

and pharmaceutical compounds in capillary electrophoresis: Detector designs, performance and

applications: A review ,Anal. Chim. Acta, 766, 2013, pp. 13–33.

[101]. N.Nuchtavorn, W.Suntornsuk, Recent applications of microchip electrophoresis to

biomedical analysis, J. of Pharma. Biomed. Anal., 113, 2015, pp. 72–96.

[102]. M. F. Dario, T. B.Freire, C. A. S. de Oliveira Pinto, M. S. A. Prado, A. R. Baby, M. V.

R. Velasco, Tryptophan and kynurenine determination in human hair by liquid chromatography,

J. Chromatogr. B., 1065, 2017, pp. 59–62.

[103]. J. Zhao,P. Gao, Optimization of Zn2+-containing mobile phase for simultaneous

determination of kynurenine, kynurenic acid and tryptophan in human plasma by high

performance liquid chromatography, J. Chromatogr.B, 878 ( 2010) 603–608.

[104] C. Wong , C. Strachan-Mills, S. Burman, Facile method of quantification for oxidized

tryptophan degradants of monoclonal antibody by mixed mode ultra performance liquid

chromatography, J. Chromatogr. A, 1270, 2012, pp. 153–161.

[105] V. P. Hanko, J. S. Rohrer, Direct determination of tryptophan using high-performance

anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection, Anal.Biochem.,

308, 2002, pp. 204–209.

[106]. M. Noroozifar, M. Khorasani-Motlagh, R. Akbari, M. Bemanadi-Parizi, Simultaneous and

sensitive determination of a quaternary mixture of AA, DA, UA and Trp using a modified GCE

by iron ion-doped natrolite zeolite-multiwall carbon nanotube,Biosens. Bioelectron., 28, 2011,

pp. 56–63.

[107]. M. Noroozifar, M. Khorasani –Motlagh, A.Taheri, Preparation of silver hexacyanoferrate

nanoparticles and its application for the simultaneous determination of ascorbic acid, dopamine

and uric acid , Talanta 80, 2010, pp. 1657–1664.

[108]. José Luiz da Silva, Maísa Azevedo Beluomini, Graziela Cristina Sedenho, Nelson Ramos

Stradiotto, Determination of amino acids in sugarcane vinasse by ion chromatographic using

nickel nanoparticles on reduced graphene oxide modified electrode, Microchemical Journal, 134,

2017, pp. 374-382.

[109]. Vítor Spínola, Eulogio J. Llorent-Martínez, Paula C. Castilho, Determination of vitamin C

in foods: Current state of method validation, Journal of Chromatography A, 1369, 2014, pp. 2-

17.

[110]. Mohammad Ali Saghiri, Armen Asatourian, Soroush Ershadifar, Mona Momeni

Moghadam, Nader Sheibani, Vitamins and regulation of angiogenesis: [A, B1, B2, B3, B6, B9,

B12, C, D, E, K], Journal of Functional Foods, Vol. 38, 2017, pp. 180–196.

[111]. Vahid Arabali, Mahmoud Ebrahimi, Maryam Abbasghorbani, Vinod Kumar Gupta,

Mohammad Farsi, M.R. Ganjali, Fatemeh Karimi, Electrochemical determination of vitamin C in

the presence of NADH using a CdO nanoparticle/ionic liquid modified carbon paste electrode as

a sensor, Journal of Molecular Liquids, 213, 2016, pp. 312-316.

[112]. Jaymin K. Jadav, Valentina V. Umrania, Khyati J. Rathod, Baljibhai A. Golakiya,

Development of silver/carbon screen-printed electrode for rapid determination of vitamin C from

fruit juices, LWT - Food Science and Technology, 88, 2018, pp. 152-158.

[113]. Piyush Kumar Sonkar, Vellaichamy Ganesan, Susanta K. Sen Gupta, Dharmendra Kumar

Yadav, Rupali Gupta, Mamta Yadav, Highly dispersed multiwalled carbon nanotubes coupled

manganese salen nanostructure for simultaneous electrochemical sensing of vitamin B2 and B6,

Journal of Electroanalytical Chemistry, 807, 2017, pp. 235–243.

[114]. L. Bellows specialist and assistant professor and R. Moore graduate student, Food and

nutrition series- Water-Soluble Vitamins: B-Complex and Vitamin C, Fact Sheet No. 9.312

Colorado State University 11/2012.

[115]. Tao Nie, Jing-Kun Xu, Li-Min Lu, Kai-Xin Zhang, Ling Bai, Yang-Ping Wen,

Electroactive species-doped poly(3,4-ethylenedioxythiophene) films: Enhanced sensitivity for

electrochemical simultaneous determination of vitaminsB2, B6 and C, Biosensors and

Bioelectronics, 50, 2013, pp. 244–250.

[116]. Horton, H., Moran, L., Ochs, R., Rawn, J., Scrimgeour, K., Principles of Biochemistry,

seconded. Prentice-Hall, New Jersey, 1996.

[117]. Vitamin and mineral requirements in human nutrition: report of a joint FAO/WHO expert

consultation, Bangkok, Thailand, 21–30 September 1998.

[118]. Fatemeh Khaleghi, Zahra Arabb, Vinod Kumar Gupta, M.R. Ganjali, Parviz Norouzi,

Necip Atar, Mehmet L. Yola, Fabrication of novel electrochemical sensor for determination of

vitamin C in the presence of vitamin B9 in food and pharmaceutical samples, Journal of

Molecular Liquids, 221, 2016, pp. 666–672.

[119]. Manal L. Louka, Ahmed M. Fawzy, Abdelrahman M. Naiem, Mustafa F. Elseknedy,

Ahmed E. Abdelhalim, Mohamed A. Abdelghany, Vitamin D and K signaling pathways in

hepatocellular carcinoma, Gene, 629, 2017, pp. 108-116.

[120]. Edward Giovannucci, Vitamin D and Cancer Incidence in the Harvard Cohorts, Ann

Epidemiol, 19 (2), 2009, pp. 84-89.

[121]. Elizabeth R. Bertone-Johnson, Wendy Y. Chen, Michael F. Holick, Bruce W. Hollis,

Graham A. Colditz, Walter C. Willett, Susan E. Hankinson, Plasma 25-Hydroxyvitamin D and

1,25-Dihydroxyvitamin D and Risk of Breast Cancer, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 14

(8), 2005, pp. 1991-1997.

[122]. Brian J. Petteys, Elizabeth L. Frank, Rapid determination of vitamin B2 (riboflavin) in

plasma by HPLC, Clinica Chimica Acta, 412, 2011, pp. 38–43.

[123]. Lopez-Anaya A, Mayersohn M., Quantification of riboflavin, riboflavin 5′- phosphate and

flavin adenine dinucleotide in plasma and urine by highperformance liquid chromatography, J.

Chromatogr, 423,1987, pp. 105–113.

[124]. Zempleni J., Determination of riboflavin and flavocoenzymes in human blood plasma by

high-performance liquid chromatography, Ann Nutr Metab, 39, 1995, pp. 224–226.

[125]. Iha Bama, Emo Dworschiik, Determination of thiamine (vitamin B1) and riboflavin

(vitamin B2) in meat and liver by high-performance liquid chromatography, Journal of

Chromatography A, 668, 1994, 359-363.

[126]. Nasrin Shadjou, Mohammad Hasanzadeh, Ali Omari, Electrochemical quantification of

some water soluble vitamins in commercial multi-vitamin using poly-amino acid caped by

graphene quantum dots nanocomposite as dual signal amplification elements, Analytical

Biochemistry, 539, 2017, pp. 70-80.

[127]. S.L. Bahattar, G.B. Kolekar, S.R. Patil, Fluorescence resonance energy transfer between

perylene and riboflavin in micellar solution and analytical application on determination of

vitamin B2, Journal of Luminescence, 128, 2008, pp. 306–310.

[128]. Yolanda Andreu, Susana de Marcos, Juan R. Castillo, Javier Galban, Sensor film for

Vitamin C determination based on absorption properties of polyaniline, Talanta, 65, 2005, pp.

1045–1051.

[129]. L.G. Shaidarova, L.N. Davletshina, G.K. Budnikov, Flow-Injection Determination of

Water-Soluble Vitamins B1, B2, and B6 from the Electrocatalytic Response of a Graphite

Electrode Modified with a Ruthenium(III) Hexacyanoruthenate(II) Film, Analyt. Chem. 61,

2006, pp. 502-509.

[130]. P. Moreno, V. Salvado´, Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-

vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography, Journal of

Chromatography A, 870, 2000, 207–215.

[131]. Tomás Pérez-Ruiz, Carmen Martínez-Lozano, Antonio Sanz, Virginia Tomás,

Photokinetic determination of riboflavin and riboflavin 5′-phosphate using flow injection

analysis and chemiluminescence detection, Analyst, 8, 1994, pp. 1825–1828.

[132]. S. Brillians Revin, S. Abraham John, Simultaneous determination of vitamins B2, B9 and

C using a heterocyclic conducting polymer modified electrode, Electrochimica Acta, 75, 2012,

pp. 35–41.

[133]. Jing Wu, Cunxi Leia, Haifeng Yang, Xumei Wu, Guoli Shen, Ruqin Yu, Ruthenium

tris(2,2) bipyridyl-modified oxidized boron-doped diamond electrode for the determination of

Vitamin B6 in the presence of Vitamins B1 and B2, Sensors and Actuators B, 107, 2005, pp.

509–515.

[134]. Hai-Ying Gu , Ai-Min Yu, Hong-Yuan Chen, Electrochemical behavior and simultaneous

determination of vitamin B2, B6, AND C at electrochemically pretreated glassy carbon

electrode, Analytical Letters, 34 (13), 2001, pp. 2361–2374.

[135]. Cui'e Zou, Jiatai Zhong, Shumin Li, Huiwen Wang, Jin Wang, Bo Yan, Yukou Du,

Fabrication of reduced graphene oxide-bimetallic PdAu nanocomposites for the electrochemical

determination of ascorbic acid, dopamine, uric acid and rutin, Journal of Electroanalytical

Chemistry, 805, 2017, pp. 110–119.

UNITATEA EXECUTIVĂ PENTRU FINANŢAREA ÎNVĂŢAMÂNTULUI SUPERIOR, CERCETĂRII, DEZVOLTĂRII ŞI INOVĂRII PROGRAM PN-III CONTRACTOR PN-III-P4-ID-PCE-2016-0050 Institutul Naţional de Cercetare

Dezvoltare pentru Electrochimie si Materie Condensata

Nr. Contract 45PCE/2017

Noi platforme inovatoare bazate pe senzori chimici, electrochimici si optici pentru implementarea fiabila si

durabila in timp real in sisteme de proces intensive de date automate

SPRADIPS

Raport ştiinţific în extenso

Etapa 2 - Selectarea materialelor optime si a tehnologiei optime pentru constructia senzorilor, bazata pe studiile si experimentele efectuate in laborator - 2018

Director de proiect CSI, Prof. Dr. JACOBUS FREDERICK VAN STADEN

Pentru atingerea obiectivelor din cadrul fazei 2 a proiectului de cercetare

45PCE/2017, in anul 2018 s-au realizat urmatoarele activitati de cercetare:

- Selectarea de noi nanomateriale pentru senzorii electrochimici, optici si

spectroelectrochimici, adaptate la substantele care urmeaza sa fie analizate.

- Dezvoltarea de noi tehnologii pentru constructia senzorilor.

- Testarea, caracterizarea si validarea senzorilor construiti.

Carotenoidele

În prezent, oamenii trăiesc mai mult, astfel că speranța medie de viață a crescut la nivel

global, ajungând la 80,6 ani în Uniunea Europeană în 2013. Cu toate acestea, obiceiurile

alimentare proaste și factorii metabolici contracarează această evoluție și se numără printre

principalii factori de risc ai mortalității la nivel mondial [1]. Cele mai frecvente cauze ale

morbiditătii și mortii premature în țările dezvoltate sunt: cardiopatia ischemică, accidentul

vascular cerebral si cancerul [2]. Sunt necesare îmbunătățiri in alimentatie pe scară largă, iar

Comisia EAT-Lancet evaluează în prezent dacă este posibilă punerea în aplicare a unui sistem

alimentar mondial care să poată oferi o dietă sănătoasă și durabilă unei populații mondiale care

se așteaptă să ajungă la 9 miliarde până în 2050 [3].

Fructele și legumele contribuie la reducerea aparitiei bolilor cardiovasculare, precum și a

unor forme de cancer, prin diverse mecanisme de furnizare de antioxidanți, fibre dietetice și

micronutrienți cum ar fi: carotenoidele, flavonoidele, vitamina C și acidul folic, care pot reduce

daunele oxidative și pot bloca acțiunile unor substanțe cancerigene [4].

Carotenoidele sunt pigmenți care se găsesc în mod natural în plante, fungii, alge și

bacterii [5]. Aceste molecule bogat colorate sunt sursele culorilor galbene, portocalii, rosii si

verzi din multe plante [6]. Fructele si legumele oferă majoritatea carotenoidelor din dieta umană.

Alfa-carotenul, beta-carotenul, beta-criptoxantina, luteina, licopenul și zeaxantinul sunt cele mai

frecvente carotenoide dietetice. In natură există mai mult de 650 de carotenoide de diferite tipuri

[7], inclusiv 100, sunt prezente în mancare [8]. Oamenii nu sintetizează carotenoidele, în schimb,

ele trebuie să fie ingerate din alimente sau din suplimente alimentare [9]. Au fost găsite 30-40 de

carotenoide în probele de sânge uman, cele mai abundente fiind licopenul, luteina, zeaxantina, β-

criptoxantina și β-carotenul [10].

Consumul de carotenoide a fost asociat cu diferite beneficii pentru sănătate, reducand

riscul de cancer și boli cardiace coronariene [11] si au un efect benefic asupra funcției cognitive

[12].

Mai multe carotenoide, precum β-carotenul, luteina, zeaxantina, licopenul,

astaxantinul și cantaxantina sunt produse la scară industrială și sunt disponibile în alimente

fortificate sau ca suplimente. Carotenoidele sunt, de asemenea, utilizate ca și coloranți în

alimente, băuturi și aplicații farmaceutice.

Deși chimia carotenoidelor a fost studiată extensiv, informații despre biodisponibilitatea,

metabolismul și, în special, despre funcțiile biologice ale acestora este în curs de dezvoltare doar

de câțiva ani.

Carotenoidele sunt compuși izoprenoidici ale căror proprietăți sunt în principal dictate de

lanțul lung central al dublelor legături conjugate. Diversi compuși carotenoidici rezultă prin

modificarea scheletului izoprenoidic, conducând fie la hidrocarburi simple (carotene), fie la

derivați oxigenați (xantofili) [13].

Carotenoidele se pot clasifica în două categorii:

1. Carotenele, care posedă numai atomi de carbon și hidrogen; din aceasta categorie fac parte:

• alfa-carotenul

• beta-carotenul

• licopenul

2. Xantofilele, care posedă grupări hidroxil, epoxi și carboxil în moleculele lor:

• beta-criptoxantina

• luteina

• zeaxantina

Potențiala contribuție a carotenoidelor in sănătate

Principalele funcții ale carotenoidelor în sănătatea umană sunt rezumate

în urmatorul tabel [14]:

Tabel. Funcțiile principale ale carotenoidelor în sănătatea umană.

Beneficii in sanatate Carotenoide

Vedere, pro-vitamina A

Sănătatea ochilor

Creier - funcții cognitive

Sanatatea inimii

Prevenirea cancerului

Nutriție maternă și pentru sugari

Piele - protecție UV

Fertilitate

Modularea/ stimularea imună

α- si β-Caroten, β-criptoxantin

Luteina, Zeaxantin

Luteina, β-caroten

Licopen

Licopen

Luteina

Licopen, β-caroten

Luteina, β-caroten

β-caroten

Din punct de vedere mecanic, beneficiile primare ale carotenoidelor pot fi explicate prin

potențialul lor antioxidant [15]. β-carotenul aduce beneficii datorită capacității sale de a fi

transformat în vitamina A [16], în timp ce luteina și zeaxantina absorb lumina la lungimi de undă

specifice care ar putea ajuta la protejarea ochilor [17]. Carotenoidele pot proteja împotriva

anumitor tipuri de cancer prin limitarea creșterii anormale a celulelor și / sau prin intensificarea

comunicării joncțiunii gap-ului [18]. În plus, carotenoidele pot ajuta la prevenirea bolilor

cardiovasculare prin blocarea formării și oxidării lipoproteinelor cu densitate scăzută [19,20].

Rolul pro-vitaminei A

Alfa-carotenul, beta-carotenul și beta-criptoxantinul sunt carotenoidele pro-vitaminei A,

ceea ce înseamnă că acestea pot fi transformate de către organism în retinol. In figura 1 se pot

observa structurile carotenoidelor pro-vitaminei A.

Figura 1. Structurile carotenoidelor pro-vitaminei A

Luteina, licopenul și zeaxantina nu pot fi transformate în retinol, deci nu au activitate de

vitamina A. Structurile carotenoidelor care nu au activitatea vitaminei A sut prezente in figura 2.

Figura 2. Structurile carotenoidelor care nu au activitatea vitaminei A

Vitamina A este esențială pentru creșterea și dezvoltarea normală a funcției sistemului

imunitar si a vederii. În prezent, singura funcție esențială a carotenoidelor recunoscută la om este

aceea a carotenoidelor pro-vitaminei A (alfa-carotenul, beta-carotenul și beta-criptoxantinul)

pentru a servi ca sursă de vitamina A [21].

Deficitul de vitamina A este o problemă majoră de sănătate publică în țările în curs de dezvoltare

care afectează în special preșcolarii și femeile însărcinate și poate provoca orbirea și chiar

decesul [4,16]. Principalele surse de vitamina A sunt produsele de origine animală,

legumele și fructele, verdele frunzelor, care conțin carotenoide, predominant β-caroten [16,22].

Diverse strategii de sănătate publică sunt folosite pentru a combate deficiența de vitamina A.

Suplimentarea cu vitamina A sau β-caroten este eficientă, dar poate fi dificil de implementat în

zonele sărace, rurale.

Sănătatea ochilor

Două carotenoide dietetice, luteina și zeaxantina și izomerul meso-zeaxantinul se găsesc

în retina umană [23]. Astfel, aceste carotenoide oferă beneficii potențiale pentru funcția oculară

și sănătate.

Performanță cognitivă

Mai multe carotenoide pot să aibă efecte asupra funcționării cognitive. Mecanismul de

bază nu este clar, dar se poate referi la activitatea antioxidantă [24]. Studiile pe animale susțin un

efect al luteinei asupra funcției cognitive [25].

Bolile cardiovasculare

Stresul oxidativ, inflamația, dislipidemia și tromboza sunt implicate în dezvoltarea bolilor

cardiovasculare și există dovezi că carotenoidele pot avea efecte benefice asupra unora dintre

acești factori. S-a demonstrat că Astaxantinul, un carotenoid derivat din animale marine, reduce

peroxidarea lipoproteinelor cu densitate scăzută, îmbunătățește profilul lipidelor sangvine și

capacitatea fluxului sanguin.

Profilaxia cancerului

Betacarotenul are rol si in profilaxia cancerului. Efectul profilatic al beta-carotenului in

bolile maligne se bazeaza pe transformarea metabolitilor cancerigieni formati in organism sau a

substantelor cancerigiene ajunse in organism din mediul exterior, in substante mai putin nocive si

mai solubile, deci mai usor de eliminat [26]. Este util un aport de beta-caroten din suplimentele

alimentare. Carotenoidele prezinta un interes deosebit ca si antioxidanți și se presupune că sunt

eficiente în chemopreventia cancerului [27,28].

Funcție imunitară

Deoarece vitamina A este esențială pentru funcționarea sistemului imunitar normal, este

dificil de stabilit dacă efectele carotenoidelor pro-vitaminei A sunt legate de activitatea vitaminei

A sau de alte activități ale carotenoidelor. Deși unele studii clinice au constatat că suplimentarea

cu β-caroten se îmbunătățește cu mai mulți biomarkeri ai funcției imune [29-31], creșterea

debutului de licopen și luteină - carotenoide fără activitate de vitamina A - nu a dus la

îmbunătățiri similare ale biomarkerilor funcției imune [32-34].

β-Carotenul (C40H56)

este unul dintre cele mai importante carotenoide;

apare în general în plante, alge și fungii [5];

se găsește într-o varietate de fructe și legume portocalii, galbene și verzi;

sursele de beta-caroten includ diverse verdeturi: spanac, salata; mango, ardei, dovleac,

morcovi și cartofi dulci;

este considerata o sursă importantă în dieta umană, ca si precursor al vitaminei A [35];

conține 11 duble legaturi carbon-carbon conjugate [36];

actioneaza ca un antioxidant impreuna cu vitaminele E si C si poate reduce riscul aparitiei

unor boli cronice.

Licopenul (C40H56)

aparține familiei carotenoidelor ca și β-carotenul, substanțe pe care organismul omului nu

le sintetizează;

este un carotenoid aciclic hidrofob cu 40 de atomi de carbon;

conține 11 duble legături conjugate și 2 neconjugate;

este unul dintre cei sase carotenoizi predominanti care se regasesc in plasma sangvina;

este un colorant vegetal, solubil în grăsimi, care dă culoarea roșie pepenilor, roșiilor și în

cantitate mai scăzută și altor fructe;

principalele surse de licopen in dieta alimentara sunt: rosiile, pepenele verde, guava și

grapefruitul. În aceste produse vegetale brute, licopenul se găsește aproximativ 95%

în forma trans [37,38] și este localizat în complexul proteic de pigment fotosintetic al

membranei tiolacoide [39].

Luteina și zeaxantina (C40H56O2)

sunt carotenoide oxigenate, membre ale grupului xantofil al carotenoidelor [40];

sunt stereoizomeri, ceea ce complică tehnicile analitice de determinare a cantităților din

fiecare stereoizomer prezent și, de asemenea, au creat dificultăți în determinarea

influenței izomerilor individuali asupra sănătății umane;

sursele acestor carotenoide sunt legumele cu frunze cum ar fi spanacul, porumbul,

și broccoli [41].

luteina produsă comercial este derivată din gălbenele și este utilizată în industria păsărilor

[42].

Metode de determinare pentru carotenoide:

Metodele cele mai frecvent utilizate pentru analiza carotenoidelor sunt spectrofotometria

(SP) și cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) [43]. Ambele metode sunt

laborioase și costisitoare datorită procedurii inevitabile de extracție.

Sistemul caracteristic de duble legaturi conjugate ale β-carotenului și a altor carotenoide

asigură o gamă largă de proprietăți, și anume absorbția la capătul violet al spectrului vizibil,

activitate electrochimică etc. Exista multe probleme în manipularea carotenoidelor care sunt

asociate cu stabilitatea lor, în special față de condițiile de lumină, oxigen, căldură, aciditate și

alcalinitate [44-46]. Fiecare factor poate provoca degradarea, oxidarea și / sau izomerizarea cis-

trans a β-carotenului. Au fost aplicate diferite tipuri de cromatografii pentru determinarea β-

carotenului din probe reale, cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu detecție UV

[47,48], cromatografia lichidă de înaltă presiune în fază inversă [49], cromatografia lichidă cu

detector electrochimic coulometric [50] și metoda HPLC cu fază normală [51]. Principalele

avantaje ale cromatografiei sunt: versatilitatea, sensibilitatea și selectivitatea oferind o analiza

fiabila a probelor de mancare.

Proprietățile optice ale β-carotenului oferă posibilități simple și ieftine pentru

determinările sale analitice directe folosind spectroscopia in infraroșu apropiat [52],

spectrometria cu xenon [53], spectroscopia de rezonanță Raman și RMN, dicroismul circular și

spectrometria de masă [54].

A fost dezvoltată o metodă spectrofotometrică simplă pentru analiza cantitativă a β-

carotenului total din aditivii alimentari, cum ar fi pulberi, emulsii și suspensii uleioase conținând

izomerii E / Z ai β-carotenului în diferite rapoarte [55].

Referinte: 1. GBD, Causes of Death Collaborators, Global, regional, and national age-sex specific mortality

for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease

Study 2016, Lancet 390, 2016, 1151–1210.

2. GBD, Risk Factors Collaborators, Global, regional, and national comparative risk assessment

of 84 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks,

1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016, Lancet 390,

2017, 1345–1422.

3. J. Rockström, G.A. Stordalen, R. Horton, Acting in the anthropocene: the eat-lancet

commission, Lancet 387, 2016, 2364–2365.

4. World Health Organization, The world health report 2002-Reducing risks, promoting healthy

life, http://www.who.int/whr/2002/en/, (2002), Accessed date: 17 October 2017.

5. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A 1012, 2003, 103–109.

6. Wang XD, Carotenoids. In: Ross CA, Caballero B, Cousins RJ, Tucker KL, Ziegler TR, eds.

Modern Nutrition in Health and Disease. 11th ed: Lippincott Williams & Wilkins; 2014, 427-439.

7. H.E. Khoo, K.N. Prasad, K.W. Kong, Y. Jiang, A. Ismail, Carotenoids and their isomers: color

pigments in fruits and vegetables, Molecules 16, 2011, 1710–1738.

8. A. Milani, M. Basirnejad, S. Shahbazi, A. Bolhassani, Carotenoids: biochemistry,

pharmacology and treatment, Br. J. Pharmacol. 174, 2017, 1290–1324.

9. J.P. Zimmer, B.R. Hammond Jr., Possible influences of lutein and zeaxanthin on the

developing retina, Clin. Ophthalmol. 1, 2007, 25–35.

10. Maiani G, Castón MJ, Catasta G, Toti E, Cambrodón IG, Bysted A, et al. Carotenoids: actual

knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in

humans. Mol Nutr Food Res 2009; 53 (Suppl. 2), S194–218.

11. A. Milani, M. Basirnejad, S. Shahbazi, A. Bolhassani, Carotenoids: biochemistry,

pharmacology and treatment, Br. J. Pharmacol. 174, 2017, 1290–1324.

12. E.J. Johnson, A possible role for lutein and zeaxanthin in cognitive function in the elderly,

Am. J. Clin. Nutr. 96, 2012, 1161S-1165S.

13. G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander, A.Z. Mercadante, E.S. Egeland (Eds.), Carotenoids

Handbook, Birkha¨user, Basel, 2004.

14. M. Eggersdorfer, A. Wyssc, Carotenoids in human nutrition and health, Archives of

Biochemistry and Biophysics 652, 2018, 18–26.

15. J. Fiedor, K. Burda, Potential role of carotenoids as antioxidants in human health and

disease, Nutrients 6, 2014, 466–488.

16. F. Gurmu, S. Hussein, M. Laing, The potential of orange-fleshed sweet potato to prevent

vitamin A deficiency in Africa, Int. J. Vitam. Nutr. Res. 84, 2014, 65–78.

17. F.M. Barker 2nd, D.M. Snodderly, E.J. Johnson, W. Schalch, W. Koepcke, J. Gerss, M.

Neuringer, Nutritional manipulation of primate retinas, V: effects of lutein, zeaxanthin, and n-3

fatty acids on retinal sensitivity to blue-light-induced damage, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52,

2011, 3934–3942.

18. T. Tanaka, M. Shnimizu, H. Moriwaki, Cancer chemoprevention by carotenoids, Molecules

17, 2012, 3202–3242.

19. T. Iwamoto, K. Hosoda, R. Hirano, H. Kurata, A. Matsumoto, W. Miki, M. Kamiyama, H.

Itakura, S. Yamamoto, K. Kondo, Inhibition of low-density lipoprotein oxidation by astaxanthin,

J. Atherosclerosis Thromb. 7, 2000, 216–222.

20. H. Yoshida, H. Yanai, K. Ito, Y. Tomono, T. Koikeda, H. Tsukahara, N. Tada,

Administration of natural astaxanthin increases serum HDL-cholesterol and adiponectin in

subjects with mild hyperlipidemia, Atherosclerosis 209, 2010, 520–523.

21. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine. β-Carotene and other carotenoids. Dietary

reference intakes for vitamin C, vitamin E, selenium, and carotenoids. Washington, D.C.:

National Academy Press; 2000, 325-400.

22. D. Weber, T. Grune, The contribution of beta-carotene to vitamin A supply of humans, Mol.

Nutr. Food Res. 56 (2), 2012, 251–258.

23. P.S. Bernstein, B. Li, P.P. Vachali, A. Gorusupudi, R. Shyam, B.S. Henriksen, J.M. Nolan,

Lutein, zeaxanthin, and meso-zeaxanthin: the basic and clinical science underlying carotenoid-

based nutritional interventions against ocular disease, Prog. Retin. Eye Res. 50, 2016, 34–66.

24. J.N. Keller, F.A. Schmitt, S.W. Scheff, Q. Ding, Q. Chen, D.A. Butterfield, W.R.

Markesbery, Evidence of increased oxidative damage in subjects with mild cognitive

impairment, Neurology 64, 2005, 1152–1156.

25. Unpublished data on file, DSM Nutritional Products.

26. Food Standards Agency. Eat well, be well. London: FSA, 2006.

27. C.A. Rice-Evans, J. Sampson, P.M. Bramley, D.E. Holloway, Free Radic. Res. 26, 1997,

381.

28. A. El-Agamey, G.M. Lowe, D.J. McGarvey, A. Mortensen, D.M. Phillip, T.G. Truscott, A.J.

Young, Arch. Biochem. Biophys. 430, 2004, 37.

29. van Poppel G, Spanhaak S, Ockhuizen T. Effect of β-carotene on immunological indexes in

healthy male smokers. Am J Clin Nutr. 1993, 57(3), 402-407.

30. Hughes DA, Wright AJ, Finglas PM, et al. The effect of β-carotene supplementation on the

immune function of blood monocytes from healthy male nonsmokers. J Lab Clin Med. 1997,

129(3), 309-317.

31. Santos MS, Gaziano JM, Leka LS, Beharka AA, Hennekens CH, Meydani SN. β-Carotene-

induced enhancement of natural killer cell activity in elderly men: an investigation of the role of

cytokines. Am J Clin Nutr. 1998, 68(1), 164-170.

32. Hughes DA, Wright AJ, Finglas PM, et al. Effects of lycopene and lutein supplementation

on the expression of functionally associated surface molecules on blood monocytes from healthy

male nonsmokers. J Infect Dis. 2000, 182 Suppl 1:S11-15.

33. Watzl B, Bub A, Blockhaus M, et al. Prolonged tomato juice consumption has no effect on

cell-mediated immunity of well-nourished elderly men and women. J Nutr. 2000, 130(7), 1719-

1723.

34. Corridan BM, O'Donoghue M, Hughes DA, Morrissey PA. Low-dose supplementation with

lycopene or β-carotene does not enhance cell-mediated immunity in healthy free-living elderly

humans. Eur J Clin Nutr. 2001, 55(8), 627-635.

35. J.C. Bauernfeind, J. Agric. Food Chem. 20, 1972, 456–473.

36. M. Careri, L. Furlattini, A. Mangia, M. Musci, E. Anklam, A. Theobald, C. von Holst, J.

Chromatogr. A 912, 2001, 61–71.

37. Shi, J. Lycopene in tomatoes: Chemical and physical properties affected by food processing.

Crit Rev Biotech. 20(4), 293–334, 2000.

38. Nguyen, M. L., and Schwartz, S. J., Lycopene: Chemical and biological properties. Food

Tech. 53(2), 38–45, 1999.

39. Shi, J., and LeMaguer, M., Lycopene in tomatoes: Chemical and physical properties affected

by food processing. Crit Rev Food Sci Nutr. 40(1), 1–42, 2000.

40. Alves-Rodrigues, A., and Shao, A., The science behind lutein. Toxicol Lett. 150, 57–83,

2004.

41. Holden, J. M., Eldridge, A. L., Beecher, G. R., Buzzard, I. M., Bhagwat, S., Davis, C. S.,

Douglass, L. W., Gebhardt, S., Haytowitz, D., and Schake, S. I., Carotenoid content of U.S.

foods: An update of the database. J Food Compos Anal. 12, 1696–196, 1999.

42. Sowbhagya, H. B., Sampathu S. R., and Krishnamurthy, N., Natural colorant from marigold:

Chemistry and technology. Food Rev Int. 20(l): 33–50 (2004).

43. D.B. Rodriguez-Amaya, M. Kimura, Harvest Plus Handbook for Carotenoid Analysis,

Harvestplus Technical Monograph Series 2, Washington D.C., 2004.

44. J. Oliver, A. Palou, J. Chromatogr. A 881, 2000, 543–555.

45. D.F. Steenson, D.B. Min, J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 2000, 1153–1160.

46. C.S. Boon, D.J. Mcclements, J. Weiss, E.A. Decker, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50, 2010,

515–532.

47. A.I.O. Barba, M.C. Hurtado, M.C.S. Mata, V.F. Ruiz, M.L.S. de Tejada, Food Chem. 95,

2006, 328–336.

48. F. Xu, Q.P. Yuan, H.R. Dong, J. Chromatogr. B 838, 2006, 44–49.

49. J. Szpylka, J.W. Devries, J. AOAC Int. 88, 2005, 1279–1291.

50. M.G. Ferruzzi, L.C. Sander, C.L. Rock, S.J. Schwartz, Anal. Biochem. 256 (1998) 74–81.

51. S.M. Silva, S.A. Rocco, K.A. Sampaio, T. Taham, L.H.M. da Silva, R. Ceriani, A.J.A.

Meirelles, Food Chem. 129, 2011, 1874–1881.

52. X. Chen, J. Wu, S. Zhou, Y. Yang, X. Ni, J. Yang, Z. Zhu, C. Shi, J. Food Compos. Anal. 22,

2009, 148–153.

53. W.W. Fish, Postharvest Biol. Technol. 66, 2012, 16–22.

54. G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander (Eds.), Carotenoids: Spectroscopy, vol. 1B,

Birkhauser Verlag, Basel, 1995.

55. J. Schierle, T. Schellenberger, C. Fizet, R. Betz, Eur. Food Res. Technol. 215, 2002, 268–

274.

Determinarea nitraților utilizand un senzor optic de fluorescenta

A fost propusă o metodă fluorimetrică simplă, sensibilă și selectivă pentru determinarea

cantităților de nitrați din diferite probe de apă (de exemplu, apă uzată geotermală, apă de izvor,

apă de suprafață, apă subterană și apă reziduală). Pentru creșterea, optimizarea semnalului,

determinarea fiabilă, adecvată și durabilă a nitraților au fost investigați diferiţi coloranți

fluorescenți. Clorura de dietilamoniu [9-(2-carboxifenil)-6-dietilamino-3-xanteniliden]

(rodamina B) a fost aleasă pentru determinarea fluorimetrică directă a nitraţilor într-o soluție

tampon acetat pH de 5.6. În condiții optime experimentale, nitratul poate fi determinat în

intervalul de concentraţii 1.00x10−4 – 1.00x10−3 mol L−1 (8.5 - 85 mg L-1) cu limită de detecție

1.173x10−6 mol L−1 (0.1 mg L-1). Metoda propusă a fost aplicată cu succes la determinarea

nitraților din diverse probe de apă. Rezultatele au fost comparate favorabil cu cele obținute prin

metoda certificată ISO.

Introducere

Nitriții și nitrații sunt implicați în ciclul general de azot din sol și plantele superioare [1]. Nitrații

se găsesc în mod natural în plante, sunt secretați din salivă și au fost folosiți ca aditivi pentru o

lungă perioadă de timp în industria alimentară [2]. Nitratul este o substanță foarte importantă

care este utilizată pe scară largă în îngrășămintele anorganice în producția agricolă. Cu toate

acestea, prin supraîncărcarea și utilizarea ineficientă a îngrășămintelor în activitățile agricole,

deversarea agricolă a nitraților devine un factor major în eutrofizarea râurilor și lacurilor. În plus,

prin formarea produsilor de fertilizare din nitrați, aceste substanțe poluante devin un pericol în

diferite zone de apă daunând sănătății [3-9]. Limita admisă de nitrat pentru apă potabilă este de

45 mg L–1, concentrațiile ridicate conducând la metemoglobinemie la sugari [9]. Concentrațiile

în exces de nitriți și nitrati în apa de băut sunt periculoase pentru sănătate, în special pentru

femeile gravide. Principalele amenințări la adresa sănătății care apar în urma ingerării acestor

ioni sunt cunoscute ca sindromul „blue baby“ și cancerul gastric [11-18]. Acești anioni

reacționează cu aminele secundare în mediul acid al stomacului. Rezultatul, este producția de

nitrozamine carcinogene implicate în patologia cancerului gastric [11,15]. Determinarea

azotatului este foarte importantă în analiza solurilor, a alimentelor și a apelor naturale.

Mai multe organizații internaționale implicate în problemele de mediu sau în sănătate, sunt în

măsură să îmbunătățească unul sau mai multe aspecte ale eficienței nutrienților în apa potabilă,

iar unele au impus limite stricte în ceea ce privește cantitatea maximă de contaminanți ce pot fi

găsiti în apa de băut. Standardele actuale stabilite de Agenția pentru Protecția Mediului din SUA

(EPA) pentru apa potabilă sunt 1 mg L–1 pentru nitrit-azot (NO–2 –N), 10 mg L–1 nitrat-azot (NO–

3 –N) și 10 mg L–1 pentru NO–2 –N + NO–3 –N [19]. Subcomitetul Consiliului Național de

Cercetare (NRC) privind nitrații și nitriții din apa potabilă a fost de acord cu standardele actuale

pentru apa potabilă impuse de EPA pentru acești anioni sunt adecvate pentru a proteja sănătatea

umană [20].

Prezența și nivelul de nitrați din apele poluate este de mare interes și au fost dezvoltate de-a

lungul anilor diverse tehnici pentru detectia și reducerea lor din diferite zone [2,21-34]. Deoarece

determinarea simultană a nitriților și nitraților este extrem de importantă în chimia mediului, sunt

prezentate în acest sens numeroase metode analitice. Tehnicile utilizate pentru determinarea

simultană a nitritului și nitratului includ tehnici cromatografice precum: cromatografie lichidă de

înaltă performanță (HPLC) [22,23] și cromatografie ionică (IC) [24], detecție electrochimică

[25], spectrometrie moleculară de absorbție electrotermică [26], flow-injection cu detector de

chemiluminiscenţă [27] sau FIA cu metode spectrofotometrice [28-30], (de exemplu reactia

Griess [31-33]) și electroforeza capilară [34].

Din cunoștințele noastre, în literatură nu există nici o determinare directă a nitraților din râuri și

lacuri. Prin urmare, am dezvoltat o metodă inovatoare, simplă, sensibilă și selectivă pentru

determinarea nitratului. Determinarea fluorimetrică se bazează pe reacția directă a nitratului cu

un colorant fluorescent, clorură de dietilamoniu [9-(2-carboxifenil)-6-dietilamino-3-xanteniliden]

(rodamina B) într-o soluție de tampon acetat la un pH de 5.6. Metoda propusă a fost aplicată cu

succes la determinarea nitraților din diferite probe de apă, iar rezultatele obținute au fost

comparate cu succes cu cele obținute prin metoda certificată ISO.

Materiale si metode

Reactivi si materiale. - Azotat de sodiu, Malachite Green, rodamina B, acid acetic, acetat de

sodiu, acid clorhidric, hidroxid de sodiu au fost achiziţionate de la Sigma-Aldrich. Toți reactivii

au fost de puritate analitică, iar soluțiile au fost preparate folosind apă deionizată obținută dintr-

un sistem de purificare a apei Direct-Q3 (Millipore Corporation, Franța). Soluțiile de lucru au

fost preparate zilnic prin diluarea soluției stoc cu apă deionizată. Toate determinările au fost

efectuate la temperatura camerei (25°C).

