/ . Embryol. cxp. Morph., Vol. 13, Part 3, pp. 327-339, June 1965Printed in Great Britain

Etude au microscope electronique de la reactioncorticale

I. La reaction corticale de fecondation chezParacentrotus et sa chronologic

II. La reaction corticale de l'oeuf vierge deSabellaria alveolata.

par JEAN J. PASTEELS1

Laboratoire d'Embryologie, Faculte de Medecine, Universite de Bruxelles

AVEC DEUX PLANCHES

INTRODUCTION

LA reaction corticale de fecondation est bien connue chez les Oursins et lesPoissons, ayant ete exploree sur le vivant, par l'experience, sur coupes et, dumoins chez les Oursins, au microscope electronique. 11 s'agit pour cette dernieretechnique d'observations faites sur des Oursins divers par Afzelius (1956),Wolpert et Mercer (1960), Endo (1961), Balinsky (1961). II y a lieu d'y ajouter letravail recent de Baxandall, Perlmann et Afzelius (1964) dans lequel ces auteursdecrivent, chez Paracentrotus, les modalites du soulevement de membrane,observees au microscope electronique, sous Faction d'anticorps.

Les conclusions de ces auteurs, a part celles de Balinsky, concordent a quelquesnuances pres: l'espace perivitellin est constitue par l'eclatement des granulescorticaux dont le contenu renforce la membrane vitelline (en la transformant en'membrane de fecondation') et forme aussi la couche hyaline; le plasmolemme deToeuf feconde est constitue partiellement par la surface profonde des alveoleseclates, partiellement par les parties du plasmolemme initial intercalees entre lesalveoles.

Tandis que Wolpert et Mercer decrivent chez Psammechinus une delaminationdu plasmolemme initial en deux couches, dont la superficielle serait soulevee etrenforcee par le contenu des alveoles corticaux, Afzelius et Endo estiment quela membrane 'vitelline' preexiste, intimement appliquee sur le plasmolemme deroeuf vierge, tout en restant distincte, et que c'est cette membrane preexistante quiest soulevee par le contenu des vacuoles.

1 Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie, Faculte de Medecine, 97 Rue aux Laines,Bruxelles l,Belgique.

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Toute differente est Interpretation de Balinsky (1960). Se basant sur desobservations faites sur Tripneustes gratilla, cet auteur conclut que l'espaceperivitellin resulterait d'une abrasion de l'ensemble des vacuoles corticaux auniveau de leur equateur. Toute la couche comprenant leur troncon apical ycompris les ponts qui les separent ainsi de l'ensemble du plasmolemme initialformeraient la membrane de fecondation, le plasmolemme de l'oeuf fecondeserait ainsi integralement neoforme, derivant de la jonction des segments basauxdes parois des alveoles.

II parait peu vraisemblable d'expliquer ces divergences en fonction des differ-ences specifiques. II parait bien plus plausible d'invoquer des difficultes d'inter-pretation resultant de conditions techniques insuffisantes. La fixation des oeufsmarins pose des problemes serieux; en particulier ni les figures de Balinsky nicelles d'Endo ne nous paraissent avoir de valeur demonstrative. Celles deWolpert et Mercer sont nettement meilleures; toutefois leurs images de delamina-tion du plasmolemme initial laissent place a la critique.

Ces contradictions nous avaient incite a reprendre cette etude qui etait termineeau moment ou a paru le travail de Baxandall, Perlmann et Afzelius (1964) sur lameme espece Paracentrotus lividus. Bien qu'il s'agisse d'oeufs actives, les clichesde reaction corticale qu'ils publient correspondent exactement a nos propresresultats II en resulte qu'une iconographie nouvelle serait superflue, d'autantplus que nous l'avons deja publiee dans une revue d'ensemble (Pasteels, 1965).Nous nous bornerons done, sur ce point, a l'expose succinct de nos resultats .

Toutefois, en ce qui concerne la chronologie de la reaction corticale, nouscroyons avoir pu apporter des precisions nouvelles La facon dont les gametesont ete mis en presence dans nos experiences, si elle provoque la polyspermie, al'avantage de nous assurer d'un debut de fecondation de tous les oeufs endeansles 10 premieres secondes. Ceci nous permettra d'etudier les modifications destructure eventuelles de la phase dite 'latente' (Allen, 1958) de la reactioncorticale, celle qui precede le soulevement de membrane et qui se caracterise pardes modifications optiques (visibles sur fond noir et au microscope polarisant)observables sur le vivant.

