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Estudio del comportamiento biof´ ısico de pel´ ıculas interfaciales de surfactante pulmonar sometidas a ciclos de compresi´ onexpansi´on. Angela Johana Ria˜ no Rivera Universidad Distrital Francisco Jos´ e De Caldas Facultad de ciencias y educaci´ on, Licenciatura en f´ ısica Bogot´ a, Colombia 2016

Estudio del comportamiento biof sico de pel culas ...repository.udistrital.edu.co/bitstream/11349/4066/1... · Palabras clave: fenomenos interfaciales, surfactante pulmonar, tensioactivo,

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Estudio del comportamiento biofısicode pelıculas interfaciales de

surfactante pulmonar sometidas aciclos de compresion expansion.

Angela Johana Riano Rivera

Universidad Distrital Francisco Jose De Caldas

Facultad de ciencias y educacion, Licenciatura en fısica

Bogota, Colombia

2016

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Estudio de caracterısticastermodinamicas de isotermas de

compresion-expansion de pelıculasinterfaciales del sistema surfactante

pulmonar

Angela Johana Riano Rivera

Informe de pasantıa presentada como requisito parcial para optar al tıtulo de:

Licenciada en Fısica

Director(a):

Olga Lucia Ospina Ramirez Ph.D

Jose Manuel Florez Perez Ph.D

Lınea de Investigacion:

Caracterizacion de pelıculas interfaciales (surfactante pulmonar)

Grupo de Investigacion:

Grupo de biofısica y bioquımica estructural PUJ

Universidad Distrital Francisco Jose de Caldas

Facultad de ciencias y educacion, Licenciatura en fısica

Bogota, Colombia

2016

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Agradecimientos

Agradezco cordialmente a lo superior por darme la oportunidad de adentrarme en la mıstica

y en la ciencia que conlleva el gran misterio de la vida, desde el primer halito de vida, la

respiracion. Soy sensible al prestamo que me ha dado el universo con su energıa, pudiendo

transformarla en trabajo y disciplina que permitio consumar este trabajo de investigacion,

un nuevo ciclo de vida que trasciende tiempo y espacio.

Agradezco a cada una de las personas que estuvieron brindandome sus conocimientos, sabe-

res y animo; tambien a aquellos que presenciaron mi ausencia y que aun ası, me brindaron

las fuerzas para continuar mi camino. Apremio la labor de mis primeros docentes, mis pa-

dres, que han brindado su esfuerzo y apoyo incondicional en mi formacion como persona

independiente.

Doy las gracias a la profesora Olga Lucia Ospina Ramirez por su paciencia, por promover

la investigacion en el ambito de la Biofısica, por compartir su espacio y tiempo en este

proyecto que cada vez da nuevos frutos. No olvido el apoyo brindado por los docentes de la

Universidad Distrital que han entregado su vida al cambio desde la accion docente.

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iv

Resumen

El estudio de los fenomenos interfaciales ha adquirido una importancia interdiciplinar, como

es el caso del estudio y analisis biofısico de pelıculas interfaciales de surfactante pulmonar.

Esta sustancia es un agente tensioactivo, localizado en los pulmones de todos los mamıferos

en la parte distal del arbol bronquial, denominados sacos alveolares, los cuales juegan un

papel de vital importancia durante la respiracion, tanto en la defensa inmune del pulmon,

como en el intercambio gaseoso, regulado por el entramado tisular y las fuerzas interfaciales.

Estas fuerzas reducen la tension superficial estabilizando la interfase aire-lıquido alveolar

durante el ciclo respiratorio, permitiendo una adaptacion de los alveolos y de esa manera

evita el colapso pulmonar.

La ausencia de surfactante pulmonar en los recien nacidos es conocida clınicamente como el

Sındrome de Dificultad Respiratoria Infantil (SDRI). Esta afeccion es la principal causa de

muerte de los bebes prematuros, ya que el pulmon tiene que realizar un mayor trabajo para

conservar el equilibrio respiratorio. El tratamiento de esta enfermedad esta dado por la admi-

nistracion de preparaciones de surfactantes exogenos procedentes de origen animal o mezclas

con suplementos artificiales. Por ello se hace importante el estudio y analisis del comporta-

miento de pelıculas de surfactante pulmonar a traves de la balanza de Langmuir, que permite

hacer un acercamiento in vitro del estudio de las caracterısticas biofısicas de actividad inter-

facial de pelıculas de surfactante pulmonar sometidas a procesos de compresion-expansion.