A fost preparată o soluție stoc de azotat de sodiu de concentrație 1.00x10−2 mol L−1 prin

dizolvarea a 0.2125 g in 250 mL apă deionizată [28-30] și păstrate in congelator.

S-au preparat diferite soluții de tampon acetat (ABS, 0.1 mol L−1) cu pH cuprins între 3-9 prin

adăugarea de volume apropiate de soluție acid acetic 0.2 mol L−1 și acetat de sodiu 0.2 mol L−1.

pH-ul soluțiilor tampon s-a adjustat cu soluții de HCl sau NaOH 0.1 mol L-1 pană la un pH

necesar în măsurători.

Pentru testele preliminare s-au preparat soluții stoc de concentrație 1.00x10−4 mol L−1 (100.00

µmol L-1) pentru următorii coloranți: Malachite Green și rodamina B. Soluțiile de lucru pentru

coloranți au fost preparate prin diluarea soluției stoc cu apă deionizată și ținute la întuneric.

Aparatura. - Pentru a ajusta pH-ul la valorile dorite s-a fost utilizat un pH-metru Mettler Toledo

(model Seven Compact).

Măsurătorile de fluorescență au fost realizate cu un spectrometru QE65000 de la Ocean Optics

(Dunedin, Florida) echipat cu o lampă de xenon (HPX 2000). Sursa de lumină este de putere si

intensitate mare, si este utilă în special pentru aplicațiile fluorescente și alte aplicații în care este

necesară o lampă cu intensitate ridicată. Spectrometrul QE65000 este un spectrometru foarte

sensibil. Rezultatele au fost obținute cu ajutorul software-ului Spectra Suite, iar datele au fost

procesate folosind SigmaPlot.

Procedura experimentală pentru calibrare. - Soluțiile pentru curbele de calibrare au fost

preparate în baloane cotate de 10 ml. Intensitatea fluorescenței fiecăreia dintre soluții a fost

măsurată într-o cuvă de cuarț de 1 cm la o lungime de undă de 594 nm și la temperatura camerei

(25°C).

Prepararea probelor. - Probele de apă (de exemplu, apă uzată geotermală, apă de izvor, apă de

suprafață, apă subterană și apă reziduală) provin din diferite bazine hidrografice si au fost

furnizate de Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Ecologie Industrială (INCD-

ECOIND). Aceste probe de apă au fost deja pre-analizate prin metode de laborator standardizate,

cu metode standard ISO pentru nitrați.

Rezultate si discuții

Alegerea colorantului optim. - Testele preliminare s-au efectuat mai întâi cu unii dintre coloranții

fluorescenți cum ar fi Malachit Green și rodamina B. Toate experimentele au fost realizate

utilizând soluții care conțin aceleași concentrații ale coloranților individuali 1.00x10-5 mol L-1 cu

nitrat 1.00x10-4 mol L-1 la diferite pH-uri ale soluției de tampon acetat (pH = 3-9) sau nitrat

singur la diferite pH-uri ale soluției de tampon acetat (figura 1).

Figura 1. Efectul pH-ului asupra intensității fluorescenței. Concentrațiile de nitrat, Malachite

Green, rodamina B au fost 1.00x10-4 mol L-1 (8.5 mg L-1), 1.00x10-5 mol L-1 (100.00 µmol L-1),

1.00x10-5 mol L-1 (100.00 µmol L-1).

După cum se poate observa in figura 1, nitratul fără coloranți și nitratul cu Malachite Green la

diferite pH-uri de ABS au aproximativ aceeași intensitate.

Alegerea pH-ului optim pentru solutia de tampon acetat (ABS). - Pentru optimizarea pH-ului s-

au preparat soluţii formate din tampon acetat de concentratie 0.1 M (pH=3.59, 4.43, 4.65, 5.03,

5.62), rodamina B (10-5M) si NaNO3 10-2M (v:v:v=1:1:1). In figura 2 sunt prezentate rezultatele,

astfel ca pH-ul optim a fost, 4.65.

Figura 2. Influenta intesitatii la diferite pH-uri de solutie de tampon acetat

S-a observat o îmbunătățire a intensității când s-a utilizat rodamina B cu nitrat la diferite pH-uri

de ABS. Rezultatele arată că la pH-ul de 5.6 al soluției tampon acetat cu rodamină B s-au obținut

cele mai bune rezultate și prin urmare acest pH a fost selectat pentru următoarele experimente.

Figura 3 arată spectrele de fluorescența la diferite concentrații de rodamină B 10-8 mol L-1 (0.01

µmol L-1) - 10-4 mol L-1 (100.00 µmol L-1) in ABS la pH 5.6 și nitrat la 1.00x10-4 mol L-1. Se

poate observa că concentrația optimă pentru rodamina B este 1.00x10−5 mol L−1 (10 µmol L-1) la

o lungime de undă maximă de 596 nm.

Figura 3. Spectrele de fluorescență pentru rodamina B la diferite concentrații 10-8 mol L-1 (0.01

µmol L-1) - 10-4 mol L-1 (100.00 µmol L-1) cu ABS pH=5.6 și nitrat 1.00x10-4 mol L-1 (8.5 mg L-

1); insert: intensitate vs. concentrație (µmol L-1) pentru rodamina B.

Liniaritatea, sensibilitatea și precizia. - Curba de calibrare a nitratului s-a obținut în intervalul de

concentrație de 1.00x10−4 mol L−1 (8.5 mg L-1) și 1.00x10−3 mol L−1 (85.00 mg L-1) în condiții

optime (figura 4). Ecuația de regresie a fost I=3529.1–56511.31×C, unde I intensitatea

fluorescenței și C concentrația de nitrat (µmol L−1), respectiv coeficientul de corelare (R2) 1.00

(figura 5). Limita de cuantificare a fost de 1.00x10−4 mol L−1 (8.5 mg L-1), limita de determinare

de 1.173x10−6 mol L−1 (0.1 mg L-1) și deviația standard relativa de (N = 5) 0.09% pentru o

concentrație de 4.00x10−4 mol L−1 (34 mg L-1) de nitrat.

Figura 4. Spectrele de fluorescența la diferite concentrații de nitrat. Condiții: [RhB]=1.00x10−5

mol L−1 (10 µmol L-1), pHABS=5.6; insert: a – intregul spectru; b – spectrul mărit.

Figura 5. Curba de calibrare pentru determinarea nitraților.

Efectul interferenților. - S-a studiat de asemenea efectele diferiților interferenți (cationi și

anioni) asupra determinării nitraților la o concentrație de 4.00x10−4 mol L−1 (34 mg L-1), și

rezultatele sunt prezentate in tabelul 1. Limita de toleranță a fost definită ca fiind concentrația de

ioni străini ce cauzează cel puțin o eroare relativă de ± 5% in fluorescența probei etalon. Așa

cum se poate vedea in tabel, metoda propusă prezintă o bună selectivitate, majoritatea ionilor

examinați nu au nicio influență asupra determinării nitraților.

Tabel 1. Limita tolerată pentru interferenți in determinarea nitratului 4.00x10−4 mol L−1 (34 mg

L-1).

Interferenți Limita tolerată (raport molar)

Br - 1000 K+ 500

SO42- 500

CO −3 500

HCO3- 100

NO2- 50

Fe2+ 10

Co2+ 10

Zn2+ 10

Cu2+ 10

PO43- 10

Cl- 10

Determinarea nitratilor din probele de apă. - Metoda fluorimetrică a fost aplicată pentru

determinarea nitratilor din diferite probe de apă (de exemplu, apă uzată geotermală, apă de izvor,

apă de suprafață, apă subterană și apă reziduală). Rezultatele prezentate in tabelul 2 arată că

gradul de recuperare din probe este de 90.24 si 91.24%, iar deviatia standard relativă (RSD%)

mai mică de 0.4% (n=5; n-numărul de determinări). Rezultatele au fost comparate cu cele

obținute utilizând metoda certificată standard ISO (metoda spectrofotometrică utilizând

standardul SR ISO 7890-3: 2000). Există o bună corelație între rezultatele obținute prin metoda

propusă și metoda certificată ISO pentru analiza nitraților.

Tabel 2. Comparatie intre metoda standard si metoda propusă pentru determinarea nitratilor din

diferite probe de apă.

Proba Metoda propusă (mg L−1)

Metoda standarda (mg L−1)

Grad de recuperare

(%)

RSD (%)b

Apă nepotabilă (1) 13.77 15.09 91.24 0.24

Apă de retea (2) 19.28 21.22 90.85 0.15

Apă subterană (3) 8.89 9.79 90.85 0.30

Probă apă (4) 27.34 30.13 90.74 0.02

Apă potabilă din izvor (5)

10.98 12.11 90.64 0.01

Apă potabilă din izvor (6)

36.70 40.48 90.67 0.09

Apă subterană (7) 1.20 1.32 90.77 0.13

Apă uzată geotermală (8)

3.20 3.55 90.24 0.03

Apă de suptafată (9) 5.57 6.16 90.37 0.13

Apă potabilă din izvor (10)

18.28 20.23 90.38 0.11

aMetoda certificată ISO (SR ISO 7890-3:2000).

bDeviatia standard relativă din 5 determinări (n =5).

Concluzii

Metoda utilizată prezintă selectivitate si sensibilitate ridicată pentru determinarea nitraților din

diferite probe de apă. Prin metoda fluorimetrică propusă s-au obtinut rezultate satisfăcătoare în

comparaţie cu metoda certificată ISO.

Bibliografie

1. Buckman, H.O., Brady, N.C., 1969. The Nature and Properties of Soils. 7th Edition,

Macmillan, New York, (Chapter 16).

2. Wang, Q.-H., Yu, L.-J., Liu, Y., Lin, L., Lu, R.-G., Zhu, J.-P., He, L., Lu, Z.-L., 2017.

Methods for the detection and determination of nitrite and nitrate: A review. Talanta 165, 709–

720.

3. Menció, A., Mas-Pla, J., Otero, N., Regàs, O., Boy-Roura, M., Puig, R., Bach, J., Domènech,

C., Zamorano, M., Brusi, D., Folch, A., 2016. Nitrate pollution of groundwater; all right…, but

nothing else?. Sci. Total Environ. 539, 241–251.

4. Wakida, F.T., Lerner, D.N., 2005. Non-agricultural sources of groundwater nitrate: a review

and case study. Water Res. 39, 3–16.

5. Cortesi, M.L, Vollano, L., Peruzy, M.F., Marro, R., Mercogliano, R., 2015. Determination of

nitrate and nitrite levels in infant foods marketed in Southern Italy. CYTA J. Food 13 (4), 629–

634.

6. Lijinsky, W., 1999. N-nitroso compounds in the diet. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ.

Mutagen. 443, 129–138.

7. Pannala, A.S., Mani, A.R., Spencer, J.P.E., Skinner, V., Bruckdorfer, K.R., Moore, K.P., Rice-

Evans, C.A., 2003. The effect of dietary nitrate on salivary, plasma, and urinary nitrate

metabolism in humans. Free Radic. Biol. Med. 34, 576–584.

8. Santamaria, P., 2006. Nitrate in vegetables: Toxicity, content, intake and EC regulation. J. Sci.

Food Agr. 86, 10–17.

9. WHO/SDE/WSH/07.01/16/Rev/1., 2016. Nitrate and nitrite in drinking-water.

10. Eaton, A.D., Clescheri, L.S., Greenberg, A.E., 1995. Standard Methods for the Examination

of Water and Wastewater, 19th Edition, American Public Health Association, Washington.

11. Swann, P.F., 1975. The toxicology of nitrate, nitrite and n-nitroso compounds. J. Sci. Food.

Agr. 26, 1761–1770.

12. Bruning-Fann, C.S., Kaneene, J.B., 1993. The effects of nitrate, nitrite and N-nitroso

compounds on human health: a review. Vet. Hum. Toxicol. 35, 521–538.

13. Eaton, A.D., Clescheri, L.S., Greenberg, A.E., 1978. Standard methods for the examination

of water and wastewater. 16th Edition, American Public Health Association, New York.

14. Cox, R.D., Frank, C.W., 1982. Determination of nitrate and nitrite in blood and urine by

chemiluminescence. J. Anal. Toxicol. 6, 148–152.

15. Kuiper, M.A., Visser, J.J., Bergmans, P.L., Scheltens, P., Wolters, E.C., 1994. Decreased

cerebrospinal fluid nitrate level in Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and multiple system

atrophy. J. Neurol. Sci. 121, 46–49.

16. McNally, B., Griffin, J.L., Roberts, L.D., 2016. Dietary inorganic nitrate: from villain to hero

in metabolic disease?. Mol. Nutr. Food Res. 60, 67-78.

17. Carter, P., Gray, L.J., Troughton, J., Khunti, K., Davies, M.J., 2010. Fruit and vegetable

intake and incidence of type 2 diabetes mellitus: systematic review and meta-analysis. Br. Med.

J. 341, 1-8.

18. Ghasemi, A., Jeddi, S., 2017. Anti-obesity and anti-diabetic effects of nitrate and nitrite.

Nitric Oxide 70, 9-24.

19. EPA (Environmental Protection Agency), 1991. National primary drinking water regulations,

final rule. Fed. Reg. 56, 3526–3597.

20. NRC (National Research Council), 1995. Nitrate and nitrite in drinking water. National

Academy Press, Washington, DC, Subcommittee on Nitrate and Nitrite in Drinking Water.

21. Moorcroft, M.J., Davis, J., Compton, R.G., 2001. Detection and determination of nitrate and

nitrite: a review. Talanta 54, 785–803.

22. Zuo, Y., Wang, C., Van, T., 2006. Simultaneous determination of nitrite and nitrate in dew,

rain, snow and lake water samples by ion-pair high-performance liquid chromatography. Talanta

70, 281–285.

23. Kok, S.H., Buckle, K.A., Wootton, M., 1983. Determination of nitrate and nitrite in water

using high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 260, 189–192.

24. Ito, K., Takayama, Y., Makabe, N., Mitsui, R., Hirokawa, T., 2005. Ion chromatography for

determination of nitrite and nitrate in seawater using monolithic ODS columns. J. Chromatogr. A

1083, 63–67.

25. Davis, J., Moorcroft, M.J., Wilkins, S.J., Compton, R.G., Cardosi, M.F., 2000.

Electrochemical detection of nitrate and nitrite at a copper modified electrode. Analyst 125, 737–

742.

26. Brandao, G.C., Matos, G.D., Pereira, R.N., Ferreira, S.L.C., 2014. Development of a simple

method for the determination of nitrite and nitrate in groundwater by high-resolution continuum

source electrothermal molecular absorption spectrometry. Anal. Chim. Acta 806, 101–106.

27. Yaqoob, M., Biot, B.F., Nabi, A., Worsfold, P.J., 2012. Determination of nitrate and nitrite in

freshwaters using flow-injection with luminol chemiluminescence detection. Luminescence 17,

419–425.

28. van Staden, J.F., 1982. Automated simultaneous determination of nitrate and nitrite by

prevalve reduction of nitrate in a flow-injection system. Anal. Chim. Acta 138, 403–408.

29. Pauer, J.J., van Vliet, H.R., van Staden, J.F., 1990. The automated determination of nitrate in

water. Water SA 16 (2), 105 - 108.

30. van Staden, J.F., Makhafola, M.A., 1999. Simultaneous spectrophotometric determination of

nitrate and nitrite in foodstuffs/water by flow injection analysis. S. Afr. J. Chem. 52 (1), 49 - 54.

31. Griess, J.P., 1857. On new nitrogenous derivatives of the phenyl- and benzoyl-series. Proc.

R. Soc. Lond. 9, 594–597.

32. Griess, J.P., 1861. Ueber eine Neue Klasse Organischer Verbindungen, in Welchcn

Wasserstoff Durch Stickstoff Vertreten ist. Annalen der Chemie und Pharmacie 17, 1–67.

33. Griess, J.P., 1879. Bemerkungen zu der Abhandlung der HH.Weselsky und Benedikt. Ueber

einige Azoverbindungen Ber 12, 426–428.

34. Fukushi, K., Ishio, N., Sumida, M., Takeda, S., Wakida, S., Hiiro, K., 2000. Improvement of

capillary zone electrophoresis sensitivity with artificial seawater as the background electrolyte

utilizing transient isotachophoresis for the determination of nitrite and nitrate ions in seawater.

Electrophoresis 21, 2866–2871.

Determinarea L-Tirozinei din capsule farmaceutice utilizând electrozi pe baza

de grafit

Doi senzori bazati pe grafit nativ si grafit modificat cu chitosan (Ch) au fost evaluati și testati

pentru capacitatea lor de analiză a L-Tirozinei din capsulele farmaceutice (de exemplu, L-

Tirozină) utilizând voltametria puls diferențială. Au fost optimizate condițiile experimentale de

lucru, ca: stabilirea pH-ului și al electrolitului suport pentru senzorii propuși. S-a obținut un

coeficient de corelație foarte bun, mai mare decât 0.9977. Cea mai mica limita de cuantificare:

0.18 mg L-1 (G) și respectiv 0.0018 mg L-1 (Ch/G) cand se utilizează KCI de concentratie 1 mol

L-1 si solutie de tampon carbonat la pH=8.6. Sensibilitatea cea mai ridicata a fost obținută pentru

electrodul G 7.95x10-10 A mg L-1, atunci cand se foloseste ca electrolit de suport NaCl de

concentratie 1 mol L-1 cu solutie de tampon carbonat la pH=8.6. Senzorii au fost utilizați pentru

testul de recuperare a L-Tirozinei din capsulele farmaceutice de L-Tirozină și rezultatele au

arătat că L-Tirozina poate fi recuperată din acestea cu o valoare medie mai mare de 98% și o

deviație standard relativă (RSD%) valoare mai mică de 1.00% (N = 5). Cea mai buna recuperare

de 99.7% si o valoare a deviatiei standard relative mai mică decât 0.80 (N=5) a fost totuși

observata pentru senzorul de Ch/G cand s-a folosit solutie CBS la pH 8.6 si KCl 1 mol L-1ca si

electroliti suport. Acidul ascorbic (vitamina C) nu interfera in masuratori.

Introducere

Aminoacizii sunt cunoscuți ca fiind precursori pentru diferite substanțe biologice

semnificative [1].

L-Tirozina (L-Tir sau 4-hidroxi fenilalanina) este, de asemenea, un aminoacid esențial cu

un grup lateral polar care este utilizat de celule drept precursor al proteinelor sintetizate și,

împreună cu epinefrina, este o parte vitală a neurotransmițătorilor, a sistemului de transducție a

semnalului și a hormonilor din creierul uman [2].

L-Tirozina este indispensabilă la oameni pentru stabilirea și menținerea echilibrului

nutrițional [3]. Conținutul tirozinei în corp este corelat cu starea sănătoasă a persoanei [4]. L-Tir

se găsește, de asemenea, în proteinele naturale, si este utilizat pe scară largă în industria

alimentară ca antioxidant și în industria farmaceutică ca biomarker. În plus, joacă un rol

important în mai multe procese biologice [5].

Unele studii au arătat că alimentele care conțin tirozină, cum ar fi: brânza, mielul, soia,

carnea de porc, peștele, carnea de vită, puiul, nucile, semințele, ouăle, laptele, fasolea și cerealele

integrale pot îmbunătăți memoria oamenilor sub stres [6]. O deficiență de L-Tir poate induce

afecțiuni precum hipocondria, demența, hipotiroidismul, Parkinson [7,8], în timp ce o

concentrație ridicată de L-Tir are ca rezultat cresterea „sister chromatid exchange” [9] și

hipertiroidismul. O serie de investigații au confirmat faptul că L-Tir este util în tratarea stresului,

frigului, oboselii [10], deprivarea somnului, a muncii prelungite [11] si in reducerea nivelurilor

hormonilor de stres [12]. De asemenea, excrețiile urinare sunt legate de diabet zaharat și

insuficiență renală [13].

Materialele de carbon au fost utilizate în investigațiile electroanalitice datorita inerției lor

chimice, a domeniului larg de potențial și a potrivirii pentru diferite tipuri de analize [14,15].

Substratul pe bază de carbon, cum ar fi grafitul (G), este utilizat ca material de electrod datorită

proprietăților legate de conductivitatea electrica buna [16]. Din păcate, aminoacizii au un răspuns

electrochimic slab pe electrozii în stare solidă, prin urmare se folosesc modificări chimice pentru

a-și îmbunătăți răspunsul electrochimic.

Chitosan (Ch) este cea mai abundentă polizaharidă extrasă din animale, cum ar fi

exoscheletele de crustacee (în special crabii și creveții), insectele și pereții celulari ai fungiilor

[17]. Una dintre cele mai importante caracteristici ale chitosanului este versatilitatea sa

structurală datorată prezenței grupărilor reactive amino și hidroxil în lanțul său liniar [18]. S-au

găsit metode electrochimice pentru determinarea aminoacizilor electro activi datorate electro

activității grupărilor aromatice, incluzând si tirozina [19].

Au fost aplicate numeroase metode de determinare a tirozinei, metode fluorometrice [20],

chemiluminescența [21,22], analiza spectrometrică [23,24], cromatografia lichidă de înaltă

performanță [25,26], electroforeza capilară [27,28], electroforeza capilară cu detecție

amperometrică (AD), detecția de fluorescentă indusă prin laser (FID) [29,30], cromatografia

lichidă cuplata cu spectrometria de masă [31], cromatografia in gaz cuplata cu spectrometria de

masă [32,33].

Aceste metode sunt foarte precise, dar costisitoare și necesită proceduri de pregătire a

probelor în mai multe etape care le fac laborioase și consumatoare de timp. În comparație cu

tehnicile convenționale menționate mai sus, detectarea electrochimică a tirozinei este în general

simplă, rapidă și stabilă [34].

Au fost evaluati si testati senzori bazati pe grafit si grafit modificat cu chitosan pentru

analiza L-Tirozinei din capsulele farmaceutice.

Experimental

Materiale si reactivi. - Toate substanțele folosite au fost de puritate analitică. L-Tirozina,

KCl, NaCl, HCl, NaOH, KHCO3 si K2CO3 au fost procurate de la Sigma-Aldrich. Pentru

prepararea senzorilor, pudra de grafit si chitosanul extras din carapacea crabilor au fost

achizitionate de la Sigma Aldrich si uleiul de parafina (d420, 0.86g cm-1) de la Fluka.

Solutiile tampon de carbonat (CBS, 0.1 mol L−1) cu pH-uri = 8, 8.6, 9.2, 9.6, 10, 10.6 au

fost preparate folosind diferite raporturi intre KHCO3 si K2CO3. pH-ul a fost adjustat cu solutii

de HCl sau NaOH 0.1 mol L-1 pana la pH-ul necesar in măsurători.

Pentru voltametria puls diferentiala (DPV) a fost preparata o solutie stoc standard de L-

Tirozina de concentratie 1.00x10-2 mol L−1 (1811.90 mg L-1) in apa deionizata. Toate solutiile de

L-Tirozina de concentratii 1.00x10-10 – 1.00x10-3 mol L−1 (0.000018 – 181.19 mg L-1) au fost

preparate din solutia stoc prin metoda dilutiilor repetate cu apa deionizata, solutie de tampon

carbonat pH=8.6 si NaCl sau KCl de concentratie 1 mol L−1 ca electrolit suport.

Toate soluțiile au fost preparate folosind apă deionizată obținută dintr-un sistem de

purificare a apei Direct-Q3 (Millipore Corporation, Franța).

Aparate si metode. – Toate masuratorile au fost realizate cu AUTOLAB/ PGSTAT 128N

potentiostat/galvanostat conectat la un calculator cu software-ul NOVA 2.1.2 folosit pentru

inregistrarea masuratorilor, iar datele au fost procesate folosind SigmaPlot. Celula electrochimica

compusa din trei electrozi. Electrodul Ag/AgCl (0.1 mol L-1) folosit drept referinta, electrodul de

platina utilizat ca si contra-electrod si noii senzori propusi au servit ca electrozi de lucru în celula

electrochimică. Curbele DPV au fost inregistrate cu o viteza de baleiaj de 0.01 V s-1, cu o

inaltime de puls de 0.025 V si cu un increment de timp de 0.05 V.

Pentru a ajusta pH-ul la valorile dorite s-a fost utilizat un pH-metru Mettler Toledo

(model Seven Compact).

Toate determinările au fost efectuate la temperatura camerei (25°C).

Designul microsensorilor G, Ch/G. - Pasta de grafit a fost preparata prin amestecarea a

100 mg pudra de grafit cu 30 μL ulei de parafina. Pentru pasta de grafit modificata cu chitosan s-

au amestecat 25 μL din solutia de chitosan de concentratie 1.00x10-5 mol L−1 (in acid acetic 0.1

mol L-1), 100 mg pudra de grafit si 25 μL ulei de parafina. Pastele de grafit se pastreaza in

recipiente de plastic foarte mici. Contactul electric s-a obtinut prin introducerea unui fir de argint

in pasta preparata. Suprafața electrodului a fost reînnoită prin lustruirea pe o folie de aluminiu.

Când nu sunt utilizati, senzorii se pastreaza într-un loc uscat, departe de lumina zilei și la

temperatura camerei.

Testul de uniformitate al conținutului capsulelor de L-Tirozină. - Au fost dizolvate

10 capsule de L-Tirozina (1 capsula farmaceutica de L-Tirozina contine 500 mg de L-Tirozina)

in baloane cotate de 500 mL cu apa deionizata. Pentru fiecare proba electrolitii suport NaCl 1

mol L-1 sau KCl 1 mol L-1 au fost utilizati în plus cu CBS pH=8.6. L-Tirozina a fost determinată

din probe.

Rezultate si discutii

Optimizarea conditiilor de lucru. – Voltametria puls diferentiala a fost utilizata pentru

optimizarea conditiilor de lucru folosind o solutie de L-Tirozina de concentratie 1.00x10-4 mol L-

1 (18.12 mg L-1) la diferite pH-uri ale tamponului CBS: 8, 8.6, 9.2, 9.6, 10, 10.6 si in amestec cu

diferiti electroliti suport NaCl 1 mol L-1 si KCl 1 mol L-1. Figura 1 (a și b) prezintă efectul pH-

ului și al electrolitului suport asupra înălțimii picului. Cele mai bune sensibilități și forma picului

in determinarea L-Tirozinei utilizand ambii senzori se observa la un pH de 8.6 în soluție de KCI

1 mol L-1. Prin urmare, pH-ul optim de lucru a fost stabilit la 8.6 (tampon carbonat). Totusi

pentru următoarele determinari au fost utilizați ambii electroliți suport NaCI 1 mol L-1 și KCl 1

mol L-1.

A

B

Figura 1. Efectul electrolitului și al pH-ul asupra înălțimii picului pentru soluția de L-Tirozina

cu o concentratie de 18.12 mg L-1: (a) G si (b) Ch/G, unde I este inaltimea picului (nA).

Raspunsul caracteristic pentru determinarea de L-Tirozina. - În figura 2 sunt

prezentate curbele DPV pentru senzorul nemodificat și pentru cel modificat cu chitosan la

diferite concentrații de L-Tirozină în soluție de tampon carbonat de concentratie 0.1 mol L-1 la

pH-ul optim, obtinut mai sus. Figura 2 (a, b, c și d) inserata prezintă curba de calibrare a fiecărui

senzor, dependenta inaltimii picului in functie de concentrația de L-Tir exprimata în mg L-1

pentru ambii electroliți suport NaCI 1 mol L-1 și KCI 1 mol L-1.

A

B

C

D

Figura 2. Curbe DPV pentru senzorul de grafit si grafit modificat cu chitosan in electrolitii

suport NaCl si KCl a) G (CBS+NaCl), b) G (CBS+KCl), c) Ch/G (CBS+NaCl); d) Ch/G

(CBS+KCl); inserat (fig. 2) este descrisa curba de calibrare pentru fiecare electod dependenta

inaltimii picului vs concentratie L-Tirozina (mg L-1).

Tabelul I prezinta raspunsul caracteristic pentru ambii senzori folosind electrolitii suport

NaCl 1 mol L-1 si KCl 1 mol L-1. Coeficienti buni de corelatie (mai mari de 0.9977) au fost

obtinuti pentru ambii senzorii. Se poate observa că atunci cand s-a folosit electrolitul suport KCI

1 mol L-1 atat pentru electrodul nemodificat cat și pentru cel modificat cu chitosan s-a obtinut

cea mai mica limita de cuantificare 1.00x10-6 mol L-1 (0.18 mg L-1) și 1.00x10-8 mol L-1 (0.0018

mg L-1). Cea mai mare sensibilitate de 7.95x10-10 A mg L-1 s-a obtinut pentru grafitul

nemodificat utilizând NaCI 1 mol L-1 si tampon CBS la pH = 8.6.

Cel mai bun raspuns s-a obtinut pentru senzorul de grafit modificat cu chitosan cand s-a

folosit ca electrolit suport KCl 1 mol L-1 si CBS pH = 8.6.

Tabelul I. Raspunsul caracteristic pentru senzorii folositi pentru determinarea L-Tirozinei

Senzori bazati pe G Ch/G

Electrolit NaCl KCl NaCl KCl

Ecuatia curbei de calibrare* H= - 4x10-9 + 7.95x10-10xC H=3x10-9 + 2.76x10-10xC H=1.67x10-8 + 2.92x10-10xC H =1.59x10-10+ 5.17x10-10xC

R 0.9983 0.9977 0.9983 0.9987

Sensibilitatea (A mg L-1) 7.95x10-10 2.76x10-10 2.9.x10-10 5.17x10-10

Domeniul liniar de conc (mg L-1) 1.81 – 181.19 0.18– 181.19 18.12 – 181.19 0.0018 – 18.12

Limita de detectie (LOD) (mg L-1) 0.27 0.40 0.36 0.02

Limita de cuantificare (LOQ) (mg L-1) 1.81 0.18 18.12 0.0018

* H este exprimata in A; C este exprimata in mg L-1

Studiul interferentilor. – Acidul ascorbic (AA) (vitamina C) a fost ales ca posibil

interferent pentru analiza L-Tirozinei din capsulele farmaceutice de L-Tirozină. Raportul dintre

concentrația analitului și a interferentului a fost de 1:1 (v:v) în soluția mixtă 1.00x10-4 mol L-1

(18.12 mg L-1) L-Tir și 1.00x10-3 mol L-1 (0.00017 mg L-1) AA, atunci cand s-a folosit CBS la

pH = 8.6 si NaCl sau KCl de concentratie 1 mol L-1 ca si electrolit suport pentru ambii senzori.

Din figura 3 se observa ca acidul ascorbic nu interfera in masuratori.

Figura 3. Răspunsul electrochimic al amestecurilor binare de AA și L-Tyr

Probele. – Capsulele farmaceutice de tip L-tirozină au fost evaluate pentru ambii

electrozi în testele de recuperare. Au fost alese concentrațiile de lucru de 181.19 mg L-1 L-

Tirozină când s-a utilizat NaCI și 1.81 mg L-1 L-Tirozină pentru KCI. Rezultatele prezentate in

tabelul II arata ca L-Tirozina poate fi recuperata din capsulele de L-Tirozina cu o valoare medie

mai mare de 98% și deviație standard relativă (RSD%) mai mică de 1.00% (N = 5). A fost totuși

observată cea mai bună recuperare de 99.7% cu deviația standard relativă (RSD%) mai mică de

0.80% (N = 5) pentru senzorul de grafit modicat cu chitosan utilizând tampon CBS la pH = 8.6

cu KCI 1 mol L-1.

Tabel II. Recuperarea L-Tirozinei din capsule farmaceutice (500 mg L-Tirozină/capsulă)

Pro

ba

Nr.

Senzor bazat pe

G Ch/G

NaCl KCl NaCl KCl

Recuperare, %

Cant. gasita (mg) ± RSD%*

Recuperare, %

Cant. gasita (mg) ± RSD%*

Recuperare, %

Cant. gasita (mg) ± RSD%*

Recuperare, %

Cant. gasita (mg) ± RSD%*

1 99.82 499.10±0.68 98.80 494.02±0.34 99.77 498.85±0.51 100.00 500.01±0.11

2 99.84 499.20±0.80 94.71 473.53±0.55 99.76 498.79±0.53 99.74 498.71±0.73

3 99.81 499.03±0.94 97.76 488.78±0.65 91.62 458.09±0.92 99.65 498.23±0.66

4 99.69 498.46±0.82 99.15 495.73±0.96 99.81 499.07±0.75 99.79 498.94±0.31

5 99.66 498.30±0.89 99.21 496.07±0.88 99.75 498.74±0.80 99.82 499.11±0.13

6 96.83 484.16±0.88 98.08 490.41±0.61 96.28 481.38±0.45 99.79 498.95±0.80

7 96.92 484.61±0.75 98.66 493.30±0.44 93.82 469.12±0.72 99.75 498.74±0.53

8 97.71 488.53 ±0.77 99.02 495.12±0.77 99.78 498.88±0.76 99.67 498.33±0.74

9 97.00 485.02±0.55 98.03 490.14±0.97 99.83 499.16±0.92 99.77 498.86±0.67

10 96.89 484.45±0.39 98.11 490.55±0.75 99.81 499.06±0.73 99.60 498.00±0.72

* Deviatia standard relativa pentru 5 masuratori (N=5)

Concluzii

Au fost testati si evaluati doi senzori, unul bazat pe grafit si celalalt pe grafit modificat cu

chitosan extras din carapacea crabilor pentru capacitatea lor de analiză a L-Tirozinei din

capsulele farmaceutice.

S-a putut observa că atunci cand s-a folosit electrolitul suport KCI 1 mol L-1 atat pentru

electrodul nemodificat cat și pentru cel modificat cu chitosan s-a obtinut cea mai mica limita de

cuantificare 0.18 mg L-1 și 0.0018 mg L-1. Cea mai mare sensibilitate de 7.95x10-10 A mg L-1 s-a

obtinut pentru grafitul nemodificat utilizând NaCI 1 mol L-1 si tampon CBS la pH = 8.6. Cel mai

bun raspuns s-a obtinut pentru senzorul Ch/G cand s-a folosit electrolitul suport KCl 1 mol L-1 si

tampon CBS pH = 8.6.

Acidul ascorbic nu interfera in masuratori.

A fost observată cea mai bună recuperare din probe pentru senzorul Ch/G utilizând KCI 1

mol L-1 si tampon CBS la pH = 8.6.

Referinte

1. J.M. Silván, J. van de Lagemaat and A. Olano, M.D. del Castillo, “Analysis and biological

properties of amino acid derivates formed by Maillard reaction in foods”, J. Pharm. Biomed.

Anal, 41, 1543 (2006).

2. J.D. Fernstrom and M.H. Fernstrom, “Tyrosine, phenylalanine, and catecholamine synthesis

and function in the brain”, J. Nutr., 137(6), 1539S (2007).

3. H.L. Chen and M.S. Li, “Structure and Function of Biomacromolecules”, Shanghai, Science

Press, Shanghai, (1999).

4. J.P. Jin and X.Q. Lin, “The electrochemical behavior and amperometric determination of

tyrosine and tryptophan at a glassy carbon electrode modified with butyrylcholine”,

Electrochem. Commun., 6, 454 (2004).

5. J.M. Silván, J. van de Lagemaat, A. Olano and M.D. del Castillo, “Analysis andbiological

properties of amino acid derivates formed by Maillard reaction infoods”, J. Pharm. Biomed.

Anal., 41, 1543 (2006).

6. A. Carlsson, M. Lindqvist and N.S. Arch, “Dependence of 5-HT and catecholamine synthesis

on concentrations of precursor amino-acids in rat brain’, Pharmacology, 303, 157 (1978).

7. J.S. Meyer, K.M. Welch, V.D. Deshmukh, F.I. Perez, R.H. Jacob, D.B. Haufrect, N.T.

Mathew and R.M. Morrell, “Neurotransmitter precursor amino acids in the treatment of multi-

infarct dementia and Alzheimer's disease”, J. Am. Geriatr. Soc., 25, 289 (1977).

8. A.J. Gelenberg, C.J. Gibson and J.D. Wojcik, “Neurotransmitter precursors for the treatment

of depression”, Psychopharmacol. Bull., 18, 7 (1982).

9. C. Li, “Voltammetric determination of tyrosine based on an L-serine polymer film electrode”,

Colloids Surf. B, 50, 147 (2006).

10. S.Z. Hao, Y. Avraham, O. Bonne and E.M. Berry, “Separation-induced body weight loss,

impairment in alternation behavior, and autonomic tone: effects of tyrosine”, Pharmacol

Biochem Behav, 68(2), 273 (2001).

11. D.F. Neri, D. Wiegmann, R.R. Stanny, S.A. Shappell, A. McCardie and D.L. McKay,”The

effects of tyrosine on cognitive performance during extended wakefulness”, Aviat Space Environ

Med, 66(4), 313 (1995).

12. D.K. Reinstein, H. Lehnert and R.J. Wurtman, “Dietary tyrosine suppresses the rise in

plasma corticosterone following acute stress in rats”, Life Sci, 37(23), 2157 (1985).

13. G.A. Molnar, Z. Wagner, L. Marko, T. Ko Szegi, M. Mohas, B. Kocsis, Z. Matus, L.

Wagner, M. Tamasko, I. Mazak, B. Laczy, J. Nagy and I. Wittmann, “Urinary ortho-tyrosine

excretion in diabetes mellitus and renal failure: evidence for hydroxyl radical production”,

Kidney Int 68(5), 2281 (2005).

14. R.S. Robinson, K. Sternitzke, M.T. Mcdermott and R.L. Mccreery, “Morphology and

Electrochemical Effects of Defects on Highly Oriented Pyrolytic Graphite”, J. Electrochem.

Soc., 138, 2412 (1991).

15. C.Y. Liu, A.J. Bard, F. Wudl, I. Weitz and J.R. Heath, “Electrochemical Characterization of

Films of Single‐Walled Carbon Nanotubes and Their Possible Application in Supercapacitors”,

Electrochem. Solid St., 2, 577 (1999).

16. E. Krebs, L. Grabill and A. Riemann, “Amino acid nanopatterning on graphite”, Surface

Science (2018).

17. Hisham A. Elshoky, Taher A. Salaheldin, Maha A. Ali Mohamed, H. Gaber, “Ascorbic acid

prevents cellular uptake and improves biocompatibility of chitosan nanoparticles”, International

Journal of Biological Macromolecules, 115, 358 (2018).

18. M. Rinaudo, “Chitin and chitosan: properties and applications”, Prog. Polym. Sci., 31, 603

(2006).

19. S.M. MacDonald and S.G. Roscoe, “Electrochemical oxidation reactions of tyrosine,

tryptophan and related dipeptides”, Electrochim Acta, 42, 1189 (1997).

20. F. Wang, K.Z. Wu, Y. Qing and Y.X. Ci, “Spectrofluorimetric determination of the

substrates based on the fluorescence formation with the peroxidase-like conjugates of hemie with

proteins”, Anal Lett, 25, 1469 (1992).

21. M.C.S. Alonso, L.L. Zamora and J.M. Calatayud, “Determination of tyrosine through a FIA-

direct chemiluminescence procedure”, Talanta, 60, 369 (2003).

22. J.W. Costin, P.S. Francis and S.W. Lewis, “Selective determination of amino acids using

flow injection analysis coupled with chemiluminescence detection”, Anal Chim Acta, 480, 67

(2003).