La reaction corticale des Echinodermes, des Poissons, etc, n'a ete que tropsouvent generalisee. Nous avons deja eu l'occasion (Pasteels, 1962; Pasteelset de Harven, 1963) de critiquer cette attitude de la plupart des embryologistes enmontrant que cette reaction corticale est inexistante (du moins dans ses manifes-tations morphologiques) dans bon nombre d'especes, dont les MollusquesBivalves constituent un excellent exemple. Dans une revue d'ensemble (1962)nous notions egalement que certains oeufs, dont ceux du Polychete Sabellariasoulevent une membrane a l'etat vierge au moment de la ponte et du premiercontact avec l'eau de mer.

Ce soulevement de membrane de l'oeuf vierge de Sabellaria s'opere-t-il suivantle meme mecanisme que celui de l'oeuf feconde des Echinodermes ? Telle est laderniere question a laquelle nous pourrons repondre dans ce travail.

La reaction corticale 329

MATERIEL ET TECHNIQUES

MaterielParacentrotus lividus et Sabellaria alveolata. Ces animaux ont ete recoltes a

Roscoff et conserves ensuite dans l'aquarium de notre Laboratoire. Noustenons a remercier vivement le Professeur G. Teissier, Directeur du Laboratoirede Zoologie de Roscoff et son Chef de Travaux, M. Deroux, de nous avoir procurece materiel.

FixationSolution a 1 % d'0s04 dans de l'eau de mer, ramenee ensuite au pH 7,4. Pour

les oeufs de Paracentrotus, nous avons procede comme suit: des lots d'oeufsvierges avec le moins d'eau de mer possible ont ete places dans des tubes contenantau prealable un exces de sperme extrait directement des testicules a la pipette;des fixations ont ete faites apres des intervalles de 10, 20, 30, 60, 90 et 120 sec.Pour Sabellaria, nous avons fixe: (a) des oeufs vierges au sortir de la cavitecoelomique; (b) des oeufs vierges ayant sejourne dans de l'eau de mer apresdes intervalles variant entre 5 sec. et 45 min.; (c) des oeufs fecondes, a des inter-valles varies apres la fecondation.

Microscopie electroniqueInclusion du methacrylate de butyle et de methyle (8/2). Les coupes ont ete

* colorees' a l'acetate d'uranyle, ensuite au plomb suivant la methode de Reynolds(1963), puis examinees au microscope Siemens 'Elmiskop F.

OBSERVATIONS

Le mecanisme du soulevement de membrane de fecondation chez Paracentrotuslividus et sa chronologie

L'oeuf vierge porte de courtes villosites (0,15 a 0,30 /z), epaisses, assez reguliere-ment ecartees a des intervalles de 0,1 a 0,3 JU, s'enfoncant perpendiculairementdans le mucus periovulaire. Le contour de l'oeuf est constitue par un plasmo-lemme simple, sans indication de membrane 'vitelline' distincte.

Immediatement sous la surface de l'oeuf, separes du plasmolemme par unemince bande de cytoplasme, se trouvent les alveoles corticaux. Chacun estcirconscrit par une membrane de meme aspect que le plasmolemme. Us sontspheriques, leur diametre etant de 0,60 a 0,75 /x. Us sont ranges en une seulecouche et juxtaposes avec une certaine irregularite, les ponts cytoplasmiques quiles separent pouvant etre lineaires, mais pouvant parfois atteindre la largeurd'un alveole. Us sont entierement remplis d'un materiel peu dense et qui peutetre decrit sous forme d'une lame granulaire repliee plusieurs fois sur elle-memeet dont les couches successives sont empilees.

Dix secondes apres la fecondation (dans les conditions ou nous avons opere!)le contact est deja realise entre les gametes, le sommet du tubule acrosomial duspermatozoide etant accole au plasmolemme ovulaire sans qu'il y ait encore de

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fusion entre les deux gametes. A ce premier contact avec le spermatozoidecorrespond un debut de reaction corticale morphologiquement decelable: lesalveoles sont gonfles, visiblement imbibes, leur diametre ayant double (1 a 5 /x).

