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Estudo do ciclo biológico do tripanossomatídeo
Phytomonas serpens no hospedeiro experimental
Oncopeltus fasciatus (Hemíptera: Lygaeidae)
Aluno: Maria Fernanda Vieira da Cunha Cardoso de Almeida
Orientador: Msc. Felipe de Almeida Dias
Co-Orientadora: Dra. Angela Hampshire de Carvalho Santos
Novembro de 2007
FICHA CATALOGRÁFICA
2
A447e Almeida, Maria Fernanda de.
Estudo do ciclo biológico do tripanossomatídeo Phytomonas serpens no hospedeiro
experimental Oncopeltus fasciatus (Hemíptera: Lygaeidae) / Maria Fernanda Vieira da Cunha
Cardoso de Almeida. 2007.
29f. : il. (algumas color.)
Orientadores: . Felipe de Almeida Dias e Angela Hampshire de Carvalho Santos
Monografia (Graduação) – Universidade Santa Úrsula. Instituto de Ciências Biológicas e
Ambientais.
Relação hospedeiro-parasito. 2. Hemípteros 3. Tripanossomatídeo 4. Tomate – Doenças e
pragas. I. Dias, Felipe de Almeida. II. Santos, Angela Hampshire de Carvalho. III. Título.
577.857
CDD 21.ed.
ABSTRACT
Phytomonas species, parasites of both plants and insects, have recently begun to attract attention due to
their role as agricultural parasites. The hemipteran Oncopeltus fasciatus is not only the natural host for
Phytomonas elmasiani, but it is also capable of hosting different species of trypanosomatids by
experimental infection. The life cycle of Phytomonas spp in the insect host involves the colonization of
the intestinal tract, the passage to the haemolymph, and the infection of salivary glands. In the present
study we observed the experimental infection of O. fasciatus, which was "cured" from other
trypanosomatids that naturally infect its midgut, with P. serpens. The distribution of this parasite along
the intestinal tract of the insects was monitored for a month. This study was carried out by means of light
and scanning electron microscopy. In the first 24 hours we observed the presence of a great number of
parasites in the first and second ventricles (V1 and V2) of the midgut and the absence of parasites in the
third and fourth ventricles (V3 and V4). However, after 48 hours, it was observed the opposite, the
absence of parasites in the two first ventricles and the third and fourth were filled with flagellates. The
infection of V3 and V4 was persistent for 15 days, when the parasites began to reach the hindgut. In the
following days, live parasites were observed in fresh feces.
RESUMO
As espécies de Phytomonas (Trypanosomatidae) são parasitas de plantas e possuem como vetores insetos
fitófagos, principalmente da ordem Hemiptera. Ao se alimentar em plantas infectadas com Phytomonas,
os insetos ingerem os parasitas, que atravessam a parede intestinal, alcançando a hemolinfa, veículo pelo
qual migram até a as glândulas salivares. Com a invasão das glândulas, os parasitas alcançam a saliva e,
então, outras plantas são contaminadas, quando o inseto se alimenta novamente. O hemíptero fitófago
Oncopeltus fasciatus, além de ser hospedeiro natural de algumas espécies de tripanossomatídeos, dentre
elas a espécie Phytomonas elmasiani, também possui reconhecida capacidade de albergar, por infecção
experimental, outras espécies desta mesma família, motivo pelo qual está sendo utilizado em nosso
estudo. Em 1957, Gibbs, analisando tomates da espécie Solanum lycopersicum (Lycopersicum
esculentum), encontrou um parasito flagelado, o qual foi denominado Leptomonas serpens e
posteriormente Phytomonas serpens. Em 1989, Jankevicius e colaboradores descreveram o ciclo
biológico desta espécie nos hospedeiros naturais Nezara viridula e Phthia picta dando ênfase na interação
do parasita com as glândulas salivares destes insetos. No presente trabalho, utilizamos o hemíptero da
espécie O. fasciatus (livre de tripanossomatídeos) como modelo biológico para o estudo da interação da
P. serpens com o trato digestório de insetos vetores. Previamente, fizemos uma triagem entre as
variedades esculentum, pyriforme e cerasiforme de tomates da espécie Lycopersicum esculentun, e
detectamos que a inoculação de P. serpens em L. esculentun var. esculentum rende um maior título de
infecção. Desta forma, insetos adultos foram alimentados com suspensão de parasitas cultivados em
Lycopersicum esculentun var. esculentum e, posteriormente, dissecados. As regiões anatômicas do trato
digestório foram separadas e processadas para a microscopia óptica e eletrônica de varredura. Devido aos
experimentos que envolvem microscopia serem mais prolongados e requererem maior número de
3
repetição do processo experimental, o trabalho ainda não está fechado, se encontrando em processo de
finalização até o final do mês de outubro.