Estos ciclos isotermicos, permiten evaluar la relacion entre la presion superficial (π) en fun-

cion del area superficial (A), temperatura (T ), masa (m) y velocidad de compresion (v).

La evaluacion de los ciclos se realiza a partir del estudio de la histeresis al momento de com-

presion-expansion de una pelıcula de surfactante pulmonar. Este analisis permite un soporte

a la hipotesis de que a menor masa de SP (10µg), se requiere un mayor costo energetico

debido la necesidad de un mayor porcentaje de compresion de la pelıcula interfacial, puesto

que no se alcanza a llegar a valores de presion superficial cercanos a ±72mN/m, siendo los

valor de presion alcanzados de ±45mN/m para un trabajo interfacial de 22, 4x10−6J y un

porcentaje de compresion de 90 %.

Este trabajo proporciona las bases biofısicas de la caracterizacion in vitro de pelıculas inter-

faciales de surfactante pulmonar de origen porcino obtenido en Colombia.

Palabras clave: fenomenos interfaciales, surfactante pulmonar, tensioactivo, tension

superficial, ciclos isotermicos, presion superficial, histeresis.

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Contenido

Agradecimientos III

Resumen IV

Lista de figuras VII

Lista de tablas IX

Lista de sımbolos X

1. Introduccion 1

1.1. Sistema pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2. Surfactante pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2.1. Mecanismo de sıntesis del surfactante pulmonar . . . . . . . . . . . . 5

1.2.2. Composicion del surfactante pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.2.3. Funcion del surfactante pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3. Fenomenos superficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3.1. Tension superficial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.3.2. Presion superficial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4. Ciclos isotermicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.4.1. Fases moleculares en la subfase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.4.2. Histeresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2. Objetivos 24

2.1. OBJETIVO GENERAL: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3. Materiales y Metodos 25

3.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.1.1. Materiales de origen sintetico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.1.2. Surfactante Pulmonar de origen Porcino . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2. Metodo de obtencion del material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.1. Lavado bronco-alveolar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.2. Extraccion y purificacion del surfactante pulmonar . . . . . . . . . . 26

3.2.3. Cuantificacion de fosfolıpidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

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vi Contenido

3.3. Metodo de obtencion y analisis de datos de isotermas . . . . . . . . . . . . . 28

3.3.1. Balanza de Langmuir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.3.2. Analisis de Datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4. Resultados 30

4.1. Valoracion de fosfolıpido de surfactante pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.2. Ciclos isotermicos de compresion-expansion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5. Discusion de resultados 42

6. Conclusiones y recomendaciones 49

6.1. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

6.2. Recomendaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

A. Anexo: Codigo de las graficas de ciclos isotermicos 51

B. Programacion Analisis de datos de las isotermas 53

Bibliografıa 54

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Lista de Figuras

1-1. Esquema de los sacos alveolares, en donde se representa el intercambio gaseoso,

ası como sus principales estructuras. Tomado de [Gil, 2010] . . . . . . . . . . 1

1-2. . Estructura ramificada del arbol bronquial de los pulmones y alveolos agru-

pados formando los sacos alveolares. Esquema tomado de [la Serna, 2006] . . 3

1-3. Esquema representativo de la ubicacion del surfactante pulmonar. Los neumo-

citos tipo II sintetizan el surfactante pulmonar, que es una mezcla lipoproteica

almacenada en los cuerpos lamelares (CL) y secretada a la hipofase acuosa en

forma de agregados y mielina tubular que se adsorbe en la interfase aire-lıquido

alveolar. Esquema tomado de [Ospina, 2011] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1-4. Distribucion de porcentaje en masa de los componentes del surfactante pul-

monar. Esquema tomado de [Ospina, 2011] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1-5. Esquema representativo de la estructura basica de los fosfolıpidos identificando

las regiones hidrofılica e hidrofobica de cada uno. Tomado de [Ospina, 2011] 7

1-6. (A) Modelo de interfaz bidimensional. (B) Interfase donde ocurre una tran-

sicion continua de las coordenadas extensivas, donde δ hace referencia a la

densidad de la interfase. Modelo Tomado de [Rabockal, 1997] . . . . . . . . 10

1-7. Esquema de las fuerzas de atraccion en el interior del lıquido A; y de las

partıculas en la interfase aire-lıquido B. Tomado de [Picardi, 2014] . . . . . . 10