L'etape ulterieure de la reaction peut s'observer a 20 sec. (avec des variantesindividuelles, certains oeufs etant plus precoces, d'autres plus tardifs). Lesalveoles corticaux, prealablement dilates ont creve le mince pont cytoplasmiquequi les separe de la surface de l'oeuf (et qui comprend le plasmolemme!) et leurcontenu fait hernie contre un mince lisere, moins dense et moins epais que leplasmolemme et qui peut etre considere comme une membrane vitelline. Nousn'avons aucune indication nous permettant d'affirmer que cette mince membraneresulte d'une delamination du plasmolemme et il nous parait plus vraisemblablede la considerer comme la couche profonde du mucus periovulaire, intimementappliquee sur le plasmolemme et, de ce fait, non visible sur l'oeuf vierge.

L'etape ulterieure apparait, suivant les oeufs, dans les lots fixes de 20 a 40 sec.apres fecondation. La plupart des alveoles sont eclates. La membrane vitellines'est soulevee davantage et, a sa face profonde est venu s'accoler une partie ducontenu des alveoles ouverts, sous forme de nodules peu denses mais homogenes.Les cloisons separant les alveoles ouverts forment de longues villosites irregulieresdont les sommets correspondent aux parties du plasmolemme initial de l'oeufvierge qui se trouvait entre les alveoles tandis que leur base et les espaces qui lesseparent proviennent des parois des alveoles ouverts. Dans le creux de ces vil-losites se deposent des lames irregulieres provenant aussi du contenu des alveoleset qui forment la couche hyaline.

Une minute apres la fecondation la situation definitive de l'oeuf feconde s'estetablie. La membrane de fecondation epaissie par du materiel dense provenantdes alveoles, s'est soulevee au maximum (elle est fortement plissee et retracteesur les coupes). Bon nombre des villosites se sont retractees. Celles qui persistentont une morphologie tres particuliere. Elles se presentent sous forme d'arbres atronc conique et dont les branches s'etalent en un plan horizontal. En fait,elles s'etalent en un reseau tres irregulier sur la surface de la couche hyaline.Les coupes montrent, tant dans les branches que dans les troncs, un reseau densede vesicules dont certaines s'ouvrent a l'exterieur et qui peuvent s'interpretercomme resultant de canaux anfractueux. II s'agit vraisemblablement soit d'unsysteme pinnocytaire, soit de canaux destines a assurer les echanges de l'eauavec l'exterieur.

Le soulevement de membrane de Voeuf vierge de SabellariaLes oeufs coelomiques fixes sans avoir ete en contact avec l'eau de mer (Planche

1, Fig. 1), sont entoures d'un chorion epais constitue de trois couches. Laprofonde, tres peu dense, est fibreuse; les fibres sont paralleles a la surface del'oeuf. Leur densite decroit aux approches de la surface ovulaire et pour autantqu'il ne s'agisse pas d'un artifice de fixation, il se pourrait qu'il y ait une mincecavite perivitelline preexistante. Une seconde couche, plus peripherique,

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PLANCHE1

FIG. 1. Cortex d'oeufs de Sabellaria alveolata preleves dans le coelome.FIG. 2. Cortex d'eoufs vierges de Sabellaria alveolata ayant sejourne 30 sec. dans l'eau de mer.

La coupe est un peu oblique demontrant ainsi Falternance en quinconce des globules quiforment la couche superficielle du chorion. Les alveoles corticaux commencent a gonfleret la surface de l'oeuf se retracte quelque peu.

FIG. 3. Cortex d'oeufs vierges de Sabellaria apres 30 sec. de sejour dans l'eau de mer. Rupturedes alveoles corticaux; cependant, au centre de la figure, un alveole est encore intact.

J. J. PASTEELS (Facingpage 330)

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PLANCHE 2

J. J. PASTEELS {Facing page 331")

La reaction corticate 331

d'epaisseur egale a la precedente, est plus dense et se compose d'un feutrage defibrilles entrelacees en tous sens. Enfin, en surface, on trouve de petites spherulesde 0,15 /x de diametre, limitees chacune par un contour net, contenant un noyaude forte densite electronique entoure par une aire plus claire. Ces spherules sontdisposees en une couche unique et tres regulierement juxtaposees en quinconce.

A intervalles assez reguliers (un peu inferieurs a 1 n), partent de la surfaceovulaire de courtes villosites cylindriques qui s'implantent dans la moitieproximale du chorion. Ces villosites ont un diametre tres regulier de plus oumoins 0,12 /x et une longueur de 0,35 a 0,40 /x.