PALAVRAS CHAVE: Trypanossomatidae, Inseto fitófago, Solanum lycopersicum, ciclo biológico.
4
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos do departamento
de Microbiologia Geral do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
Apoio: FAPERJ, CNPq and CNPq/PIBIC-UFRJ.
AGRADECIMENTOS
Agradeço de coração a todos que de qualquer forma participaram desta etapa da
minha vida. Obrigada, mesmo.
Um obrigada especial para todos do meu laboratório, principalmente Felipe, por
todas as atenções que me foram dadas, pela compreensão, pelo apoio, pela paciência,
pelas risadas. Agradeço demais a Angela por me receber com todo o carinho e me
considerar uma aluna sem distinção. Um obrigada ao laboratório “do lado” por toda a
parceria que existe, foi muito bom ter todos na minha vida.
Queria agradecer a todos da minha faculdade, Universidade Santa Úrsula, a todos
os funcionários que acima de qualquer problema desejam o melhor para todos os alunos,
fazendo sempre o possível para que tudo fique bem. São funcionários que trabalham
com o coração.
Aprendi com este trabalho que conhecimento nunca é demais, quero ter dentro de
mim sempre a força para buscá-los.
O obrigada mais importante é dedicado aos meu pais, pelo apoio e investimento,
pela confiança e pelo amor que eles me dedicam todos os dias, ganhei um prêmio de ter
pais como os meus.
Obrigada ao resto da minha família, minha irmã (Xerinha), Tereza e Carol, pelo
apóio diário e só por saber que vocês estão ali, já fico em paz.
Obrigada ao meu nego por ter feito desses últimos tempos de correria, dias de mais
pura felicidade.
Termino com um poema de Fernando Sabino que reflete ao meu momento:
De tudo, ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
5
Da queda um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...
SUMÁRIO
ABSTRACT & RESUMO.....................................................................................3
AGRADECIMENTOS..........................................................................................5
SUMÁRIO.............................................................................................................6
1. Introdução
1.2 Família Trypanosomatidae...............................................................................7
1.3 Gênero Phytomonas.........................................................................................7
1.4 Espécie Phytomonas serpens...........................................................................8
1.5 Solanum lycopersicum (L. esculentum)...........................................................8
1.6 Insetos vetores de Phytomonas........................................................................9
2. Materiais & Métodos
2.1 Colônia e insetos...............................................................................................11
2.2 Estabelecimento da colônia de insetos curados................................................11
2.3 Phytomonas serpens.........................................................................................11
2.4 Microscopia Óptica..........................................................................................12
2.5 Microscopia eletrônica de varredura................................................................12
2.6 Infecção experimental dos insetos com P. serpens crescida
em meio Warren............................................................... ........... .................12
2.7 Infecção de tomates com P. serpens................................................................12
2.8 Curva de crescimento da P. serpens nas variedades de L. esculentum............14
2.9 Infecção experimental dos insetos com parasitas crescidos no tomate............14
3. Resultados & Discussão
3.1 Infecção experimental dos insetos com parasita crescido