1-8. El esquema representa el cambio de volumen comprendido entre dos fases,

teniendo en cuenta una superficie de separacion inicial y final. . . . . . . . . 14

1-9. Segun la ley de Laplace, dos alveolos esfericos de diferente radio, R1 y R2 , con

la misma γ y que estan interconectados, no pueden coexistir en equilibrio a

una presion determinada. La presion P1, en el alveolo de radio menor, tiende a

colapsarlo en el alveolo de radio mayor. El SP disminuye la tension superficial

de acuerdo con el tamano del alveolo, estabilizando la interfase contra las

fuerzas que tienden a su colapso. Tomado de [Ospina, 2011]. . . . . . . . . . 15

1-10.Sistema basico de la balanza de Langmuir. 1) Base, 2) Barreras, 3) Tina de

teflon, 4) sensor de presion de superficie, 5) Inmersor mecanico, 6) Unidad de

interfaz. Tomado del manual KSV NIMA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1-11.Diagrama de la bandera. Tomado de [la Serna, 2006] . . . . . . . . . . . . . 17

1-12.Se observa una grafica de una isoterma de compresion de una monocapa de

DPPC a 250C con las indicaciones de los estados dimensionales. . . . . . . . 20

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viii Lista de Figuras

1-13.A la izquierda se observa un ciclo isotermico (γ − A) a una temperatura de

250C, una masa de 25µg y una velocidad de compresion 25cm2/min con una

marcada histeresis. A la derecha se observa un ciclo isotermico de (π−A) con

las mismas condiciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3-1. Esquema del gradiente de densidad discontinuo. a. Comparacion de los gra-

dientes de densidad de Bromuro de sodio. b. Fraccion de surfactante obtenida.

Tomado de [Angela Alvarez, 2014] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3-2. Esquema general de funcionamiento del espectrofotometro. Tomado de [An-

gela Alvarez, 2014] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3-3. A la izquierda se presenta la balanza de Langmuir del laboratorio de Biofısica

de la Universidad Javeriana, PUJ; empleada para la obtencion de datos de

ciclos isotermicos de compresion-expansion como se observa al lado derecho. 29

4-1. Grafica de la absorbancia en funcion de la cantidad de moles de fosfato. Donde

p0 hace referencia al punto de corte y p1 la pendiente de la recta. . . . . . . 30

4-2. La grafica muestra los diez ciclos consecutivos de compresion-expansion a

250C, 25µg y 25cm2/min; donde solamente se remarcan los ciclos 1, 5 y 10. . 33

4-3. Ciclos isotermicos de compresion-expansion de SP a 25oC en funcion de la

cantidad de materia m; 10µg, 25µg y 50µg ubicado en las columnas y la

velocidad de compresion v 25cm2/min, 47cm2/min y 65cm2/min ubicado en

las filas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4-4. Ciclos isotermicos de compresion-expansion de SP a 37oCen funcion de la

cantidad de materia m; 10µg, 25µg y 50µg ubicado en las columnas y la

velocidad de compresion v 25cm2/min, 47cm2/min y 65cm2/min ubicado en

las filas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

4-5. Area de histeresis para los respectivos ciclos de compresion-expansion a 25oC,

una masa de (25µg) y una razon de cambio de area de 25cm2/min. En color

gris se observa la histeresis del ciclo 1, en rosado el ciclo 5 y en verde el ciclo

10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

5-1. Ciclos 1 y 10 (π−A) a 25oC, detallados por color segun su masa y graficados

para las tres velocidades de compresion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

5-2. Ciclos 1 y 10 (π−A) a 37oC, detallados por color segun su masa y graficados

para las tres velocidades de compresion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