Immediatement sous le plasmolemme ovulaire se trouve une couche uniqued'alveoles corticaux. Us sont entierement remplis d'un contenu fibrillo-granuleux, limites par une membrane nette, analogue au plasmolemme. Engeneral ils sont juxtaposes bien que, de-ci de-la ils puissent etre separes par desinterstices variables qui peuvent egaler, ou meme depasser, la valeur de leurlargeur. Plus ou moins aplatis et ovoiides, ils ont un petit axe de 0,4 (x tandis queleur grand axe varie de 0,5 a 0,75 /x. La zone cytoplasmique dans laquelle ils setrouvent, sur une profondeur de 1 /x, ne contient pas de plaquettes vitellines maisse caracterise par un abondant reticulum endoplasmique garni de tres nombreuxribosomes (ergastoplasme) et dont les citernes sont disposees en majorite encouches tangentielles superposees.

Une fixation faite apres 4 a 5 sec. de contact avec l'eau de mer (Planche 1, Fig. 2)montre une reaction quasi immediate du cortex ovulaire dont la surface devientplus crenelee tandis que certains alveoles corticaux tendent a se gonfler.

Apres 30 sec. de sejour dans l'eau de mer (Planche 1, Fig. 3, et Planche 2, Fig. 4),nous voyons la majorite des alveoles corticaux, prealablement gonfles, venircrever a la surface, deversant un contenu devenu peu dense et irregulierementfibreux dans un espace vitellin large mais irregulier. II est en effet traverse par delongs prolongements irreguliers et arborescents de la surface ovulaire: ce sontles cloisons interalveolaires dont les sommets restent agrippes au chorion par lesvillosites. Sauf, au niveau du sommet des villosites, le plasmolemme de l'oeufest a present constitue par les parois des alveoles ouverts.

Cette reaction, malgre son declanchement rapide des le contact avec l'eau demer, se poursuit d'une facon irreguliere et progressive.

L'ouverture des alveoles est loin d'etre synchrone (sur le milieu de la Planche 1,

PLANCHE 2

FIG. 4. Cortex d'oeufs vierges de Sabellaria apres 30 sec. de sejour dans l'eau de mer. Rupturedes alveoles corticaux; cependant au centre et a gauche de la figure deux de ces alveoles sontencore intacts.

FIG. 5. Cortex d'oeufs vierges de Sabellaria apres 45 min. de sejour dans l'eau de mer. Lesmicrovillosites se sont retractees du chorion. Les longues villosites correspondent auxcloisons interalveolaires en contact avec le chorion, sans s'y inserer.

FIG. 6. Cortex d'oeuf feconde de Sabellaria. De nombreuses villosites se sont retractees;celles qui persistent contiennent un reseau de cavites et de petites vacuoles.

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Fig. 3, et Planche 2, Fig. 4, et a gauche de la Fig. 4 nous voyons encore desalveoles intacts). Le contenu des alveoles semble se liquefier et se deverseruniformement dans l'espace perivitellin, sans se deposer sur la face interne duchorion ni sur la surface de l'oeuf.

Apres 15 min. de sejour dans l'eau de mer (Planche 2, Fig. 5), tous les alveolesont cependant reagi; de plus, les courtes villosites inserees precedemment dans lechorion se sont retractees de sorte que les longs prolongements cytoplasmiques(provenant des parois interalveolaires) ne forment plus que des axes relativementsimples n'entrant en contact avec le chorion que par leur sommet non ramifie.

En conclusion. Le soulevement de membrane de l'oeuf vierge de Sabellaria,declenche par l'immersion dans l'eau de mer est du a l'eclatement de granulescorticaux.

Sabellaria: modification du cortex apres la fecondationCes modifications seront minimes: elles se bornent a la retraction de la plupart

des grandes villosites, de facon lente et progressive, de sorte qu'il est malaised'en evaluer la chronologic Certaines villosites persistent toutefois (Planche 2,Fig. 6) et gardent le contact avec le chorion. Elles presentent alors les plusgrandes analogies avec les villosites de l'oeuf feconde de Paracentrotus, etantcreusees d'un reseau de vesicules (ou de canaux anfractueux) communiquantavec l'exterieur par des pertuis a travers le plasmolemme. Cependant, con-trairement a ce qui se passe chez l'Oursin, (ou les sommets ramifies de cesvillosites s'etalent sur la couche hyaline), la villosite traverse ici l'espace peri-vitellin de part en part et prend contact avec le chorion. Ces contacts se rompenttoutefois ulterieurement a l'occasion des deplacements corticaux dus a l'expulsiondes globules polaires et a la segmentation.