em meio Warren...........................................................................................................16
3.2 Infecção do inseto por parasitas crescidos em tomate........................ ....18
4. Conclusão....................................................................................................21
6
Bibliografia.....................................................................................................22
1. INTRODUÇÃO
1.1 Família Trypanosomatidae:
Os tripanossomatídeos atualmente estão divididos em treze gêneros, de acordo,
principalmente, com aspectos morfológicos e especificidade por hospedeiros. Dos treze
gêneros, oito são constituídos por parasitos monoxênicos (desenvolvem todo o seu ciclo
de vida em um hospedeiro invertebrado) e cinco por parasitos heteroxênicos (durante o
seu ciclo de vida necessitam de dois hospedeiros distintos para completar seus ciclos -
invertebrado e planta ou invertebrado e vertebrado, dependendo do gênero) (Vickerman,
1994). Estes microrganismos têm sido amplamente utilizados como modelos biológicos
em diversas áreas da ciência, como a biologia celular e molecular, genética, evolução,
imunologia, bioquímica e fisiologia (Wallace, 1966; Vickerman, 1976; Wallace, 1979;
Dutra, 2000; Romeiro, 2001). A família Trypanosomatidae apresenta também grande
importância na área médica, já que possui constituintes potencialmente patogênicos para
o homem, e na área econômica, devido aos prejuízos que causam no setor agropecuário
(Wallace, 1979; McGhee & Cosgrove, 1980; Vickerman, 1994; Camargo, 1999).
1.2 Gênero Phytomonas:
Em 1909, foi descoberto que tripanossomatídeos poderiam infectar plantas (revisto
por Camargo, 1999). Diferentes famílias de vegetais são conhecidamente capazes de
abrigar, por infecção natural e/ou artificial, parasitos da família Trypanosomatidae
(Revisto por Camargo, 1999).
Os tripanossomatídeos do gênero Phytomonas constituem modelos biológicos
interessantes para muitos estudos, já que seu ciclo evolutivo ocorre em condições bem
diferenciadas, seja no trato digestivo e nas glândulas salivares de insetos, no látex, nos
vasos condutores de seiva, em frutos e sementes de vários tipos de vegetais (revisto por
Camargo, 1999). Os processos envolvidos na interação destes parasitos com seus
7
hospedeiros (Jankevicius et al., 1989; Kastelein & Camargo, 1990; Jankevicius, 1992)
permanecem pouco estudados e, portanto, pouco entendidos.
1.3 Espécie Phytomonas serpens:
Em 1957, Gibbs, analisando frutos da planta Solanum lycopersicum (tomate),
encontrou um parasito flagelado, o qual foi denominado de Leptomonas serpens e
posteriormente reposicionado como Phytomonas serpens por Podlipaev (1986). Em
1989, Jankevicius e colaboradores pesquisando a presença de Phytomonas em plantas
laticíferas, na cidade de Londrina (Estado do Paraná), observaram que duas espécies de
insetos (Phthia picta e Nezara viridula), que se alimentavam nestas plantas, também se
alimentavam em tomates (Lycopersicum sculentum), nos quais constatou-se a presença
de flagelados da espécie P. serpens. Neste estudo ficou demonstrado que P. serpens
possui pelo menos dois insetos fitófagos vetores para tomates, Ph. picta e N. viridula.
Ainda neste trabalho foi observado, em tomates, o aparecimento de manchas amareladas
nos locais onde foram picados pelos insetos, manchas essas que foram atribuídas à
atividade metabólica do tripanossomatídeo, já que tomates picados por insetos não
infectados, criados em laboratório, não apresentaram tais manchas.
1.4 Solanum lycopersicum (Lycopersicum esculentum):
O tomate foi originalmente denominado de Solanum lycopersicum por Linnaeus
(1753). Philip Miller no Gardeners Dictionary, em 1768, utilizou a denominação
Lycopersicon esculentum e este se tornou o nome aceito até hoje. As variedades foram
originadas do tomate cereja, lycopersicum esculentum var. (Heiser and Anderson,
1999).