23. C.J. Lee and J. Yang, “α-Cyclodextrin-modified infrared chemical sensor for selective

determination of tyrosine in biological fluids”, Anal Biochem, 359, 124 (2006).

24. M. Du, W. Wu, N. Ercal and Y.F. Ma, “Simultaneous determination of 3-nitro tyrosine, o-,

m-, and p-tyrosine in urine samples by liquid chromatography-ultraviolet absorbance detection

with precolumn cloud point extraction”, J Chromatogr B, 803, 321 (2004).

25. L. Sabine, P.G. Jean, S. Joelle and B. Bernard, “Determination of the L-dopa/L-tyrosine ratio

in human plasma by high-performance liquid chromatography: usefulness as a marker in

metastatic malignant melanoma”, J Chromatogr B, 696, 9 (1997).

26. D.I. Sánchez-Machado, B. Chavira-Willys and J. López-Cervantes, “High-performance

liquid chromatography with fluorescence detection for quantitation of tryptophan and tyrosine in

a shrimp waste protein concentrate”, J Chromatogr B, 863, 88 (2008).

27. Y. Huang, X.Y. Jiang, W. Wang, J.P. Duan and G.N. Chen, “Separation and determination of

L-tyrosine and its metabolites by capillary zone electrophoresis with a wall-jet amperometric

detection”, Talanta, 70, 1157 (2006).

28. R.M. Latorre, J. Saurina and S.H. Cassou, “Determination of amino acids in overlapped

capillary electrophoresis peaks by means of partial least-squares regression”, J Chromatogr A,

871, 331 (2000).

29. J. Wang, S. Mannino, C. Camera, M.P. Chatrathi, M. Scampicchio and J. Zima, “Microchip

capillary electrophoresis with amperometric detection for rapid separation and detection of

seleno amino acids”, J. Chromatogr. A, 1091, 177 (2005).

30. S. Zhao, Y. Song, Y. Liu, “A novel capillary electrophoresis method for the determination of

d-serine in neural samples”, Talanta, 67, 212 (2005).

31. H. Orhan, N.P.E. Vermeulen, C. Tump, H. Zappey and J.H.N. Meerman, “Simultaneous

determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid

chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage”,

J. Chromatogr. B, 799, 245 (2004).

32. C.H. Deng, Y.H Deng, B. Wang and X.H. Yang, “Gas chromatography–mass spectrometry

method for determination of phenylalanine and tyrosine in neonatal blood spots”, J. Chromatogr.

B, 780, 407 (2002).

33. H.C. Lin, Y.H. Chou and J. Yang, “Development of an amino carboxylic acid-modified

infrared chemical sensor for selective determination of tyrosine in urine”, Anal Chim Acta, 606,

230 (2008).

34. Q. Ma, S. Ai, H.Yin, Q. Chen and T. Tang, “Towards the conception of an amperometric

sensor of L-tyrosine based on Hemin/PAMAM/MWCNT modified glassy carbon electrode”,

Electrochim. Acta, 55(22), 6687 (2010).

Rodamina B – un nou cromofor pentru determinarea melatoninei în probele

biologice, alimentare și farmaceutice

Introducere Melatonina, N-acetil-5-metoxitriptamina (Figura 1), este un biomarker esențial pentru

tulburările de somn. Secreția melatoninei are loc la întuneric fiind inhibată de lumină [1,2].

Melatonina - ca produs farmaceutic, este utilizată pentru a gestiona diferite forme de insomnie și

tulburări de somn [1]. Prin urmare, analiza exactă a acesteia în probele de sânge integral poate fi

utilizată pentru diagnosticarea tulburărilor de somn. Formulele de lapte pentru sugari conțin, de

asemenea, melatonină în concentrații similare cu laptele matern; sunt necesare metode de testare

fiabilă a melatoninei atât în formulele de lapte pentru sugari, cât și în laptele matern.

Figura 1. Structura chimică a melatoninei

Au fost raportate mai multe metode cromatografice pentru analiza melatoninei în fluide

biologice umane. Cu toate acestea, în cazul monitorizării melatoninei în fluide biologice pentru

efectuarea studiilor clinice, utilizarea metodelor imunologice, cum ar fi testul de imunoabsorbție

legată de enzime (ELISA) și radioimunoanaliză (RIA), sunt cele mai răspândite [3,4]. Au fost

elaborate diferite metode analitice pentru cuantificarea melatoninei folosind cromatografia de

lichide de înaltă performanță (HPLC), cu diferiți detectori, cu detector de fluorescență (FL) care

exploatează fluorescența nativă a analiților [5], detectori electrochimici [6] și spectrometria de

masă (MS) [7] din probele biologice [8-11] sau din produsele alimentare [12] și băuturile

derivate din struguri [13].

Rodamina B reprezintă un nou cromofor pentru detecția melatoninei în diferite probe:

probe biologice (lapte matern și probe serice), probe alimentare (formula de lapte pentru sugari)

și în comprimatele de Melatonină ( 1 mg melatonină / comprimat).

Toate măsurătorile de fluorescență au fost efectuate cu un spectrometru QE65000 de la

Ocean Optics (Dunedin, Florida) echipat cu o lampă cu xenon (HPX 2000). Sursa de lumină

Xenon HPX-2000 este o sursă de mare putere, de mare intensitate, care este utilă în special

pentru aplicațiile fluorescente și pentru alte aplicații în care este necesară o lampă cu intensitate

ridicată. Rezultatele sunt obținute și procesate folosind un program software Spectra Suite.

Pentru toate măsurătorile de pH a fost utilizat un pH-metru Mettler Toledo (model

Seven Compact).

Pregătirea probelor

Melatonina a fost determinată din două fluide biologice (ser și lapte matern), un produs

alimentar (formula de lapte pentru sugari - NAN 2 Optipro de la Nestle) și dintr-un produs

farmaceutic Melatonină care conține 1 mg melatonină / comprimat).

Pentru determinarea melatoninei au fost utilizate zece tablete care conțineau melatonină

fiind dizolvate fiecare într-o soluție în raport de 1:1 (v/v) apă distilată și tampon fosfat (pH =

7.45); concentrația de melatonină a fost determinată direct din aceste soluții.

De asemenea, s-au preparat, cinci probe de formule de lapte pentru sugari NAN 2

Optipro cu un conținut de apă distilată și tampon fosfat (pH = 7.45) în raport de 1:1 (v/v);

concentrația de melatonină a fost determinată direct din aceste soluții.

Au fost analizate trei probe serice și o probă de lapte matern folosind Rodamina B.

Colectarea probelor biologice s-a facut cu acordul pacienților, în conformitate cu Comitetul de

Etică al Universității de Medicină și Farmacie "Carol Davila" din București, aprobarea nr.

11/2013.

Rezultate și discuții

Conform experimentelor preliminare, fluorescența nativa a melatoninei a prezentat o

intensitate scăzută a semnalului. Pentru a crește sensibilitatea detecției fluorescenței melatoninei,

s-au testat noi substanțe cromofore. Pentru testele preliminare au fost utilizate mai multe

substanțe cromofore, cum ar fi Malachit Green, complexul de Cobalt Protoporpirina IX și

Rodamina B. Nu s-a observat nici o intensificare a semnalului de fluorescență când s-au utilizat

substanțe cromofore precum Malachit Green și complexul de Cobalt Protoporpirina IX. O

îmbunatațire a semnalului fluorescent s-a observat când s-a utilizat Rodamina B.

Optimizarea conditiilor de lucru

Pentru analiza melatoninei s-a folosit concentrația optima de Rodamină B. Prin urmare, s-

au preparat soluții de diferite concentrații de Rodamină B și s-a măsurat intensitatea semnalului

de fluorescență. Figura 2 arată că cea mai mare intensitate a semnalului de fluorescență a fost

obținută pentru o concentrație de Rodamină B de 1.00x10-5mol L-1.

Figura 2. Influența concentrației Rodaminei B asupra intensității semnalului de fluorescenta

(Cmelatonină=1,00x10-3 mol L-1).

Influența pH-ului asupra intensității semnalului de fluorescență a fost testat folosind trei

valori ale pH-ului, un pH bazic, un pH neutru (pH fiziologic 7.45) și un pH acid când a fost

utilizat noul cromofor - Rodamina B pentru măsurătorile de fluorescență. Figura 3 a arătat că cea

mai mare valoare a semnalului de fluorescență a fost obținută atunci când măsurătorile au fost

făcute la un pH 7.45.

Figura 3. Influența pH-ului asupra intensității semnalului de fluorescenta (Cmelatonină= 1.00x10−3 mol L-1).

Liniaritatea și sensibilitatea pentru analiza melatoninei

Toate măsurătorile s-au efectuat utilizând condițiile optime de lucru: tampon fosfat la pH

7.45 si Rodamina B de concentrație 1.00x10-5 mol L-1. Rezultatele obținute pentru fluorescența

nativa a melatoninei au fost comparate cu rezultatele obținute în cazul folosirii melatoninei cu

Rodamina B.

Pentru fluorescența nativa a melatoninei s-au obținut următorii parametri: - domeniul de

concentrație liniară a fost între 0,05 și 10 pmol L-1 melatonină (figura 4.1). Ecuația de regresie

liniară a fost I = 2695,3 + 35,58 x C, unde I este intensitatea fluorescenței și C este concentrația

melatoninei (pmol L-1). S-a constatat că limita de cuantificare este de 0,05 pmol L-1.

Atunci când Rodamina B a fost utilizată ca substanță cromoforă, parametrii obținuți s-au

schimbat la: - domeniul de concentrație liniară a fost între 0,01 și 50 pmol L-1 (Figura 4.2).

Ecuația de regresie liniară a fost I = 8326,8-5,61 x C, unde I este intensitatea fluorescenței și C

este concentrația de melatonină (pmol L-1). S-a constatat că limita de cuantificare este de 0,01

mol L-1.

Folosind Rodamina B ca substanță cromoforă, s-a observat o îmbunătățire a domeniului

de concentrație liniară - noul interval de concentrație liniară fiind mai mare și, prin urmare, fiind

capabil să încadreze mai ușor concentrații mai mici și mai mari de melatonină; limita de

cuantificare a scăzut - făcând posibilă determinarea melatoninei și în serul copilului.

Figura 4 (1)

Figura 4 (2)

Figura 4. Spectrele de fluorescență ale diferitelor concentrații de melatonina înregistrate pentru (1)

fluorescența nativă a melatoninei; (2) folosind Rodamina B ca substanță cromoforă care prezintă (a)

suprapunerile cu valoarea inițială; și (b) - extensia.

Aplicații analitice

Probele utilizate pentru analiza melatoninei au fost: două fluide biologice (serul și laptele

matern), un produs alimentar (formula de lapte pentru sugari - NAN 2 Optipro de la Nestle) și

produs farmaceutic Melatonină care conține (1 mg melatonină / comprimat). Pentru gradele de

recuperare, metoda utilizată pentru determinarea fluorescenței native a melatoninei a fost

comparată cu metoda în care s-a utilizat Rodamina B ca substanță cromoforă, contribuind la

intensificarea semnalului fluorescent.

Rezultatele obținute pentru analiza melatoninei utilizând ambele metode fluorescente în

NAN 2 Optipro (Figura 6) și in tabletele de Melatonină (Figura 5) au fost prezentate în Tabelul

1. După cum se poate observa din tabel, gradele de recuperare au fost mai mari decât 98,40%, cu

valori ale deviației standart relative (RSD, %) foarte scăzute, valori crescute ale gradelor de

recuperare fiind observate când a fost utilizată Rodamina B ca substanță cromoforă pentru

analiza melatoninei în formulele de lapte pentru sugari și în comprimatele de melatonină.

Figura 5 (1)

Figura 5 (2)

Figura 5. Spectru de fluorescență pentru Melatonină - produse farmaceutice care utilizează: (1)

fluorescență nativă și (2) Rodamina B ca substanță cromoforă.

Figura 6 (1)

Figura 6 (2)

Figura 6. Spectru de fluorescență pentru NAN 2 Optipro folosind: (1) fluorescență nativă și (2)

Rodamina B ca substanță cromoforă.

Tabel 1. Gradele de recuperare ale melatoninei în NAN 2 Optipro și tabletele de Melatonină (1 mg

melatonină / comprimat).

Probă Metoda %, Gradele de recuperare ale

Melatoninei

NAN 2 Optipro Fluorescență Nativă 98.43±0.12

Utilizarea Rodaminei B ca substanță cromoforă 99.05±0.07

Melatonină tablete (1mg melatonină/tabletă)

Fluorescență Nativă 99.14±0.07 Utilizarea Rodaminei B ca

substanță cromoforă 99.73±0.03

N=5

Tabelul 2 prezintă rezultatele obținute pentru probele de ser (figura 7) și pentru proba

de lapte matern (figura 8). Se observă o corelație foarte bună între concentrațiile de melatonină

obținute utilizând fluorescența nativă a melatoninei și intensificarea semnalului fluorescent al

melatoninei obținut utilizând Rodamina B ca substanță cromoforă. Se poate concluziona că, prin

utilizarea Rodaminei B ca substanță cromoforă pentru analiza melatoninei, s-au obținut

sensibilități superioare și limite inferioare de determinare și, de asemenea, gradele de recuperare

au demonstrat rezultate îmbunătățite pentru determinarea melatoninei în diferite tipuri de probe,

de exemplu probe de ser, probe de lapte matern, probe de lapte pentru sugari și produse

farmaceutice de melatonină.

Tabel 2. Determinarea melatoninei in probele de ser și lapte matern.

Probă Metodă Melatonină, pmol L-1

Lapte matern Fluorescență Nativă 45.30±0.07

Utilizarea Rodaminei B ca substanță cromoforă 44.82±0.04

Proba ser 1 Fluorescență Nativă 28.93±0.09

Utilizarea Rodaminei B ca substanță cromoforă 29.15±0.05

Proba ser 2 Fluorescență Nativă 29.00±0.07

Utilizarea Rodaminei B ca substanță cromoforă 29.29±0.03

Proba ser 3 Fluorescență Nativă 29.08±0.08

Utilizarea Rodaminei B ca substanță cromoforă 29.76±0.05

N =10

Figura 7 (1)

Figura 7 (2)

Figura 7. Spectru de fluorescență pentru proba serică utilizând: (1) fluorescență nativă și (2)

Rodamina B ca substanță cromoforă.

Figura 8 (1)

Figura 8 (2)

Figura 8. Spectrul de fluorescență pentru proba de lapte matern utilizând: (1) fluorescență nativă și (2)

Rodamina B ca substanță cromoforă.

Concluzii

Rodamina B a fost propusă ca un nou cromofor pentru analiza melatoninei în probe

diferite, cum ar fi: probele biologice (serul și laptele matern), probele alimentare (formula de

lapte pentru sugari) și comprimatele de melatonină (1 mg melatonină / comprimat). Utilizarea

Rodaminei B ca substanță cromoforă pentru analiza melatoninei a intensificat semnalul de

fluorescență, marind domeniul de concentrație liniară și scăzând limita de determinare a

melatoninei. Rezultatele obținute pentru gradele de recuperare, precum și pentru determinarea

melatoninei în probele biologice au demonstrat că există o creștere semnificativă a preciziei

metodei de fluorescență, când Rodamina B a fost utilizată ca substanță cromoforă.

Bibliografie

1. Yeligar V.C., Gaikwad R.G., Patil K.D., Patil S.S. (2016) Development of

spectrophotometric method and validation for melatonin in tablet. World J Pharm

Pharmaceutical Sci., 5(6): 1440-1451.

2. Huether, G. (1999) Tryptophan, serotonin, and melatonin: basic aspects and applications.

Advances in experimental medicine and biology. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New

York, p. 852.

3. McIntyre I.M., Nrman T.R., Burrows G.D., Armstrong S.M. (1987) Melatonin rhythm in

human plasma and saliva. J Pineal Res, 4(2): 177-183.

4. Simonin, G., Bru L., Lelievre E., Jeanniot J.P., Bromet N., Walther B., Boursier-Neyret C.

(1999) Determination of melatonin in biological fluids in the presence of the melatonin

agonist S 20098: comparison of immunological techniques and GC-MS methods. J Pharm

Biomed Anal, 21(3): 591-601.

5. Muñoz J.L.P., Ceinos R.M., Soengas J.L., Míguez J.M. (2009) A simple and sensitive

method for determination of melatonin in plasma, bile and intestinal tissues by high

performance liquid chromatography with fluorescence detection. J Chromatogr B 877:2173–

2177.

6. Chau R.M.W., Patel B.A. (2009) Determination of serotonin, melatonin and metabolites in

gastrointestinal tissue using high-performance liquid chromatography with electrochemical

detection. Biomed Chromatogr 23:175–181.

7. Tudela R., Ribas-Agustí A., Buxaderas S., Riu-Aumatell M., Castellari M., López-Tamames

E. (2016) Ultrahigh-performance liquid chromatography (UHPLC)-tandem mass

spectrometry (MS/MS) quantification of nine target indoles in sparkling wines. J Agric Food

Chem 64: 47720–47767.

8. Morita I., Masujima T., Yoshida H., Imai H. (1981) Enrichment and HPLC analysis of

tryptophan metabolites in plasma. Anal Biochem 118(1): 142-146.

9. Römsing S., Ulfberg J., Bergqvist Y. (2003) Determination of melatonin in human plasma

with solid-phase extraction, high-performance liquid chromatography and fluorescence

detection. Scand J Clin Lab Invest 63:81–88.

10. Zagajewski J, Drozdowicz D, Brzozowska I, Hubalewska-Mazgaj M, Stelmaszynska T,

Laidler PM, Brzozowski T (2012) Conversion L-tryptophan to melatonin in the

gastrointestinal tract: the new high performance liquid chromatography method enabling

simultaneous determination of six metabolites of L-tryptophan by native fluorescence and

UV-VIS detection. J Physiol Pharmacol 63:613–621.

11. Hényková E, Vránová HP, Amakorová P, Pospíšil T, Žukauskaite A, Vlčková M, Urbánek L,

Novák O, Mareš J, Kaňovský P, Strnad M (2016) Stable isotope dilution ultra-high

performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry quantitative profiling of

tryptophan-related neuroactive substances in human serum andcerebrospinal fluid. J

Chromatogr A 1437:145–157.

12. Zieliński H, Szawara-Nowak D,WiczkowskiW (2017) Determination of melatonin in bakery

products using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC–MS/MS).

Chem Pap 71:1083–1089.

13. Mercolini L, Mandrioli R, Raggi MA (2012) Content of melatonin and other antioxidants in

grape-related foodstuffs: measurement using a MEPS-HPLC-FL method. J Pineal Res 53:21–

28.

Recunoasterea moleculara si determinarea cantitativa a melatoninei folosind senzori stocastici

Introducere Melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) (figura 1) este un compus secretat în principal

de glanda pineală, dar sintetizat și în multe alte țesuturi și celule, inclusiv retina [1-3]

celulele din măduva osoasă umană și murină [4], trombocitele [5], tractul gastrointestinal [6],

pielea [7] sau limfocitele [8]. Numeroase metode analitice au fost raportate până în prezent

pentru determinarea melatoninei, cum ar fi spectrofotometria ultraviolet-vizibilă (UV-vis),

chemiluminiscența, fluorometria, cromatografia în strat subțire, cromatografia de gaz-

spectrometrie de masă și cromatografia de lichide de înaltă performanță [9].

Figura 1. Melatonina – structura chimică.

Pentru determinarea melatoninei au fost realizați doi senzori stocastici pe bază de oxid

de grafen redus (rGO) și TiO2 sau pe bază de TiO2 și nanoparticule de aur, modificate cu o

soluție de complex de cobalt protoporfirină IX, în scopul realizării modelului de recunoaștere al

melatoninei în probele farmaceutice și biologice.

Toate măsurătorile electrochimice au fost efectuate cu un potențiostat/galvanostat

AUTOLAB / PGSTAT 302N (Metrohm, Utrecht, Olanda) conectat la un calculator cu un

software GPES folosit pentru înregistrarea măsurătorilor. Pentru efectuarea măsurătorilor a fost

utilizată o celulă electrochimică formată din trei electrozi: electrodul de referință Ag / AgCl (0.1

mol L-1 KCI), electrodul de platină (contra electrod) și electrodul de lucru (senzorul stocastic)

pentru toate măsurătorile.

Un pH metru Mettler Toledo (model Seven Compact) a fost utilizat pentru toate

măsurătorile de pH.

Tehnica cronoamperometrică a fost utilizată pentru măsurarea valorilor toff (semnătura

melatoninei) și a valorilor ton, fiind aplicat un potențial de 125 mV față de Ag /AgCl. Soluțiile

standard care conțin diferite concentrații de melatonină au fost introduse în celula

electrochimică. Ecuațiile de calibrare: 1 / ton = a + bxConcmelatonină, au fost obținute folosind

metoda regresiei liniare. Cantitățile de melatonină din probele reale au fost determinate prin

introducerea valorilor ton în ecuațiile de calibrare.

Pregătirea probelor

Melatonina a fost determinată din două fluide biologice (sânge integral și lapte matern),

un produs alimentar (formula de lapte pentru sugari - NAN 2 Optipro de la Nestle) și dintr-un

produs farmaceutic Melatonină care conține 1 mg melatonină / comprimat.

Pentru determinarea melatoninei au fost utilizate zece tablete care conțin melatonină fiind

dizolvate fiecare într-o soluție cu un conținut de apă distilată și tampon fosfat (pH = 7.45) într-un

raport de 1:1 (v /v); concentrația de melatonină a fost determinată direct din aceste soluții.

S-au dizolvat, de asemenea, cinci probe de formule de lapte pentru sugari NAN 2 Optipro

într-o soluție cu un conținut de apă distilată și tampon fosfat (pH = 7.45) într-un raport de 1:1 (v

/v); concentrația de melatonină a fost determinată direct din aceste soluții.

Probele de sânge și lapte matern au fost analizate ca atare fiind colectate de la pacienți.

Colectarea probelor biologice s-a realizat cu acordul pacienților, în conformitate cu Comitetul de

etică aprobat al Universității de Medicină și Farmacie "Carol Davila" din București, aprobarea

nr. 11/2013.

Rezultate și discuții

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici sunt prezentate în tabelul 1. Cea mai

bună sensibilitate (8.95 x 104 s-1 / µg mL-1) a fost obținută atunci când s-a utilizat senzorul bazat

pe rGO-TiO2-Au. Aceeași limită de determinare (2.32 x 10-9 s-1 / µg mL-1) a fost determinată

pentru ambii senzori stocastici. Domeniul de concentrații liniare a acoperit concentrațiile de

melatonină găsite în fluide biologice: probele de sânge integral și laptele matern, în probele de

alimente cum ar fi formulele de lapte pentru sugari și în produsele farmaceutice care conțin

melatonină.

Măsurătorile melatoninei au fost efectuate timp de mai mult de 3 luni în laborator; în această

perioadă de timp, panta (sensibilitatea) senzorului stocastic a variat cu 1,20%, dovedind că

senzorii stocastici sunt fiabili în timp.

Tabel 1 Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici pentru determinarea melatoninei.

Senzori

bazați pe

complex de

Co PIX

Ecuația de calibrare și

coeficientul de corelare

(r)

Domeniul

linear de

concentrație

(µg/mL)

toff

(s)

Sensibilitatea

(s-1/ µg mL-1)

Limita de

determinare

(µg mL-1)

rGO-TiO2 1/ton=0.03+1.57x103xC

r=0.9990

2.32x10-9-

2.32x10-4

1.2 1.57x103 2.32x10-9

rGO-TiO2-Au 1/ton=0.03+8.95x104xC

r=0.9992

2.32x10-9-

2.32x10-3

1.8 8.95x104 2.32x10-9

S-a lucrat cu cei doi senzori pe o serie de interferenții: sorbitol, manitol, lactoza,

vitaminele B1, B6, B12, dopamina și epinefrina. Pentru toți acești compuși s-au observat diferite

semnături (valori toff), comparativ cu semnăturile obținute cu ajutorul senzorilor stocastici, pentru

melatonină. În consecință, nici unul dintre acești compuși nu a interferat în analiza melatoninei.

Aplicații analitice

Modul stocastic a fost utilizat pentru modelul de recunoaștere și determinarea cantitativă

a melatoninei în diferite probe: fluide biologice (laptele matern și sângele integral), probe

alimentare (formula de lapte pentru sugari) și tablete de Melatonină. Modelul de recunoaștere a

melatoninei a fost efectuat utilizând cei doi senzori stocastici pe bază de oxid de grafen redus. În

diagramele înregistrate pentru probele reale (Figurile 2-5) a fost identificată semnătura (valoarea

toff) a melatoninei și a fost măsurată următoarea valoare de ton pentru a putea găsi concentrația de

melatonină.

Figura 2 (a)

Figura 2 (b)

Figura 2. Exemple de diagrame obținute pentru modelul de recunoaștere al melatoninei în probele de

sânge integral utilizând senzori stocastici bazați pe complexul Co PIX și (a) rGO-TiO2 și (b) rGO TiO2-

Au.

Figura 3 (a)

Figura 3 (b)

Figura 3. Exemple de diagrame obținute pentru modelul de recunoaștere al melatoninei în proba de

lapte matern folosind senzorii stocastici bazați pe complexul Co PIX și (a) rGO-TiO2 și (b) rGO-TiO2-Au.

Figura 4 (a)

Figura 4 (b)

Figura 4. Exemple de diagrame obținute pentru modelul de recunoaștere al melatoninei în NAN 2

Optipro folosind senzorii stocastici bazați pe complexul Co PIX și (a) rGO-TiO2 și (b) rGO-TiO2-Au.

Figura 5(a)

Figura 5 (b)

Figura 5. Exemple de diagrame obținute pentru modelul de recunoaștere al melatoninei în tabletele de

melatonină utilizând senzori stocastici bazați pe complexul Co PIX și (a) rGO-TiO2 și (b) rGO-TiO2-Au.

Nu a fost necesară prelevarea de probe înainte de măsurarea melatoninei în laptele

matern și în probele de sânge integral. Laptele praf și tabletele trebuie dizolvate într-o soluție

care conține tampon fosfat și apă distilată într-un raport de 1: 1 (v / v). Tabelul 2 prezintă

rezultatele obținute utilizând cei doi senzori stocastici pentru determinarea melatoninei în

probele NAN 2 Optipro și în comprimatele de melatonină (1 mg melatonină / comprimat).

Tabel 2. Gradul de recuperare al melatoninei in NAN 2 Optipro și in tablete de Melatonină (1mg

melatonin/tabletă) folosind senzori stocastici bazați pe grafene reduse modificate.

Senzor bazat pe complex de Co

PIX

%, Gradul de recuperare al Melatoninei *

NAN 2 Optipro** Tablete Melatonină

rGO-TiO2 99.12±0.04 99.50±0.03

rGO-TiO2-Au 99.83±0.02 99.87±0.02

*N=10

** Gradele de recuperare au fost calculate față de valorile raportate de un laborator cu certificat obținut

utilizând metoda HPLC.

Gradele de recuperare pentru melatonină din probele NAN 2 Optipro au fost calculate

în raport cu valoarea medie obținută pentru melatonină utilizând metoda HPLC; pentru ambii

senzori stocastici s-au obținut grade de recuperare mai mari de 99.00%, cele mai bune fiind

obținute pentru senzorul stocastic bazat pe rGO-TiO2-Au (99.83%), deviația standart relativă

(RSD, %) fiind mai mică de 0.10%. Gradul de recuperare al melatoninei în comprimatele de

Melatonină a fost calculat față de valoarea declarată de 1 mg melatonină / comprimat. Valorile

gradelor de recuperare ale melatoninei în produsele farmaceutice au fost mai mari de 99.50%, cel

mai bun grad de recuperare obținut fiind pentru senzorul stocastic bazat pe rGO-TiO2-Au

(99.87%); valorile deviației standart relativă (RSD, %) au fost mai mici de 0.10%.

Cantitatea de melatonină găsită în laptele matern a fost: 44.80 ± 0,09 pmol / L folosind

senzorul stocastic bazat pe rGO-TiO2 și 44.34 ± 0,04 pmol / L utilizând senzorul stocastic bazat

pe rGO-TiO2-Au. Tabelul 3 prezintă determinarea cantitativă a melatoninei în probele de sânge

integral folosind cei doi senzori stocastici. A fost obținută o bună corelație între cantitățile de

melatonină determinate utilizând cei doi senzori stocastici.

Tabel 3 Determinarea melatoninei în probele de sânge integral utilizând senzori stocastici bazați pe

grafene reduse modificate.

Nr.

Proba.

Melatonină (pmol/L)

Senzori stocastici bazați pe complex de Co PIX

rGO-TiO2 rGO-TiO2-Au

1 29.88±0.07 29.19±0.03

2 29.50±0.08 29.95±0.03

3 29.30±0.05 29.36±0.04

N=10

Caracteristicile de răspuns, precum și rezultatele obținute pentru analiza melatoninei în

probele de sânge integral au demonstrat că senzorul stocastic ales pentru modelul de

recunoaștere și determinarea cantitativă a melatoninei în probele reale propuse a fost cel bazat pe

imobilizarea complexului Co PIX în pasta de rGO-TiO2-Au.

Concluzii Modelul de recunoaștere al melatoninei a fost realizat utilizând doi senzori stocastici

bazați pe imobilizarea unui complex de cobalt protoporfirină IX în matrici pe bază de paste de

grafenă: rGO-TiO2 și rGO-TiO2-Au. Caracteristicile de răspuns ale celor doi senzori stocastici au

făcut posibil modelul de recunoaștere și determinarea cantitativă a melatoninei în patru tipuri de

probe. Nu a fost necesară prelevarea minimă de probe (dizolvarea probelor solide în apă distilată:

soluție tampon fosfat (1:1, v /v). Au fost obținute rezultate fiabile pentru determinarea cantitativă

a melatoninei în fluide biologice (probe de lapte matern și de sânge integral), probe de alimente

(NAN 2 Optipro) și tablete de melatonină (1 mg melatonină / comprimat).

Bibliografie

1. D.P. Cardinali, J.M. Rosner, Metabolism of serotonin by the rat retina “in vitro”. J

Neurochem 18 (1971) 1769–1770. doi: https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.1971.tb03752.x.

2. G. Tosini, M. Menaker, The clock in the mouse retina: melatonin synthesis and

photoreceptor degeneration. Brain Res 789 (1998) 221–228. doi:

https://doi.org/10.1016/S0006-8993(97)01446-7

3. C. Liu, C. Fukuhara, J.H. Wessel 3rd, P.M. Iuvone, G. Tosini, Localization of Aa-nat mRNA

in the rat retina by fluorescence insitu hybridization and laser capture microdissection. Cell

Tissue Res. 315 (2004) 197-201. doi:10.1007/s00441-003-0822-1

4. A. Conti, S. Conconi, E. Hertens, K. Skwarlo-Sonta, M. Markowska, J.M. Maestroni,

Evidence for melatonin synthesis in mouse and human bone marrow cells. J Pineal Res 28

(2000) 193–202. doi: https://doi.org/10.1034/j.1600-079X.2000.280401.x

5. J. Champier, B. Claustrat, R. Besancon, C. Eymin, C. Killer, A. Jouvet, G. Chamba, M.

Fevre-Montange, Evidence for tryptophan hydroxylase and hydroxy-indol-O-methyl-

transferase mRNAs in human blood platelets. Life Sci 60 (1997) 2191–2197. doi:

https://doi.org/10.1016/S0024-3205(97)00234-8

6. G.A. Bubenik, Gastrointestinal melatonin: localization, function, and clinical relevance. Dig

Dis Sci 47 (2002) 2336–2348. doi:10.1023/A:1020107915919

7. A. Slominski, T.W. Fischer, M.A. Zmijewski, J. Wortsman, I. Semak, B. Zbytek, R.M.

Slominski, D.J. Tobin, On the role of melatonin in skin physiology and pathology. Endocr 27

(2005) 137–148. doi:10.1385/ENDO:27:2:137

8. A. Carrillo-Vico, J.R. Calvo, P. Abreu, P.J. Lardone, S. Garcia-Maurino, R.J. Reiter, J.M.

Guerrero, Evidence of melatonin synthesis by human lymphocytes and its physiological

significance: possible role as intracrine, autocrine, and/or paracrine substance. FASEB J 18

(2004) 537–539. doi: 10.1096/fj.03-0694fje

9. M. Ansari, K. Rafiee, N. Yasa, S. Vardasbi, S.M. Naimi, A. Nowrouzi. Measurement of

melatonin in alcoholic and hot water extracts of Tanacetum parthenium, Tripleurospermum

disciforme and Viola odorata. Daru. 18 (2010) 173–178. PMID: 22615614.

Detecția simultană a bisfenolilor în probele de apă utilizând

senzori stocastici

Bisfenolii reprezintă un grup de substanțe chimice cu două grupări funcționale de

hidroxifenil și includ mai multe tipuri de bisfenoli, cum ar fi bisfenol A (BPA) (Figura 1),

bisfenol F (BPF) (Figura 2) , bisfenol Z (BPZ) (Figura 3). Bisfenolul A este cel mai cunoscut

reprezentant al acestui grup [1] și este un produs chimic industrial important datorită utilizării

sale largi ca intermediar în fabricarea materialelor plastice din policarbonat, a rășinilor epoxidice,

a produselor ignifuge, a rășinilor poliesterice nesaturate, a răsinilor poliacrilate,polieterimide și

polisulfonice. Bisfenolul A implică, în principal, riscul potențial de sănătate umană datorat

activităților sale estrogenice care pot interfera cu activitățile hormonale și, prin urmare, a fost

identificat ca fiind un compus important care distruge sistemul endocrin. S-a constatat că

bisfenolul A provoacă diverse tipuri de cancer, acțiuni pleiotropice în creier și în sistemul

cardiovascular [5]. La om, BPS și BPF au fost detectate în urină în concentrații și frecvențe

comparabile cu bisfenolul A [3, 4].

Tehnicile analitice clasice utilizate în prezent pentru a determina bisfenolii, sunt:

fluorescență, cromatografie lichidă cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS), cromatografie în

fază gazoasă cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS), teste de imunoabsorbție legată de

enzime (ELISA) și senzori electrochimici [5].

Pentru determinarea Bisfenolului A, F și Z s-au realizat trei senzori stocastici bazați pe

nano carbon (nano C), nano grafene (nano Gr) și oxid de grafen redus (rGO) și modificați cu

soluție de 2, 2-difenil-1-pycrilhydrazil (DPPH) preparată în tetrahidrofuran (THF). BPA, BPF și

BPZ au fost determinați simultan folosind senzorii stocastici propuși.

Toate măsurătorile electrochimice au fost efectuate cu un potențiostat/galvanostat

AUTOLAB / PGSTAT 302N (Metrohm, Utrecht, Olanda) conectat la un calculator cu un

software GPES folosit pentru înregistrarea măsurătorilor. A fost utilizată o celulă electrochimică

cu trei electrozi care include electrodul de referință Ag / AgCl (0,1 mol L-1 KCI), electrodul de

platină (contra electrod) și electrodul de lucru (senzorul stocastic) pentru toate măsurătorile.

Un pH metru Mettler Toledo (model Seven Compact) a fost utilizat pentru toate

măsurătorile de pH.

Tehnica cronoamperometrică a fost utilizată pentru măsurarea valorilor toff (semnăturile

bisfenolilor) și valorilor ton, fiind aplicat un potențial de 125 mV față de Ag / AgCl. Soluțiile

standard care conțin diferite concentrații de BPA, BPF și BPZ au fost introduse în celula

electrochimică. Ecuațiile de calibrare: 1/ton = a + bxConcbisfenoli, au fost obținute folosind

metoda regresiei liniare. Cantitățile de bisfenoli din probele reale au fost determinate prin

introducerea valorilor ton în ecuațiile de calibrare.

Figura 1. Structura chimică a bisfenolului A

Structura chimica a bisfenolului F.

Figura 3. Structura chimică a bisfenolului Z

Pregătirea probelor

Pentru a determinarea bisfenolilor s-au utilizat zece probe de apă pentru care

concentrațiile de BPA, BPF și BPZ au fost determinate prin metode ISO..

Rezultate și discuții

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici sunt prezentate în tabelul 1, tabelul 2 și

tabelul 3. În cazul bisfenolului A cea mai bună sensibilitate (4.25x1010 s-1/mol L-1), s-a înregistrat

atunci când s-a utilizat senzorul bazat pe nano C, a bisfenolului F (4.63x1010 s-1/mol L-1),

utilizând senzorul bazat pe nano Gr, iar în cazul bisfenolului Z (2.44x1011s-1/mol L-1), utilizând

senzorul bazat pe rGO. Toți cei trei senzorii bazați pe nano Gr, nano C și rGO, au prezentat o

sensibilitate ridicată și o limită mică de determinare, demonstrând faptul că sunt fiabili pentru

determinarea bisfenolilor A, F și Z din probele de apă.

Tabel 1: Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici pentru determinarea bisfenolului A.

Senzori

bazați pe

DPPH

Ecuația de calibrare și

coeficientul de corelare

(r)

Domeniul

linear de

concentrație

(mol L-1)

toff

(s)

Sensibilitatea

(s-1/ mol L-1)

Limita de

determinare

(mol L-1)

rGO 1/ton=0.04+5.20x106xC

r=0.9999

1.00x10-12-

1.00x10-5 0.7 5.20x106 1.00x10-12

nano C 1/ton=0.01+4.25x1010xC

r=0.9999

1.00x10-15-

1.00x10-5 1.0 4.25x1010 1.00x10-15

nano Gr 1/ton=0.01+2.41x1010xC

r=0.9996

1.00x10-13-

1.00x10-6 1.2 2.41x1010 1.00x10-13

Tabel 2: Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici pentru determinarea bisfenolului F.

Senzori

bazați pe

DPPH

Ecuația de calibrare și

coeficientul de corelare

(r)

Domeniul

linear de

concentrație

(mol L-1)

toff

(s)

Sensibilitatea

(s-1/ mol L-1)

Limita de

determinare

(mol L-1)

rGO 1/ton=0.02+2.36x1010xC

r=0.9998

1.00x10-14-

1.00x10-6 1.2 2.36x1010 1.00x10-14

nano C 1/ton=0.04+4.17x1010xC

r=0.9998

1.00x10-14-

1.00x10-7 1.3 4.17x1010 1.00x10-14

nano Gr 1/ton=0.01+4.63x1010xC

r=0.9977

1.00x10-14-

1.00x10-10 0.6 4.63x1010 1.00x10-14

Tabel 3: Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici pentru determinarea bisfenolului Z.

Senzori

bazați pe

DPPH

Ecuația de calibrare și

coeficientul de corelare

(r)

Domeniul

linear de

concentrație

(mol L-1)

toff (s) Sensibilitatea

(s-1/ mol L-1)

Limita de

determinare

(mol L-1)

rGO 1/ton=0.03+2.44x1011xC

r=0.9995

1.00x10-13-

1.00x10-5 0.5 2.44x1011 1.00x10-13

nano C 1/ton=0.01+4.11x109xC

r=0.9999

1.00x10-13-

1.00x10-7 0.6 4.11x109 1.00x10-13

nano Gr 1/ton=0.03+2.31x1010xC

r=0.9998

1.00x10-14-

1.00x10-4 1.0 2.31x1010 1.00x10-14

Aplicații analitice

Metoda cronoamperometrică a fost propusă pentru determinarea cantitativă a BPA, BPF

și BPZ în probele de apă utilizând cei trei senzori stocastici pe bază de nano grafene, oxid de

grafen redus și nano carbon. În diagramele înregistrate pentru probele reale (Figurile 4 a, b,c) au

fost identificate semnăturile celor trei bisfenoli și au fost măsurate valorile ton pentru a găsi

concentrațiile de BPA, BPF și BPZ.