DISCUSSION

Le mecanisme du soulevement de membrane de fecondation chez VOursinNous confirmons les conclusions de Wolpert et Mercer et celles de Endo, en

opposition directe avec la these de Balinsky. II n'y a done pas abrasion de l'en-semble des alveoles corticaux au niveau de l'equateur, mais eclatement de chaquealveole a travers le plasmolemme. La surface de l'oeuf feconde est done con-stituee a la fois par la paroi des alveoles ouverts ainsi que par les parties duplasmolemme initial qui se trouvaient entre les alveoles.

L'origine de la membrane de fecondation presente un point d'interpretationun peu delicat. Nous n'avons pas pu deceler, malgre les recherches les plusattentives, de membrane vitelline distincte du plasmolemme sur l'oeuf vierge,celui-ci paraissant uniquement limite par cette membrane. Nous n'avons pasnon plus pu observer de delamination du plasmolemme en deux couches commel'ont decrit Wolpert et Mercer. La premiere trace d'une membrane exocellulairenous est apparue au contact du contenu alveolaire, apres rupture de la surface

La reaction cortkale 333

des alveoles. Nos observations ne sont done pas decisives ni en faveur de lapreexistence de la membrane vitelline, ni en faveur de sa neoformation. Lemecanisme invoque par Wolpert et Mercer est toutefois peu vraisemblable,etant difficile a concevoir du point de vue physico-chimique et nous pensons, nousralliant a la these de Endo, qu'une tres mince membrane vitelline preexistereellement dans l'oeuf vierge. Etant tres mince, tres peu dense et intimementappliquee sur la surface de l'oeuf, elle n'a pu etre discernee chez Paracentrotus.

La chronologie de la reaction corticale chez V Our sin

Malgre les nombreuses etudes qui ont ete faites sur le vivant, quelque in-certitude persiste encore sur l'etat du cortex pendant les 20 a 30 premieres secondesqui suivent la fecondation.

Par des artifices experimentaux qu'il serait trop long de decrire ici mais queTon pourra retrouver dans plusieurs mises au point (cf. Allen, 1958; Pasteels,1962), Allen a pu montrer qu'il s'ecoule (a 20° C.) un delai de 30 sec. entre lemoment ou 50 % des oeufs sont fecondes et celui ou 50 % des oeufs debutent leursoulevement de membrane. Cette phase de 30 sec. a ete qualifiee de 'periodelatente de la reaction corticale'.

Nous avons deja eu l'occasion (Pasteels, 1962) de critiquer ce terme en faisantremarquer que cette periodeprealable se caracterise par les modifications optiques(illumination sur fond noir, disparition de la birefringence) qui ont ete de-couvertes par Runnstrom (1923) et Monroy (1945, 1947); v. aussi Monroy etMonroy Oddo, (1946); Monroy et Montalenti (1947). La cinematique de ceschangements, sur des oeufs observes individuellement, a pu etre etudiee parenregistrement cinematographique par Rothschild et Swann (1949, 1951),ensuite par Mitchison et Swann (1952), enfin par Kacser (1955) qui en a faitl'analyse mathematique. II en resulte: (a) que le debut de la modification optiqueapparait 7 sec. apres l'impact spermatique; (b) qu'elle se propage a partir de cepoint d'impact sur toute la surface ovulaire en un temps de 20 sec.; (c) qu'immedia-tement apres ces 20 secondes, le soulevement de membrane apparait au niveaudu point d'impact et qu'il se propage le long de la surface ovulaire avec exacte-ment le meme rythme.

Ce parallelisme de 1' 'onde lumineuse' sur fond noir et du soulevement demembrane qui lui succede ne laisse evidemment aucun doute: la premieremanifestation n'est que la phase preliminaire de la seconde. Cependant la naturedes remaniements structuraux, prealables au soulevement de membrane et quiconditionnent les modifications optiques, restaient enigmatiques jusqu'ici.