A três variedades da espécies de S. Lycopersicum, utilizadas neste trabalho, podem
ser definidas da seguinte forma:
L.esculentum var. esculentum - nome popular: tomate salada L.esculentum var. cerasiforme – nome popular: tomate cereja L.esculentum var. pyriforme – nome popular: tomate italiano
8
As variedades são analisadas em relação à fruta, intensidade da cor, forma,
qualidade, hábito de crescimento, e morfologia da folha (Grandioso et al., 1996;
Carrinha der Knaap et al., 2002; Frank et al. Holtan e Mar luzam peixe Yates et al.,
2004).
Há atualmente uma enorme variedade de tomates, muitos desenvolvidos a partir
de manipulação gênica. Muitas pesquisas estão sendo realizadas no tomate para garantir
resistência à doença e também um maior rendimento. Cultivos novos de tomates vêm
aparecendo no mercado todos os anos, expandindo a seleção e melhorando a resistência
da doença (Heiser and Anderson, 1999).
VARIEDADE DE TOMATES Imagem retirada do site: www.taps.org.br/Paginas/agroartigoai01.html - Foto: ROBERTO CARRA
1.5 Insetos vetores de Phytomonas:
Os insetos, baseando-se nas especificidades alimentares, foram divididos por Brues
(1946) em quatro grandes grupos: parasitas, herbívoros, predadores e saprófitos,
considerando parasitas aqueles que se alimentam em animais, herbívoros aqueles que se
alimentam de plantas (fitófagos) ou fungos (micetófagos), predadores aqueles que se
alimentam de outros insetos e saprófitos aqueles que se alimentam de matéria em
decomposição.
9
Em lavouras, os insetos, além de serem polinizadores e controladores de pragas,
podem também agir como vetores e disseminadores de doenças causados por
microrganismos. Entre essas doenças estão, as causadas por tripanossomatídeos do
gênero Phytomonas, que têm insetos fitófagos como seus vetores (revisto por Camargo,
1999).
No que diz respeito à transmissão de flagelados aos insetos hospedeiros na
natureza, observa-se que esta ocorre por via oral, pela ingestão de fluidos de vegetais
infectados, como a seiva e o látex (Wallace, 1966; Jankevicius, 1992), ou por
coprofagia direta e indireta (Gibbs, 1950; Mcghee & Hanson, 1962). Isso torna possível
a transmissão de tripanossomatídeos de inseto para inseto e permite que esses atuem não
somente como vetores, mas também como reservatórios de doenças de plantas.
O parasitismo dos tripanossomatídeos em insetos ocorre, geralmente, sem causar
dano ao seu hospedeiro, desde que este esteja em bom estado nutricional (Vickerman,
1962; Wallace, 1966; Romeiro, 1997).
O gênero Oncopeltus, da família Lygaeidae, abriga algumas espécies de insetos
vetores de tripanossomatídeos parasitas de vegetais (Vickerman, 1962; Hanson &
McGhee, 1963; McGhee & Hanson, 1964). Em 1925, Holmes observou que o
hemíptero Oncopeltus fasciatus era capaz de transmitir tripanossomatídeos para plantas.
Por abrigar diferentes espécies de tripanossomatídeos por infecção natural ou
experimental (Hanson & McGhee, 1963; McGhee & Hanson, 1964; Romeiro, 1997;
Romeiro et al., 2000; Romeiro et al., 2003), e ser de fácil manutenção, em colônias em
laboratórios, o O. fasciatus mostrou-se um importante modelo nos estudos de interação
entre tripanossomatídeos e seus insetos hospedeiros.
FOTO DE TODAS AS FASES DE VIDA DO INSETO, ONCOPELTUS FASCIATUS.