Figura 4 (a) Figura 4 (b)

Figura 4 (c)

Figura 4. Exemple de diagrame obținute pentru determinarea bisfenolilor în probele de apă

bazați pe complex DPPH și rGO (a), nano C (b), nano Gr (c)

Tabelul 4 prezinta rezultatele obținute cu ajutorul celor trei senzori stocastici în probele de apă,

care arată grade de recuperare foarte bune, mai mult de 98% și valorile ale deviației standart

relative (RSD,%) mai mici de 0.2% (N = 4).

Tabel 4: Gradul de recuperare a bisfenolilor in probele de apă folosind senzorii stocastici

bazati pe rGO , nano C , nano Gr.

Senzor bazat pe DPPH %, Grad de recuperare*

BPA BPF BFZ

rGO 98.24±0.13 98.14±0.18 98.98±0.12

nano C 99.73±0.07 99.31±0.05 99.14±0.07

nano Gr 99.02±0.09 98.47±0.10 98.90±0.08

Concluzii

Determinarea cantitativă a bisfenolului A, F și Z s-a efectuat cu ajutorul celor trei

senzori bazați pe rGO , nano C , nano Gr. Rezultatele obtinute confirmă faptul că toti cei 3

senzori sunt fiabili pentru determinarea bisfenolilor în probele de apă.

Bibliografie

1. C. Liao and K. Kannan, ExposureJ. Agric. Food Chem., 2013, 61, 4655–4622.

2. Xu Wang, Hulie Zeng, Yanlin Wei, Jin-Ming Lin, A reversible fluorescence sensor based on

insoluble β-cyclodextrin polymer for direct determination of bisphenol A (BPA), Sensors and

Actuators B 114 (2006) 565–572.

3. Liao C, Liu F, Alomirah H, Loi VD, Mohd MA, Moon HB, et al. 2012a. Bisphenol S in

urine from the United States and seven Asian countries: occurrence and human exposures.

Environ Sci Technol 46:6860–6866.

4. Zhou X, Kramer JP, Calafat AM, Ye X. 2014. Automated on-line column-switching high

performance liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry method for the

quantification of bisphenol A, bisphenol F, bisphenol S, and 11 other phenols in urine. J

Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 944:152–156.

5. Chao Lua, Jinge Li, Yi Yang, Jin-Ming Lin, Determination of bisphenol A based on

chemiluminescence from gold(III)–peroxymonocarbonate, Talanta 82 (2010) 1576–1580.

Etapa 3 - Integrarea senzorlor in platfore mobile pentru monitorizare continua, in timp real si crearea de baze de date cuplate cu in system informatics de management intelligent. - 2019

Pentru atingerea obiectivelor din cadrul fazei 3 a proiectului de cercetare

45PCE/2017, in anul 2019 s-au realizat urmatoarele activitati de cercetare:

- Testarea, caracterizarea si validarea senzorilor construiti. Partea 2 Realizat

- Selectarea celor mai buni senzori si integrarea lor in platforme; designul platformelor Realizat

- Testarea si validarea platformelor pentru monitorizarea in timp real a substantelor propuse O

platforme sunt in faza de validare

- Construirea unei baze de date, cu date obtinute prin transformarea platformelor in instrumente

inteligente capabile sa transmita in timp real date la baza de date si sa ia decizii. Realizat

- Diseminarea rezultatelor Trei lucrari sunt in lucru pentru a fi trimise la reviste ISI

PROIECTAREA UNEI METODE ELECTROCHIMICE PAPIDE SI SENSIBILE DE

DEDECTIE A MONOBENZIL FTALATULUI DIN PROBE BIOLOGICE

Introducere

Mai multe substante chimice utilizate in plastic au fost indentificate ca potentiali disruptori ai

sistemului endocrin, care pot afecta reproducerea individului si a calendarului pubertal. Ftalatii

(dialchil sau alchil aril esteri ai acidului 1,2-benzendicarboxilic) sunt chimicale folosite in

micsorarea duritatii materialelor plastic (policlorura de vinil), de asemenea sunt folositi adesea

in materiale de constructie, ustensile medicale, ambalarea produselor alimentare si alte produse

de consum. Ftalatii folositi ca plastifianti au masele molecular mari, dintre acestia se numara:

butilbenzil ftalat (BBzP), di(2-etilhexil) ftalat (DEHP), diisononil ftalat (DiNP) si diisododecil

ftalat (DiDP) [1].

Fiind omnipresent, expunerea la ftalati se poate realize pe cale orala, dermala sau prin

inhalatie. Dupa expunere, ftalatii (compusi non-persistenti) sunt implicate in procese

metabolice, conducand la formarea monoesterilor hidrolitici respective. Mai mult, o parte

dintre acestia sunt metabolizati in continuare cu obtinerea produsilor oxidativi [2-8],

eliminarea realizandu-se pe cale renala sau metabolica, sub forma libera sau conjugata [9-13].

Metabolitii au fost detectati cu nivel de recuperare mai mare de 98, studiu realizat in perioada

2013-2014 de catre Sondajul Național privind Examenul de Sănătate și Nutriție (NHANES)

(CDC 2013–2014 [14]).

Datorita utilizarii pe scala larga, ftalatii si metabolitii acestora sunt adesea determinati in toate

categoriile populatiei (sex, varsta, nationalitati), metabolitii sunt indentificati intr-o serie de

probe biologice precum: urina [2, 13-16], ser [13, 17], saliva [18], fluid amniotic [19] si lapte

matern [20]. Saliva ofera cateva avantaje comparative cu sangele, folosit ca proba in

biomonitorizarea expunerii la compusi non-persistenti, dintre acestea numarandu-se metoda de

colectare care este simpla si non-invaziva [18], de asemenea matricea probei este mai simpla.

Cel mai adesea probele sunt supuse unui tratament de extractie lichid-lichid, insa aceasta

metoda dureaza mult si foloseste cantitati mari de solventi organic, daunatori mediului

inconjurator. Ideal, pregatirea probelor trebuie sa fie eficienta, simpla, rapida si ieftina.

Mono-benzil ftalatul (MBzP) este un monoester provenind din metabolizarea

butilbenzilftalatului. Cromatografia este până în prezent metoda cea mai frecvent utilizată în

identificarea și determinarea ftalatilor și a metaboliților lor [13,20-25]. Aceste proceduri

cromatografice de determinare a ftalatului de mono-benzil utilizeaza extracția în fază solidă ca

metoda de preconcetrare, urmată de cromatografia de lichide pentru separare și spectrometrie

de masă ca detecție (SPE-HPLC-MS-MS). Cea mai folosită metode de pre-tratare a probelor

este extracția lichidă, dar acest lucru este obositor, consumator de timp și consumă un volum

mare de solvenți organici nepoluanți, în timp ce costul pentru HPLC-MS-MS este mare. În

mod ideal, o tehnică de pregătire a eșantioanelor ar trebui să fie eficientă, simplă, rapidă și

rentabilă. Comparația diferitelor metode analitice pentru determinarea mono-benzil ftalatului

este prezentată în Tabelul I

Tabelul I. Compararea diferitelor metode analitice in detereminarea MBzP

Metoda Matrice Limita de detectie (ng mL-1) Referinta

SPE-LC–MS–MS Ser 0.70 [24] SPE-LC–MS–MS Urina 0.47 [23] SPE-LC–MS–MS Urina 0.26 [22] MSPE-GC–MS Urina 0.05 [21] HPLC-APCI-MS-MS Saliva 0.30 [18]

HPLC–ESI–MS/MS Lapte matern 0.50 [20]

DPV Urina 5.38×10-8 Acesta lucrare Saliva

Nenumarate metode electroanalitice sunt folosite cu regularitate [26] iar performanta acestora

este in permanenta imbunatatita [27]. Acestea sunt tehnici simple, sensibile, selective si

dinamice care pot fi aplicate in determinarea diferitilor compusi organic [28-30]. Exemple de

metode voltametrice: voltametrie in puls diferential (DPV), voltametrie cu unde patrate

(SWV), voltametrie ciclica (CV), voltametrie de stripping anodic (ASV), voltametrie de

stripping absorptiva (AdSV), voltametrie cu baleaj linear de potential (LSV), etc. Tehnicile

folosite cel mai adesea in determinarea de compusi organici sunt CV, DPV si SWV. Dintre

electrozii de lucru folositi se numara: electrodul glassy carbon (GCE), electrodul de diamant

dopat cu bor (BDDE), electrodul pasta de carbon (CPE) si electrodul picurator de mercur

(HMDDE).

Electrozii pasta de carbon (CPE) apartin unei clase de senzori electrochimici si

bioelectrochimici cu aplicabilitate variata. In present acest tip de electrod de lucru este foarte

frecvent folosit. Grafena este un material de baza folosit in fabricarea electrozilor pasta de

carbon, iar prin introducerea unui modificator, se imbunatateste suprafata active, sensibilitatea

si selectivitatea [21-33].

In acest studiu am dezvoltat o metoda viabila indentificarii monobenzil ftalatului in probe

biologice folosind trei senzori pe baza de material de carbon, grafena nemodificata si

modificata cu ftalocianura de fier (II) (Fe(II)-Pc) si ftalocianura de nichel (II) (Ni(II)-Pc).

Senzorii pe baza de ftalocianuri au fost folositi anterior in determinarea serotoninei[34].

Experimental

Materiale si reactivi

Reactivii folositi au fost procurati de la Sigma-Aldrich, precum: monobenzyl ftalatul (MBzP),

bisfenol A (BPA), L-tirozina (L-Tyr), grafena (Gr), fericianura de potasiu (K3[Fe(CN)6]),

methanol, acid acetic, acetat de sodiu, clorura de sodium, azotat de potasiu si clorura de

poatsiu. Modificatorii senzorilor pe baza de grafena, ftalocianura de nichel (II) si ftalocianura

de fier (II) au fost deasemenea obtinute de la Sigma-Aldrich iar uleiul de parafina (d420, 0.86g

cm-1) de la Fluka (Buchs, Suedia). Solutia tampon acetat a fost preparata din acid acetic si

acetat de sodiu, la diferite pH-uri (pH=1.10-6.05)[27,28]. Solutia stoc de fericianura de potasiu

(1.00 mol L-1) a fost preparata in apa distilata, procurata de la sistemul de purificare Direct-Q 3

Water Purification (Millipore Corporation, Franta).

Solutia standard de mono-benzil ftalat cu o concentratie de 1.00×10-3 mol L-1 a fost preparata

in apa-metanol (raport volumetric 9:1). Prin dilutii successive au fost facute solutiile de lucru

de MBzP in solutie tampon acetat (pH=2.04) continand KCl, NaCl, NaNO3 sau KNO3 (0.1

mol L−1) ca electrolit support.

Aparatura si metode

Voltametria in puls diferentiat (DPV) s-a realizat folosind AUTOLAB/ PGSTAT 128N

potentiostat/galvanostat conectat la un calculator, programul folosit in inregistrarea

masuritorilor este NOVA 2.1.2.

Voltamogramele ciclice (CV) s-au inregistrat folosind AUTOLAB/PGSTAT 100

potentiostat/galvanostat conectat la un calculator cu programul GPES, la diferite viteze de

baleaj.

Celula electrochimica a fost compusa din trei electrozi, electrodul de referinta, argint/clorura

de argint (Ag/AgCl) (0.1 mol L-1), contraelectrod, platina (Pt) si electrodul de lucru. Curbele

DPV au fost inregistrate la 0.01 V s-1, amplitudinea pulsului fiind de 0.025 V iar step potential

de 0.05 V.

Masuratorile de pH au fost facute folosind un pH-metru Mettler Toledo (model Seven

Compact).

Toate masuratorile s-au realizat la temperatura camerei (25 °C).

Prepararea microsenzorilor Gr, Ni(II)-Pc/Gr, Fe(II)-Pc/Gr

Senzorul pe baza de grafena (Gr) nemodificata a fost preparata in accord cu procedura discrisa

anterior[28], dupa cum urmeaza: la 100 mg pudra de grafena au fost adaugati 80 µL ulei de

parafina iar apoi s-a amestecat pana la formarea unei paste omogene. In cazul electrozilor

modificati, in plus s-au adaugat 25 µL de Fe(II)-Pc (1.00×10-3 mol L-1) pentru Fe(II)-Pc/Gr si

25 µL de Ni(II)-Pc pentru electrodul Ni(II)-Pc/Gr.

Pasta obtinuta a fost plasata intr-un tub de plastic cilindric iar contactul electric s-a realizat cu

un fir de argint (Ag). Inainte de fiecare utilizare, suprafata electrodului se poliseaza cu o folie

de aluminiu. Senzorii s-au depozitat intr-un loc uscat, la temperature camerei.

Probe biologice

Douazeci de probe biologice (Ethics committee approval no.158/2018, awarded by the

University of Medicine and Pharmacy „Carol Davila” in Bucharest) (10 probe de saliva si 10

de urina) au fost investigate ca matrice complexa in procesul de recovery a MBzP.

Masuratorile s-au realizat in ziua prelevarii probelor.

Tratarea probelor s-a facut prin adaugarea de electrolit suport (KNO3) si de solutie tampon

acetat (pH=2.04).

Rezultate si Discutii

Caracterizarea electrochimica a senzorilor

S-a evaluat performanța de detectare a senzorilor pe bază de grafena nemodificata și grafena

modificata cu Ni(II)-Pc sau Fe(II)-Pc utilizând fericianura de potasiu (1 mol L-1), prin

inregistrarea de voltamograme ciclice la diferite viteze de scanare. Cuplul redox

([Fe(III)(CN)6]3-/[Fe(II)(CN)6)4-) este adesea utilizat in determinarea performantei si

caracterizarea electrochimica a electrozilor [37]. Maruratorile indica o crestere liniara a

curentului de pic prin cresterea radacinii patrate a vitezei de scanare. Densitatea de current este

mai mare cand se utilizeaza senzorii modificati, Ni(II)-Pc/Gr si Fe(II)-Pc/Gr, cresterea

densitatii de current este prezentata in Figura 1.

Figura 1. Voltamogramele ciclice inregistrate folosind senzorii Ni(II)-Pc/Gr si Fe(II)-Pc/Gr in

comparative cu senzorul nemodificat, in solutie de K3[Fe(CN)6]3-/4- 1 mol L-1

Pentru cei trei electrozi s-au determinat ariile suprafetelor active, folosind ecuatia Randles

Sevcik, care descrie procesele quasi-reversibile a trasferului de electron [38]:

ip=(2.65×105)×n3/2×A×D1/2×C×v1/2

unde: ip= curentul de pic (A), n= numarul de electroni transferati (n=1), A= aria suprafetei

active (cm2), C= concentratia solutiei de fericianura de potasiu (mol L-1) si v1/2= viteza de

scanare ((V s)1/2). Coeficientul de difuzie al cuplului redox [Fe(III)(CN)6]3-/[Fe(II)(CN)6)4- este

7.60×10-6 cm2s-1 [39] la temperature camerei (25°C =298.15 K). Ariile suprafetelor active

pentru cei trei electrozi sunt prezentate in Tabelul 2, valorile fiind mai mari pentru electrozii

medificati comparative cu electrodul nemodificat.

Tabelul 2. Aria suprafetei active a senzorului nemodificat si a senzorilor modificati

Coeficientul de difuzie (cm2s-1)

Sezori

Fe(II)-Pc/Gr Ni(II)-Pc/Gr Gr Aria suprafetei active (cm2)

7.6×10-6 0.00246 0.00411 0.000821

Voltamogramele ciclice masurate la diferite viteze de baleaj (0.01-0.5 V s-1) sunt reprezentate

in Figura 2. Procesul redox este controlat de difuzie. Aceste profiluri sunt fiabile pentru o

difuzie semi-infinită a speciilor redox active la electrod.

A

B

C Figura 2. Diagramele voltametriei ciclice (CV) la diferite viteze de baleaj (0.01-0.05 V s-1)

(stanga) si dependent liniara a curentului de pic vs. radacina patrata din viteza de baleaj

(dreapta) pentru senzorii: A) Fe(II)-Pc/Gr; B) Ni(II)-Pc/Gr; C) Gr in 1.00 mol L−1 K3[Fe(CN)6]

Efectul pH-ului

Metoda folosita in investigarea efectului pH-ului a fost voltametria in puls diferential. Solutia

de tampon acetat a fost preparata astfel cum este descrisa in literature [28], domeniul de pH

fiind cuprins in intervalul 1.10-6.05. Potentialul de pic al analitului se deplaseaza negative

direct proportional cu cresterea pH-ului, tendinta acestuia este prezentata in Figura 3.

Figura 3. Influenta pH-ului asupra potentialului de pic a MBzP

Valoarea optima de pH este mai mica decat pKa-ul analitului (pKa=3.08, [40]), ceea ce este

correct deoarece la o valoare mai mare a pH-ul comparativ pKa-ului, analitul va disocia in

solutie iar cantitatea de MBzP nu va putea fi determinate exact. Influenta pH-ului este

reprezentata in Figura 4.

Figura 4. Voltamogramele pentru MBzP in solutie tampon acetat la diferite pH-uri 1.10; 1.24;

1.55; 2.04; 2.56; 3.00; 3.59; 4.62; 5.01 si 6.05, pentru senzorii: A) Fe(II)-Pc/Gr; B) Ni(II)-

Pc/Gr; C) Gr

Electrolitul suport

Investigarea electrolitului suport s-a realizat prin aceeasi metoda ca in cazul determinarii pH-

ului optim. Curbele voltmanetrice au fost inregistrate intr-o solutie de 1.00×10-3 mol L-1MBzP

care contine acetat buffer solution, pH=2.04 si diferiti suporti electroliti, precum : NaCl (0.1

mol L-1), KCl (0.1 mol L-1), NaNO3 (0.1 mol L-1) si KNO3 (0.1 mol L-1).

Rezultatele si performantele diferitilor senzori au fost analizate pentru fiabilitatea, stabilitatea

si forma picurilor pentru a gasi cel mai bun electrolit suport. Din Figura 5 rezulta o crestere a

curentului de pic cand s-a folosit 0.1 mol L-1KNO3 ca electrolit support. Azotatul de sodium

prezinta de asemenea un raspuns bun, insa nu poate fi folosit datorita formei picului, folosind

senzorul Ni(II)-Pc/Gr. In continuare s-au ales 0.1 mol L-1 KNO3 si KCl 0.1 mol L-1 ca

electroliti support.

Figura 5. Masuratorile DPC pentru MBzP (1.00×10-3 mol L-1) continand solutie tampon acetat (pH=2.04) si diferiti electroliti support, precum: NaCl (0.1 mol L-1), KCl (0.1 mol L-1), NaNO3 (0.1 mol L-1) si KNO3 (0.1 mol L-1),

utilizand electrozii A) Fe(II)-Pc/Gr; B) Ni(II)-Pc/Gr; C) Gr

Performanta analitica a mono-benzil ftalatului

Performanta analitica a mono-benzil ftalatului s-a realizat prin masuratori DPV la concentratii

diferite de analit, folosind electrozii de lucru pe baza de grafena nemodificata si modificata cu

ftalocianura de fier (II) sau ftalocianura de nichel (II). Masuratorile au implicat diferite

concentratii de MBzP preparate in solutie tampon acetat (pH=2.04) si electroliti suport (0.1

mol L-1 KNO3 sau 0.1 mol L-1 KCl).

In termeni de fiabilitate si stabilitate, domeniul de concentratie pentru determinarea mono-

benzil ftalatului a fost intre 1.00×10-10 si 5.00×10−9 mol L−1 pentru electrodul Fe(II)-Pc/Gr,

folosint KNO3 ca electrolit support. Pentru pasta de grafena modificata cu Ni(II)-Pc domeniul

de concentratie a fost mai mare utilizand acelas electrolit support. Urmata de electrodul de

grafena nemodificata, mai putin fiabil si stabil, cu un domeniu de concentratii restrains, pentru

acelas electrolit suport. Proportionalitatea directa dintre curentul de pic si concentratia de

mono-benzil ftalat este prezentata in Figura 6 (in 0.1 mol L-1 KCl) si Figura 7 (in 0.1 mol L-1

KNO3).

A

B

C

Figura 6. Voltamogramele in puls diferentiat (stanga) si curbele de calibrare (dreapta),

curentul de pic vs concentratia de mono-benzil ftalat, obtinute pentru senzorii: A) Fe(II)-

Pc/Gr; B) Ni(II)-Pc/Gr; C) Gr in 0.1 mol L-1 KCl

A

B

C

Figura 7. Voltamogramele in puls diferentiat (stanga) si curbele de calibrare (dreapta),

curentul de pic vs concentratia de mono-benzil ftalat, obtinute pentru senzorii: A) Fe(II)-

Pc/Gr; B) Ni(II)-Pc/Gr; C) Gr in 0.1 mol L-1 KNO3

In Tabelul III si Tabelul IV sunt evidentiate raspunsurile caracteristice pentru cei trei electrozi

si cei doi electroliti suport. Limita de detective este mai joasa in cazul electrozilor modificati,

pentru cei doi electroliti suport.

Tabelul III. Raspunsurile caracteristice ale senzorilor folositi in determinarea MBzP in 0.1

mol L-1 KCl

* H exprimat in amperi (A); C exprimat in mol L-1.

Tabelul IV. Raspunsurile caracteristice ale senzorilor folositi in determinarea MBzP in 0.1

mol L-1 KNO3

* H exprimat in amperi (A); C exprimat in mol L-1.

Studiul interferentilor

S-au studiat doi posibili interferenti in cazul determinarii mono-benzil ftalatului. Compusii

Senzori Ni-Pc/Gr Fe-Pc/Gr Gr Ecuatia curbei de

calibrare* 5.464×10-

7+2.136×CMBzP 4.137×10-

7+73.493×CMBzP 2.790×10-

8+29.346×CMBzP R 0.9997 0.9982 0.9990

Sensibilitatea (A mol L-1) 2.136 73.493 29.346

Domeniul de concentratie (mol L-

1) 5.00×10-9–1.00×10-7 1.00×10-10-5.00×10-9 1.00×10-10-5.00×10-9

Limita de detectie (LOD) (mol L-1) 2.33×10-11 6.72×10-12 3.46×10-12

Limita de cuantificare (LOQ)

(mol L-1) 5.00×10-9 1.00×10-10 1.00×10-10

Senzori Ni-Pc/Gr Fe-Pc/Gr Gr Ecuatia curbei de

calibrare* 3.726×10-

7+29.389×CMBzP 6.739×10-

7+23.485×CMBzP 7.211×10-8+4.3×10-

4×CMBzP R 0.9981 0.9999 0.9996

Sensibilitate (A mol L-1)

29.089 23.485 4.3×10-4

Domeniul de concentratie (mol L-

1)

1.00×10-10-1.00×10-08 1.00×10-10-5.00×10-9 1.00×10-5-1.00×10-4

Limita de detectie (LOD) (mol L-1)

1.38×10-11 2.33×10-13 1.84×10-8

Limita de cuantificare (LOQ)

(mol L-1)

1.00×10-10 1.00×10-10 5.00×10-5

alesi au fost L-tirozina (L-Tyr) si bisfenolul A (BPA). Concentratia analitului a fost de 1.00 x

10-5 mol L-1, de 1000 de ori mai mica decat cea a interferentilor, 1.00 x 10-2 mol L-1. In Tabelul

V si Tabelul VI sunt prezentate voltamogramele DPV, ilustrand o rezolutie buna intre analit si

interferenti.

Tabelul V. Curbele DPV ilustrand efectul bisfenolului A ca posibil interferent pentru senzorii:

A) Fe(II)-Pc/Gr; B) Ni(II)-Pc/Gr; C) Gr;

i 0.1 mol L-1KCl 0.1 mol L-1KNO3

Gr

Tabelul V. Curbele DPV ilustrand efectul L-tirozinei ca posibil interferent pentru senzorii: A)

Fe(II)-Pc/Gr; B) Ni(II)-Pc/Gr; C) Gr;

Senzori 0.1 mol L-1KCl 0.1 mol L-1KNO3

Fe(II)-Pc/Gr

Ni(II)-Pc/Gr

Gr

Rezultatele sunt sustinute si prin coeficientii de selectivitate, calculate prin metoda solutiilor

mixte propusa de Wang [41] (Tabelul VII si Tabelul VIII). Pentru o valoare a coeficientului de

selectivitate mai mare de 1.00×10-3, substanta studiata interfera cu analitul in conditiile optime

de lucru (pH = 2.04 in 0.1 mol L-1 KCl sau KNO3), insa valorile obtinute sunt mai mici de zero

conducand la ipoteza ca L-Tyr si BPA nu interfera in determinarea mono-benzil ftalatului.

Table VII. Coeficientii de selectivitate pentru senzorii folositi in determinarea MBzP (ABS,

pH = 2.04 in 0.1 mol L-1 KCl)

BPA Tyr

Fe-Pc/Gr -8.95×10-4 -9.35×10-4 Ni-Pc/Gr -8.87×10-4 -6.42×10-4

Gr -9.82×10-4 -9.14×10-4

Table VIII. Coeficientii de selectivitate pentru senzorii folositi in determinarea MBzP (ABS,

pH = 2.04 in 0.1 mol L-1 KNO3)

BPA Tyr

Fe-Pc/Gr -7.02×10-4 -8.92×10-4 Ni-Pc/Gr -8.93×10-4 -9.93×10-4

Gr -7.63×10-4 -6.60×10-4

Aplicatii analitice

Douazeci de probe biologice (Ethics committee approval no.158/2018, awarded by the

University of Medicine and Pharmacy „Carol Davila” in Bucharest) (10 salive umane si 10

probe de urina), preparate cum a fost indicat in sectiunea experimental, probe biologice, au

fost scanate pentru indentificarea MBzP. Este foarte important să se detecteze foarte rapid

nivelurile foarte scăzute de mono-benzil ftalat, deoarece se metabolizeaza foarte rapid, în

special la sugari și copii, nivelul MBzP a fost extrem de scăzut, astfel ca nu a fost posibilă

măsurarea analitică a conținutului de MBzP în eșantioane. Cu toate acestea, deoarece a fost

critic să aflăm dacă există MBzP în probe, am fost nevoiți să ne adaptăm metoda la un sistem

de screening pentru detectarea nivelurilor de urme a mono-benzil ftalatului sub limita de

detecție din aceste probe. Apoi am aplicat electrodul de grafena modificat cu ftalocianină de

fier (Fe (II) -Pc / Gr) cu limita de detecție (LOD), 2,338 x 10-13 mol L-1 (5.999 x 10-5 ng mL-1),

ca un nou dispozitiv sensibil, microsensor in voltametria in puls diferențială (DPV) ca sistem

de screening pentru detectarea nivelelor de urme de mono-benzil ftalat la pacienți. Noutatea

sistemului nostru simplu de monitorizare rapidă, eficientă din punct de vedere al costurilor,

este confirmată prin compararea diferitelor metode analitice de determinare numai a

monobenzil ftalatului din Tabelul I.

In continuare, am testat aplicabilitatea metodei dezvoltate. Prin urmare, metoda a fost aplicată

pentru a analiza mono-benzil ftalatul în diferite probe biologice, incluzând probe de saliva și

urină utilizând metoda probelor spiked. Rezultateale sunt prezentate in Tabelul IX (a), (b) si

Tabelul X (a), (b). Pentru a testa acuratetea metodei s-a investigat determinarea MBzP din

probe biologice spiked, la o singura concentratie 5.00×10-9 mol L-1. Nivelurile de recuperare

din probele de saliva s-au incadrat in domeniul 92.73- 99.98%, pentru probele de urina

rezultatele s-au incadrat intre 63.36% si 97.94%, ceea ce indica ca metoda este potrivita pentru

analiza MBzP in probe biologice.

Table IX (a). Nivelurile de recuperare a mono-benzil ftalatului in saliva umana

Electrode S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Fe-Pc/Gr 99.66

±0.03 95.12 ±0.33

96.70 ±0.11

98.81 ±0.68

99.96 ±0.73

99.96 ±0.31

99.60 ±0.33

94.96 ±0.51

94.91 ±0.23

97.18 ±0.28

Ni-Pc/Gr 97.81 ±0.30

95.74 ±0.21

97.16 ±0.32

92.73 ±0.56

99.98 ±0.62

97.42 ±0.32

99.41 ±0.58

97.36 ±0.49

97.74 ±0.38

96.55 ±0.64

Graphene 97.44 ±0.27

94.64 ±0.66

96.39 ±0.77

98.60 ±0.50

98.86 ±0.76

99.92 ±0.27

99.96 ±0.78

94.38 ±0.10

93.95 ±0.12

97.66 ±0.54

S-proba

Deviatia standard pentru 5 masuratori (n=5).

Table X (a). Nivelurile de recuperare a mono-benzil ftalatului in probe de urina

Electrode S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Fe-Pc/Gr 92.55

±0.30 83.29 ±0.02

90.09 ±0.39

85.34 ±0.36

85.03 ±0.52

93.23 ±0.58

91.11 ±0.58

88.26 ±0.23

92.55 ±0.48

86.47 ±0.41

Ni-Pc/Gr 96.99 ±0.20

66.54 ±0.25

88.66 ±0.91

94.66 ±0.72

91.66 ±0.53

94.67 ±0.51

97.94 ±0.51

94.95 ±0.14

94.57 ±0.64

94.45 ±0.50

Graphene 88.67 ±0.39

63.36 ±0.53

87.98 ±0.52

78.90 ±0.41

76.62 ±0.21

92.08 ±0.66

68.80 ±1.08

86.52 ±0.53

90.15 ±0.26

70.18 ±0.71

S-proba

Deviatia standard pentru 5 masuratori (n=5).

Dupa cum se poate vedea in tabele, senzorii pe baza de grafena modificata cu Ni(II)-Pc sau

Fe(II)-Pc/Gr prezinta rezultate bune in termini de recuperare a mono-benzil ftalatului din

matrici complexe, precum saliva si urina umana.

Table IX (b). Estimarea cantitatii recuperate de MBzP din salive umane

Electrod S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Fe(II)-Pc/Gr 4.98×10-9 4.75×10-

9 4.83×10-9 4.94×10-9 4.99×10-9 4.87×10-

9 4.98×10-

9 4.74×10-

9 4.74×10-

9 4.85×10-

9

Ni(II)-Pc/Gr 4.89×10-9 4.78×10-

9 4.85×10-9 4.63×10-9 4.99×10-9 4.99×10-

9 4.97×10-

9 4.86×10-

9 4.88×10-

9 4.82×10-

9

Gr 4.87×10-9 4.73×10-

9 4.81×10-9 4.93×10-9 4.93×10-9 4.99×10-

9 4.99×10-

9 4.71×10-

9 4.69×10-

9 4.88×10-

9

Table X (b). Estimarea cantitatii recuperate de MBzP din probe de urina

Electrod S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Fe(II)-Pc/Gr 4.62×10-9 4.16×10-9 4.50×10-9 4.26×10-9 4.25×10-9 4.66×10-

9 4.55×10-

9 4.41×10-

9 4.62×10-

9 4.31×10-

9 Ni(II)-Pc/Gr 4.84×10-9 3.32×10-9 4.43×10-9 4.73×10-9 4.58×10-9 4.73×10-

9 4.89×10-

9 4.74×10-

9 4.72×10-

9 4.72×10-

9

Gr 4.43×10-9 3.16×10-9 4.39×10-9 3.94×10-9 3.83×10-9 4.60×10-

9 3.44×10-

9 4.32×10-

9 4.50×10-

9 3.50×10-

9

S-proba

Deviatia standard pentru 5 masuratori (n=5).

Concluzii

In acesta lucrare am dezvoltat un nou microsensor rapid, sensibil folosit in voltametria in puls

diferentiat ca system de screening pentru a detecta nivelele scazute de mono-benzil ftalat, care

sunt critice pentru a cunoaste de la prima formare metabolica la oameni, in special la sugari si

copii. Acest sistem de screening pentru detectarea nivelelor de mono-benzil ftalat a fost aplicat

cu succes sub limita de detecție din aceste probe. Noutatea sistemului de screening rapida,

sensibila și eficienta este confirmată în continuare prin compararea diferitelor metode analitice

de determinare a monobenzil ftalatului din Tabelul I.

În dezvoltarea metodei noastre analitice normale pentru determinarea ftalatului de mono-

benzil, determinarea analitului a fost efectuată prin voltamatrie in puls diferențială, utilizând

senzori bazați pe grafena nemodificata și modificata cu ftalocianura de nichel (II) (Ni(II)-

Pc/Gr) și ftalocianura de fier (II) (Fe(II)-Pc/Gr).

Metoda propusă este fiabilă și sustenabilă pentru procesul de recuperare a ftalatului de

monobenzil în probele biologice, nivelul de recuperare din saliva umană este cuprins între

92,73% și 99,98% iar pentru urină intervalul se situeaza între 63,36% și 97,94%. Nivelurile de

recuperare nu au fost influențate de interferenti, de ex. bisfenol A și L-tirozină.

Bibliografie

1. R. M. David, R. H. McKee, J. H. Butala, R. A. Barter and M. Kayser, Esters of

aromatic mono-, di-, and tricarboxylic acids, aromatic diacids, and di-, tri-, or polyalcohols,

Chapter 80, p. 635, John Wiley and Sons: New York, (2001).

2. D. B. Barr, M. J. Silva, K. Kato, J. A. Reidy, N. A. Malek, D. Hurtz, M. Sadowski, L.

L. Needham and A.M. Calafat, “Assessing human exposure to phthalates using monoesters

and their oxidized metabolites as biomarkers,” Environ. Health Perspect., 111, 1148 (2003).

3. A. M. Calafat, M. J. Silva, J. A. Reidy, L. E. Gray, E. Samandar, J. L. Preau, A. R.

Herbert and L. L. Needham, “Mono-(3-carboxypropyl) phthalate, a metabolite of di-n-octyl

phthalate,” J. Toxicol. Environ. Health A, 69, 215 (2006).

4. H. M. Koch, H. M. Bolt, R. Preuss and J. Angerer, “New metabolites of di(2-

ethylhexyl)phthalate (DEHP) in human urine and serum after single oral doses of deuterium-

labelled DEHP,” Arch. Toxicol.,79, 367 (2005).

5. H. M. Koch, J. Muller and J. Angerer, “Determination of secondary, oxidised di-iso-

nonylphthalate (DINP) metabolites in human urine representative for the exposure to

commercial DINP plasticizers,” J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 847, 114

(2007).

6. M. J. Silva, J. A. Reidy, J. L. Preau, L. L. Needham and A. M. Calafat, “Oxidative

metabolites of diisononyl phthalate as biomarkers for human exposure assessment,” Environ.

Health Perspect., 114, 1158 (2006).

7. M. J. Silva, E. Samandar, J. L. Preau, L. L. Needham and A. M. Calafat, “Urinary

oxidative metabolites of di(2-ethylhexyl) phthalate in humans,” Toxicology, 219, 22 (2006).

8. M. J. Silva, J. A. Reidy, K. Kato, J. L. Preau, L. L. Needham and A. M. Calafat,

“Assessment of human exposure to di-isodecyl phthalate using oxidative metabolites as

biomarkers,” Biomarkers, 12, 113 (2007).

9. ATSDR, “Toxicological profile for di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP),” Agency for

Toxic Substances and Disease Registry, Atlanta, GA, (2002).

10. ATSDR, “Toxicological profile for diethyl phthalate (DEP),” Agency for Toxic

Substances and Disease Registry, Atlanta, GA, (1995).

11. ATSDR, “Toxicological profile for di-n-octyl phthalate (DNOP),” Agency for Toxic

Substances and Disease Registry, Atlanta, GA, (1997).

12. ATSDR, “Toxicological profile for di-n-butyl phthalate (DBP),” Agency for Toxic

Substances and Disease Registry, Atlanta, GA, (2001).

13. M. J. Silva, D. B. Barr, J. A. Reidy, K. Kato, N. A. Malek, C. C. Hodge, D. Hurtz, A.

M. Calafat, L. L. Needham and J. W. Brock, “Glucuronidation patterns of common urinary

and serum monoester phthalate metabolites,” Arch. Toxicol., 77, 561 (2003).

14. CDC (Centers for Disease Control and Prevention) 2013–2014. “National Health and

Nutrition Examination Survey Data,” Atlanta, GA:U.S. Department of Health and Human

Services, CDC.

15. B. C. Blount, M. J. Silva, S. P. Caudill, L. L. Needham, J. L. Pirkle, E. L. Sampson, G.

W. Lucier, R. J. Jackson and J. W. Brock, “Levels of seven urinary phthalate metabolites in a

human reference population,” Environ Health Perspect., 108, 979 (2000).

16. K. Kato, M. J. Silva, J. A. Reidy, D. Hurtz, N. A. Malek, L. L. Needham, H.

Nakazawa, D. B. Barr and A. M. Calafat, “Mono(2-ethyl-5-hydroxyhexyl) phthalate and

mono-(2-ethyl-5-oxohexyl) phthalate as biomarkers for human exposure assessment to di-(2-

ethylhexyl) phthalate,” Environ. Health Perspect., 112, 327 (2004).

17. M. J. Silva, D. B. Barr, J. A. Reidy, K. Kato, N. A. Malek, C. C. Hodge, D. Hurtz III,

A. M. Calafat, L. L. Needham and J. W. Brock, “Glucuronidation patterns of common urinary

and serum monoester phthalate metabolites,” Arch. Toxicol., 77, 561 (2003).

18. M. J. Silva, A. J. Reidy, E. Samandar, A. R. Herbert, L. L. Needham and A. M.

Calafat, “Detection of phthalate metabolites in human saliva,” Arch. Toxicol., 79, 647 (2005).

19. M. J. Silva, J. A. Reidy, A. R. Herbert, J. L. Preau, L. L. Needham and A. M. Calafat,

“Detection of phthalate metabolites in human amniotic fluid,” Bull Environ. Contam Toxicol.,

72, 1226 (2004).

20. A. M. Calafat, A. R. Slakman, M. J. Silva, A. R. Herbert and L. L. Needham,

“Automated solid phase extraction and quantitative analysis of human milk for 13 phthalate

metabolites,” J. Chromatogr. B, 805, 49 (2004).

21. N. Rastkaria and R. Ahmadkhanihab, “Magnetic solid-phase extraction based on

magnetic multi-walled carbon nanotubes for the determination of phthalate monoesters in

urine samples,” J. of Chromatogr. A, 1286, 22 (2013).

22. M. J. Silva, A. R. Slakman, J. A. Reidy, J. L. Preau, A. R. Herbert, E. Samandar, L. L.

Needham and A. M. Calafat, “Analysis of human urine for fifteen phthalate metabolites using

automated solid-phase extraction,” J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 805,

161 (2004).

23. M. J. Silva, N. A. Malek, C. C. Hodge, J. A. Reidy, K. Kato, D. B. Barr, L. L.

Needham and J. W. Brock, “Improved quantitative detection of 11 urinary phthalate

metabolites in humans using liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization

tandem mass spectrometry,” Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 789, 393

(2003).

24. K. Kato, M. J. Silva, J. W. Brock, J. A. Reidy, N. A. Malek, C. C. Hodge, H.

Nakazawa, L. L. Needham and D. B. Barr, “Quantitative detection of nine phthalate

metabolites in human serum using reversed-phase high-performane liquid chromatography-

electrospray ionization-tandem mass spectrometry,” J. Anal. Toxicol., 27, 284 (2003).