Par l'artifice de la fecondation massive, nous avons pu nous assurer d'un debutde fecondation (sous forme du contact entre le tubule acrosomial et le plasmol-emme) pour tous les oeufs avant le delai de 10 sec. et nous avons apercu que lechangement de structure du cortex est immediat, se manifestant par le gonflementdes alveoles.

II n'y a done pas de phase latente de la reaction corticale; celle-ci est immediate22*

334 J. J. PASTEELS

et unitaire, se caracterisant par le gonflement puis la rupture des alveolescorticaux. Ce gonflement debute des le tout premier contact des surfaces desgametes. Les modifications d'ordre optique du cortex, preatables au soulevementla membrane sont dues au gonflement des alveoles corticaux.

Le soulevement du chorion de Voeufvierge de SabellariaComme Faure-Fremiet (1924) et Novikoff(1938) l'avaient deja observe sur le

vivant, l'oeuf de Sabellaria souleve son chorion et expulse un liquide perivitellin,a l'etat vierge, losqu'il est pondu dans l'eau de mer. L'examen au microscopeelectronique nous demontre que le mecanisme est identique a celui du souleve-ment de membrane de fecondation de l'Oursin: le gonflement et l'eclatementd'alveoles corticaux. Quelques differences apparaissent, mais d'ordre mineur:le chorion souleve chez Sabellaria est bien plus epais et evident que la membranevitelline de l'Oursin; le contenu des alveoles corticaux se disperse tout entier dansle perivitellin sans renforcer la membrane ni constituer de couche hyaline. Maisle principe est identique.

Signification de la reaction corticale

11 serait opportun de se debarrasser de la generalisation abusive que Ton trouveencore dans la plupart des traites, qui font de la fecondation de l'Oursin, avecson soulevement de membrane, le prototype de toute fecondation (cf. Pasteels,1962, 1965). Une etude comparative des modifications corticales, precisees parle microscope electronique, a montre jusqu'a present cinq possibilites.

1. Une absence totale de toute modification morphologique, meme sur le plandes structures decelables par la microscopic electronique. C'est le cas pour lesMollusques Bivalves et pour certains Polychetes, dont Chaetopterus. Malgrel'absence complete de tout soulevement de membrane, l'oeuf est neanmoinsmonospermique ce qui implique un remaniement physico-chimique indecelablepar nos methodes actuelles.

2. Les alveoles corticaux eclatent et soulevent la membrane dans un oeuf aumoment ou celui-ci est pondu; l'influence ulterieure de la fecondation est minimeet se borne a la retraction d'une partie des villosites. L'oeuf est neanmoins mono-spermique. Ceci est le cas pour Sabellaria et, vraisemblablement pour d'autresAnnelides.

3. L'eclatement des granules corticaux est declenche par la fecondation. C'estle cas chez les Echinodermes, les Poissons, les Amphibiens Anoures (pas lesUrodeles!) Ce soulevement assure indeniablement la monospermie chez lesOursins et les Poissons, quoique par des mecanismes differents.

4. II n'y a pas de reaction corticale au moment meme de la fecondation, maisplus tardivement, l'oeuf secrete des membranes protectrices (cas de l'Ascaris).

5. Un espace perivitellin se forme dans l'oeuf vierge, mais sans interventiond'alveoles corticaux (ceux-ci etant absents); aucun changement ne se produit aumoment de la fecondation (cas des Urodeles).

La reaction corticate 335

Le cas no 1 demontre que le reglage de la monospermie est, en principe, inde-pendant du soulevement de membrane.

Le cas no 2 prouve aussi que la formation d'un espace perivitellin est, enprincipe, independant de la fecondation.

Le cas no 3 demontre enfln que ce mecanisme est integre a la fecondation et, deslors, assume le controle de la monospermie.

Nous concevrions volontiers une veritable phylogenie de la reaction corticale,du moins concue dans ses aspects structuraux. Dans une premiere etape s'installeun mecanisme regulateur de la monospermie, dependant de changementsphysico-chimiques qui n' affectent pas les structures qui nous sont visibles parnos methodes actuelles. Pour les oeufs pondus isolement et exposes aux agres-sions du milieu exterieur, s'installent ensuite des mecanismes protecteurs sousforme de membranes, de gaines elastiques. Parmi ces mecanismes protecteurs,la formation d'une gaine liquide qui par ses qualites osmotiques met soustension une membrane, se revele comme des plus efficace; c'est ainsi que s'installele dispositif des alveoles corticaux independamment de la fecondation et pre-alablement a celle-ci.