Foto: Arquivo pessoal de Felipe de Almeida Dias. 2007
10
2. MATÉRIAS & MÉTODOS
2.1 Colônia de insetos:
Neste trabalho foram utilizados insetos da espécie Oncopeltus fasciatus
naturalmente infectados com o tripanossomatídeo Leptomonas wallacei (Romeiro et al.,
2000). A partir de exemplares originários da colônia do Dr. Alexandre Romeiro, do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (UFRJ) conseguimos estabelecer uma nova
colônia em nosso laboratório. Os insetos foram mantidos em potes plásticos, a 26oC, e
alimentados com água filtrada e sementes de girassol descascadas.
A partir da colônia de insetos infectados, estabelecemos uma colônia de insetos
curados.
2.2 Estabelecimento da colônia de insetos curados:
Três dias após a postura, os ovos foram colhidos da colônia de insetos infectados e
tratados, por 5 min, a 28oC, com hipoclorito de sódio a 2%, e, em seguida, em etanol a
70%. Após a eclosão, as ninfas foram alimentadas até a fase adulta da mesma forma
descrita anteriormente. Os insetos adultos foram, então, dissecados e seu trato intestinal
observado por microscopia óptica e eletrônica de varredura para checar a eficácia da
metodologia. A ausência de parasitas, ou seja, a cura dos insetos, foi confirmada por
microscopia óptica e eletrônica de varredura.
2.3 Phytomonas serpens:
Os parasitos da espécie Phytomonas serpens (isolado 9T, CT-IOC-189) foram
mantidos em meio Warren modificado (infusão de cérebro e coração a 37 g/L, ácido
fólico a 10 g/L e hemina a 1mg/L), suplementado com 10% de soro fetal bovino, a
11
26oC. Os repiques das culturas foram realizados a cada 48 h, em tubos de rosca
(13x100mm) contendo 5 ml de meio.
2.4 Microscopia óptica:
Insetos adultos das colônias parental e curada tiveram o trato digestivo dissecado
em PBS e o conteúdo das diferentes regiões do trato digestório (V1, V2, V3, V4 e reto)
fixados em lâmina e corados com corante de Giensa. As lâminas foram analisadas em
microscópio Axioplan 2 (Zeiss, Germany) e as imagens captadas pela câmera digital
Color View SX.
2.5 Microscopia eletrônica de varredura:
Insetos adultos das colônias parental e curada tiveram o trato digestivo dissecado
em PBS, fixado em sacarose 3,7%, p-formaldeído 4%, glutaraldeído 2,5% em tampão
Cacodilato 0,1 M. Os ventrículos 3 e 4, e o reto foram separados, secos pelo método do
ponto crítico com CO2 no aparelho Balzers CDP-20 (Balzers Union, Fürstentun
Liechstenstein) e cobertos com ouro no aparelho Balzers modelo FC- 9646. As
observações e micrografias foram feitas em microscópio eletrônico Jeol JSM-5310. Da
mesma forma foram processados os ovos e as fezes dos insetos das colônias parental e
curada.
2.6 Infecção experimental dos insetos com P. serpens crescida em meio Warren:
Foram separados 80 insetos no 5o estágio de ninfa. Após a passagem para a fase
adulta, os insetos foram colocados na ausência de água por 15 horas. Em seguida, no
bebedouro dos insetos, foi colocada, ao invés de água, uma suspensão de P. serpens
(105cels/ml) em solução salina (NaCl 0,89 %).
A cada 48 horas após a infecção, grupos de insetos eram dissecados, como
previamente descrito, e o conteúdo das diferentes regiões do trato digestório, e as
glândulas salivares foram analisadas por microscopia óptica e eletrônica de varredura.
12
No grupo de insetos controle, no lugar da suspensão de parasitas, foi administrada
apenas solução salina.
2.7 Infecção de tomates com P. serpens:
Os tomates foram adquiridos no supermercado da linha Hortifruti, e foram
utilizadas as variedades salada, italiano e cereja da marca Taeq. Todos em fase de
maior amadurecimento, com pigmentação vermelha.