25. K. Kato, M. J. Silva, L. L. Needham and A. M. Calafat, “Determination of 16 Phthalate

Metabolites in Urine Using Automated Sample Preparation and On-line

Preconcentration/High-Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry,”

Anal. Chem., 77, 2985 (2005).

26. G. Denuault, “Electrochemical techniques and sensors for ocean research,” Ocean Sci.,

5, 697 (2009).

27. C. M. A. Brett, “Electroanalytical techniques for the future: the challenges of

miniaturization and of real-time measurements,” Electroanalysis, 11, 1013 (1999).

28. B. T. Dogan, A. S. Ozkan and B. Uslu, “The analytical applications of square wave

voltammetry on pharmaceutical analysis,” Open Chem. Biomed. Meth. J., 3, 56 (2010).

29. P. Zuman, “Principles of applications of polarography and voltammetry in the analysis

of drugs” FABAD J. Pharm. Sci., 31, 97 (2006).

30. P. Zuman, “Past, present, and future of applications of electroanalytical techniques in

analytical and physical organic chemistry” J. Solid Stat. Electrochem., 15, 1753 (2011).

31. T. Kuwana and W. G. French, “Electrooxidation or Reduction of Organic Compounds

into Aqueous Solutions Using Carbon Paste Electrode,” Anal. Chem., 36, 241 (1964).

32. F. A. Schultz and T. Kuwana, “Electrochemical studies of organic compounds

dissolved in carbon-paste electrodes,” J. Electroanal. Chem., 10, 95 (1965).

33. L. A. Gugoasa, R. I. Stefan-van Staden, J. van STADEN, M. Coroş and S. Pruneanu,

“3D-printed electrochemical Platform containing novel Au-rGO Nanocomposite used for

Determination of an Endocrine disrupting Compound from Saliva Samples,” Anal. Letters,

doi: 10.1080/00032719.2019.1620262

34. J. F. van Staden, R. Georgescu, R. I. Stefan-van Staden and I. Calinescu, “Evaluation

of Amperometric Dot Microsensors for the Analysis of Serotonin in Urine Samples,” J.

Electrochem. Sci., 161, B49-B54 (2014).

35. Sigma-Aldrich. Buffer Reference Center. https://www.sigmaaldrich.com/life-

science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html

36. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Laboratory stock solutions and

equipment Common Buffers and Stock Solutions, John Wiley & Sons, Inc., A.2A.1-A.2A.12,

(2000).

37. F. Pogaceana, M. Corosa, V. Mirela, L. Magerusana, L. Barbu-Tudorana, A. Vulpoib,

R. I. Stefan-van Staden and S. Pruneanua, “Graphene-based materials produced by graphite

electrochemical exfoliationin acidic solutions: Application to Sunset Yellow voltammetric

detection,” Microchem. J., 147, 112 (2019).

38. P. Zanello, "Inorganic Electrochemistry: Theory, Practice and Application," The Royal

Society of Chemistry, (2003). ISBN 0-85404-661-5

39. A. Purwidyantri, C. H. Chen, L. Y. Chen, C. C. Chen, J. D. Luo, C. C. Chiou, Y. C.

Tian, C. Y Lin, C. M. Yang, H. C. Lai, and Chao-Sung Lai, “Speckled ZnO Nanograss

Electrochemical Sensor for Staphylococcus epidermidis Detection,” J. Electrochem. Sci., 164,

B205-B11 (2017).

40. https://chemaxon.com/products/calculators-and-predictors#pka

41. J. Wang, “Selectivity coefficients for amperometric sensors,” Talanta, 41, 857 (1994).

Recunoasterea moleculara a aminoacizilor din vinuri

Au fost utilizate doua noi amide sintetizate ale acidului oleic, (N-(2-(piperidin-1-il) etil)

oleamidă și N-(2-(pirolidină-1-etil) etil) oleamidă pentru proiectarea senzorilor stocastici pe

bază de pasta nanografene. Senzorii stocastici au fost folosiți pentru recunoașterea moleculara

a patru aminoacizi: L-histidină, L-tirozină, L-ornitină și L-lizină din probe de vin.

Recunoașterea moleculara a fost realizată pe baza semnăturilor înregistrate pentru fiecare

dintre aminoacizii. Prin metoda stocastica, limitele de determinare permit analiza

aminoacizilor din probele de vin la concentrații foarte mici mai rapid, fiabil și mai rentabil

decât alte metode propuse până în prezent.

Introducere

Senzorii stocastici au fost folosiți în analiza diferitelor substanțe care se gasesc în concentrații

mici în matrici foarte complexe ca de exemplu: dopamina [1], acidul pipecolic [2], antigenul

hepatitei B [3] din probe de sânge. S-au folosit până în prezent pentru proiectarea senzorilor

stocastici [4-6] diferite clase de substanțe cum ar fi: porfirine, maltodextrine, ciclodextrine,

ftalocianine.

Analiza aminelor biogene in concentrații foarte mici este extrem de importantă pentru

sănătatea consumatorilor. Au fost necesare pentru industria vinurilor si alimentară [7,8],

metode rapide de analiză ale aminoacizilor precum: cromatografie lichidă [9,10], electroforeza

capilară cu etichetarea pre- sau post-coloană [11,12]; cea mai utilizata tehnica fiind detectia

spectroscopică [13-24]. Pentru analiza aminelor biogene au fost propusi, de asemenea, screen-

printed electrozii pe bază de ftalocianine [25].

Lucrarile experimentale au constat in construcția, caracterizarea și validarea a doi senzori

stocastici pe baza de noi amide ale acizilor grasi sintetizate: N-(2-(piperidin-1-il)etil) oleamidă

și N-(2-(pirolidină-1-il) etil) oleamidă (Figura 1a și 1b), folositi pentru testarea L-histidinei, L-

tirozinei, L-ornitinei și L-lizinei din probele de vin. Amidele acizilor grași precum: N-(2-

(piperidin-1-il)etil) oleamidă și N-(2-(pirolidin-1-il)etil) oleamidă, sunt capabile să furnizeze

porii necesari pentru funcția de senzorii stocastici. Pulberea de nanografena a fost propusă

pentru matrice; aceasta fiind preferata față de alte materiale precum nanotuburile de carbon și

grafenul dopat cu N, datorită nanostructurii care poate favoriza o formă mai bună și mai stabilă

a nanocanalelor găsite în cele două amide cu acizii grasi propusi ca modificatori.

Figura 1. Proiectarea platformei electrochimice; formulele structurale ale amidelor acizilor

grasi pentru constructia senzorilor stocastici: (a) N-(2-(piperidin-1-il)etil)oleamida (O1) si (b)

N-(2-(pirolidin-1-il)etil)oleamida (O2); proiectarea celor doi senzori stocastici bazati pe (c) O1

si (d) O2; (e) reprezentarea schematic a platformei electrochimice.

Experimental

Reactivi si materiale – Amidele acizilor grasi: N-(2-(piperidin-1-il)etil)oleamida (O1) si N-(2-

(pirolidin-1-il)etil)oleamida (O2) (Figura 1) au fost sintetizate de un grup de cercetatori din

cadrul Institutului National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutice din Bucuresti,

Romania, conform metodei publicate anterior [26].

Pudra de nanografena și uleiul de parafină au fost achiziționate de la Fluka (Buchs).

Apa deionizată necesară pentru prepararea tuturor soluțiilor a fost obținută folosind un sistem

Millipore Direct-Q3 (Mosheim, Franța). Toate soluțiile de aminoacizi au fost preparate în apă

deionizată, fiind tamponate cu solutie de tampon fosfat (pH = 7.5). S-a utilizat metoda

dilutiilor repetate pentru prepararea soluțiilor de aminoacizi. Toate substanțele chimice folosite

au fost de calitate analitică.

Aparatura – Măsurătorile experimentale s-au efectuat cu un potențialostat/galvanostat

(Metrohm) AUTOLAB / PGSTAT 302N conectat la un computer cu software-ul GPES. Celula

electrochimică contine un electrod de referință Ag/AgCl (0.1 mol L−1 KCl), un electrod de

platină ca electrod auxiliar si electrodul de lucru, senzorul stocastic pe baza de nanografena

modificata cu amidele acizilor grasi O1 si O2.

Constructia senzorilor stocastici – S-au preparat soluții de concentratie 1.00x10-3 mol L-1

pentru amidele acizilor grasi O1 și O2 în alcool etilic. Pasta de nanografena nGrP a fost

obținută prin amestecarea pulberii de nanografena cu ulei de parafină. Soluțiile etanolice

O1/O2 au fost amestecate cu nGrP într-un raport de 1:1 (v(µL)/w(mg)) pentru a obtine pastele

de nanografene modificate: O1/nGrP și O2/nGrP. Pastele O1/nGrP și O2/nGrP au fost

introduse într-un tub de plastic cu un diametru intern de 150μm (fig. 1c și 1d). A fost folosit un

fir de argint drept contact electric. Senzorii stocastici au fost integrați în platformele de

măsurare, care conțin, de asemenea, un fir de platina ca senzor auxiliar și un electrod Ag/AgCl

(0.1 mol L−1 KCl) ca senzor de referință (figura 1e). Platforma a fost realizată dintr-un material

plastic non-conductiv și a fost imprimat 3D în laborator cu ajutorul unei imprimante 3D.

Metoda stocastica - Măsurătorile au fost efectuate după aplicarea unui potențial de 125mV, la

25°C. Parametrii măsurați au fost ton (parametrul cantitativ) și toff (semnătura analitului -

parametrul calitativ) (figura 2). Soluțiile pregătite pentru fiecare amino acid au fost plasate în

platformă, s-au înregistrat diagrame și s-au determinat intervalele liniare de concentrație și

ecuațiile de calibrare pentru fiecare amino acid folosind metoda regresiei liniare. Ecuația

folosită pentru calibrarea senzorilor a fost: 1/ton = a + b × Conc. amino acid. În laborator a fost

dezvoltat un sistem automat utilizat pentru citirea valorilor toff și ton din diagramele obținute

pentru analiza vinului și a fost utilizat pentru citirea tuturor diagramelor. Amino acizii au fost

identificați în diagrame pe baza semnăturilor lor și în continuare valorile ton au fost citite și

introduse în ecuațiile de calibrare (Tabel1), pentru a determina concentrațiile de L-histidină, L-

tirosină, L-ornitină , și L-lizină din probele de vin.

Probe

Au fost selectate trei tipuri de vinuri pentru screening folosind senzorii stocastici propuși. A

fost verificat pH-ul probelor de vin și s-au ajustat la pH 7.5 cu ajutorul solutiei de tampon

fosfat. Acesta a fost singurul tratament înainte ca vinurile să fie analizate cu platforma care

conține senzorul stocastic.

Rezultate si discutii

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici

Răspunsul senzorilor stocastici s-a bazat pe conductivitatea canalului [4]. Procesele care au

loc: (1) amino acidul blocheaza canalulul, iar curentul scade la zero pentru un anumit timp,

ceea ce se numeste semnătura amino acidului și se regaseste în diagrama notat ca si toff (figura

2); (2) amino acidul se leagă de peretele canalului intern și este supus unui proces redox în

timp numit ton (Figura 2), care este corelat cu concentrația amino acidului prin ecuația 1/ton=

a+b×Conc.amino acid.

Procesul de legare care are loc pe canal este:

Ch(i) + amino acid (i) ⇔Ch(i) ∙ Amino acid(i), unde Ch este canalul, iar i este interfața.

Semnaturile diferite inregistrate pentru amino acizi au permis detreminarea lor simultana

(Tabel 1). Senzorul stocastic pe baza de O2/ngrafena a dat cele mai inalte sensibilitati si cele

mai mici limite de determinare in analiza L-histidinei, L-tirozinei, L-ornitinei si L-lizinei.

Comparativ cu datele prezentate in Tabelul 1, senzorii stocastici propusi au prezentat domenii

largi de concentratie liniara si limite mai mici de determinare. Aceasta este prima metoda

electrochimica capabila sa recunoasca si sa cuantifice simultan L-histidina, L-tirozina, L-

ornitina si L-lizina.

Tabel 1. Raspunsurile caracteristice ale senzorilor stocastici pentru determinarea L-histidinei,

L- lizinei, L-ornitinei si L-tirozinei.

Amino

acizi

toff

(s)

Domeniul

liniar de

concentratie

(mol L-1)

Sensibilitatea

(s mol L-1)

Ecuatia de

calibrare si

coeficentul de

corelatie, r*

Limita de

determinare

(mol L-1)

Senzori stocastici pe baza de O1/nGrafena

L-

histidina 0.8

1.00x10-10-

1.00x10-7 4.83x105

1/ton = 0.03 +

4.83x105xC;

r=0.9947

1.00x10-10

L-lizina

1.2

1.00x10-7-

1.00x10-4 4.85x102

1/ton = 0.05 +

4.85x102xC; 1.00x10-7

r=0.9988

L-

ornitina

0.4 1.00x10-8-

1.00x10-4 6.16x102

1/ton = 0.05 +

6.16x102xC;

r=0.9980

1.00x10-8

L-

tirozina 1.0

1.00x10-10-

1.00x10-8 2.61x106

1/ton = 0.05 +

2.61x106xC;

r=0.9999

1.00x10-10

Senzori stocastici pe baza de O2/nGrafena

L-

histidina 0.7

1.00x10-10 -

1.00x10-8 5.00x106

1/ton = 0.04 +

5.00x106xC;

r=0.9988

1.00x10-10

L-lizina

0.3

1.00x10-7 -

1.00x10-5 5.60x103

1/ton = 0.03 +

5.60x103xC;

r=0.9967

1.00x10-7

L-

ornitina

1.2 1.00x10-8 -

1.00x10-6 2.87x104

1/ton = 0.04 +

2.87x104xC;

r=0.9965

1.00x10-8

L-

tirozina 0.6

1.00x10-11 -

1.00x10-8 4.77x107

1/ton = 0.03 +

4.77x107xC;

r=0.9995

1.00x10-11

*<C> = mol L-1; <ton> = s

Selectivitatea platformelor care contin senzorii stocastici

Selectivitatea a fost verificata fata de aminele biogene din vinuri, cum ar fi histamina,

putresceina si cadaverina si fata de ionii de fier (II) si (III). Toti acesti compusi au dat

semnaturi mult diferite fata de cele inregistrate pentru L-histidina, L-tirozina, L-ornitina si L-

lizina, atunci cand au fost testati cu senzorii stocastici propusi, dovedind speciile analizate nu

interfera in analiza L-histidinei, L-tirozinei, L-ornitinei si L-lizinei.

Stabilitatea si reproducibilitatea

Senzorii stocastici propusi integrati in platforme au fost utilizati timp de patru luni pentru

testele de screening ale amino acizilor din probele de vin. In acest timp panta (sensibilitatea)

senzorilor stocastici a variat cu 1.50% (reproductibilitatea intre zile), in timp ce in aceeasi zi

panta (sensibilitatea) senzorilor stocastici a variat cu 0.32%. Au fost construite zece platforme

pentru fiecare dintre sensorii stocastici; valorile înregistrate pentru sensibilitățile acestora au

variat cu 1.00%. În consecință, construcția platformelor și a senzorilor stocastici sunt fiabile

pentru cel puțin 4 luni (perioada de testare).

Aplicatiile analitice ale senzorilor stocastici

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici propuși au făcut posibilă utilizarea

platformelor pentru testele de screening ale vinurilor, când L-histidina, L-tirozina, L-ornitina și

L-lizina au fost identificate și cuantificate. Trei tipuri de vinuri au fost selectate pentru

screening folosind platformele care conțin senzori stocastici. Amino acizii au fost identificați

în diagrame (figura 2) pe baza semnăturii lor. După identificarea lor în diagrama, valorile ton

au fost citite și utilizate pentru determinarea concentrațiilor de amino acizi - așa cum este

descris în paragraful modului stocastic. După cum se poate observa din tabelul 2, există o bună

corelație între valorile obținute cu ajutorul platformelor care încorporează senzorii stocastici

propuși. S-a efectuat t-testul cu nivel de încredere de 99.00% pentru analiza fiecărui amino

acid. Toate valorile calculate cu t-testul cu nivelul de încredere de 99.00% sunt mai mici decât

valoarea teoretică: 4.032; pentru L-histidină valoarea a fost 2.32, pentru L-tirozină valoarea

2.87, pentru L-ornitină valoarea a fost de 2.45, iar pentru L-lizină de 2.20. În consecință, nu

există nici o diferență semnificativă statistic între rezultatele obținute folosind cei doi senzori

stocastici încorporați in platformele electrochimice cu un nivel de încredere de 99.00%, pentru

analiza L-histidinei, L-tirozinei, L-ornitinei și L-lizinei in probele de vin .

A

B

Figura 2. Diagramele obținute pentru screeningul probelor de vin cu senzori stocastici pe baza

de: (a) O1/nGrP si (b) O2/nGrP.

Tabel 2. Determinarea amino acizilor: L-histidina, L-lizina, L-ornitin si L-tirozina din probe

de vin (N=10 determinari).

Probe Senzori stocastici pe

baza de nGrafena si

L-histidina (ng L-1)

L-lizina (mg L-1)

L-ornitina (mg L-1)

L-tirozina (ng L-1)

Vin alb O1 37.20±0.02 5.49±0.03 7.75±0.01 9.78±0.02

O2 38.12±0.03 5.81±0.04 7.47±0.02 9.69±0.02

Vin rosu 1 O1 16.40±0.04 5.50±0.02 2.18±0.02 1.20±0.04

O2 16.96±0.03 5.15±0.03 2.64±0.03 1.28±0.01

Vin rosu 2 O1 18.90±0.04 3.43±0.02 1.61±0.01 3.20±0.02

O2 18.39±0.04 3.68±0.02 1.79±0.01 2.95±0.03

Concluzii

Au fost proiectate două platforme electrochimice bazate pe senzori stocastici pentru

determinarea a patru aminoacizi: L-histidină, L-tirozină, L-ornitină și L-lizină din probe de

vin. A fost înregistrată o fiabilitate ridicată a senzorilor. Principala caracteristică a platformelor

este utilizarea lor pentru determinarea calității vinurilor și a altor băuturi.

Referinte

1. R.I. Stefan-van Staden, S.C. Balasoiu, J.F. van Staden, J Electrochem Soc 2012, 159,

B839-B844.

2. R.I. Stefan-van Staden, I. Moldoveanu, F.S. Sava, C. Kapnissi, J.F. van Staden, Chirality

2013, 25, 114-118.

3. R.I. Stefan-van Staden, I. Moldoveanu, J Electrochem Soc 2014, 161, B3001-B3005.

4. H. Bayley, P.S. Cremer, Nature 2001, 413, 226–230.

5. R.I. Stefan-van Staden, J.F. van Staden, J. Mod. Med. Chem. 2013, 1, 86–91.

6. F. Harja, R.I. Stefan–van Staden, I.R. Comnea-Stancu, C. Cioates Negut, E.M. Ungureanu,

J. Electrochem. Soc. 2016, 163, B252-B255.

7. G. Sarwar, H.G. Botting, J. Chromatography B 1993, 615, 1-22.

8. M.I. Mohamed, C. Cordle, Dev. Food Sci. 2000, 41, 181-215.

9. E. Heftmann, Chromatography, Fundamentals and Applications of Chromatography and

Related Differential Migration Methods, Part B: Applications, fifth ed., Elsevier,

Amsterdam, 1992.

10. R.I. Khan, R. Onodera, M.R. Amin, N. Mohammed, Amino Acids 2002, 22, 167-177.

11. D.R. Baker, Capillary Electrophoresis, Wiley, New York, 1995.

12. W.J.M. Underberg, J.C.M. Waterval, Electrophoresis 2002, 23, 3922-3933.

13. A.A. Ensafi, R. Hajian, Anal Chim Acta 2006, 580, 236–243.

14. J. Hou, F. Zhang, X. Yan, L. Wang, J. Yan, H. Ding, L. Ding, Anal Chim Acta 2015, 859,

72–78.

15. Y.R. Liu, R. Hu, T. Liu, X.B. Zhang, W. Tan, G.L. Shen, R.Q. Yu, Talanta 2013, 107,

402–407.

16. M. Sa, Li Ying, Tang Ai-Guo, Xiao Le-Dong, Ren Ya-Ping, Clin Chim Acta 2012, 413,

973–977.

17. K. Varmira, G. Mohammadi, M. Mahmoudi, R. Khodarahmi, K. Rashidi, M. Hedayati,

H.C. Goicoechea, A.R. Jalalvand Talanta 2018, 183, 1-10.

18. L. Jiang, S. Gu, Y. Ding, D. Ye, Z. Zhang, F. Zhang, Colloids Surf. B: Biointerfaces 2013,

107, 146–151.

19. P. Kowalski, M. Bieniecki, I. Oledzka, H. Lamparczyk, Biomed. Chromatogr. 2006, 20,

185–194.

20. A.M. Almuaibed, A. Townshend, Anal Chim Acta 1999, 388, 339-343.

21. J. Martens-Lobenhoffer, S. Postel, U. Tröger, S.M. Bode-Böger, J Chromatogr B 2007,

855, 271–275.

22. A. Guerrieria, R. Ciriello, T.R.I. Cataldi, Anal Chim Acta 2013, 795, 52– 59.

23. R. Ciriello, T.R.I. Cataldi, F. Crispo, A. Guerrieri, Food Chem. 2015, 169, 13–19.

24. Z. Xue, L. Xiong, H. Rao, X. Liu, X. Lu, Dyes and Pigments 2019, 160, 151–158.

25. M.L. Rodriguez-Mendez, I.M. Apetrei, D. Tutunaru, L. Nechita, M. Badescu, M. Ciocoiu,

Anal Univ. “Dunarea de Jos” Galati (Medicina), 2011, XVII, 25-31.

26. C. Tanase, C. Cioates Negut, D. I. Udeanu, E.M. Ungureanu, M. Hrubaru, C. Munteanu,

S.P. Voicu, F. Cocu, A.C. Ionita, Rev. Chim. 2014, 65, 768-773.

Determinarea fluorimetrică a β-carotenului dintr-o varietate de produse

alimentare utilizând un colorant fluorescent

A fost propusă o metodă fluorimetrică simplă, sensibilă și selectivă pentru determinarea β-

carotenului din diferite probe de sucuri proaspete si conservate de legume si fructe, precum si

din paste de legume. Pentru creșterea și optimizarea semnalului de răspuns, au fost investigati

într-o succesiune de experimente o serie de coloranți fluorescenți, cum ar fi: fluoresceina (F),

eozina B (EB) și roșul Congo (CR). Pentru determinarea fluorimetrica a β-carotenului a fost

aleasa fluoresceina, 3',6'-dihidroxispiro [izobenzofuran-1(3H), 9'-[9H] xanten]-3-ona, in

prezenta de solutie de tampon fosfat pH=9. În condiții optime experimentale, β-carotenul a

putut fi determinat în intervalul 0.54 – 536.87 mg L-1, cu limita de detecție 0.47 mg L-1.

Metoda propusă este ușor de utilizat, eficientă din punct de vedere al costurilor, rapidă și mai

puțin complexă în comparație cu o metoda descrisa recent în care a fost utilizată o procedură

de extracție consumatoare de timp urmată de o determinare costisitoare prin cromatografie de

lichide de inalta performanta. Metoda propusă a fost validată cu succes si cu o recuperare

foarte bună de peste 90% pentru determinarea β-carotenului în probe reale dintr-o varietate de

produse alimentare.

Introducere

Carotenoidele au structură identică cu molecula retinolului și au funcții biologice pentru

oameni, cum ar fi: proprietăți antioxidante, crește funcțiile sistemului imunitar, activitate de

provitamina A1; protejează împotriva: cancerului, a bolilor cardiovasculare și a degenerării

maculare2. Din acest grup, β-carotenul (Figura 1) este unul dintre principalii carotenoizi

prezenți în dieta3 și acționează ca un precursor al vitaminei A. Acesta a atras interesul

organizațiilor de sănătate pentru importanța sa în controlul deficienței vitaminei A, care este

încă o problemă de sănătate globală4.

Figura 1 – Structura chimica a β-carotenului.

Beta-carotenul cu formula chimică C40H56, este un derivat cu structura aciclică și compus din

opt unități izoprenice cu inele retinice specifice5. Acesta se găsește într-o varietate de fructe și

legume portocalii, galbene și verzi. Sursele de beta-caroten include: collard, ridiche, spanac,

salată, mango, pepeni, ardei, dovleac, morcovi și cartofi dulci6. În industria alimentară, β-

carotenul este utilizat ca pigment roșu-portocaliu în produse, cum ar fi: băuturi nealcoolice,

grăsimi comestibile, brânză, înghețată și produse de patiserie7.

În prezent, pentru determinarea β-carotenului se utilizează metode pentru determinarea beta-

carotenului, cum ar fi: detecția amperometrică8, spectroscopia în infraroșu apropiat9,

spectrometria in flacara de xenon10, rezonanța Raman și spectroscopia RMN, dicroismul

circular și spectrometria de masă11; au fost aplicate diferite tipuri de cromatografii pentru

determinarea β-carotenului în probe reale, inclusiv cromatografia de lichide de înaltă

performanță (HPLC) cu detecție UV12,13 cromatografia de lichide de înaltă presiune în fază

inversă14, cromatografia de lichide cu detector de câmp electromagnetic coulometric15 și

cromatografia de lichide de înaltă presiune cu fază normală16. Tabelul 1 prezintă câteva

realizări până în prezent privind limita de cuantificare (LOQ) și limita de detecție (LOD)

pentru determinarea beta-carotenului17-19.

Tabel 1. Metode analitice propuse până în prezent pentru analiza β-carotene

Metoda Limita de

cuantificare

(LOQ)

Limita de

detectie

(LOD)

Tipul probei Referinte

Metoda

fluorimetrica

0.54 μg mL-1 0.47 μg mL-1 Mancare

Studiul

prezent

Voltametrie

ciclica

4.45 μg mL-1 1.34 μg mL-1 Legume și

fructe crude

17

UHPLC 1.89 μg mL-1 0.62 μg mL-1 Mancare 18

UHPSFC 3.18 µg mL-1 0.95 µg mL-1 Suplimente

alimentare

19

În acest studiu a fost propusă o metodă fluorimetrică simplă, sensibilă și adecvată pentru

determinarea cantităților de β-caroten din diferite probe de alimente (de exemplu sucuri

proaspete de fructe și legume, sucuri și legume conservate, pastă de tomate). Metoda propusă

este ușor de utilizat, eficientă din punct de vedere al costului, rapidă și mai puțin complexă în

comparație cu o altă procedură descrisă anterior20, unde a fost utilizată o procedură de extracție

consumatoare de timp, urmată de o determinare costisitoare prin cromatografie de lichide de

inalta performanta. Pe baza experienței noastre din lucrările descrise anterior și a studiilor

relevante de fluorescenta am propus o metoda care se bazează pe reacția directă a β-

carotenului cu un colorant fluorescent, 3',6'-dihidroxispiro [izobenzofuran-1(3H), 9'-[9H]

xanthen]-3-onă, în mediu alcalin.

Fluorescența compușilor organici este furnizată în mod normal de către electronii π din

legături duble și din nucleul aromatic al acestor molecule într-un proces de delocalizare și

conjugare a electronilor π. Grupurile funcționale, cu un număr mai mare de electroni donori,

conduc în mod normal la intensitatea fluorescenței. În acest studiu am folosit fluoresceina cu

structura de xantina ca un dianion cu fluorescență puternica21 la o concentrație optimă de 5x10-

5 mol L-1. Lungimea de undă a fluoresceinei apare în zona verde (490-570 nm), λ = 526 nm.

Analitul, β-caroten22 prezinta o excitare mai slabă și o fluorescență în zona albastră (440-490

nm), λ=461 nm, care nu este suficientă pentru a fi analizat singur. Fluorescența fluoresceinei în

prezența β-carotenului este totuși un proces foarte complex. Intensitatea fluorescenței pentru β-

caroten a crescut într-un amestec de soluție de concentrație scăzută de β-caroten cu

fluoresceină ca si colorant fluorofor datorită interacțiunii π-π stacking a electronilor π din

ambele substanțe organice. Cu toate acestea, intensitatea fluorescenței a scăzut o data cu

creștere concentrației de β-caroten datorită mecanismului Förster (FRET).

Metoda propusă a fost aplicată cu succes într-o perioadă de timp cu o recuperare foarte bună

de peste 90% pentru determinarea β-carotenului în probe reale dintr-o varietate de produse

alimentare.

Materiale si metode

Reactivi utilizati

Fluoresceina (F), eozina B (EB), roșu congo (CR), β-carotenul, dimetilsulfoxidul, acidul

clorhidric, hidroxidul de sodiu, fosfatul dibazic de sodiu heptahidrat și fosfatul monobazic de

sodiu monohidrat s-au achiziționat de la Sigma-Aldrich. Toți reactivii sunt de calitate analitică

superioara, iar soluțiile au fost preparate utilizând apă deionizată obținută dintr-un sistem de

purificare al apei Direct-Q3 (Millipore Corporation, Franța). Toate soluțiile de lucru au fost

preparate zilnic prin diluarea corespunzătoare a soluției stoc cu apă deionizată. Determinările

au fost efectuate la temperatura camerei, la 25°C.

Soluția stoc de β-caroten de concentratie 1.00x10-2 mol L-1 se prepară zilnic prin dizolvarea a

0.0268 g de β-caroten în etanol și apă deionizată. Atat soluția stoc cat și soluțiile de lucru ale

β-carotenului, preparate prin diluarea soluției stoc cu apă deionizată, sunt pastrate la întuneric

în frigider.

Au fost preparate diferite soluții de tampon fosfat (PBS, 0.1 mol L-1) cu pH-ul în intervalul

5.8-10 asa cum este descris în literatură23,24, folosind diferite rapoarte între fosfatul dibazic de

sodiu heptahidrat (Na2HP04 · 7H20, 0.2 mol L-1) și fosfatul monobazic de sodiu monohidrat

(NaH2P04 · H2O, 0.2 mol L-1). pH-ul soluțiilor de tampon fosfat a fost ajustat prin adăugarea

de mici cantități de 0.1 mol L-1 de soluție de HCI sau de NaOH.

Pentru testarea preliminară s-au preparat soluții stoc individuale de concentratie 1.00x10-3 mol

L-1 pentru fiecare dintre următoarele coloranți: fluoresceină, eozină B și roșu congo. Soluția

stoc de fluoresceină a fost preparată în dimetilsulfoxid cu soluție de tampon fosfat pH=7.4.

Pentru colorantii: eozina B și roșu Congo soluțiile stoc au fost preparate în apă deionizată.

Toate soluțiile de lucru de concentratie 1.00x10-4 mol L-1 au fost preparate prin diluarea

soluțiilor stoc cu apă deionizată și pastrate la întuneric.

Aparatura

Pentru ajustarea pH-ului soluțiilor de tampon fosfat la valorile dorite s-a folosit pH-metrul

Mettler Toledo (modelul Seven Compact).

Măsurătorile de fluorescență au fost realizate cu un spectrometru QE65000 foarte sensibil,

achizitionat de la Ocean Optics (Dunedin, Florida), echipat cu o lampă cu xenon. Sursa de

lumină, Xenon HPX-2000, este o sursă de mare putere, utilizata în special pentru aplicațiile pe

fluorescenta. Inregistrarea spectrelor s-a obținut cu programul Spectra Suite, iar prelucarea

datelor s-a facut in Sigma Plot.

Procedura experimentală pentru obtinerea curbelor de calibrarea

Soluțiile pentru obtinerea curbelor de calibrare au fost preparate în baloane cotate cu

capacitatea de 10 mL. Intensitatea radiatiei de fluorescență pentru fiecare soluție a fost

măsurată într-o celulă de cuarț de 1 cm la temperatura camerei, 25°C.

Prepararea probelor

Sistemul caracteristic de dublă conjugare a carotenoidelor conduce la probleme asociate

muncii și manipulării carotenoidelor, adică instabilitatea lor particulară, în special față de

lumină, oxigen și căldură. Condițiile acide și alcaline pot fi, de asemenea, în detrimentul

anumitor carotenoide. Oricare dintre acești factori pot produce degradarea și/ sau

transformarea carotenoidelor prezente în probă și apoi modificarea compoziției acestora. Din

acest motiv, sunt necesare mai multe măsuri de precauție atunci când se manipulează

carotenoidele; experimentele de laborator ar trebui să fie efectuate la lumină slabă, si evitat, pe

cât posibil, contactul cu lumina directă a soarelui21.

Probele de fructe și legume proaspete sau conservate au fost achiziționate de pe piața locală.

Pentru procedura experimentală, probele proaspete au fost spălate cu apa deionizata, curățate,

tăiate și stoarse pentru a obține sucuri. Probele de legume conservate au fost tăiate și stoarse.

Probele de pastă și sucuri conservate au fost tratate ca atare.

Rezultate si discutii

Au fost investigați cativa coloranți fluorescenți într-o serie de experimente pentru creșterea și

optimizarea semnalului de răspuns pentru determinare fiabilă, adecvată și durabilă a β-

carotenului. Testele preliminare s-au făcut mai întâi cu coloranți fluorescenți, cum ar fi:

fluoresceina, eozina B și roșu congo, împreună cu β-caroten prin modificarea pH-ului soluției

de tampon fosfat cu fiecare dintre coloranții individuali. Toate experimentele au fost realizate

utilizând soluții care conțin aceleași concentrații de 1.00x10-4 mol L-1 pentru coloranții

individuali cu β-caroten de concentratie 1.00x10-4 mol L-1, la diferite pH-uri ale soluțiilor de

tampon fosfat (pH = 3-10) sau numai pentru β-caroten în soluții de tampon de fosfat la diferite

pH-uri (Figura 2).

După cum se vede în figura 2, β-carotenul fără colorant și β-carotenul cu eozina B la diferite

pH-uri ale soluției de tampon fosfat au aproximativ aceeași intensitate. O intensitate

modificată a fost observată când s-au utilizat fluoresceină și roșu congo cu β-caroten la diferite

pH-uri de soluție tampon fosfat. Valori mai mari ale intensităților inregistrate pentru

fluoresceina au făcut ca aceasta să fie aleasa pentru urmatoarele experimente.

Figura 2 - Efectul pH-ului asupra intensității radiatiei de fluorescența. Concentrația β-

carotenului, a fluoresceinei, eozinei B și a roșului Congo este de 1.00x10-4 mol L-1 la diferite

valori de pH pentru PBS (pH=3-10).

Figura 3 prezintă spectre de fluorescență inregistrate la diferite concentrații de fluoresceina

1.00x10-7 mol L-1 (0.1 µmol L-1) – 5.00x10-4 mol L-1 (500.00 µmol L-1). Concentrația optimă

pentru fluoresceina este de 5.00x10-5 mol L-1 (50 µmol L-1) pentru o lungime de undă de 526

nm. Concentrația de 5.00x10-5 mol L-1 (50 µmol L-1) obtinuta pentru fluoresceină este utilizată

pentru obținerea curbei de calibrare.

Figura 3 - Spectre de fluorescență pentru diferite concentrații de fluoresceină: de la 0.1 pmol

L-1 – 500.00 pmol L-1; inserat: intensitatea in functie de concentrația (μmol L-1) de

fluoresceină

Pentru obtinerea pH-ului optim, am amestecat soluții de tampon fosfat 0.1 mol L-1 (pH = 7.4-

10), fluoresceină (5.00x10-5 mol L-1) și 1.00x10-4 mol L-1 β-caroten (v: v: v = 1: 1: 1). Din

figura 4 observam că pH-ul optim pentru soluția de tampon fosfat, este 9.

Figura 4 – pH-ul optim pentru PBS (amestec de solutii format din 0.1 mol L-1 PBS (pH=7.4-

10) fluoresceina (5.00x10-5 mol L-1) si 1.00x10-4 mol L-1 β-caroten (v:v:v = 1:1:1) .

Caracteristicile de răspuns in determinarea β-carotenului

Curba de calibrare pentru determinarea β-carotenului prin fluorescență a fost obținută în

condițiile optime descrise mai sus. Din tabelul 2 reiese că ecuația de regresie este I = 22356-

11.242xC, unde I este intensitatea radiatiei de fluorescența și C este concentrația β-carotenului

exprimata in mg L-1. In figura 5 se observa că înălțimea picului scade o data cu creșterea

concentrației de β-caroten, ca urmare a interacției dintre β-caroten și fluoresceină. Coeficientul

de corelație este 0.9977 (Figura 6), iar limita de detecție (LOD) este de 0.47 mg L-1. Limita de

cuantificare (LOQ) este de 0.54 mg L-1, iar deviația standard relativă (pentru cinci măsurători,

N=5) a fost de 0.08% pentru β-carotenul de concentratie 53.69 mg L-1. Aceste rezultate arată

că metoda este potrivită pentru determinarea β-carotenului.

Tabel 2. Raspunsul caracteristic pentru determinarea β-carotenului

Parametrii Rezultat

Domeniul de concentratie (mg L-1) 0.54-536.87

Detalii de calibrare I=22356-11.242xC; R2=0.9977

Sensibilitatea, (A mg L-1) -11.242

Limita de detectie (mg L-1) 0.47

Limita de cuantificare (mg L-1) 0.54

Deviatia standard relativa (N=5), % 0.08

Gradul de recuperare, % 95

Deviatia standard relativa pentru analiza din probe (N=5), %

0.37

Figura 5 - Spectre de fluorescență la diferite concentrații de β-caroten pentru concentratia de

fluoresceina de 5.00x10-5 mol L-1 (50 µmol L-1) si pH-ul solutiei tampon fosfat de 9.

Figura 6 - Curba de calibrare pentru determinarea β-carotenului.

Influenta diferitelor specii de compusi S-a evaluat efectul diferitelor specii de aminoacizii, minerale și vitamine prin analiza unei

soluții standard de β-caroten de concentratie 1.00x10-5 mol L-1 și diferite proportii de

interferenți (1, 10, 50, 100, 500 si 1000). Limita de toleranță a fost definită ca fiind

concentrația speciilor străine ce provoacă cel puțin o eroare relativă de ± 5% în fluorescența

eșantionului standard. După cum se observa din tabelul 3, metoda propusă oferă o bună

selectivitate; majoritatea speciilor examinate nu au nici o influență in determinarea β-

carotenului.

Tabel 3. Limita de toleranta a posibililor interferenti in determinarea β-carotenului de

concentratie 1.00 x 10−5 mol L−1

Interferenti Limita de toleranta (raport molar)

K+ 500

D-Glucoza 500

Na+ 100

L- acid ascorbic 50

DL- acid aspartic 50

Cu2+ 50

Zn2+ 10

Fe2+ 10

L-Triptofan 10

L-Tirozina 10

Determinarea β-carotenului din probele de alimente

Metoda fluorimetrică a fost aplicată pentru determinarea β-carotenului în diferite probe reale

de alimente (de exemplu: sucuri proaspete de fructe și legume, sucuri și legume conservate,

pastă de tomate). Au fost analizate 13 probe diferite pentru determinarea cantității de β-caroten

din probele reale, iar valorile se regasesc in tabelul 4. Metoda propusă a fost validată prin

adăugarea unei concentrații cunoscute de β-caroten la fiecare probă reală prezentată în tabelul

4. S-a adăugat in probe o concentrație de 1.00x10-3 mol L-1 de β-caroten, iar valorile gradelor

de recuperare pentru β-caroten sunt prezentate în tabelul 5. Valoarea medie de recuperare a

metodei propuse (pentru 5 determinari, N=5) a fost între 90.50% și 95.21%, ceea ce indică o

recuperare satisfăcătoare pentru β-caroten din probe reale.