Enfin, comme derniere adaptation, ce soulevement de membrane a ete in-corpore a la fecondation, ce qui a pu perfectionner le reglage de la monospermie.De telles evolutions ont pu etre vraisemblablement polyphyletiques.

Meme sur le plan de la microscopie electronique, l'anatomie comparee con-serve tous ses droits.

Role eventuel des villosites issues des parois interalveolairesNous voudrions insister sur la morphologie particuliere des villosites qui

resultent de la rupture des alveoles corticaux, tant dans le cas de l'oeuf feconded'Oursin que dans celui de l'oeuf vierge et pondu de Sabellaria.

Dans les deux cas les villosites, parfois tres ramifiees, sont creusees de multiplesvesicules et cavites anfractueuses dont certaines peut etre nettement percuescomme s'ouvrant vers l'exterieur. II n'est pas douteux qu'il s'agisse d'un systemede communication entre l'oeuf et le liquide perivitellin. L'oeuf se trouvant dansl'eau de mer, il est vraisemblable que cette pinnocytose contribue au reglage dela teneur en sels et en eau du cytoplasme ovulaire.

RESUME

Paracentrotus lividus1. La reaction corticale de fecondation, chez l'oeuf de Paracentrotus, debute

par un gonflement des alveoles corticaux, ceux-ci affleurent ensuite au niveau dela surface ovulaire et eclatent a travers le plasmolemme.

2. Aucune membrane vitelline n'a pu etre decelee a la surface de l'oeuf vierge.Nous n'avons pas pu observer non plus de delamination du plasmolemme audebut de la reaction corticale. Le contenu des alveoles corticaux vient souleverune mince membrane qui peut etre consideree comme une membrane vitelline

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preexistante, mais intimement appliquee sur le plasmolemme de l'oeuf viergeet, de ce fait, non visible.

3. Les alveoles corticaux sont entierement remplis d'une lame granuleuserepliee sur elle-meme. Ce materiel s'homogeneise au moment du gonflement ets'applique, en partie sur la membrane vitelline, en partie sur la surface de l'oeuf,en constituant la couche hyaline.

4. Le plasmolemme de l'oeuf feconde resulte en partie des parois des alveolesouverts, en partie des portions du plasmolemme de l'oeuf vierge qui se trouvaitentre les granules.

5. Ayant reussi a provoquer la fecondation immediate des oeufs endeans les10 premieres secondes apres la mise en presence des gametes, nous avons puconclure que l'activation ovulaire debute avant ce delai, au moment du premiercontact des surfaces des gametes (tube acrosomial et plasmolemme de l'oeuf),et prealablement a leur fusion.

6. Cette activation se traduit par un gonflement immediat des alveoles corti-caux; elle peut dejaetre observee au bout de 10 sec. II n'y a done pas de phaselatente a la reaction corticale; celle-ci est immediate, unitaire et progressive. Lesmodifications du cortex sur fond noir et au microscope polarisant qui ont eteanalysees par divers auteurs sont concomitantes de la modification des alveolescorticaux.

Sabellaria alveolata

7. L'oeuf coelomique de Sabellaria alveolata possede un chorion epais etcomplexe juxtapose a la surface ovulaire. Celle-ci est prolongee par des micro-villosites cylindriques, assez espacees, qui s'implantent perpendiculairement dansla moitie proximale de ce chorion. Sous le plasmolemme se trouve une couched'alveoles remplis d'un contenu fibro-granuleux.

8. Des le premier contact de l'oeuf vierge avec l'eau de mer les alveolescorticaux gonflent, puis eclatent en surface, formant un espace perivitellin danslequel se deverse leur contenu. Tandis que les microvillosites se retractent, lessommets des parois interalveolaires forment un systeme villositaire irregulier,partant de la surface ovulaire, traversant tout le perivitellin et venant en contactavec la couche profonde du chorion.

9. La fecondation ne provoque qu'une retractation progressive d'une partiede ces villosites. Celles qui persistent deviennent cavitaires.

10. La reaction corticale de l'oeuf vierge de Sabellaria est identique, dans sestraits essentiels, a la reaction corticale de fecondation de l'oeuf vierge.