DO LADO ESQUERDO, FOTO DE TOMATE MADURO, LADO
DIRETIO TOMATE VERDE, E NO MEIO VARIAÇÕES NA MATURIDADE.
Imagem retirada do site: www.feagri.unicamp.br/.../consumidordicas2.htm
O processo de higiene dos tomates envolveu o uso de Clor-in, que é um poderoso
potabilizador a base de cloro orgânico cujo princípio ativo é o dicloroisocianurato de
sódio. Este produto, apresentado na forma de comprimidos, é elaborado para tratamento
de água para consumo humano, eliminando os microorganismos causadores das
doenças de veiculação hídrica. Foram utilizados 2 comprimidos para cada litro de água.
Esta dosagem deixa um residual aproximado de 20 PPM de Cloro livre por litro de
água. Os tomates foram tratados por 15 min nessa solução (clor-in + água).
Depois do processo de limpeza foram retirados os tomates e espalhados em uma
bacia, aonde permaneceram por 30 min no fluxo laminar expostos à luz UV.
Após a permanência na luz UV, ocorreu o processo de inoculação nos tomates,
através de seringa Hamilton, injetando 5l de solução salina contendo 5x104 parasitas.
Foram escolhidos 3 pontos do tomate e colocado uma etiqueta de identificação em
cada parte selecionada, ao redor dessas etiquetas foram realizadas 5 inoculações com a
seringa, como mostra a foto abaixo:
13
Foto: Arquivo pessoal de Felipe de Almeida Dias. 2007
Após esse processo, os tomates foram guardados em estufa a 22oC, passado o
tempo de 24 h foi realizada a primeira análise.
A análise foi realizada nos três diferentes pontos do tomate, aonde foi extraído o
endosperma e analisado através da contagem de parasitas em câmara de Neubauer,
sendo inseridos 10l de cada região. Essas análises formaram a curva de crescimento
descrita no próximo tópico.
A cada 48 horas após a infecção, 3 tomates eram dissecados, sendo analisados por
microscopia óptica.
2.8 Curva de Crescimento da P.serpens nas variedades de L. esculentum:
A gráfico foi feito através do programa SIGMAPLOT, aonde foram incluídos
resultados referentes a 4 meses de experimento.
2.9 Infecção experimental dos insetos com parasitas crescidos no tomate:
Foram separados 80 insetos no 5° estágio de ninfa. Após a passagem para a fase
adulta, os insetos foram colocados na ausência de água por 15 horas. Em seguida, no
bebedouro dos insetos, foi colocada, ao invés de água, uma suspensão de P. serpens,
crescida no tomate (105cels/ml), em solução salina (NaCl 0,89 %).
A cada 48 horas após a infecção, grupos de insetos eram dissecados, como
previamente descritos, e o conteúdo das diferentes regiões do trato digestório, a
14
hemolinfa e as glândulas salivares foram analisados por microscopia óptica e eletrônica
de varredura.
No grupo de insetos controle, no lugar da suspensão de parasitas, foi administrado
apenas solução salina.
15
3. Resultados & Discussão
3.1 Infecção experimental dos insetos com parasita crescido em meio Warren
Os parasitas foram recolhidos por centrifugação do meio Warren e lavados com
salina para que, desta forma, pudessem ser colocados no bebedouro dos insetos.
Os insetos ficaram 15h sem ingerir água. Desta forma, logo que foi oferecida a
solução A (P.serpens + salina) os insetos rapidamente ingeriram o conteúdo.
A solução A foi retirada do contato com os insetos após 12h, voltando a ser
administrada água. Foram separados 5 insetos, para dissecação, a cada 24h. Após 3
dias(72h) de infecção, o intervalo de análise ficou a cada 48h.