Tabel 4. Continutul de β-caroten din probele reale a fost calculat pe baza curbei de calibrare

din figura 6.

Nr. Proba

Cantitatea gasita

(mg g-1) Alte metode

(mg g-1)

Referinte

1 Suc din dovleac 0.09 1.423 25

2 Suc din morcovi

portocali

0.116 0.0410 20

3 Suc din cartofi dulci 0.358 0.0582 26

4 Pasta de rosii conservata 0.039 0.137 18

5 Ketchup picant 0.237 - -

6 Suc din mandarine 0.081 0.00085 27

7 Suc conservat 0.163 - -

8 Suc din ardei kapia 0.372 0.0095 28

9 Suc din kiwi 0.396 0.0006 29

10 Suc din rosii chery 0.225 0.0161 30

11 Suc din portocale 0.531 0.0017 31

12 Ketchup dulce 1 0.110 0.323 32

13 Ketchup dulce 2 0.146 - -

Tabel 5. Determinarea β-carotenului din produse alimentare.

Probe Cantitate

adaugata (mol L-

1)

Cantitate gasita (mol L-

1)

Grad de recuperare± RSD*,

% Suc din dovleac 1.00x10-3 0.95x10-3 95.21±0.51

Suc din portocale 1.00x10-3 0.95x10-3 94.66±0.47

Suc din cartofi dulci 1.00x10-3 0.95x10-3 94.63±0.37

Pasta din rosii conservate 1.00x10-3 0.94x10-3 94.33±0.19

Ketchup picant 1.00x10-3 0.94x10-3 94.01±0.10

Suc din mandarine 1.00x10-3 0.94x10-3 93.96±0.23

Suc conservat 1.00x10-3 0.94x10-3 93.47±0.14

Suc din ardei kapia 1.00x10-3 0.93x10-3 93.06±0.09

Suc din kiwi 1.00x10-3 0.93x10-3 92.96±0.88

Suc din rosii chery 1.00x10-3 0.92x10-3 91.93±0.05

Suc din portocale 1.00x10-3 0.91x10-3 90.84±0.46

Ketchup dulce 1.00x10-3 0.91x10-3 90.50±0.12

Suc din morcovi conservati 1.00x10-3 0.92x10-3 91.74±0.14 *Deviatia standard relativa pentru 5 masuratori (N=5)

Concluzii

În concluzie, a fost elaborată o metodă fluorimetrică simplă, sensibilă și adecvată pentru

determinarea conținutului de β-caroten din diferite probe reale de alimente folosind

fluoresceină ca si colorant fluorofor, unde creșterea intensității de fluorescența se datorează

interacțiunii π-π stacking a electronilor π dintre β-caroten și fluoresceină. Metoda propusă

satisface nevoia și căutarea de sisteme de detectare sensibile “on-site” a moleculelor de mici

dimensiuni, ușor de utilizat, eficiente din punct de vedere al costurilor, rapide și mai puțin

complexe în cadrul procesării și producției de alimente.

Referinte

1. G. Zakynthinos, T. Varzakas, Carotenoids: From plants to food industry, Current Research in

Nutrition and Food Science, 2016, 4(1), 38–51,

https://doi.org/https://doi.org/10.12944/CRNFSJ.4.Special-Issue1.04.

2. H. Schulz, Carotenoid bioavailability from the food matrix, Carotenoids, 2016, 191–216,

Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd, http://dx.doi.org/10.1002/9781118622223.ch11.

3. E. J. Johnson, The role of carotenoids in human health, Nutrition in Clinical Care, 2002,

5(2), 56–65, https://doi.org/10.1046/j.1523-5408.2002.00004.x.

4. World Health Organization, Global prevalence of vitamin A deficiency in populations at risk

1995-2005: WHO global database on vitamin A deficiency, 2009, 55WHO Iris, doi.org/978 92

4 159801 9.

5. C. Pénicaud, N. Achir, C. Dhuique-Mayer, M. Dornier, P. Bohuon, Degradation of β-

carotene during fruit and vegetable processing or storage: reaction mechanisms and kinetic

aspects: a review, Fruits, 2011, 66(6), 417-440, doi.org/10.1051/fruits/2011058.

6. J. M. Holden, A. L. Eldridge, G. R. Beecher, I. M. Buzzard, S. Bhagwat, C. S. Davis, L. W.

Douglass, S. Gebhardt, D. Haytowitz, S. Schake, Carotenoid content of U.S. foods: An update

of the database, Journal of Food Composition Analysis, 1999, 12(3), 169–196,

doi.org/10.1006/jfca.1999.0827.

7. L. Bogacz-Radomska, J. Harasym, β-Carotene-properties and production methods, Food

Quality and Safety, 2018, 2, 69–74, doi:10.1093/fqsafe/fyy004.

8. R. Agneessens, P. Nangniot, J. P. Lacroix, D. Muri, Bull. Rech. Agron. Gembloux 24, 1989,

85–90.

9. X. Chen, J. Wu, S. Zhou, Y. Yang, X. Ni, J. Yang, Z. Zhu, C. Shi, Application of near-

infrared reflectance spectroscopy to evaluate the lutein and β-carotene in Chinese kale, Journal

of Food Composition and Analysis, 22, 2009, 148–153, doi.org/10.1016/j.jfca.2008.10.007.

10. W.W. Fish, Refinements of the attending equations for several spectral methods that

provide

improved quantification of β-carotene and/or lycopene in selected foods, Postharvest Biology

and Technology, 66, 2012, 16–22, doi:10.1016/j.postharvbio.2011.08.007.

11. G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander (Eds.), Carotenoids, Spectroscopy, vol. 1B,

Birkhauser Verlag, Basel, 1995.

12. A. I. O. Barba, M. C. Hurtado, M. C. S. Mata, V. F. Ruiz, M. L. S. de Tejada, Application

of a UV-VIS Detection-HPLC Method for a Rapid Determination of Lycopene and Beta-

Carotene in Vegetables, Food Chemistry, 95, 2006, 328–336,

doi:10.1016/j.foodchem.2005.02.028.

13. F. Xu, Q.P. Yuan, H.R. Dong, Determination of lycopene and-carotene by high-

performanceliquid chromatography using sudan I as internal standard, Journal of

Chromatography B 838 (2006) 44–49, doi:10.1016/j.jchromb.2006.04.004.

14. J. Szpylka, J.W. DeVries, Determination of beta-Carotene in Supplements and Raw

Materials by Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography: Collaborative Study,

Journal of AOAC International 88 (2005) 1279–1291.

15. M.G. Ferruzzi, L.C. Sander, C.L. Rock, S.J. Schwartz, Carotenoid Determination in

Biological Microsamples Using Liquid Chromatography with a Coulometric Electrochemical

Array Detector, Analytical Biochemistry 256 (1998) 74–81, doi:10.1006/abio.1997.2484.

16. S.M. Silva, S.A. Rocco, K.A. Sampaio, T. Taham, L.H.M. da Silva, R. Ceriani, A.J.A.

Meirelles, Validation of a method for simultaneous quantification of total carotenesand tocols

in vegetable oils by HPLC, Food Chemistry 129 (2011) 1874–1881,

doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.05.137.

17. Guzel Ziyatdinova, Endzhe Ziganshina, Herman Budnikov, Voltammetric determinationof

b-carotene in raw vegetables and berries in Triton X100 media, Talanta 99 (2012) 1024–1029,

doi: 10.1016/j.talanta.2012.07.093.

18. Ha, J., Y. S. Shim, H. Y. Seo, H. J. Nam, M. Ito, and H. Nakagawa. 2010. Rapid Method

for Determination of β-Carotene in Foods Using Ultra High Performance Liquid

Chromatography. Food Science and Biotechnology 19 (5):1199-204. DOI 10.1007/s10068-

010-0171-2.

19. Bing Li, Haiyan Zhao, Jing Liu, Wei Liu, Sai Fan, Guohua Wu, Rong Zhao, Application of

ultra-high performance supercritical fluid chromatography for the determination of carotenoids

in dietary supplements, Journal of Chromatography A, 1425 (2015) 287–292,

doi:10.1016/j.chroma.2015.11.029.

20. Yunliang Dai and Kyung Ho Row, Isolation and Determination of Beta-Carotene in

Carrots by Magnetic Chitosan Beta-Cyclodextrin Extraction and High-Performance Liquid

Chromatography (HPLC), Analytical Letters, 52(11), 2019, 1-16,

doi:10.1080/00032719.2019.1570245.

21. Oliver, J., and A. Palou. 2000. Chromatographic determination of carotenoids in foods.

Journal of Chromatography A. 881:543–55. doi:10.1016/S0021-9673(00)00329-0.

22. Carvalho E., P.D. Fraser, and S. Martens. 2013. Carotenoids and tocopherols in yellow and

red raspberries. Food Chemistry 139:744–52.

23. Sigma-Aldrich. Buffer Reference Center. https://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-

bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html

24. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Laboratory Stock Solutions and Equipment

Common Buffers and Stock Solutions (2000) A.2A.1-A.2A.12, John Wiley & Sons.

25. Sathiya Mala, K., and A. E. Kurian. 2016. Nutritional composition and antioxidant activity

of pumpkin wastes. International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences

6 (3):336-44.

26. Nazrul Islam, S., T. Nusrat, P. Begum, and M. Ahsan. 2016. Carotenoids and β-carotene in

orange fleshed sweet potato: A possible solution to vitamin A deficiency. Food Chemistry

199:628–31. doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.12.057.

27. Zhu, C. H., E. R. Gertz, Y. Cai, and B. J. Burri. 2016. Consumption of canned citrus fruit

meals increases human plasma beta-cryptoxanthin concentration whereas lycopene and beta-

carotene concentrations did not change in healthy adults. Nutrition Research 36 (7):679-88.

doi: 10.1016/j.nutres.2016.03.005.

28. Deli, J., Z. Matus, and G. Toth. 1996. Carotenoid Composition in the Fruits of Capsicum

annuum Cv. Szentesi Kosszarvu during Ripening. J. Agric. Food Chem. 44:711-6.

doi.org/10.1021/jf950354n.

29. D’Evoli, L., S. Moscatello, M. Lucarini, A. Aguzzi, P. Gabrielli, S. Proietti, A. Battistelli,

F. Famiani, V. Bohm, and G. Lombardi-Boccia. 2015. Nutritional traits and antioxidant

capacity of kiwifruit (Actinidia deliciosa Planch., cv. Hayward) grown in Italy. Journal of Food

Composition and Analysis 37:25–9. doi.org/10.1016/j.jfca.2014.06.012.

30. Ahamad, M. N., M. Saleemullah, H. U. Shah, I. A. Khalil, and A.U.R. Saljoqi. 2007.

Determination of beta carotene content in fresh vegetables using high performance liquid

chromatography. Sarhad Journal of Agriculture 23 (3):767-70.

31. Charoensiri, R., R. Kongkachuichai, S. Suknicom, and P. Sungpuag. 2009. Beta carotene,

lycopene, and alpha-tocopherol contents of selected Thai fruits. Food Chemistry 113:202–7.

doi:10.1016/j.foodchem.2008.07.074.

32. Valderas-Martinez, P., G. Chiva-Blanch, R. Casas, S. Arranz, M. Martínez-Huélamo, M.

Urpi-Sarda, X. Torrado, D. Corella, R. M. Lamuela-Raventós, and R. Estruch. 2016. Tomato

Sauce Enriched with Olive Oil Exerts Greater Effects on Cardiovascular Disease Risk Factors

than Raw Tomato and Tomato Sauce: A Randomized Trial. Nutrients 8 (170):1-14.

doi:10.3390/nu8030170.

Determinarea β-carotenului în băuturile răcoritoare folosind un senzor stocastic bazat pe un material compozit grafenă-porfirină

Introducere

Carotenoidele reprezintă din punct de vedere structural și funcțional un grup foarte

divers de pigmenți naturali care fac parte din clasa polienelor [1], fiind constituenți importanți

ai organelor fotosintetice din toate plantele superioare, mușchi, ferigi și alge, în membranele

fotosintetice ale bacteriilor fototrope și cianobacteriilor [2]. Cele mai importante carotenoide

din corpul uman includ β-caroten, α-caroten, licopen, luteină, zeaxantină, β-criptoxantină, α-

criptoxantină, γ-caroten, toate fiind prezente în plasma umană [5-8]. Beta-carotenul (Fig.1)

este considerat un inhibitor al unor gene; în plus, prezintă proprietăți antioxidante și

anticanceroase [9-11]. În industria alimentară, β-carotenul este utilizat ca un pigment roșu-

portocaliu în băuturi nealcoolice netratate termic, produse de patiserie și înghețată, în industria

farmaceutică, acționează ca agent colorant pentru comprimate, iar în industria cosmetică, este

utilizat ca ingredient bioactiv al cremelor, care protejează leziunile pielii împotriva oxidării și

expunerii la radiațiile UV [12]. Metodele propuse pentru determinarea β-carotenului au fost:

cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC) [13], spectrofotometria [14], cromatografia de

gaze [15] și electroforeza capilară [16]. Scopul acestei lucrari este de a utiliza un senzor

stocastic bazat pe material compozit grafenă-porfirină (Gr-TPyP) pentru determinarea β-

carotenului în probe de băuturi răcoritoare.

Toate măsurătorile electrochimice au fost efectuate cu un potențiostat/galvanostat

AUTOLAB / PGSTAT 302N (Metrohm, Utrecht, Olanda) conectat la un calculator cu un

software GPES folosit pentru înregistrarea măsurătorilor, fiind utilizată o celulă electrochimică

cu trei electrozi:electrodul de referință Ag/AgCl (0,1 mol L-1 KCI), electrodul de platină

(contra-electrod) și electrodul de lucru (senzorul stocastic. Un pH metru Mettler Toledo

(model Seven Compact) a fost utilizat pentru toate măsurătorile de pH. Tehnica

cronoamperometrică a fost utilizată pentru măsurarea valorilor toff (aspartame, acesulfam K,

ciclamat de sodiu) și a valorilor ton, fiind aplicat un potențial de 125 mV față de Ag/AgCl.

Soluțiile standard care conțineau diferite concentrații de de β-caroten au fost introduse în

celula electrochimică. Ecuațiile de calibrare: 1/ton= a+bxConc, au fost obținute folosind

metoda regresiei liniare. Cantitățile de β-caroten din probele de băuturi răcoritoare au fost

determinate prin introducerea valorilor ton în ecuația de calibrare.

Figura 1. β-carotenul-structura chimică

Pregătirea probelor

Pentru determinarea β-carotenului s-au folosit patru tipuri de băuturi răcoritoare cu gusturi și

arome de fructe diferite, produse de diferite companii achiziționate din regiunea București.

Înainte de efectuarea fiecarei măsurători, a fost măsurat pH-ul băuturilor răcoritoare și ajustat cu ABS

la valoarea de 3.00.

Rezultate și discuții

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici

Conform caracteristicilor de răspuns ale senzorului stocastic prezentate în (tabelul 1), a fost

obținut un domeniu larg de concentrații liniare între 1.00x10-15 mol L-1 și 1.00x10-3 mol L-1 cu o limită

scăzută de determinare 1.00x10-15 mol L-1 și o valoare ridicată a sensibilității 8.66x10 10s-1/mol L-1,

dovedind că senzorul stocastic bazat pe Gr-TPyP a prezentat o sensibilitate ridicată atunci când este

utilizat pentru determinarea β-carotenului. Un senzor stocastic a fost proiect și utilizat pentru o

perioadă de o lună pentru analiza β-carotenului. Sensibilitatea senzorului a fost determinată în fiecare

zi, când valorile RSD înregistrate au fost de 0.34%. Sensibilitatea a fost comparată în fiecare zi,

valoarea medie obținută după o lună fiind de 0.12%. Aceste valori au dovedit fiabilitatea proiectării

senzorului stocastic, precum și faptul că poate utilizat cu încredere pentru determinarea β-carotenului

timp de cel puțin o lună.

Tabelul 1. Caracteristicile de răspuns ale senzorului stocastic utilizat pentru determinrea β-carotenului

Senzor bazat pe

Ecuația de calibrare și coeficientul de

corelare (r)*

Domeniul linear de

concentrație (mol L-1)

toff(s) Sensibilitatea

(s-1/mol L-1)

Limita de determinare

(mol L-1)

Gr-TPyP 1/ton=0.03+8.66x1010xC r=0.9997

1.00x10-15-1.00x10-3 0.6 8.66x1010 1.00x10-15

*<C> = mol L-1; <ton> = s

Aplicații analitice

Pentru determinarea β-carotenului au fost utilizate patru băuturi răcoritoare produse de

diferite companii achiziționate din regiunea București folosind senzorul stocastic propus. Primul

pas în determinarea β-carotenului în probele de băuturi răcoritoare a fost identificarea parametrului

calitativ (pe baza valorii toff (Tabelul 1 și Fig 2). Următorul pas a fost măsurarea valorii ton (Figura 2) și

utilizarea ecuației de calibrare pentru a determina valoarea concentrației de β-caroten în băuturile

răcoritoare. Valorile obținute sunt prezentate în tabelul 2 comparativ cu valorile determinate prin

metoda HPLC. După cum se poate observa în tabelul 2, există o corelație bună între valorile obținute

folosind senzorul stocastic și metoda HPLC, dovedind că senzorul stocastic poate fi utilizat cu

încredere în analiza β-carotenului din probele de băuturi răcoritoare.

Figura 3 Exemplu de diagrama obținută utilizând senzorul stocastic bazat pe Gr-PyP pentru măsurarea

β-carotenului în băuturile răcoritoare.

Tabelul 2. Determinarea β-carotenului în băuturi răcoritoare.

Probă β-caroten, µg mL-1

Senzor bazat pe Gr-TPyP

HPLC [13]

1 2.80±0.05 2.67±0.32

2 66.35±0.03 66.00±0.53

3 3.40±0.02 3.15±0.58

4 14.72±0.02 14.90±0.85

Rezultatele reprezintă media a 5 determinări.

Concluzii

Pentru determinare β-carotenului în probe de băuturi răcoritoare, a fost creat un

senzor stocastic pe bază de material compozit grafenă-porfirină (Gr-TPyP). Senzorul a

prezentat o sensibilitate ridicată, fiind obținut un domeniu larg de concentrații liniare, cu limită

de determinare scăzută, facilitând determinarea fiabilă a β-carotenului în probe de băuturi

răcoritoare. Avantajul utilizării senzorului stocastic în comparație cu alte metode, cum ar fi

HPLC este: fiabilitate mai mare, nu este necesară prelucrarea probelor înainte de efectuarea

măsurătorilor, costuri scăzute de analiză și analiza rapidă a băuturilor răcoritoare.

Bibliografie

1. Landrum, J.T. Carotenoids: Physical, Chemical, and Biological Functions and Properties;

CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2010, 367–381.

2. Scheer, H. The Pigments. In Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis; Green, B.R.,

Parson, W.W., Eds.; Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, the Netherlands, 2003, 29–

81.

3. Britton, G.; Liaaen-Jensen, S.; Pfander, H. Carotenoids. Handbook; Birkhauser Verlag:

Basel, Switzerland, 2004.

6. Khachik, F. Distribution and metabolism of dietary carotenoids in humans as a criterion for

development of nutritional supplements. Pure Appl. Chem. 2006, 78:1551–1557.

7. Parker, R.S. Carotenoids in human blood and tissues. J. Nutr. 1989, 119:101–104.

8. Breecher, G.R.; Khachik, F. Qualitative relationship of dietary and plasma carotenoids in

human beings. Ann. N. Y. Acad. Sci. USA, 1992, 669:320–321.

9. Berman, J.; Zorrilla-Lo´pez, U.; Farre´, G.; Zhu, C.; Twyman, G.S.R.M.; Capell, T.;

Christou, P. Nutritionally important carotenoids as consumer products. Phytochemistry

Review, 2014, 14: 727–743

10. Harasym, J., Oledzki, R. Effect of fruit and vegetable antioxidants on

total antioxidant capacity of blood plasma. Nutrition, 2014. 30: 511–517

11. Zhang, Z.-Q., Cao, W.-T., Liu, J., Cao, Y., Su, Y.-X., Chen, Y.-M.

Greater serum carotenoid concentration associated with higher bone mineral density in

Chinese adults. Osteoporosis International, 2016, 27: 1593–1601.

12. Bogacz-Radomska L., and Harasym J. β-Carotene—properties and production

methods, Food Qual. Safety, 2018, 00, 1–6

13. Feltl, L., Pacakova, V., Stulik, K. and Volka, K. Reliability of carotenoid analyses: a

review. Curr. Anal. Chem., 2005, 1: 93-102.

14. Arabshahi-D, S., Devi, D. V. and Urooj, A. Evaluation of antioxidant activity of some

plant extracts and their heat, pH and storage stability. Food Chem., 2007, 100:1100-1105.

15. Wu, Z., Robinson, D. S., Hughes, R. K., Casey, R., Hardy, D. and West, S. I. Co-

oxidation of β- carotene catalyzed by soybean and recombinant pea lipoxygenases. J.

Agric. Food Chem., 1999, 47: 4899-4906.

16. Jorgenson, J. W. and DeArman Lukacs, K. Zone electrophoresis in open‐tubular glass

capillaries: Preliminary data on performance. J. High Res. Chromatogr., 1981, 4: 230-231

Determinarea bisfenolului F în probe de muștar utilizând metoda fluorescentă

Introducere

Muștarul este o pastă densă, cu gust iute, dinamic, obținut din semințele măcinate ale

unei plante de muștar (muștar alb sau galben, Sinapishirta; muștar brun sau indian, Brassica

juncea; sau muștar negru, Brassica nigra). [1]. Componentele importante ale semințelor de

muștar sunt compușii cu sulf numiți glucozinolați (sinigrină în B. juncea și B. nigra) și sinalbin

în (S. alba), care conferă aroma și gustul picant. [2].

Bisfenolul F [bis (hidroxifenil) metan] (Fig.1) este un difenilalcan cu o structură

similară cu bisfenolul A. Aceste molecule sunt implicate în producerea de rășini epoxidice

și/sau policarbonat. De asemenea, sunt utilizate în producerea de materiale medicale (de

exemplu, materiale dentare de etanșare,dispozitive protetice orale și înlocuitori de țesut) și

învelișuri pentru ambalarea alimentelor [4,5]. Bisfenolul F se formează în timpul producției de

muștar în condiții de laborator controlate, dar numai atunci când sunt folosite semințe de

muștar alb/galben (Sinapis alba, sinonim Brassica alba). Prin utilizarea semințelor de muștar

brun (Brassica juncea) sau muștar negru (Brassica nigra) nu s-a observat formarea bisfenolului

F. Semințele de muștar alb/galben sunt utilizate pentru producerea tipurilor de muștar dulce, în

timp ce semințele de muștar maro și negru sunt folosite pentru producerea pastei de muștar

picante. Toate măsurătorile de fluorescență au fost efectuate cu un spectrometru QE65000 de

la Ocean Optics (Dunedin, Florida) echipat cu o lampă cu xenon (HPX 2000). Sursa de lumină

Xenon HPX-2000 este o sursă de mare putere, de mare intensitate, care este utilă în special

pentru aplicațiile fluorescente și pentru alte aplicații în care este necesară o lampă cu

intensitate ridicată. Rezultatele sunt obținute și procesate folosind un program software

Spectra Suite. Pentru toate măsurătorile de pH a fost utilizat un pH-metru Mettler Toledo

(model Seven Compact). Această lucrare propune o metodă de fluorescență bazată pe

fluorescența nativă a bisfenolului F, dar și pe îmbunătățirea semnalului fluorescent prin

utilizarea fluoresceinei ca substanță fluoroforă pentru determinarea bisfenolului F în probe de

muștar.

Figura 1. Bisfenol F-structura chimică Pregătirea probelor

În scopul determinării bisfenolului F și validării metodei de fluorescență s-au utilizat

cinci probe de muștar, proba 1 a fost muștar clasic, proba 2 muștar picant, proba 3 muștar

dulce, proba 4 din muștarul iute și proba 5 din muștarul natural produse de diferite companii

achiziționate din regiunea București, România. Probele au fost preparate cu PBS (pH=7.45).

Rezultate și discuții

Fluorescența nativă a bisfenolului F a arătat o intensitate scăzută a semnalului

fluorescent. Pentru a spori sensibilitatea detecției fluorescenței bisfenolului F au fost analizate

două substanțe fluorofore: rodamina B și fluoresceina. Rodamina B nu a dat un răspuns pozitiv

comparativ cu fluoresceina care a condus la o îmbunătățire semnificativă a semnalului

fluorescent.

Optimizarea conditiilor de lucru

Pentru determinarea bisfenolului F a fost necesară optimizarea concentrației de

fluoresceină. Prin urmare, s-au preparat soluții de diferite concentrații de fluoresceină și a fost

măsurată intensitatea semnalului de fluorescență. Domeniul de concentrații al fluoresceinei a

fost între 1.00x10-9-1.00x10-3 mol L-1. Figura 2 arată că cea mai mare intensitate a semnalului

de fluorescență a fost obținută pentru o concentrație de fluoresceină de 1.00x10-4 mol L-1 (log

1,00x10-4=-4), utilizată pentru reprezentarea grafică).

Fig. 2. Influența concentrației fluoresceinei asupra intensității semnalului de fluorescență.

Liniaritatea și sensibilitatea pentru analiza Bisfenolului F

Rezultatele obținute pentru fluorescența nativă a bisfenolului F au fost comparate cu

rezultatele obținute pentru probele de bisfenol F cu fluoresceina utilizată ca substanță

fluorescentă. Pentru fluorescența nativă a bisfenolului F, s-au obținut următorii parametri:

domeniul de concentrații liniare a fost între 1.00x10-8-1.00x10-6 mol L-1 bisfenol F (Fig. 3).

Ecuația de regresie liniară a fost I = 2588.7 + 9,00 x107xC (r = 0,9987) unde I este intensitatea

fluorescenței și C este concentrația de bisfenol F (mol L-1). Limita de determinare s-a dovedit a

fi 1.00x10-8 mol L-1. Când fluoresceina a fost utilizată ca substanță fluoroforă, parametrii

obținuți s-au modificat după cum urmează: domeniul de concentrații a fost între 1.00x10-9 și

5.00x10-7mol L-1 (Fig. 3). Ecuația de regresie liniară a fost I=4894,8-2x10-9xC (r = 0.9996),

unde I este intensitatea fluorescenței și C este concentrația de bisfenol F (mol L-1). Limita de

determinare a fost de 1.00x10-9 mol L-1

Figura 3. Spectrele de fluorescență ale diferitelor concentrații de bisfenol F înregistrate pentru (1)

fluorescență nativă a bisfenolului F; (2) folosind fluoresceina ca substanță fluoroforă care prezintă (a)

suprapunerile cu valoarea inițială; și (b) - extensia.

Prin utilizarea fluoresceinei ca substanță fluoroforă pentru detectarea bisfenolului F a

fost obținut un domeniu de concentrații liniare mai mare, metoda având capacitatea de a

acoperi concentrații puțin mai mici și mai mari de bisfenol F. Datorită obținerii unei limite de

determinare mici, bisfenolul F a putut fi detectat în probele de muștar.

Aplicații analitice

Probele de muștar au fost analizate folosind metoda fluorescenței în două moduri:

folosind fluorescența nativă a bisfenolului F și prin adăugarea fluoresceinei ca substanță

fluoroforă la probele de muștar în scopul îmbunătățirii semnalului fluorescent. Rezultatele

obținute folosind metodele de fluorescență au fost comparate cu cele obținute folosind o

metodă diferită-o metodă electrochimică bazată pe un senzor stocastic [6] (bazat pe

imobilizarea 2,2-difenil-1-picrililhidrazil (DPPH) în nanopudră de carbon (nC)) (tabelul 1).

Figura 4 prezintă câteva exemple pentru spectrele de fluorescență obținute folosind cele două

metode de fluorescență. Tabelul 1 arată că există o corelație bună între rezultatele obținute

folosind cele două metode de fluorescență și metoda electrochimică bazată pe senzorul

stocastic.

Tabel 1. Determinarea bisfenolului F în probele de muștar (N=10)

Probă de muștar

nr.

ng BPF/1g muștar

Fluorescența nativă

Utilizarea fluoresceinei

ca substanță fluoroforă

Senzor stocastic bazat pe

DPPH/nC

1 6.48± 0.08 6.45±0.06 6.48±0.02

2 9.19±0.04 9.90±0.08 9.27±0.03

3 6.25±0.05 6.89±0.05 6.50±0.02

4 9.20±0.07 9.72±0.08 9.05±0.05

5 10.84±0.08 10.20±0.05 10.38±0.03

Figura 4. Exemplu de spectru de fluorescență pentru probe de muștar dulce folosind: (1)

fluorescență nativă și (2) fluoresceina ca substanță fluoroforă.

Concluzii

Utilizarea fluoresceinei ca substanță fluoroforă pentru determinarea bisfenolului F a condus

la la îmbunătățirea semnalului de fluorescență, mărirea domeniului de concentrații liniare și scăderea

limitei de determinare a bisfenolului F. Metoda propusă s-a dovedit a fi fiabilă pentru determinarea

bisfenolului F în muștar. Metoda este rapidă, eficientă, având costuri reduse atunci când este utilizată

pentru analiza bisfenolului F din diferite probe alimentare, cum ar fi muștarul.

Bibliografie

1. M. McNulty,How is mustard made? In D. S. Blanchfield (ed.), How Products are Made: An

Illustrated Guide to Product Manufacturing,vol. 7, Detroit: Gale Group 2002.

2. R.K. Downey, Mustard. In S.H. Katz and W.W. Weaver. Encyclopedia of Food and Culture. Gale

virtual reference library. New York: Scribner 2003.

3. N. Leepipatpiboon, O. Sae-Khow, S. Jayanta, Simultaneous determination of bisphenol-A-diglycidyl

ether, bisphenol-F diglycidyl ether, and their derivatives in oil-in-water and aqueous based

canned foods by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J

Chromatogr A, 1073,2005, pp. 331–339.

4. C. Nerín, M. R. Philo,J. Salafranca, L. Castle, Determination of bisphenol-type contaminants from

food packaging materials in aqueous foods by solid-phase microextraction-high-performance

liquid chromatography. J Chromatogr A, 963(1-2), 2002, pp. 375–380.

5. R-I Stefan-van Staden, A. Lungu-Moscalu, J. F. van Staden, Nanostructured Materials Used for

Pattern Recognition of Bisphenols in Waste Water Samples. J Electrochem Soc, 166 (12), 2019,

pp. B903-B907

Recunoașterea moleculară a îndulcitorilor în fluide biologice, băuturi carbogazoase și ketchup folosind senzori stocastici

Introducere

Îndulcitorii sunt aditivi alimentari care sunt folosiți pentru a îmbunătăți gustul produselor

alimentare [1] Îndulcitorii naturali sunt compuși care au gust dulce cu valoare nutrițională;

ingredientul principal al îndulcitorilor naturali fiind mono sau dizaharidele [2]. Îndulcitori

artificiali sunt folosiți ca înlocuitori de zahăr în cantități considerabile în alimente și băuturi, în

special pentru pacienții diabetici și/sau obezi. [3]. Unii dintre îndulcitorii cu conținut scăzut de

calorii din zilele noastre, aprobate de diferite autorități internaționale ca aditivi alimentari

direcți sunt reprezentați de acesulfam K, aspartam, ciclamat, zaharină și sucraloză [7,8].

Aspartamul (fig.1 (a))-un îndulcitor non-nutritiv constituit din două peptide: ester metilic al L-

fenilalaninei și al acidului L-aspartic [9], este un îndulcitor cu conținut scăzut de calorii,

utilizat pentru îndulcirea unei varietăți de alimente și băuturi cu un conținut caloric scăzut,

[10]. Acesulfam-K (fig. 1 (b)) reprezintă sarea de potasiu a 3,4-dihidro-6-metil-1,2,3-oxatiazin-4-

1,2,2-dioxid [11] și deoarece nu se metabolizează în corpul uman, are zero calorii și nu

influențează aportul de potasiu în ciuda conținutului său de potasiu [12]. Ciclamatul este un

membru al unui grup de săruri ale acidului ciclamic (acid ciclohexilsulfamic). [13]. Ciclamatul

este permis într-o gamă de produse alimentare, de exemplu în băuturi pe bază de lapte și

derivate din lapte sau pe bază de suc de fructe [14]. Deși, au gust dulce și conținut caloric

scăzut, îndulcitorii pot avea efecte secundare, cum ar fi:-favorizarea producerii de

tumori/cancer și, prin urmare, consumul acestora necesită un control permanent. Pentru

determinarea îndulcitorilor sintetici din alimente, băuturi și dietete, se utilizează o varietate de

metode, cum ar fi spectroscopia UV [15], electroforeza capilară [16], cromatografia lichidă de

înaltă performanță [17] și cromatografia ionică [18].

Această lucrare a propus o nouă metodă bazată pe paste modificate de nanopudră de diamant

pentru detectarea simultană a aspartamului, acesulfamului K și ciclamatului de sodiu modificat

cu soluții de α, β, γ ciclodextrină 10-3mol L-1 în diferite probe: băuturi carbogazoase, ketchup

și probe de urină. Cei trei senzori stocastici au fost folosiți pentru recunoașterea moleculară și

analiza cantitativă a aspartamului, acesulfamului K și ciclamatului de sodiu.

Toate măsurătorile electrochimice au fost efectuate cu un potențiostat/galvanostat AUTOLAB

/ PGSTAT 302N (Metrohm, Utrecht, Olanda) conectat la un calculator cu un software GPES

folosit pentru înregistrarea măsurătorilor. A fost utilizată o celulă electrochimică cu trei

electrozi:electrodul de referință Ag/AgCl (0,1 mol L-1 KCI), electrodul de platină (contra-

electrod) și electrodul de lucru (senzorul stocastic) pentru efectuarea măsurătorilor. Un pH

metru Mettler Toledo (model Seven Compact) a fost utilizat pentru toate măsurătorile de pH.

Tehnica cronoamperometrică a fost utilizată pentru măsurarea valorilor toff (aspartam,

acesulfam K, ciclamat de sodiu) și a valorilor ton, fiind aplicat un potențial de 125 mV față de

Ag/AgCl. Soluțiile standard care conțineau diferite concentrații de aspartam, acesulfam K,

ciclamat de sodiu au fost introduse în celula electrochimică. Ecuațiile de calibrare: 1/ton =

a+bxConc, au fost obținute folosind metoda regresiei liniare. Cantitățile de aspartam,

acesulfam K, ciclamat de sodiu din probele reale au fost determinate prin introducerea

valorilor ton în ecuațiile de calibrare.

Fig.1(a) Fig. 1 (b)

Fig. 1 (c)

Figura 1. Structura chimică a) Aspartam, b)Acesulfam K, c)Ciclamat de sodiu.

Pregătirea probelor

În scopul determinării îndulcitorilor aspartam, acesulfam K și ciclamat de sodiu s-au utilizat

cinci tipuri de ketchup și cinci tipuri de băuturi carbogazoase produse de diferite companii

achiziționate din regiunea București, România și zece probe de urină de la persoane care au

consumat cinci băuturi carbogazoase care conțineau cei trei îndulcitori folosind senzori

stocastici. Înainte de fiecare măsurare a fost verificat pH-ul probelor de ketchup băuturilor

carbogazoase și a probelor de urină; toate soluțiile aveau pH-ul 3.0. Probele de urină au fost

analizate ca atare fiind colectate de la pacienți. Colectarea probelor biologice a fost efectuată

cu acordul pacienților, în conformitate cu Comitetul de etică aprobat al Universității de

Medicină și Farmacie "Carol Davila" din București, documente nr. 11/2013.

Rezultate și discuții

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici sunt prezentate în tabelul 1. Semnăturile

(valorile toff) înregistrate pentru aspartam, acesulfam K și ciclamat de sodiu au fost diferite

atunci când a fost utilizat același senzor stocastic, dovedind că recunoașterea moleculară poate fi

efectuată cu același senzor stocastic. Cele mai mari domenii de concentrații liniare obținute au

fost: pentru acesulfamul K între 1.00x10-10 mol L-1 și 1.00x10-3 mol L-1, pentru aspartam între

1.00x10-12 mol L-1 și 1.00x10-3 mol L-1 și pentru ciclamatul de sodiu între 4.97x10-12 mol L-1 și

4.97x10-3 mol L-1. Cele mai mici limite de determinare au fost obținute folosind senzorul

stocastic pe baza de γ-CD/nDP după cum urmează: pentru acesulfam K 1.00x10-10 mol L-1,

pentru aspartam 1.00x10-12 mol L-1 și pentru ciclamatul de sodiu 4.97x10-12 mol L-1. Au fost

înregistrate valori ridicate ale sensibilităților pentru senzorii stocastici propuși (tabelul 1).

Tabelul 1. Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici pentru determinarea

aspartamului, acesulfamului K și ciclamatului de sodiu.

Senzori bazați

pe

Ecuația de calibrare și

coeficientul de corelare (r)

Domeniul linear de

concentrație (mol L-1)

toff(s) Sensibilitatea

(s-1/mol L-1)

Limita de determinare

(mol L-1)

Acesulfam K α-

CD/nDP 1/ton=0.01+3.67x104xC

r=0.9986 1.00x10-

8/1.00x10-3 0.5 3.67x104 1.00x10-8

β-CD/nDP

1/ton=0.02+3.01x10 xC r=0.9999

1.00x10-

5/1.00x10-3 1.3 3.01x10 1.00x10-5

γ-CD/nDP

1/ton=0.02+2.24 x106xC

r=0.9999

1.00x10-

10/1.00x10-3 1.8 2.24 x106 1.00x10-10

Aspartam

α-CD/nDP

1/ton=0.02+7.27 x107xC

r=0.9999

1.00x10-

12/1.00x10-3 1.2 7.27 x107 1.00x10-12

β-CD/nDP

1/ton=0.02+4.17 x104xC

r=0,9983

1.00x10-

9/1.00x10-3 0.6 4.17 x104 1.00x10-9

γ-CD/nDP

1/ton=0.06+5.77 x107xC

r=0.9990

1.00x10-

12/1.00x10-3 0.6 5.77 x107 1.00x10-12

Ciclamat de sodiu

α-CD/nDP

1/ton=0.02+8.87 x107xC

r=0.9999

4.97x10-

12/4.97x10-3 0.6 8.87 x107 4.97x10-12

β-CD/nDP

1/ton=0.02+8.44 x106xC

r=0.9999

4.97x10-

11/4.97x10-3 1.2 8.44 x106 4.97x10-12

γ-CD/nDP

1/ton=0.02+7.30 x107xC

r=0.9996

4.97x10-

12/4.97x10-3 1.2 7.30 x107 4.97x10-12

*<C> = mol L-1; <ton> = s

Selectivitatea senzorilor stocastici este dată de semnăturile (valorile toff) înregistrate pentru

eventualele specii de interferență. Pentru cei trei îndulcitori: aspartam, acesulfam K și ciclamat

de sodiu au fost obținute semnături diferite care demonstrează faptul că nici unul dintre ei nu

interferă în analiza celuilalt.