Conclusions generales

11. Une revue comparative des diverses modalites de reactions corticalespermet de conclure: (a) qu'une fecondation avec monospermie normale peut sederouler en l'absence de toute reaction corticale morphologique (cas desMollusques Bivalves); (b) que la formation d'un perivitellin par eclatement des

La reaction corticate 337

alveoles corticaux est une reaction adaptative de protection, en principe inde-pendante de la fecondation (cas de Sabellaria); (c) que cette reaction adaptativea pu etre incorporee a la fecondation, permettant ainsi un perfectionnement dumecanisme de la monospermie (cas des Echinodermes et des Poissons).

12. Nous attirons l'attention sur la morphologie particuliere des villositesprovenant, tant dans l'oeuf feconde de l'Oursin que dans l'oeuf vierge deSabellaria, des cloisons interalveolaires; les images observees suggerent uneactivite pinnocytaire tres forte dans les deux cas.

SUMMARY

An electron microscope study of the cortical reactionI. The cortical reaction at fertilization and its timing in sea-urchin

eggsII. The cortical reaction of the unfertilized egg of Sabellaria

alveolata

Paracentrotus lividus

1. The swelling of the cortical alveoli is the first step in the fertilization reactionof the egg of Paracentrotus', later on, these alveoli come into contact with theplasma membrane and burst through it.

2. No vitelline membrane on the surface of the unfertilized egg was seen. Butwe were also unable to observe any delamination of the plasma membrane at thebeginning of the cortical reaction. Immediately after the bursting of the alveoli,their extruded contents lift a thin membrane, which may be considered as apreformed vitelline membrane of the unfertilized egg and is not, therefore, visiblewhile still applied to the plasma membrane.

3. The cortical alveoli are entirely filled by a convoluted granular membrane.This material becomes homogeneous after bursting out of the alveoli, and some ofit lines the inner surface of the vitelline membrane as well as forming the hyalinelayer on the outer surface of the egg.

4. The plasma membrane of the fertilized egg derives from the sides of thealveoli and from those parts of the primitive plasma membrane of the unfertilizedegg which were situated between the alveoli.

5. Having been able to fertilize all eggs of Paracentrotus within the first 10sec. of mixing the gametes, we may state that activation of the egg begins duringthis period when the acrosomal tubule first comes into contact with the plasmamembrane of the egg.

6. This activation immediately provokes a swelling of the cortical alveoliwhich may already be observed after 10 sec. Thus the cortical reaction has nolatent period and may be considered as a progressive and unitary process, startingimmediately after sperm contact. The cortical modifications which may beobserved in a dark field or with the polarization microscope are due to the firstswelling of the alveoli before they burst.

338 J. J. PASTEELS

Sabellaria alveolata7. The coelomic egg of Sabellaria is covered by a thick and complex chorion,

adjacent to the plasma membrane. The egg cortex bears regular, cylindricalmicro villi which run perpendicularly through the inner half of the chorion.Under the plasma membrane lies a layer of alveoli filled with fibro-granularmaterial.

8. Immediately after the first contact of the unfertilized egg with sea-water, thecortical alveoli swell and burst at the surface of the egg, their liquefied contentsbeing shed into a perivitelline space. While the microvilli retract from thechorion, the inter-alveolar walls form long villi crossing the vitelline space fromthe egg surface to the inner surface of the chorion.

9. The only cortical change brought about by fertilization is a progressiveretraction of some of the villi. Those which remain become divided by a systemof vesicles and irregular cavities.

10. The cortical reaction of the unfertilized egg of Sabellaria brought about bycontact with sea-water is, in the main, identical to the fertilization reaction of thesea-urchin.

General conclusions

11. A general and comparative review of the various kinds of cortical reactionleads to the following conclusions: (a) that a normal monospermic fertilizationmay exist without any morphological reaction (bivalve molluscs); (b) that theformation of a perivitelline space after bursting of cortical alveoli may be con-sidered as a protective adaptive device, whose principle is independent offertilization (Sabellaria); (c) that this adaptive reaction has been incorporatedthrough evolution into the fertilization process, thus allowing an improvedmechanism for ensuring monospermy (echinoderms and fishes).

12. Attention is drawn to the peculiar morphology of the villi originatingfrom the interalveolar walls; the pictures observed in both cases (fertilized eggs ofParacentrotus and unfertilized eggs of Sabellaria) suggest an intense pinnocyticactivity.

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