O processo de dissecação envolveu a utilização de microscópio estereoscópio
(lupa), aonde foram separadas as regiões de análise (V1, V2, V3,4 e reto), demonstrado
em vermelho na próxima foto:
FOTO DO APARELHO DIGESTÓRIO DO INSETO FITÓFAGO ONCOPELTUS FASCIATUS
Imagem retirada de: Hood, C. W. (1937). Ohio J. Science. Vol. XXXVII 151-160.
16
A freqüência da P.serpens no fitófago O. fasciatus está demonstrada na
tabela abaixo.
Regiões anatômicas do inseto
1°dia24h
2°dia24h
3°dia 24h
5°dia48h
7°dia48h
9°dia48h
11° dia48h
13° dia48h
15° dia48h
17° dia48h
V1 + +/- O O O O O O O O
V2 O +/- + +/- O O O O O O
V3,4 O O O O +/- + + +/- O O
Reto O O O O O O O O O O
LEGENDA O Ausência de P.serpens+/- Baixa presença de P.serpens+ Alta presença de P.serpens
A presença alta da P.serpens na região V1 do inseto nas primeiras 24h é
justificada por ser a região mais próxima da área de sucção sendo o primeiro local
de passagem do parasita. Esta região tem o pH mais ácido, o que nos leva a pensar
que seja difícil a permanência do parasita neste local. Este fato fica claro nas
próximas 24h aonde aparece a diminuição da freqüência do parasito, sendo
observado que com 72h de infecção não é mais encontrado P.serpens nesta região.
Na região V2 foi observado presença baixa do parasita e o seu surgimento
somente após 24h da infecção. Com 48h de infecção foi observada presença alta do
parasita, explicada pelo tempo normal que o parasita leva na passagem do V1 para o
V2. Foi observado que após os 3 primeiros dias de infecção o parasita não é mais
observado na região, levando a pensar que o desaparecimento seja causado pela sua
passagem para o V3,4.
17
As regiões V3,4 só apresentaram a presença do parasita após 1 semana da infecção.
Este tempo de demora é devido ao percurso que o parasita teve que percorrer pelas
regiões V1, V2. O parasita mostrou presença alta depois do 9° dia, permanecendo alta
por 24h. Após esse período foi constatado uma diminuição da P.serpens até chegar ao
ponto do seu desaparecimento, no 15° dia de infecção.
Não foram observados parasitas na região do reto por todo o tempo de
experimentação, o que nos remete achar que o parasita não foi eliminado pelas fezes.
Acreditamos que o parasita não conseguiu estabelecer a infecção no inseto e não
obteve êxito na colonização das regiões estomacais do O.fasciatus, o que causou o seu
completo desaparecimento.
3.2 Infecção do inseto por parasitas crescidos em tomate
Os parasitas foram recolhidos do meio Warren por centrifugação e lavados com
salina para que desta forma pudessem ser inoculados nos tomates.
Os tomates, após serem lavados e ficarem imersos na água clorada, foram
retirados, separados em uma bandeja e logo após foram colocados no fluxo laminar
sob exposição à luz UV, por 30 min. Após esse tempo foi iniciado o processo de
infecção em todos os tomates das três variedades (salada, cereja e italiano).
Após a inoculação foram recolocados na bandeja e guardados na estufa 22°C,
sendo feitas análises de 48h em 48h como mostra a curva de crescimento abaixo:
Como foi
observado o
18
tomate L.esculentum var. esculentum (variedade salada) foi a variedade em que a
P.serpens apresentou o maior índice de crescimento. Dessa forma foi a espécie de
tomate utilizada para o crescimento de parasitas que foram oferecidos aos insetos.
Um fato observado foram os tomates infectados apresentarem sinal de
deteriorização maior que os tomates do controle , o que nos faz acreditar que a P.
serpens deixa o local mais favorável aos organismos invasores como por exemplo
bactérias fitopatogênicas.