Aplicații analitice

Modul stocastic a fost utilizat pentru recunoașterea moleculară și determinarea cantitativă a

aspartamului, acesulfamului K și ciclamatului de sodiu în diferite probe: ketchup, băuturi

carbogazoase și probe de urină. Recunoașterea moleculară a aspartamului, acesulfamului K și

ciclamatului de sodiu a fost efectuat utilizând cei trei senzori stocastici pe bază de nanopudră

de diamant. În diagramele înregistrate pentru probele reale (Figurile 2-4) a fost identificată

semnătura (valoarea toff) a aspartamului, acesulfamului K și ciclamatului de sodiu și a fost

măsurată valoarea ton pentru a putea găsi concentrația de aspartam, acesulfam K și ciclamat de

sodiu.

Fig. 2 (a) Fig. 2 (b)

Fig. 2 (c)

Figura 2. Exemple de diagrame obținute pentru recunoașterea moleculară a aspartamului,

acesulfamului K și ciclamatului de sodiu în băuturi carbogazoase utilizănd senzori stocastici bazați pe

a) α-CD/nDP; (b) β-CD/nDP; (c) γ-CD/nDP

Fig. 3 (a) Fig. 3 (b)

Fig. 3 (c)

Figura 3. Exemple de diagrame obținute pentru recunoașterea moleculară a aspartamului,

acesulfamului K și ciclamatului de sodiu în probe de ketchup utilizând senzori stocastici bazați pe a) α-

CD/nDP; (b) β-CD/nDP; (c) γ-CD/nDP

Fig.4 (a) Fig.4 (b)

Fig.4 (c)

Figura 4. Exemple de diagrame obținute pentru recunoașterea moleculară a aspartamului,

acesulfamului K și ciclamatului de sodiu în probe de urină utilizănd senzori stocastici bazați pe a) α-

CD/nDP; (b) β-CD/nDP; (c) γ-CD/nDP

Selectivitatea senzorilor stocastici este dată de semnăturile (valorile toff) înregistrate pentru

eventualele specii de interferență. Pentru toți cei trei îndulcitori: aspartam, acesulfam K și

ciclamatul de sodiu au fost obținute semnături diferite, demonstrând faptul că nici unul dintre

ei nu interferă în analiza celuilalt.

Rezultatele obținute în urma efectuării recunoașterii moleculare și analizării

îndulcitorilor în probele de băuturi carbogazoase, ketchup și urină sunt prezentate în tabelele

2-4. Tabelul 2 prezintă rezultatele băuturilor–cinci tipuri de băuturi răcoritoare, dintre care este

specificat pe etichetele probelor 1 și 5 ca se gasesc aspartamul, acesulfamul K și ciclamatul de

sodiu, în schimb pe eticheta probelor 3 și 4 au fost menționate doar aspartamul și acesulfamul

K, iar pe eticheta probei 2 a fost menționat doar aspartamul. Efectuarea recunoașterii moleculare

a îndulcitorilor în probele de băuturi carbogazoase folosind senzorii stocastici propuși a arătat

o bună corelație între îndulcitorii găsiți pe eticheta probelor și îndulcitorii determinați folosind

senzorii stocastici (tabelul 2). Există o corelație bună între concentrațiile de îndulcitori care se

găsesc în băuturile răcoritoare folosind cei trei senzori stocastici (tabelul 2).

Tabel 2. Recunoașterea moleculară și analiza acesulfamului K, aspartamului și ciclamatului de

sodiu în băuturi carbogazoase (N = 10).

Proba No.

Senzor stocastic bazat pe nDP și

Acesulfam K, µg mL-1

Aspartam, µg mL-1

Ciclamat de sodiu,

µg mL-1

1 α-CD 394.31±0.02 476.77±0.03 448.23±0.02 β-CD 392.12±0.04 492.30±0.03 455.00±0.02 γ-CD 408.52±0.04 479.07±0.02 480.43±0.05

2 α-CD - 573.89±0.03 - β-CD - 547.40±0.03 - γ-CD - 532.68±0.04 -

3 α-CD 700.32±0.02 718.09±0.03 - β-CD 705.27±0.03 703.21±0.05 - γ-CD 721.20±0.05 698.92±0.02 -

4 α-CD 221.80±0.03 489.16±0.02 - β-CD 235.09±0.02 481.14±0.03 - γ-CD 237.46±0.04 466.99±0.06 -

5 α-CD 291.80±0.02 407.21±0.03 554.54±0.02 β-CD 285.26±0.04 409.08±0.03 540.89±0.04 γ-CD 287.46±0.05 408.25±0.06 564.82±0.04

Pe etichetele celor 5 probe de ketchup selectate era specificată doar prezența acesulfamului K.

Recunoașterea a moleculară a acesulfamului K a indicat o corelație bună între prezența acestuia

pe eticheta produselor și rezultatele obținute folosind senzorii stocastici (Tabelul 3). Există, de

asemenea, o corelație bună între cantitățile de acesulfam K găsite în probele de ketchup,

folosind senzorii stocastici propuși (Tabelul 3).

Tabel 3. Recunoașterea moleculară și analiza acesulfamului K în probe de ketchup (N = 10)

Proba No.

Senzor stochastic bazat pe nDP și

Acesulfame K, µg per g ketchup

1 α-CD 230.24±0.01 β-CD 227.42±0.02 γ-CD 242.76±0.02

2 α-CD 195.90±0.02 β-CD 192.94±0.03 γ-CD 194.93±0.05

3 α-CD 197.28±0.02 β-CD 196.21±0.02 γ-CD 199.54±0.03

4 α-CD 235.28±0.03 β-CD 231.18±0.02 γ-CD 236.20±0.04

5 α-CD 240.32±0.01 β-CD 233.95±0.05 γ-CD 237,43±0.05

Zece probe de urină au fost colectate de la pacienții care au consumat îndulcitori după cum

urmează: probele 1, 9 și 10 conțin aspartam, acesulfam K și ciclamat de sodiu; probele 3-8

conțin aspartam și acesulfam K, iar în proba 2 se regasește doar aspartam. Rezultatele sunt

prezentate în tabelul 4, iar în ceea ce privește recunoașterea moleculară a îndulcitorilor se

observă o corelație bună între tipurile de îndulcitori consumați și cei determinați folosind

senzorii stocastici.

Tabel 3. Recunoașterea moleculară și analiza acesulfamului K, aspartamului și ciclamatului de

sodiu în probe de ketchup (N = 10)

Proba No.

Senzor stocastic bazat pe nDP și

Acesulfam K, ng mL-1

Aspartam, ng mL-1

Ciclamat de sodiu,

ng mL-1

1 α-CD 225.39±0.02 259.29±0.03 222.52±0.01 β-CD 229.43±0.03 224.98±0.02 232.02±0.01 γ-CD 224.29±0.03 267.27±0.02 221.34±0.03

2 α-CD - 353.12±0.03 - β-CD - 323.18±0.02 - γ-CD - 360.08±0.04 -

3 α-CD 776.23±0.03 765.98±0.02 - β-CD 773.80±0.02 767.24±0.03 - γ-CD 770.24±0.03 771.07±0.05 -

4 α-CD 291.80±0.02 585.23±0.03 - β-CD 289,79±0.02 583,29±0.02 - γ-CD 298.81±0.02 571,21±0.07 -

5 α-CD 291.80±0.03 334.75±0.02 - β-CD 295.40±0.04 335.50±0.01 - γ-CD 297.88±0.02 330.17±0.03 -

6 α-CD 427.40±0.02 862.22±0.03 - β-CD 422.60±0.02 892.16±0.04 - γ-CD 420.59±0.03 871.13±0.04 -

7 α-CD 255.03±0.01 879.26±0.02 - β-CD 252.47±0.02 871.13±0.03 - γ-CD 241.49±0.02 877.57±0.02 -

8 α-CD 229.41±0.01 389.15±0.01 - β-CD 226.67±0.01 376.70±0.02 - γ-CD 220.38±0.02 374.15±0.02 -

9 α-CD 853.26±0.03 351.16±0.02 332.01±0.03 β-CD 858.20±0.03 352.17±0.02 336.12±0.02 γ-CD 839.45±0.05 364.93±0.04 339.42±0.02

10 α-CD 551.43±0.01 478.23±0.02 283.54±0.02 β-CD 555.42±0.04 474.11±0.03 287.74±0.03 γ-CD 545.37±0.03 486.22±0.03 289.25±0.03

Rezultatele obținute pentru recunoașterea moleculară și determinarea aspartamului,

acesulfamului K și ciclamatului de sodiu în probe de băuturi carbogazoase, ketchup și probe de

urină au arătat că senzorii stocastici propuși au prezentat o fiabilitate ridicată fiind utilizați în

screening-ul acestor probe pentru determinarea îndulcitorilor.

Concluzii

Determinarea aspartamului, acesulfamului K și ciclamatului de sodiu a fost efectuată folosind

trei senzori stocastici pe baza de nanopudră de diamant modificate cu soluții de α, β, γ

ciclodextrină. S-au obținut rezultate fiabile pentru efectuarea recunoașterii moleculare a

îndulcitorilor și determinarea cantitativă a acestora în băuturi carbogazoase, ketchup și probe

de urină. Metoda propusă poate fi utilizată pentru screening-ul și controlul calității băuturilor

carbogazoase și probelor de ketchup și a probelor de urină în special pentru diabetici în scopul

prevenirii efectelor secundare.

Bibliografie

1. Khuwaja, A.K., Z. Fatmi, W.B. Soomro and N.K. Khuwaja. 2003. Risk factors for

cardiovascular disease in school children: A pilot study. J. Pak. Med. Assoc. 53(9): 396- 400.

2. Belšcak-Cvitanovic A, Komes D, Dujmović M, Karlović S, Biškic M et al (2015) Physical,

bioactive and sensory quality parameters of reduced sugar chocolates formulated with natural

sweeteners as sucrose alternatives. Food Chem 167:61–70

3. Ygler A, Wasik A, Namiesnik J (2009) Analytical methodologies for determination of

artificial sweeteners in food stuffs. TRAC Trends Anal Chem 28(9):1082–1102.

4. US FDA (2006) Artificial sweeteners: no calories. sweet! FDA Consum Mag 40(4):27–28

5. EU (2003) European Parliament and Council Directive 2003/115/EC of 22 December 2003

6. Fitch C, Keim KS, Academy of Nutrition, Dietetics.Position of the Academy of Nutrition

and Dietetics: use of nutritive and non nutritive sweeteners. Journal of the Academy of

Nutrition and Dietetics 2012;112(5):739–58

7. Magnuson BA, Burdock GA, Doull J (2007) Aspartame: a safety evaluation based on

current use levels, regulations, and toxicological and epidemiological studies. Crit Rev Toxicol

37:629–727

8. Kuhn C, Bufe B, Winnig M, Hofmann T, Frank O, Behrens M, Lewtschenko T, Slack JP,

Ward CD and Meyerhof W, Bitter taste receptors for saccharin and acesulfame- K, Journal

Neuroscience, 24 (45), 2004, 10260-10265.

9. [ADA] American Dietetic Association, (2004) Position of the American Dietetic

Association: use of nutritive and nonnutritive sweeteners. J Am Diet Assoc 104:255–275

10. Mortensen, A. 2006. Sweeteners permitted in European Union: Safety aspects.

Scandinavian J. Food Nutr., 50: 104-116.

11. Alicja Mortensen (2006) Sweeteners permitted in the European Union: safety aspects,

Scandinavian Journal of Food and Nutrition, 50:3, 104-116.

12. M.A Cantarelli, Pellerano R.G, Marchevsky E.J and Camina J.M., Food Chem. 115, 1128-

1132 (2009).

13. M. Horie, F. Ishikawa, Oishi M, Shindo T, Yasui A and Ito K., J Chromatogr A 1154, 423-

428 (2007).

14.Z Huang, Ma J, Chen B, Zhang Y and Yao S., Anal Chim Acta 555, 233-237 (2006).

15. Y. Zhu, Guo Y, Ye M. And James F.S., J Chromatogr A 1085, 143-146 (2005).

Recunoașterea moleculară a aflatoxinei M1 în probe de apă și lapte

Introducere

În ultimii ani, calitatea apei și a produselor dietetice, cum ar fi laptele, au influențat calitatea

vieții oamenilor și a animalelor, cei mai afectați fiind copiii. Din categoria poluanților

principali din probele de apă și lapte, cel care afectează cel mai mult sănătatea este aflatoxina

M1.

Aflatoxinele sunt micotoxine care apar în mod natural produse de ciupercile Aspergillus, care

pot fi găsite într-o gamă largă de alimente crude, materii prime și produse dietetice importante.

Prezența aflatoxinei M1 (AFM1) în lapte este cunoscută încă de acum 30 de ani [1,2].

Cancerul hepatic și agentul dăunător ADN, AFM1 este un mutagen, teratogen, care provoacă

imunosupresie la animale. Efectele toxice ale AFM1 s-au arătat și la nivelul rinichilor, prin

reglarea L-prolinei și a apoptozei în aval [3]. Prin urmare, Comisia UE, precum și

Administrația pentru produse alimentare și medicamente au stabilit limite foarte mici de

aflatoxină M1 în probele de apă și lapte și produse lactate [4,5].

Până în prezent au fost propuse o serie de metode pentru determinarea aflatoxinei M1 [6],

dintre care cele mai sensibile au fost metodele HPLC [7-9], ELISA [10], metodele

impedimetrice [11,12] și metodele electrochimice și impedimetrice ale biosenzorilor [12,13].

Datorită limitelor mici stabilite de Comisia UE, precum și de Administrația pentru produse

alimentare și medicamente, este nevoie de metode extrem de sensibile, capabile să determine

aflatoxina M1 în probe de lapte și apă, într-un timp foarte scurt și cu un cost foarte scăzut. Prin

urmare, această lucrare a propus platforme care să includă doi microsenzori stochastici pe bază

de pastă de diamant modificată cu 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) pentru recunoașterea

moleculară a aflatoxinei M1 în probe de apă și lapte. Au fost utilizate două tipuri de diamante:

o pulbere de diamant monocristalin (1 µm) (DP) și o nanopudra de diamant monocristalin (10

nm) (nDP) pentru design-ul microsenzorilor stochastici.

Senzorii electrochimici clasici (micro) pot efectua doar analize cantitative in probe cu matrici

foarte complexe, în timp ce microsenzorii stochastici sunt singurii microsenzori electrochimici

capabili să efectueze atât analize calitative cât și cantitative ale concentrațiilor scăzute ale

analitilor în probe foarte complexe precum probe de apă și lapte. Performanțele lor s-au

dovedit în diferite ocazii, când au fost utilizate pentru analiza poluanților in probe de apă

[14,15] sau biomarkeri în probe de sânge integral [16-18]. Pulberea de diamant monocristalin

și nanopudra de diamant au fost alese pentru compoziția matricei, pentru a găsi cea mai bună

matrice care poate fi utilizată pentru determinarea aflatoxinei M1. DPPH a fost ales datorită

capacității sale de formare a canalelor capabile să dea răspunsul stocastic pentru microsenzorii

propuși.

Partea experimentala

Materiale și reactivi

Au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Viena, Austria) 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil

(DPPH), pulbere de diamant sintetic monocristalin (1 µm), nanopudră de diamant (10 nm) și

aflatoxina M1 (AFM1). Uleiul de parafină a fost cumpărat de la Fluka (Buchs, Suedia). Apa

deionizată folosită pentru prepararea soluțiilor a fost obținută folosind un sistem Millipore

Direct-Q 3 (Mosheim, Franța). Soluția stoc de aflatoxină M1 (5µg aflatoxină M1/mL) a fost

preparată prin adăugarea de etanol până la dizolvarea pudrei de aflatoxina M1, urmată de

adăugarea unui amestec de apă deionizată: soluție tampon fosfat (0.1 mol L-1, pH = 7.40) 1: 1

(v/v), pentru a obține concentrația necesară de aflatoxină M1; s-a utilizat metoda de diluare

succesiva pentru diluarea soluției stoc până la o concentrație de fg / ml.

Aparate și metode

Toate măsurătorile au fost efectuate cu un AUTOLAB/PGSTAT 302N (Utrecht, Olanda)

conectat la un computer cu un software GPES. A fost utilizată o celulă electrochimică bazata

pe un sistem cu trei electrozi. În timpul măsurătorilor electrodul Ag/AgCl (0.1 mol L-1 KCl) a

servit ca electrod de referință și firul de platină ca contra electrod. Toate citirile au fost făcute

automat folosind soft-ul GPES.

Design-ul microsenzorilor stochastici pe baza de pudra de diamant și a platformei

Pudra de diamant sintetic monocristalin și nanopudra de diamant au fost amestecate separat cu

ulei de parrafină pentru a forma paste omogene de pastă de diamant (DP) și pastă de

nanodiamant (NDP). S-a adăugat o soluție de 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) de 10-3

mol/L la fiecare pastă (în raport de 1:1 (v/w)) pentru a forma două paste de diamant

modificate: DPPH/DP și DPPH/nDP. Fiecare pastă a fost introdusă într-un tub de plastic cu un

diametru intern de 100 µm. Contactul electric a fost obținut prin introducerea unui fir de argint

în pastele cu diamant. Microsenzorii stochastici au fost plasați pe platformele utilizate pentru

scanarea probelor de apă și lapte (Figura 1).

Figura 1. Platforma aflatoxinei M1 pentru screening-ul probelor de lapte și apă: (a)

configurarea platformei pentru măsurători; (b) vederea frontală a microsenzorului integrat

combinat cu microsenzorii stochastici pe baza de DPPH/DP sau DPPH/nDP.

Modul Stocastic

Modul stastic se bazeaza pe măsurarea picurilor (valorile toff) ale aflatoxinei M1 și a valorilor

ton asociate pentru diagramele înregistrate (Fig. 2 și 3), folosind tehnica cronoamperometrica.

Măsurătorile au fost efectuate la un potențial constant ales de 125 mV, astfel încât valoarea toff

să poată fi măsurată cu încredere (este de ordinul secundelor). Analiza calitativă a aflatoxinei

M1 s-a bazat pe identificarea semnalelor în diagrame. Valorile ton au fost utilizate pentru

determinarea parametrului cantitativ al microsenzorilor stocastici; 1/ton a fost reprezentat grafic

in functie de concentrațiile de aflatoxină M1 (1/ton = a + bxConcAFM1) pentru fiecare

microsensor propus. Soluțiile standard, precum și probele de apă și lapte au fost trecute prin

platformă, așa cum se vede în Figura 1 (a); debitul a fost oprit timp de 6 min până la

înregistrarea diagramelor (Figura 2 și 3); o soluție de apă distilată a fost trecută prin sistem

după fiecare probă pentru a spăla microsenzorul combinat activ și pentru a evita contaminarea

suprafeței active a microsenzorului stocastic din electrodul combinat.

Figura 2. Recunoașterea modelului de aflatoxina M1 în probele de apă utilizând

senzori stochastici pe baza de (a) DPPH/DP și (b) DPPH/nDP

.

Figura 3. Recunoașterea modelului de aflatoxina M1 în probele de lapte utilizând

senzori stochastici pe baza de (a) DPPH/DP și (b) DPPH/nDP

Au fost determinate concentrațiile necunoscute de aflatoxină M1 utilizând ecuația de calibrare

obținută pentru fiecare microsenzor. Toate măsurătorile au fost efectuate la 25ºC.

Probe

Au fost colectate probe de ape uzate. Probele de lapte au fost obținute de la o fermă. Toate

probele de apă reziduală și lapte au fost analizate folosind metodele certificate ISO (metoda

HPLC/fluorescență). Au fost analizate folosind platforma propusă (Figura 1) fără a efectua

vreo pretratare înainte de a trece prin platformă.

Rezultate și discuții

Caracteristicile de răspuns ale microsenzorilor stochastici pe baza de diamant

Caracteristicile de răspuns ale microsensorilor stochastici propuși au fost determinate așa cum

s-a descris mai sus în modul stocastic, utilizând platforma propusă in care a fost încorporat

microsenzorul combinat. Răspunsul microsenzorilor poate fi explicat folosind conductivitatea

canalului. Pentru microsenzorii stochastici, procesul are loc în două etape: în prima etapă,

AFM1 blochează parțial intrarea în pori pentru o perioadă de timp (curentul scade la câteva

pA), ceea ce se numește semnalul AFM1 (valoarea toff); iar în cea de-a doua etapă, procesele

redox și de delimitare fac parte din interiorul canalului, această etapă fiind caracterizată de

valorile ton.

În tabelul 1 sunt prezentate semnalurile înregistrate pentru AFM1 în probele de apă. Domeniile

de concentrație liniară înregistrate pentru ambii microsenzori stochastici au fost mari (tabelul

1), putând acoperi concentrațiile cuprinse între 0.001fg/L și 20 µg/L. Cea mai mare

sensibilitate (4.74x1010 s mg-1 L) a fost înregistrată pentru microsensorul stocastic pe baza de

DPPH/nDP. Limita de determinare 0.001fg/L este suficient de mică pentru a determina la

concentrații mult mai mici AFM1 atât în probe de apă, cât și în lapte; limita superioară a

intervalului de concentrație liniară (20 µg/L) favoriza determinarea concentrațiilor de AFM1

mai mari decât limitele admise în SUA și UE.

Tabelul 1. Caracteristicile de raspuns ale microsenzorilor stocastici utilizati pentru

determinarea aflatoxinei M1

Microsenzorul pe baza de DPPH si

Semnalul analitului

toff (s)

Ecuatia de calibrare* si coeficientul de

corelare (r)

Domeniul liniar de

concentratie (µg L-1)

Sensibilitatea (s mg-1 L)

Limita de determinare

(µg L-1)

DP 1.3 1/ton=0.03+5.78x108 x C r = 0.9976

1.00 x 10-12-2.00 x 101 5.78x108 1.00 x 10-12

nDP 2.1 1/ton=0.02+4.74x1010 x C r = 0.9964

1.00 x 10-12-2.00 x 101 4.74x1010 1.00 x 10-12

*C este concentratia de aflatoxina M1 <C> = mg L-1; <ton> = s.

Reproductibilitatea construcției al microsenzorului combinat și a platformei a fost testată prin

construcția a 5 microsenzori stochastici inserați în 5 platforme construite noi și măsurând

zilnic caracteristicile de răspuns timp de 10 zile. Rezultatele obținute au demonstrat că

valoarea deviatiei standard relativă (%) obținută prin compararea pantelor obținute pentru cei 5

microsenzori combinați în fiecare zi, precum și pentru același microsenzor combinat când

panta a fost determinată timp de 10 zile, a fost de 0.85%, dovedind că, construcția este fiabila

și că platformele care conțin microsenzorul stocastic poate fi utilizat cu incredere timp de cel

puțin 10 zile.

Selectivitatea microsenzorilor stocastici

Selectivitatea microsenzorilor propuși a fost verificată versus specii posibile de interferenta,

cum ar fi metalele grele (Cu, Cd, Hg, Pb), ioni sulfați, nitrat, nitrit, melatonină, bisfenoli A, F

și Z și fenoli. Toate aceste substanțe au dat semnaluri mult diferite atunci când au fost testate

cu microsenzorii stochastici propuși (tabelul 5), dovedind că microsenzorii stochastici propuși

sunt selectivi.

Aplicații analitice

Aplicatia principala a platformelor propuse pentru integrarea microsenzorilor stocastici

combinați a fost screening-ul rapid al probelor de apă și lapte pentru aflatoxina M1.

Semnalurile aflatoxinei M1 au făcut posibilă identificarea sa rapidă în diagrame (valorile toff

din figurile 2 și 3). Valorile de ton (figurile 2 și 3) au fost măsurate pentru a obține

concentrațiile de aflatoxină M1 în probe de apă și lapte.

Pentru a valida platformele propuse, metoda de recunoaștere moleculară și determinarea

concentrației de aflatoxina M1, prima etapă a fost adăugarea la probele de lapte și apă cantități

cunoscute de aflatoxină M1. Au fost înregistrate diagramele înainte și după adăugarea de

aflatoxină M1 și apoi au fost măsurate concentrațiile. Cantitatea adăugată de aflatoxină M1 a

fost comparată cu cantitatea găsită (recuperată) de aflatoxină M1 în probele de apă și lapte.

Rezultatele din tabelul 2 au arătat că aflatoxina M1 poate fi determinată fiabil din apele uzate

și din probele de lapte, recuperările înregistrate fiind mai mari de 98.00%, cu valorile deviatiei

standard (RSD) mai mici decât 1.00%.

Tabelul 2. Testele de recuperare ale aflatoxinei M1 în probe de apă și lapte

Microsenzori stocastici pe baza de DPPH si

Recuperarea Aflatoxinei (%)

Apa uzata Lapte

DP 98.72±0.04 98.47±0.02

nDP 99.32±0.03 99.27±0.03

Platformele propuse au fost utilizate pentru screening-ul a cinci probe de apă uzată și cinci

probe de lapte pentru aflatoxina M1. Nu s-a efectuat niciun tratament la probele de apă sau

lapte. După înregistrarea diagramelor, aflatoxina M1 a fost identificată în mod corespunzător

cu semnalurile date pentru microsenzorii stochastici (Figurile 2 și 3, Tabelul 1), iar valorile ton

au fost citite (Figurile 2 și 3) și folosite pentru a determina concentrațiile de aflatoxina M1 în

probele de ape uzate și de lapte (tabelele 3 și 4). Rezultatele obținute prin screening-ul

probelor de apă uzată și lapte folosind platformele (figura 1) au fost comparate cu cele obținute

prin metoda ISO, bazată pe determinarea prin HPLC/fluorescență (tabelele 3 și 4); s-a obținut

o corelație foarte bună pentru rezultatele obținute cu ajutorul platformelor și pentru cele

obținute prin metoda ISO. Valorile RSD (%) au aratat că metoda și platformele propuse sunt

fiabile pentru recunoașterea moleculară și determinarea concentrației de aflatoxina M1 în

probele de ape uzate și lapte.

Tabelul 3. Recunoașterea aflatoxinei M1 în probele de apă uzată

Nr. crt. Metode utilizate Aflatoxina M1 (µg L-1)

1

Metoda Standard 4.50 x 10-7

DPPH/DP 4.48(±0.03) x 10-7

DPPH/nDP 4.62(±0.02) x 10-7

2

Metoda Standard 1.00 x 10-5

DPPH/DP 0.96(±0.01) x 10-5

DPPH/nDP 1.12(±0.01) x 10-5

3

Metoda Standard 1.12x 10-4

DPPH/DP 1.94(±0.02) x 10-4

DPPH/nDP 1.13(±0.01) x 10-4

4

Metoda Standard 1.25 x 10-3

DPPH/DP 1.60(±0.04) x 10-3

DPPH/nDP 1.37(±0.02) x 10-3

5

Metoda Standard 7.13 x 10-5

DPPH/DP 7.94(±0.03) x 10-5

DPPH/nDP 7.25(±0.03) x 10-5

* Toate valorile sunt media a 10 determinări. Metoda standard a fost metoda certificată ISO - metoda HPLC/fluorescență.

Tabelul 4. Recunoașterea aflatoxinei M1 în probele de lapte

Nr. crt. Metoda utilizata Aflatoxina M1 (µg L-1)

1

Metoda Standard 0.32

DPPH/DP 0.37±0.02

DPPH/nDP 0.39±0.01

2

Metoda Standard 4.80

DPPH/DP 4.87±0.04

DPPH/nDP 4.90±0.02

3

Metoda Standard 16.00

DPPH/DP 16.08±0.02

DPPH/nDP 16.12±0.02

4

Metoda Standard 2.56 x 10-3

DPPH/DP 2.78(±0.01) x 10-3

DPPH/nDP 2.60(±0.01) x 10-3

5

Metoda Standard 12.80 x 10-3

DPPH/DP 12.80(±0.01) x 10-3

DPPH/nDP 12.88(±0.01) x 10-3

* Toate valorile sunt media a 10 determinări. Metoda standard a fost metoda certificată ISO - metoda HPLC/fluorescență.

Pentru analiza aflatoxinei M1 au fost efectuate pair-t-test la un nivel de încredere de 99.00%

în probe de lapte și apă. Toate valorile calculate pentru testul t pereche la nivelul de încredere

de 99.00% au fost mai mici decât valoarea teoretică tabelată: 4.032: pentru probele de lapte -

când s-a utilizat microsenzorul pe baza de DPPH/DP valoarea a fost de 3.20, iar când

microsensorul pe baza de DPPH/nDP a fost utilizat, valoarea a fost 3.15; pentru probele de apă

- când s-a utilizat microsenzorul pe baza de DPPH/DP valoarea a fost 2.47, iar când

microsenzorul pe baza de DPPH/nDP a fost utilizat, valoarea a fost 2.19. În consecință, nu

există nici-o diferență semnificativă statistica între rezultatele obținute folosind cei doi

microsenzori stochastici și metoda standard (acolo unde este disponibila) la un nivel de

încredere de 99.00%, pentru analiza aflatoxinei M1 în probele de lapte și apă, atunci când au

fost utilizate metodele propuse bazate pe microsenzorii stochastici.

Tabelul 5. Semnalurile posibilor interferenti versus semnalurile aflatoxinei M1

Microsenzorii

stocastici pe baza de DPPH si

Semnalul (valoarea toff (s)) de

Cu2

+ Cd2

+ Pb2

+ Hg2

+ Sulfat

Nitrat

Nitrit

Melatonina

BPA

BPF

BPZ

Fenol

AFM1

DP 0.3 0.7 2.0

1.7 2.4 2.0 2.5 3.0 3.4 3.7

4.2 2.7 1.3

nDP 0.5 1.2 1.5

1.0 0.8 0.2 2.7 2.9 1.8 3.4

3.9 3.0 2.1

Comparativ cu alte metode electrochimice propuse anterior pentru determinarea aflatoxinei

M1, metoda propusă a obținut următoarele avantaje: nu este necesară pregătirea probei, analiza

calitativă permite identificarea aflatoxinei M1 în matrici complexe si a fost înregistrată o

selectivitate mare.

Concluzii

Au fost propuse și validate platformele utilizate pentru screening-ul probelor de apă uzată și

lapte. Platformele au integrat microsenzorii combinați (microsenzorul stochastic, firul de Pt și

senzorul de Ag/AgCl). Au fost luate în considerare pentru platformă doi microsenzori

stocastici: unul pe baza de pastă de diamant și altul pe baza de pastă de nanodiamant, ambele

paste fiind modificate cu o soluție de 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil. Platformele au prezentat

sensibilitate și selectivitate ridicată. Domeniile liniare de concentrație au făcut posibilă

determinarea aflatoxinei M1 în limitele superioare stabilite de comisiile din Uniunea

Europeană și de Administrația Medicamentelor și Alimentelor din SUA.

Bibliografie

1. S.Z. Iqbal, S. Jinap, A.A. Pirouz, A.R. Ahmad Faizal, Aflatoxin M1 in milk and dairy

products occurrence and recent challenges: A review. Trends Food Sci. 2015, 46, 110-

119.

2. E.K. Kang'ethe, K.A. Lang'a Aflatoxin B1 and M1 contamination of animal feeds and

milk from urban centers in Kenya. Afr Health Sci. 2009, 9, 218-226.

3. H.Li, L. Xing, M. Zhang, J. Wang, N. Zheng The toxic effects of aflatoxin B1 and

aflatoxin M1 on kidney through regulating L-proline and downstream apoptosis.

BioMed Res Int. 2018, Article ID 9074861, 11pages.

4. Commission Regulation (EU) No 165/2010 Amending Regulation (EC) No 1881/2006

Setting Maximum levels for Certain Contaminants in Foodstuffs as Regards

Aflatoxins. Official J EU, Feb 26, 2010, L50/8-L50/12.

5. FDA Compliance Policy Guide, under Inspections, Compliance, Enforcements, and

Criminal Investigations, CPG Section 527 400 Whole Milk, Low fat Milk, Skim Milk

– Aflatoxin M1.

6. N.M. Danesh, H.B. Bostan, K. Abnous, M. Ramezani, K. Youssefi, S.M. Taghdisi, G.

Karimi, Ultrasensitive detection of aflatoxin B1 and its major metabolite aflatoxin M1

using aptasensors: A review, TrAC, 2018, 99, 117-128.

7. Y. Wang, X. Liu, C. Xiao, Z. Wang, J. Wang, H. Xiao, L. Cui, Q Wang, T. Yue, HPLC

determination of aflatoxin M1 in liquid milk and milk powder using solid phase

extraction on OASIS HLB, Food Control 2012, 28, 131-134.

8. J. Mao, S. Lei, Y. Liu, D. Xiao, C. Fu, L. Zhong, H. Ouyang, Quantification of

aflatoxin M1 in raw milk by a core-shell column on a conventional HPLC with large

volume injection and step gradient elution, Food Control, 2015, 51, 156-162.

9. N.S. Shuib, A. Makahleh, S.M. Salhimi, B. Saad, Determination of aflatoxin M1 in

milk and dairy products using high performance liquid chromatography – fluorescence

with postcolumn photochemical derivatization. J.Chromatogr A, 2017, 1510, 51-56.

10. J. Kos, E.J. Hajnal, I. Jajic, S. Krstovic, J. Mastilovic, B. Saric, P. Jovanov,

Comparison of ELISA, HPLC-FLD, and HPLC-MS/MS methods for determination of

aflatoxin M1 in natural contaminated milk samples. Acta Chim Slo, 2016, 63, 747-756.

11. G. Istamboulie, N. Paniel, L. Zara, L.R. Granados, L. Barthelmebs, T. Noguer,

Development of an impedimetric aptasensor for the determination of aflatoxin M1 in

milk, Talanta, 2016, 146, 464-469.

12. E. Dinckaya, O. Kinik, M.K. Sezginturk, C. Altug, A. Akkoca, Development of an

impedimetric aflatoxin M1 biosensor based on a DNA probe and gold nanoparticles,

Biosens Bioelectron 2011, 26, 3806-3811.

13. R. Eivazzadeh-Keihan, P. Pashazadeh, M. Hejazi, M. de la Guardia, A. Mokhtarzadeh,

Recent advances in nanomaterial-mediated bio and immune sensors for the detection of

aflatoxin in food products. TrAC 2017, 87, 112-128.

14. R.I. Stefan-van Staden, M. Mincu, J.F. van Staden, L.A. Gugoasa, Molecular

recognition of nitrites and nitrates in water samples using graphene-based stochastic

microsensors, Anal. Chem., 2018, 90, 9997-10000.

15. L.R. Popescu (Mandoc), I. Moldoveanu, R.I. Stefan-van Staden, E.M. Ungureanu,

Pattern Recognition of Cu(II), Pb(II), Hg(II), and Cd(II) in Waste Waters. Microsyst.

Technol. 2017, 23, 1141-1145.

16. RI Stefan-van Staden, RM Ilie, LA Gugoasa, A Bilasco, CA Visan, A Streinu-Cercel,

Molecular recognition of IL-8, IL-10, IL-12, and IL-15 in biological fluids using

phthalocyanine based stochastic sensors, Anal Bioanal Chem, 2018, 410, 7723–7737.

17. RI Stefan-van Staden, G Mitrofan, C Ionescu-Tirgoviste, Pattern recognition of

diabetes related biomarkers, Electroanalysis, 2018, 30, 2628-2634.

18. R.I. Stefan-van Staden, I. Popa-Tudor, C Ionescu-Tirgoviste, R.A. Stoica, Molecular

recognition of pyruvic acid and L-lactate in early-diabetic stage, J Electrochem Soc,

2018, 165, B659-B664.

Materiale nanocarbonice modificate cu complex de zinc protoporfirină IX imobilizat in platforme, utilizate pentru determinarea antibioticelor în

probe de apă

Introducere

Antibioticele sunt foarte des utilizate în tratarea atât a oamenilor, dar și a animalelor.

În cadrul unei ferme în urma verificării cărnii de pui sau a apei utilizate se găsesc cantități mici

sau care depășesc limita acceptată de către organele specializate Tratamentul contraindicat cu

antibiotice prin consumul apei sau a cărnii este foarte periculos pentru oameni, în special

pentru copii.

Detectarea rapidă a antibioticelor în probele de apă, în concentrații foarte mici, va

favoriza avertizarea rapidă a autorităților care efectueazăa tratarea apei și, de asemenea,

evitând acumularea lor în concentrații care devin periculoase pentru oameni și în special

pentru copii. Au fost propuse numeroase metode pentru determinarea antibioticelor [1-7], de

exemplu, HPLC [2,4], metoda spectrofotometrică [1], metoda electrochimică [3] și metoda

fluorescentă [7].

Senzorii stocastici pot fi folosiți cu încredere atât pentru analiza calitativă cât și

cantitativă [8-10]. Metoda stocastică nu necesită nici o prelucrare a probei înainte de analiză,

rezultatele nu sunt influențate de complexitatea metodei, este economică din punct de vedere

al costurilor și poate fi utilizată pentru analiza mai multor analiți în concentrații foarte mici, în

matrici foarte complexe.

Prin urmare, doi senzori stocastici proiectați utilizând paste de nanocarbon și

nanodiamant modificate cu complex Zn protoporfirină IX au fost propuse pentru analiza

simultană a antibioticelor: amoxicilină, ampicilină și biotină în probele de apă. A fost selectat

complexul protoporfirină IX deoarece poate crea agregate moleculare foarte stabile și, prin

urmare se formează canalele necesare care sunt fiabile pentru răspunsul senzorilor stocastici.

Deoarece acest complex are nevoie de o matrice stabilă care să poată găzdui cele mai bune

canale, două nanomateriale: nanocarbon și nanodiamant au fost alese pentru proiectarea

matricilor.

Partea experimentală

Reactivi și soluții

Amoxicilina (Amx), ampicilina (Amp), biotina, pudra de nanocarbon, pudra de

nanodiamond și complexul zinc protoporfirină IX au fost achiziționate de la Sigma Aldrich

(Milwaukee) și uleiul de parafină a fost cumpărat de la Fluka (Buchs, Elveția).

S-au preparat soluții stoc de Amx (3 mg/ml), Amp (3 mg/ml) și biotină (2,14 mg/ml).

Soluțiile stoc au fost diluate pînă la fg/ml. Soluțiile de antibiotice au fost păstrate la frigider la

temperatura de 2-8 ° C.

Prepararea probelor

Pentru validarea metodei propuse (screening-ul probei de apă folosind microsensorii

stocastici) au fost utilizate zece probe de apă reziduală analizată folosind o metodă standard

aprobată (metoda de screening microbian) pentru amoxicilină, ampicilină și biotină. Nu a fost

necesară prelevarea de probe înainte de analiza acestora cu ajutorul microsenzorilor stocastici.

Echipamente

Toate măsurătorile au fost efectuate utilizând un potențiostat/galvanostat PGSTAT

128 (Metrohm) conectat la o celulă cu trei electrozi și un computer prin intermediul unei

versiuni 4.9 de software Eco Chemie (Utretch, Olanda). Ca electrod de referință a fost utilizat

Ag/AgCl a și un fir de platină a fost folosit ca electrod auxiliar.

Construcția microsensorilor stocastici

Nanocarbonul (nC) și pudra de nanodiamant (nD) au fost amestecate cu ulei de

parafină pentru a forma pasta de nanocarbon omogenă (nCP) și pasta de nanodiamant (NDP).

Modificarea pastelor s-a realizatt folosind o soluție a complexului zinc protoporfirină IX (10-3

mol/L), adăugată într-un raport de 1: 1 (v/ w, µL/mg) la fiecare dintre paste . Pasta a fost

introdusă în tuburi de plastic cu diametrul intern de 150 μm. Pentru realizarea contactului

electric a fost introdus un fir de argint în pasta de grafen. Suprafața microsenzorilor a fost

clătită cu apă deionizată și uscată cu hârtie înainte de fiecare utilizare. Când nu sunt utilizați,

microsenzorii stocastici sunt depozitați la frigider la 4-8oC.

Modul Stocastic

Modul stocastic este bazat pe conductivitatea canalului. Au fost măsurate semnăturile

antibioticelor: amoxicilină, ampicilină și biotină (valori toff) și valorile ton pentru diagramele

înregistrate (Figura 1) folosind metodele cronoamperometrice. Toate măsurătorile s-au

efectuat la 125 mV și la 25ºC. Semnăturile identificate în diagramele antibioticelor au fost

utilizate pentru analizele calitative. Valorile ton au fost utilizate ca parametri cantitativi pentru

microsenzorii stocastici; 1/ton depindea de concentrațiile de AMX, AMP, biotină în consecință

cu ecuația: 1/ton = a+b x Concantibiotic, pentru fiecare microsenzor propus. Ecuațiile obținute au

fost utilizate pentru determinarea concentrațiilor necunoscute de AMX, AMP și biotină în

probele de apă.

Fig. 1 (a)

Fig. 1 (b)

Figura 1. Diagramele obținute pentru recunoașterea moleculară a amoxicilinei, ampicilinei

și biotinei în probe de apă folosind microsenzorii stocastici bazați pe complex zinc protoporfirină IX și

(a) pastă nanocarbon; (b) pastă de nanodiamant

Rezultate și discuții

Caracteristicile de răspuns ale microsenzorilor stocastici

Caracteristicile de răspuns ale microsenzorilor stocastici propuși sunt prezentate în tabelul 1.

Răspunsul microsenzorilor stocastici se face prin conductivitatea canalului; și este un proces care are

loc în două etape. În prima etapă, antibioticul a intrat in canal, blocându-l pentru o perioadă de timp

(timpul necesar pentru a intra în canal se numește semnătura antibioticului și este dat de valoarea toff).

În a doua etapă, procesele de legare și redox au avut loc în interiorul canalului-timpul necesar în care

au avut loc aceste procese a fost numit ton.

Semnături diferite (valori toff) au fost înregistrate pentru AMX, AMP și biotină pentru fiecare

microsenzor, acest lucru facilitând selectivitatea între cele trei tipuri de antibiotice atunci când a fost

efectuată analiză calitativă. Domeniile de concentrație liniară au acoperit o gamă largă de concentrații

pentru cele trei tipuri de antibiotice: între 0.3pg/ml și 3 ng/ml pentru AMX, între 0.3 pg/ml și 0.3 µg/ml

pentru AMP și între 0.214 și 2.14 pg/mL pentru biotină când s-a utilizat microsensorul bazat pe

nanocarbon și între 0.03 pg/mL și 0.3 µg/ml pentru AMX, între 0.3 pg/mL și 0.3ng/mL pentru AMP și

între 2.14 fg/mL și 0.214pg/mL pentru biotină când a fost utilizat microsensorul pe bază de

nanodiamant; aceste domenii acoperă concentrații foarte mici de antibiotice, făcând posibilă analiza lor

rapidă în probele de apă, în etapa în care pot fi curățate cu ușurință. Limitele de determinare mai mici

decât cele raportate folosind alte metode de analiză [1-7] au fost obținute folosind microsensorii

stocastici. Cele mai mici limite de determinare au fost obținute atunci când pudra de nanodiamant a fost

utilizat pentru proiectarea microsenzorului stocastic - acest lucru poate fi explicat prin structura fixă a

diamantului, demonstrând faptul că este capabil să își păstreze în forma lor inițială canalele formate de

agregatele moleculare ale complexului zinc protoporfirină.

Microsenzorii stocastici au fost folosiți mai mult de trei luni; valorile RSD (%) ale

sensibilităților au variat cu mai puțin de 0.83%. Cinci microsensori stocastici de fiecare tip au fost

construiți folosind metoda descrisă mai sus; caracteristicile de răspuns ale fiecărui microsenzor au fost

monitorizate timp de trei luni; o diferență de sensibilitate mai mică de 0.78% a fost înregistrată pentru

fiecare tip de microsenzor, dovedind faptul că microsenzorii au un design reproductibil.

Table 1. Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici utilizați pentru determinarea simultană a amoxicilinei, ampicilinei și biotinei.

Microsenzor bazat pe

complex de Zn PIX

Ecuația de calibrare și

coeficientul de corelare (r)

toff (s)

Domeniul linear de

concentrație

Sensibilitatea (s-1 pg-1 mL)

Limita de

determinare

AMX nCP 1/ton=0.03+4.00x10-

4xC; r=0.9999

1.3 0.3pg/mL – 3ng/mL

4.00x10-4 0.3pg/mL

nDP 1/ton=0.06+2.65x10-

3xC; r=0.9995

1.3 0.03pg/mL – 0.3µg/mL

2.65x10-3 0.03pg/mL

AMP nCP 1/ton=0.02+9.46x10-

3xC;

r=0.9998

0.7 0.3pg/mL – 0.3µg/mL

9.46x10-3 0.3pg/mL

nDP 1/ton=0.02+1.21x10-

3xC;

r=0.9969

0.7 0.3pg/mL – 0.3ng/mL

1.21x10-3 0.3pg/mL

Biotin nCP 1/ton=0.03+0.51xC;

r=0.9991 2.0 0.214-

2.14pg/mL 0.51 0.214pg/mL

nDP 1/ton=0.03+2.83x10-

4xC;

r=0.9976

2.0 2.14fg/mL – 0.214pg/mL

2.83x10-4 2.14fg/mL

*C este concentrația antibioticelor <C> = pg/mL; <ton> = s

Selectivitatea

Semnăturile (valorile toff) ale posibilelor specii de interferență dau selectivitatea

microsenzorilor. Pentru cele trei tipuri de antibiotice: AMX, AMP și biotină s-au înregistrat

semnături diferite utilizând microsenzorii propuși (Tabelul 1), ceea ce înseamnă că nici unul

nu interferă în analiza celuilalt. Au fost luate în considerare și alți interferenți posibili, cum ar

fi: bisfenoli, azotat, nitrit, cadmiu, plumb, zinc, melatonină, semnăturile lor aveau valori

diferite decât cele înregistrate pentru AMX, AMP și biotină, demonstreazând faptul că nu

interferă în determinarea antibioticelor.

Aplicații analitice

Probele de apă uzată au fost analizate folosind metoda de screening descrisă mai sus.

Analiza calitativă a fost realizată pe baza valorilor toff pentru a identifica semnăturile AMX,

AMP și biotină în diagramele înregistrate (Figura 1). Valorile ton corespunzătoare au fost citite

și concentrațiile de AMX, AMP și biotină au fost determinate conform metodei stocastice

descrisă mai sus. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2. Au fost observate corelații bune între

rezultatele obținute folosind senzorii stocastici propuși și metoda standard (metoda de

screening microbian). Valorile scăzute ale RSD,% au dovedit fiabilitatea ridicată a metodei de

screening propusă.

Table 2. Determinarea amoxicilinei, ampicilinei, și biotinei în probe de ape reziduale.

Probă

nr.

Microsenzor bazat pe complex de Zn

PIX

Gradul de recuperare AMX

(pg/mL) AMP

(pg/mL) Biotin

(pg/mL) 1 nCP 0.31±0.04 0.29±0.05 0.21±0.02

nDP 0.33±0.02 0.31±0.03 0.22±0.01 Standard Method 0.30 0.28 0.21

2 nCP 0.28±0.02 0.37±0.01 2.40±0.05 nDP 0.29±0.01 0.36±0.01 2.47±0.03

Standard Method 0.27 0.35 2.45 3 nCP 31.14±0.01 31.27±0.01 2.30±0.04

nDP 31.20±0.02 31.25±0.01 2.17±0.02 Standard Method 31.12 31.23 2.14

4 nCP 0.33±0.02 3.79±0.03 0.22±0.03 nDP 0.37±0.01 3.74±0.02 0.29±0.02

Standard Method 0.37 3.78 0.25 5 nCP 300.14±0.03 30.12±0.03 2.70±0.02

nDP 300.12±0.02 30.16±0.02 2.77±0.02 Standard Method 300.24 30.15 2.75

6 nCP 301.04±0.03 30.14±0.02 2.22±0.02 nDP 301.27±0.02 30.15±0.02 2.28±0.03

Standard Method 301.24 30.12 2.23 7 nCP 0.37±0.02 317.20±0.03 0.22±0.02

nDP 0.34±0.02 317.12±0.02 0.25±0.02 Standard Method 0.33 317.18 0.22

8 nCP 30.30±0.02 342.23±0.04 0.28±0.02 nDP 30.21±0.02 342.12±0.03 0.28±0.01

Standard Method 30.23 342.16 0.27 9 nCP 3.00±0.01 30.15±0.03 2.19±0.02

nDP 3.14±0.01 30.23±0.02 2.25±0.02 Standard Method 3.09 30.23 2.21

10 nCP 30.14±0.02 3.88±0.04 0.28±0.01 nDP 30.12±0.03 3.98±0.03 0.29±0.01

Standard Method 30.00 3.87 0.29 Metoda standard - metoda de screening microbian

.Concluzii

Pentru analiza antibioticelor au fost propuși doi microsenzori stocastici bazați pe

imobilizarea complexului zinc protoporfirină IX în pasta de nanocarbon și în pasta de

nanodiamant: amoxicilină, ampicilină și biotină în probe de apă. Microsenzorii propuși s-au

dovedit a fi fiabili pentru analiza simultană a celor trei tipuri de antibiotice în probele de apă.

Metoda a fost simplă, fiabilă și rapidă pentru analiza amoxicilinei, ampicilinei și biotinei la

concentrații foarte mici în probele de apă.

Bibliografie

1. MB Devani, T. Patel, TM Patel, Spectrophotometric determination of ampicillin and its

dosage forms, Talanta 1992, 39, 1391-1394.

2. O Opris, ML Soran, V Coman, F Copaciu, R Dumitru, Determination of some frequently

used antibiotics in waste water using solid phase extraction followed by high performance

liquid chromatography with diode array and mass spectrometry detection, Central

European J Chem, 2003, 11, 1343-1351.

3. Y. Tian, Y. Wang, S. Wu, Z. Sun, B. Gong, Preparation of ampicillin surface molecularly

imprinted polymers for its selective recognition of ampicillin in eggs samples, Int. J. Anal.

Chem. 2018, Article ID 5897381, 11 pages.

4. MAF Locatelli, FF Sodre, WF Jardim, Determination of antibiotics in Brazilian surface

waters using liquid chromatography – electrospray tandem mass spectrometry, Env.

Contam. Toxicol. 2011, 60, 385-393.

5. K. Xie, L. Jia, D. Xu, H. Guo, X. Xie, Y. Huang, X. Chen, W. Bao, G. Dai, J. Wang,

Simultaneous determination of amoxicillin and ampicillin in eggs by reversed-phase high-

performance liquid chromatography with fluorescence detection using pre-column

derivatization, J. Chromatogr. Sci. 2012, 50, 620-624.

6. P. Verma, M Gupta, P Parasher, Analytical method for the determination of ampicillin and

ciprofloxacin in the hospital wastewater, Res. Rev.J. 2018, 3, 97-99.

7. P. Raksawong, P. Nurerk, K. Chullasat, P. Kanatharana, O. Busskoed, A polypyrole doped

with fluorescent CdTe quantum dots and incorporated into molecularly imprinted silica for

fluorimetric determination of ampicillin, Microchim Acta, 2019, 186, 338.

8. RI Stefan-van Staden, RM Ilie, LA Gugoasa, C Stanciu-Gavan, Pattern recognition of p53

and KRAS in whole blood samples, J Electrochem Soc, 2019, 166, B183-B186.

9. RI Stefan-van Staden, I Popa-Tudor, Molecular Recognition of C-Reactive Protein,

Adiponectin and Zn2+ in Serum Samples, J Electrochem Soc, 2019, 166, B3051-B3055.

10. RI Stefan-van Staden, A. Lungu - Moscalu, J.F. van Staden, Nanostructured Materials

Used for Pattern Recognition of Bisphenols in Waste Waters, J Electrochem Soc, 166,

2019, B903-B907.

Electroanaliza bisfenolilor A, F și Z folosind microsenzorii stocastici pe bază de grafene

Introducere

Bisfenolii (BP) sunt un grup de substanțe chimice cu două grupari funcționale hidroxi [1]

utilizate pentru fabricarea materialelor din policarbonat și a rășinilor epoxidice [2-6].

Bisfenolul A (BPA) este utilizat pe scară largă pentru fabricarea de recipiente alimentare și

lichide, jucării, dispozitive medicale, materiale dentare și aparate de marcat [7-10]. Ulterior, au

fost sugerate restricții privind utilizarea BPA în anumite produse de consum [11-13], de

exemplu, Administrația pentru Alimente și Medicamente (FDA) din USA, precum și Comisia

Europeană au interzis utilizarea BPA la fabricarea cănilor si sticlelor pentru copii [11-14]. În

2018, Comisia Parlamentului European pentru mediu, sănătate publică și siguranță alimentară

a aprobat propunerea de a reduce limita specifică de migrație (SML) aplicabilă plasticelor,

precum si a altor surse de BPA de la 0.6 mg/kg la 0.05 mg/kg [14]. În prezent, în UE există o

limită a cantității de BPA pentru jucării pentru copiii mai mici de trei ani și pentru orice tip de

jucărie destinată a fi plasată în gură de către copii. In acest caz, limita de migrare a BPA a fost

stabilită la 0.04 mg / kg. [14]. Erica Danzl și colaboratorii [15] au realizat primul raport

privind biodegradarea BPF în apa de mare și susține concluziile lui Sakai si a grupului [16]

precum și Ying și Kookana [17] că BPF este biodegradabil în apa de mare. Datorită creșterii

restricțiilor în utilizarea BPA în contactul cu alimentele [18-21], industria plastică și a

conservarii se mișcă rapid pentru a căuta substanțe chimice alternative care să înlocuiască BPA

în multe aplicații. BPF și BPZ au fost dezvoltate ca alternative la BPA și au înlocuit utilizarea

BPA în rășinile epoxidice, materiale plastice, hârtie termică și ambalaje de hârtie pentru

alimente. Bisfenolii A, F și Z și analogii săi sunt considerați substanțe chimice perturbatoare

endocrine (EDC) fiind un grup de substanțe care pot interfera cu sistemele endocrine umane

sau animale și pot provoca efecte negative asupra sănătății [22]. Expunerea la bisfenoli nu se

limitează la oameni, iar efectele asupra vieții sălbatice prin aprovizionarea cu apă contaminată

au fost dovedite la mai multe specii [23-30]. BPA este eliberat în principal în mediu în apele

uzate provenite din echipamente industriale care produc materiale plastice și depozite de

deșeuri [31]. Ca urmare a utilizării extinse a BPA, multe studii au raportat apariția sa în mediu,

astfel: aer [33], apă [33], sol [34], reziduuri [35] și țesuturi umane [36].

Există o mare nevoie de monitorizare și control a bisfenolilor în mediul acvatic. O serie de

metode au fost descrise de literatura de specialitate pentru cuantificarea bisfenolilor, și anume:

HPLC cuplată cu UV [37], LC-MS/MS, [38,39], GC-MS [40] sau metode electrochimice [41].

In tabelul 1 sunt prezentate cele mai bune limite de determinare raportate până în prezent în

literatura de specialitate [42-47]. Necesitatea unei analize rapide la fața locului, a

concentrațiilor scăzute de substanțe organice periculoase în probele de apă a crescut pentru a

preveni acumularea lor în ape. Senzorii electrochimici au fost, de asemenea, propuși pentru

analiza BPA [48-50].

Tabel 1. Limite de determinare pentru bisfenolii A, F si Z din literatura.

Sursa probei de apă Bisfenolii Metoda Limita de detectie

Ref.

Apa de băut,

apa de la robinet, apa din lac

BPA, BPF UPLC-ESI (-)-MS/

MS(MRM)

0.25ng/mL [42]

Apa de râu BPA, BPF LC-UV-VIS 2.5pg/mL [43]

Apa de râu BPA

LC-ESI(-)-MS/MS(SRM)

5.7pg/mL [44]

Apa de râu BPA, BPF

UPLC-ESI (-)-MS/

MS(MRM)

20pg/mL [45]

Apa de râu BPA, BPF LC-FD 30pg/mL [46]

Apa de râu, rezervor de apă potabilă

BPA, BPF, BPZ

LC-ESI(-)-MS/MS(MRM)

0.1pg/mL [47]

Senzorii stocastici sunt singurii senzori electrochimici capabili să efectueze o analiză fiabilă

calitativă și cantitativă a cantităților mici de analit din probe complexe, cum ar fi probele de

apă, fără a efectua nicio prelucrare a acestora (acesta este un avantaj față de metodele

cromatografice si optice). Până în prezent, acestea au fost utilizate pentru analiza diferitelor

substanțe din mediu, alimente și probe biologice [26, 51, 52].

Lucrarea propune doi microsenzori stocastici pe baza de nanografena și pasta de oxid de

grafen redus prin imobilizarea complexului dintre protoporfirină IX și cobalt pentru

identificarea și cuantificarea simultană a bisfenolilor A (BPA), F (BPF) și Z (BPZ) din probe

de apă. Noutatea lucrării constă în analiza simultană calitativă și cantitativă a celor trei

bisfenoli folosind același instrument - microsenzori stocastici pe baza de materiale noi. Pentru

senzorii stocastici, este nevoie de canale stabile și, prin urmare, s-a ales complexul

protoporfirină IX cu cobalt (protoporfirina IX este bine cunoscută pentru formarea agregatelor

moleculare stabile, iar cobaltul pentru îmbunătătirea conductivitatii). Mai mult, nanografena a

fost selectată pentru a crește suprafața activă a microsensorului, în timp ce oxidul de grafen

redus a fost utilizat pentru îmbunătățirea conductivitatii.

Bisfenol A

Bisfenol F

Bisfenol Z

Figura 1. Structurile bisfenolilor A, F si Z.

2 Experimental

2.1 Reactanti si solutii

Bisfenol A, BPA (2,2-Bis (4-hidroxifenil) propan), bisfenol F, BPF (Bis (4-hidroxifenil)

metan), bisfenol Z, BPZ (1,1-Bis (4-hidroxifenil) -ciclohexan)), dimetilsulfoxidul, oxidul de

grafena redus și complexul protoporfirinei IX cu cobalt au fost achiziționate de la Sigma

Aldrich (Milwaukee) iar uleiul de parafină a fost cumpărat de la Fluka (Buchs, Elveția).

Nanografena a fost achizitionata de la SkySpring Nanomaterials Inc. (SSNANO, SUA).

Soluția stoc de 10-2 mol/L BPA, BPF și BPZ au fost obținute prin dizolvarea cantității necesare

în dimetilsulfoxid. Soluțiile standard de lucru 10-3–10-15 mol/L s-au preparat din soluția stoc

utilizând metoda dilutiilor succesive. Soluțiile etalon au fost depozitate la frigider la 2–8°C.

2.2 Probe

Zece probe de apă reziduala cu concentrații diferite de BPA, BPF și BPZ, determinate folosind

metoda standard aprobata (LC-ESI(-)-MS/MS(MRM) [47]), bazata pe cromatografia de

lichide a fost utilizată pentru validarea metodei propuse bazată pe screeningul probelor de apă

folosind microsensorii stochastici. Nu s-a făcut eșantionare înainte de testarea screening-ului

cu ajutorul microsenzorilor stocastici, pentru probele de apă, deoarece acești microsenzori au

fost capabili să efectueze analiza calitativă și cantitativă la nivele foarte joase de poluanți din

probe complexe.

2.3 Echipament

Toate măsurătorile au fost înregistrate utilizând un PGSTAT 302 potentiostat/galvanostat

(Metrohm) conectat la o celula cu trei electrozi și conectat la un computer prin intermediul

unui Eco Chemie (Utretch, Olanda) versiunea software 4.9. Electrodul Ag/AgCl a servit ca

electrod de referință iar un fir de platină a servit ca electrod auxiliar.

2.4 Design-ul microsenzorilor stochastic

Nanografena (nGr) și pulberea de oxid de grafena resusa (rGO) au fost amestecate cu ulei de

parafină pentru a forma o pasta omogena. O soluție a complexului dintre protoporfirina IX și

cobalt (10-3 mol/L) au fost adăugate la fiecare pastă în a raport de 1: 1 (v/w, µL/mg) pentru a

forma două paste de grafene modificate. Fiecare pastă a fost plasată într-un tub de plastic

având un diametrul intern de 125 µm. Contactul electric a fost obținut prin introducerea unui

fir de argint în pasta de grafena. Inainte de la fiecare măsuratoare, suprafața microsensorului a

fost spălata cu apă deionizată. Când nu au fost utilizati, microsenzorii stochastic au fost

depozitați la frigider la 4–8°C.

2.5 Modul stochastic

Modul Stocastic se bazează pe măsurarea semnături bisfenolului A, F și Z (valori de toff) și ton

valori asociate pentru diagramele înregistrate (Figura 2) folosind metoda cronoamperometrică.

Măsurătorile au fost realizate la un potențial constant de 125 mV. De asemenesea, s-a bazat pe

analiza calitativă a bisfenolilor A, F și Z. Valorile ton au fost utilizate pentru a determina

parametrul cantitativ al microsensorii stochastici; 1/ton depinde de concentrații de BPA, BPF

sau BPZ în consecință cu ecuație: 1/ton=a +b˟Concbisfenoli, pentru fiecare microsensor propus.

Concentrațiile necunoscute de PBA, PBF și PBZ au fost determinate folosind ecuația de

calibrare pentru fiecare microsensor al bisfenolul corespunzător. Toate măsurătorile au fost

efectuate la 25̊ C.

3 Rezultate si discutii

3.1 Raspunsul caracsteristica al microsezorilor stochastic

Caracteristicile de răspuns ale microsenzorilor stochastic propusi au fost determinate utilizând

metoda stocastic. Răspunsul microsensorilor poate fi explicat folosind conductivitatea

canalului; procesul are loc în două etape: în primul pas, bisfenolul a blocat la intrarea în canal

pentru o perioadă de timp, numita semnătura bisfenolului (valoare toff); iar în a doua etapă,

procesele redox (proces de oxidare) și legare pe canal au avut loc în interiorul canalului,

această etapă fiind caracterizat prin valoarea ton.

Caracteristicile de răspuns ale microsensorilor stocastici proiectati pentru analiza BPA, BPF și

BPZ sunt prezentate în Tabelul 2. Au fost înregistrate diferite semnături (valori toff) pentru

BPA, BPF și BPZ pentru fiecare dintre senzori. Acest fapt a ajutat la indentificarea celor trei

bisfenoli in momentul efectuarii analizei calitative. Domeniul liniar de concentratie a acoperit

un domeniu larg de concentrații pentru cei trei bisfenoli: între 10-15 și 10-5 mol/L pentru BPA,

între 10-15 și 10-7 mol/L pentru BPF, și între 10-13 și 10-10 mol/L pentru BPZ, acestea intervale

acoperă concentrațiile de bisfenoli regăsițe de obicei în probele de apă, si anume: pentru BPA

10-12–10-8 mol/L, pentru BPF 10-13–10-9 mol/L, și pentru BPZ 10-13–10-11 mol/L, [42-47]

facilitând testarea rapidă și determinarea în probele de apă. Limitele de detectie sunt mai mici

decât cele raportate până în prezent (tabelul 1), facilitând determinarea lor la o concentrație

foarte mică in probele de apă. Pentru analiza BPA, mai mică limita de detectie a fost

înregistrată pentru microsensorul pe baza de nGr, pentru analiza BPZ, cea mai mică limită de

detectie s-a obținut utilizand microsensorul pe baza de rGO, în timp ce pentru analiza BPF

ambii senzori au prezentat o limita de detectie egala cu 1fmol/L. Sensibilitatea lor a fost foarte

mare pentru ambii senzori, cel mai buna sensibilitate fiind înregistrata pentru senzorul pe bază

de nanografena; acesta poate să fie explicata pe baza suprafeței active crescute a microsenzorul

pe baza de nanografena.

Tabel 2. Raspunsurile caracteristice ale microsenzorilor stichastici folositi in determinarea simultana a bisfenolilor A, F si Z.

Microsensor pe baza de complex a PIX cu Co

si

Ecuatia de calibrare* toff (s) Domeniul linear de

concentratie (mol/L)

Sensibilitate (s-1/mol L-1)

Lim de (m

BPA nGr 1/ton=0.04+4.70x107xC;

r=0.9988 2.5 10-15-10-8 4.70x107 1

rGO 1/ton=0.02+6.44x109xC; r=0.9999

2.1 10-13-10-5 6.44x109 1

BPF nGr 1/ton=0.03+6.51x109xC;

r=0.9962 1.4 10-15-10-7 6.51x109 1

rGO 1/ton=0.03+3.16x109xC;

r=0.9999 1.4 10-15-10-7 3.16x109 1

BPZ nGr 1/ton=0.02+7.62x109xC;

r=0.9979 2.2 10-13-10-11 7.62x109 1

rGO 1/ton=0.05+2.04x108xC;

r=0.9997 2.8 10-14-10-10 2.04x108 1

Pentru determinare BPA, BPF și BPZ s-au utilizat microsensorii stochastici pe o peroadamai

mare de șase luni, iar valorile RSD (%) ale sensibilităților au variat cu mai puțin de 1,00%.

Trei microsensori stochastici de fiecare tip au fost proiectati folosind metoda de propusă;

pentru fiecare microsensor au fost determinate caracteristicile de raspuns timp de o luna;

obtinandu-se o diferență față de sensibilitate mai mică de 1,00%, comparativ cu valorile

înregistrate pentru fiecare microsensor în această perioadă; dovedind ca modul de preparare al

microsensorul este reproductibil.

3.2 Selectivitatea

Pentru microsensorii stochastici, selectivitatea este dată de semnăturile (valorile toff) speciilor

interferente posibile; obtinandu-se valori diferite de toff ale speciilor analizate inseamna ca

acestea nu interfera. În primul rând,au fost obtinute valori toff diferite pentru cei trei bisfenoli:

A, F, și Z dovedind că niciunul dintre ei nu intervine în analiza celuilalt. Alte specii cu caracter

interferect posibil ar fi: anionul nitrat, nitrit, cadmiu, plumb, zinc, melatonină si fenol au fost

luate în considerare; semnăturile lor erau cu mult diferite de semnături înregistrate pentru

indentificarea bisfenolilor A, F și Z, atfel ca acestia nu au intervenit în determinarea celor trei

bisfenoli.

3.3. Aplicații analitice

Folosind microsenzorii stocastici propuși, zece probe de apă menajeră au fost supuse unor teste de

screening. De pe diagramele obținute (Figura 2), prima dată au fost interpretate valorile toff , pentru a

identifica semnăturile BPA, BPF și BPZ. După identificarea acestor valori, au fost interpretate valorile

ton și potrivit cu procedura descrisă în paragraful despre modul stocastic, au fost determinate

concentrațiile pentru BPA, BPF și BPZ. Rezultatele se regăsesc in Tabelul 3. Au fost observate corelări

bune între rezultatele obținute folosind senzorii stocastici propuși și cele ale metodelor standard

(cromatografie de lichid/spectometrie de masă). De asemenea, valorile RSD% au demonstrat o precizie

crescută și exactitatea microsenzorilor stocastici propuși.

Tabel 3. Determinarea BPA, BPF si BPZ din probe de apa.

Proba n.

Microsensor pe baza de complex a PIX cu

Co

Recuperare bisfenol A (ng/L) F (g/L) Z (pg/L)

1 nGr 0.25±0.02 196.31±0.05 26.98±0.08 rGO 0.26±0.06 198.42±0.07 27.21±0.09

Standard Method 0.23 200.24 26.83 2 nGr 227.96±0.04 998.12±0.04 130.12±0.14

rGO 228.00±0.03 997.16±0.09 129.59±0.12 Standard Method 228.29 1001.2 134.18

3 nGr 23.16±0.08 995.47±0.04 215.00±0.10 rGO 23.95±0.05 997.12±0.08 214.97±0.09

Standard Method 22.83 998.14 214.68

4 nGr 1.44±0.07 160.43±0.03 20.95±0.05 rGO 1.39±0.03 158.12±0.12 19.87±0.13

Standard Method 1.14 160.19 21.46 5 nGr 13.65±0.10 772.93±0.03 240.95±0.08

rGO 16.00±0.08 784.14±0.08 243.47±0.12 Standard Method 15.98 775.63 241.52

6 nGr 0.48±0.07 9.81±0.08 11.07±0.08 rGO 0.45±0.03 9.47±0.13 12.29±0.14

Standard Method 0.46 10.12 10.73 7 nGr 158.80±0.09 158.75±0.09 183.23±0.10

rGO 157.73±0.08 163.24±0.12 180.47±0.12 Standard Method 159.80 160.19 187.84

8 nGr 0.13±0.07 0.09±0.02 23.93±0.04 rGO 0.14±0.03 0.08±0.01 24.20±0.08

Standard Method 0.14 0.10 24.15 9 nGr 1.73±0.03 82.04±0.03 21.85±0.14

rGO 1.70±0.07 81.48±0.12 20.98±0.08 Standard Method 1.60 80.00 21.73

10 nGr 2.53±0.07 22.20±0.07 108.07±0.05 rGO 2.57±0.05 21.94±0.12 110.07±0.08

Standard Method 2.28 20.04 107.34

Fig. 2 (a)

Fig. 2 (b)

Figura 2. Diagrame obtinute pentru recunoasterea bisfenolilor A, F si Z in probe de apa folosind

microsenzorii stochastici pe baza de (a) nanografena; (b) oxid de grafena redus.

4. Concluzii

Doi microsenzori stocastici pe bază de pudră de nanografena și oxid de grafena redus, modificați

folosind un complex de protoporfirină IX și cobalt, au fost utilizați pentru a diferenția BPA, BPF și

BPZ din probe de apă și pentru a-i cuantifica. Microsenzorii stocastici propuși s-au dovedit a fi fiabili

în ceea ce privește analiza simultană a BPA, BPF și BPZ, datorită sensibilității ridicate și a limitelor

mai mici de detecție (mai bune decât cele raportate până în prezent) și rezultatele obținute au fost

corelate foarte bine cu cele obținute folosind metoda standard bazată pe cromatografia de lichide. S-a

dovedit că metoda este fiabilă, rentabilă, rapidă și simplă în ceea ce privește cuantificarea bisfenolilor

A, F și Z în probele de apă.

Referinte

11. M.Y. Chen, M. Ike, M. Fujita, Environ Toxicol. 2002, 17, 80-86.

12. L.N. Vandenberg, R. Hauser, M. Marcus, N. Olea, W.V. Welshons, Reprod. Toxicol. 2007,

24, 139–177.

13. C. Liao, K. Kannan, J Agric Food Chem. 2013, 61, 4655-4662.

14. L.N. Vandenberg, T. Colborn, T.B. Hayes, J.J. Heindel, D.R. Jacobs Jr., D.H. Lee, T.

Shioda, A.M. Soto, F.S. vom Saal, W.V. Welshons, R.T. Zoeller, J.P. Myers, Endocr. Rev.

2012, 33, 378−455.

15. L.N. Vandenberg, I. Chahoud, J.J. Heindel, V. Padmanabhan, F.J. Paumgartten, G.

Schoenfelder, Environ Health Perspect. 2010, 118, 1055–1070.

16. T. Geens, D. Aerts, C. Berthot, J.P. Bourguignon, L. Goeyens, P. Lecomte, G. Maghuin-

Rogister, A.M. Pironnet, L. Pussemier, M.L. Scippo, J. van Loco, A. Covaci, A. Food

Chem. Toxicol. 2012, 50, 3725−3740.

17. A. Ballesteros-Gomez, S. Rubio, D. Perez-Bendito, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 449–

469.

18. E.J. Hoekstra, C. Simoneau, Rev. Food Sci. Nutr., 2013, 53, 386–402.

19. C. Simoneau, L. van den Eede, S. Valzacchi, Food Addit. Contam. Part A, 2012, 29, 469–

480.

20. C. Simoneau, S. Valzacchi, V. Morkunas, L. van den Eede, Food Addit. Contam,. Part A

2011, 28, 1763–1768.

21. U.S. Food and Drug Administration (FDA). Bisphenol A (BPA) in Food Contact

Application, 2012; available from

http://www.fda.gov/newsevents/publichealthfocus/ucm064437.htm (accessed Oct 27,

2018)

22. National Conference of State Legislatures (NCSL). NCSL Policy Update: State

Restrictions on Bisphenol A (BPA) in Consumer Products, 2012; available from

http://www.ncsl.org/issues-research/env-res/policy-update-on-state-restrictions-on-

bisphenol-a.aspx (accessed Oct 20, 2018).

23. European Commission (EC). Amending Directive 2002/72/EC as regards the restriction of

use of Bisphenol A in plastic infant feeding bottles, 2011; available from http://eur-

lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:026:0011:0014:EN:PDF

(accessed Oct 20, 2018).

24. https://echa.europa.eu/ro/hot-topics/bisphenol-a (accessed Oct 27, 2018)

25. E. Danzl, K. Sei, S. Soda, M. Ike, M. Fujita, Int. J. Environ. Res. Public Health 2009, 6,

1472-1484

26. K. Sakai, H. Yamanaka, K. Moriyoshi, T. Ohmoto, T. Ohe, Biosci. Biotechnol. Biochem.

2007, 71, 51-57.

27. G.G. Ying, R.S. Kookana, Envrion. Sci. Technol. 2003, 37, 1256-1260.

28. EC, Commission Directive 2011/8/EU of 28 January 2011 amending Directive2002/72/EC

as regards the restriction of use of Bisphenol A in plastic infant feeding bottles, Off. J. Eur.

Union L26, 2011, 11–14.

29. France, Regulation No 1442/2012 of 24 December 2012 aiming at banningthe

manufacture, import, export and commercialisation of all forms of foodpackaging

containing bisphenol A, Off. J. French Republic, 2012, text 2 of 154.

30. FDA, Indirect food additives: polymers, Fed. Regist., 77, 2012, 41899–41902.

31. FDA, Indirect food additives: adhesives and components of coatings, Fed. Regist.78, 2013

41840–41843.

32. C. Huang, L.H. Wu, G.Q. Liu, L. Shi, Y. Guo, Arch Environ Contam Toxicol. 2018, 75,

224-235.

33. D.A. Crain, M. Eriksen, T. Iguchi, S. Jobling, H. Laufer, G.A. LeBlanc, L. Guillette, J.

Reprod. Toxicol. 2007, 24, 225–239.

34. M.V. Maffini, B.S. Rubin, C. Sonnenschein, A.M. Soto, Mol. Cell. Endocrinol., 2006, 25,

254–255.

35. F.S. vom Saal, B.T. Akingbemi, S.M. Belcher, L.S. Birnbaum, D.A. Crain, M. Eriksen, F.

Farabollini, L.J. Guillette, R. Hauser, J.J. Heindel, S.M. Ho, P.A. Hunt, T. Iguchi, S.

Jobling, J. Kanno, R.A. Keri, K.E. Knudsen, H. Laufer, G.A. LeBlanc, M. Marcus, J.A.

McLachlan, J.P. Myers, A. Nadal, R.R. Newbold, N. Olea, G.S. Prins, C.A. Richter, B.S.

Rubin, C. Sonnenschein, A.M. Soto, C.E. Talsness, J.G. Vandenbergh, L.N. Vandenberg,

D.R. Walser-Kuntz, C.S. Watson, W.V. Welshons, Y. Wetherill, R.T. Zoeller, Reprod.

Toxicol., 2007, 24, 131–138.

36. R.I. Stefan-van Staden, L.A. Gugoasa, B. Calenic, J.F. van Staden, J. Legler, Anal. Chem.

Res. 2014, 1, 1–7.

37. D.P. Mohapatra, S.K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, Chemosphere, 2010, 78, 923–

941.

38. J. Ashby, Env. Health Perspect. 2001, 109, 1091-1094

39. I.F.H. Purchase, Toxicology 2004, 202, 1–20.

40. F.S. vom Saal, C. Hughes, Environ Health Perspect. 2005, 113, 926–933.

41. A.V. Krishnan, P. Stathis, S.F. Permuth, L. Tokes, D. Feldman, Endocrinology 1993, 132,

2279-2286.

42. P. Fu, K. Kawamura, Environ.Pollut. 2010, 158, 3138–3143.

43. T. Suzuki, Y. Nakagawa, I. Takano, K. Yaguchi, K. Yasuda, Environ. Sci. Technol. 2004,

38, 2389–2396.

44. M.R. Burkhardt, R.C. ReVello, S.G. Smith, S.D. Zaugg, Anal. Chim. Acta , 2005, 34, 89–

100.

45. C. Liao, F. Liu, H.B. Moon, N. Yamashita, S. Yun, K. Kannan, Environ. Sci. Technol.

2012, 46, 11558–11565.

46. C. Liao, F. Liu, Y. Guo, H.B. Moon, H. Nakata, Q. Wu, K. Kannan, Environ. Sci. Technol.

2012, 46, 9138–9145

47. M. Rezae, Y. Yamini, S. Shariati, A. Esrafili, M. Shamsipur, J. Chromatogr. A, 2009,

1216, 1511-1514.

48. A. Cariot, A. Dupuis, M. Albouy-Llaty, B. Legube, S. Rabouan, V. Migeot, Talanta, 2012,

100, 175-182.

49. A. Khedr, J. Chromatogr. B, 2013, 930, 98-103.

50. A. Zafra, M. del Olmo, M. Beatriz Suárez, E. Hontoria, A. Navalón, J.L. Viìlchez, Water

Res., 2003, 37, 735-742.

51. W. Huang, Bull. Korean Chem. Soc., 2005, 26, 1560-1564.

52. X.M. Shan, D.H. Shen, B.S. Wang, B.B. Lu, F.Y. Huang, Biomed. Environ. Sci., 2014, 27,

471-474.

53. J. Yin, Z. Meng, Y. Zhu, M. Song, H. Wang, Anal. Meth., 2011, 3, 173-180.

54. H. Gallart-Ayala, E. Moyano, M.T. Galceran, J. Chromatogr.A , 2010, 1217, 3511-3518.

55. Y. Yang, L. Lu, J. Zhang, Y. Yang, Y. Wu, B. Shao, J. Chromatogr. A, 2014, 1328, 26-34.

56. A. Ballesteros-Gomez, F.J. Ruiz, S. Rubio, D. Perez-Bendito, Anal. Chim. Acta, 2007, 603,

51-59.

57. E. Yamazaki, N. Yamashita, S. Taniyasu, J. Lam, P.K.S. Lam, H.B. Moon, Y. Jeong, P.

Kannan, H. Achyuthan, N. Munuswamy, K. Kannan, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2015, 122,

565-572.

58. S. Güney, O. Güney, Electroanalysis, 2017, 29, 2579-2590.

59. K. Varmira, M. Saed-Mocheshi, A.R. Jalalvand, Sens. Bio-Sens. Res., 2017, 15, 17-33.

60. X. Dong, X. Qi, N. Liu, Y. Yang, Y. Piao, Sensors, 2017, 17, 836; doi:10.3390/s17040836

61. R.I. Stefan-van Staden, L.A. Gugoasa, B. Calenic, J. Legler, J. Sci. Rep., 2014, 4, 5579,

DOI:10.1038/srep05579

62. R.I. Stefan-van Staden, I. Moldoveanu, C. Surdu-Bob, C. Stanciu-Gavan, C. RSC Adv.,

2014, 4, 54140 – 54143.