TOMATE INFECTADO COM P.SERPENS, EM PROCESSO DE DETERIORIZAÇÃO
Foto: Arquivo pessoal de Felipe de Almeida Dias. 2007
O principio da infecção foi a retirada do bebedouro aonde os insetos ficaram 15h
sem ingerir água, desta forma logo que foi oferecida a solução B (extrato do tomate +
P.serpens – lavada em salina) os insetos rapidamente ingeriram o conteúdo.
A solução B foi retirada do contato com os insetos após 12h voltando a ser
administrada água. Foram separados 5 insetos, para dissecação, a cada 24h. Após 3
dias(72h) de infecção, o intervalo de análise ficou a cada 48h.
O processo de dissecação foi o mesmo do experimento anterior, no qual o
inseto se alimentou do parasita vindo de meio axênico.
A freqüência da P.serpens no fitófago O. fasciatus está demonstrada na
tabela a seguir.
19
Regiões anatômicas do inseto
1°dia24h
2°dia24h
3°dia 24h
5°dia48h
7°dia48h
9°dia48h
11° dia48h
13° dia48h
15° dia48h
17° dia48h
V1 O +/- +/- O O O O O O O
V2 O O +/- +/- O O O O O O
V3,4 O O O O +/- O O O O O
Reto O O O O O O O O O O
LEGENDA O Ausência de P.serpens+/- Baixa presença de P.serpens+ Alta presença de P.serpens
Foi observado que nas primeiras 24h o parasita ainda não aparecia em nenhuma
região do trato digestório do inseto. Após essas primeiras horas foi constatado o
aparecimento da P.serpens, em baixa quantidade, na região V1. Após outras 24h a
quantidade de parasita foi desaparecendo desta região, até que foi constatada sua
ausência por completo.
Na região V2, só a partir do 3° dia (72h de experimento), o parasita aparece em
pouca quantidade, desaparecendo após 48h. Na região V3,4 foi encontrada presença
baixa de P. serpens após 7 dias de experimento, ficando por apenas algumas horas,
constatando-se após, seu desaparecimento por completo. No reto não foi encontrado
parasita em nenhum momento, o que nos remete a achar que o parasita não foi
eliminado pelas fezes.
20
4. CONCLUSÃO
O experimento de crescimento do parasita em tomates foi realizado após o
experimento que utilizava o parasita crescido em meio axênico. Acreditamos que o
parasita sofreria alguma alteração e se tornaria infectante para o inseto, após a passagem
pelo tomate. Como pôde ser observado o parasita não conseguiu estabelecer infecção no
inseto, já que as duas formas de estabelecer a infecção de P.serpens que utilizamos não
obtiveram êxito.
Percebemos que P.serpens consegue infectar o inseto, mas não se perpetua
devido a alguma ação vinda do inseto como uma defesa, ou uma ação do parasita que
não tem o ambiente adequado para proliferar. Muitos fatores podem ser comentados
para explicar a ausência de parasita após alguns dias no trato digestório do inseto. Um
fator principal é que o inseto utilizado no presente trabalho não é o hospedeiro natural
do parasita P. serpens, logo não possui a conecção perfeita para estabelecer uma
colonização, como foi dito anteriormente o O. fasciatus foi usado como hospedeiro
experimental.
Pensamos que seria possível essa interação devido ao parasita possuir como
hospedeiro um inseto de características fisiológicas muito parecidas com o O. fasciatus,
assim as interações não seriam prejudicadas pois o metabolismo seria praticamente
igual. Um estudo mais detalhado poderia revelar a verdadeira causa, um trabalho que
comparasse os dois insetos checando quais as diferenças que não permitem a
permanência do parasito.
O trabalho teve um resultado interessante que poderá envolver mais estudos no
futuro, a P. serpens quando foi inoculada no tomate provocou alguma reação que
causou uma proliferação de bactérias, aparecendo um muco esbranquiçado. Não nos
aprofundamos nesse assunto, mas ficou constatado que o parasita usado no trabalho
pode oferecer uma quantidade de informações muito maior do que existem no momento
atual, representando uma peça chave para estudos de controle biológico em tomateiros.
21
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