5-3. Pendientes de compresion-expansion del primer ciclo isotermico para una masa

de 25µg, una velocidad de compresion de 65cm2/min para una temperatura

de 25oC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

5-4. Pendientes de compresion-expansion del primer ciclo isotermico para una masa

de 25µg, una velocidad de compresion de 65cm2/min para una temperatura

de 37oC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

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Lista de Tablas

4-1. Valores de la cuantificacion de fosfolıpidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4-2. Valores de absorbancia cantidad de moles de fosfato y concentracion para las

muestras de surfactante pulmonar, para un volumen de 10µl 1/10 la muestra

SP1 y 1/20 la muestra SP2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

4-3. Valores calculados para el trabajo de compresion-expansion, representado por

el area de histeresis para los ciclos 1, 5 y 10; considerando la cantidad de SP

(m) y la velocidad de compresion (v) a una temperatura de 250C . . . . . . . 39

4-4. Valores calculados para el trabajo de compresion-expansion, representado por

el area de histeresis para los ciclos 1, 5 y 10; considerando la cantidad de SP

(m) y la velocidad de compresion (v) a una temperatura de 370C. . . . . . . 41

5-1. Valores de presion superficial maxima (πmax), y el area relativa de compresion

para alcanzar dicho valor (A%), para el primer y decimo ciclo de compresion-

expansion de las isotermas (π − A) a temperatura de 25OC en funcion de la

masa m y la velocidad de compresion v. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

5-2. Valores de presion superficial maxima (πmax), y el area relativa de compresion

para alcanzar dicho valor (A%), para el primer y decimo ciclo de compresion-

expansion de las isotermas (π − A) a temperatura de 37oC en funcion de la

masa m y la velocidad de compresion v. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

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Lista de sımbolos

Sımbolos con letras latinas

Sımbolo Termino Unidad SI Definicion

A Area m2∫ ∫

dxdy

c Concentracion de la cantidad de materia mgml

mV

solutosolucion

m Masa kg DF

n Cantidad de materia mol DF

P Presion Pa~F ·~nA

Q Calor kJ 1. LT

T Temperatura K DF

t Tiempo s DF

V Volumen m3∫dr3

Sımbolos con letras griegas

Sımbolo Termino Unidad SI

γ Tension Superficial Nm

θ Angulo de inclinacion 1

π Presion Superficial Nm

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Lista de Tablas xi

Abreviaturas

Abreviatura Termino

NaBr Bromuro de sodio

NaCl Cloruro de sodio

CO2 Dioxido de Carbono

DPPC Dipalmitolilfosfatidilcolina

LBA Lavado Bronco Alveolar

O2 Oxigeno

SDRI Sındrome de Dificultad Respiratoria Infantil

SN Surfactante Nativo (Porcino)

SP − A Proteına A del Surfactante pulmonar

SP −B Proteına B del Surfactante pulmonar

SP − C Proteına C del Surfactante pulmonar

SP −D Proteına D del Surfactante pulmonar

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1. Introduccion

Los mamıferos se caracterizan por realizar un proceso respiratorio a traves de los pulmones,

los cuales presentan en su interior unas estructuras denominados sacos alveolares (ver figura

1-1), en donde se realizan dos funciones principales como son la absorcion de oxigeno (O2)

y la eliminacion del dioxido de carbono (CO2) del cuerpo [W.F., 1993]. Esta funcion se

lleva a cabo en una zona interfacial aire-lıquido que tiene un papel primordial para el recien

nacido en su primera respiracion, en donde el O2 que proviene inicialmente de la placenta,

debe ser absorbido del aire inspirado. Este cambio es equilibrado por la presencia de una

sustancia denominada surfactante pulmonar (SP). La ausencia y/o inactivacion de SP en el

neonato referencia sıntomas de dificultad respiratoria, la cual esta relacionada con patologıas

como; el Sındrome de Dificultad Respiratoria Infantil (SDRI) y el Sındrome de Aspiracion

de Meconio (MAS) principalmente; lo cual da lugar a una elevada tension superficial en la

interfase pulmonar implicando un colapso alveolar. La ausencia y/o inactivacion puede ser

debido a la inmaduracion del pulmon, por falta de las celulas epiteliales que producen el SP

o por la presencia de residuos al momento del parto.

Figura 1-1.: Esquema de los sacos alveolares, en donde se representa el intercambio gaseoso,

ası como sus principales estructuras. Tomado de [Gil, 2010]

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2 1 Introduccion

Diversos estudios del surfactante pulmonar han evaluado la composicion y funcionamiento

de este. En 1929 el fisiologo sueco Kurt Von Neegaard [Jimenez and Reyes, 2009], realizo

las primeras investigaciones sobre la fuerza de retraccion ejercida por la tension superficial

en los pulmones extirpados de diferentes especies [Wustneck et al., 2005], indicando que la

presion requerida para mantener el pulmon lleno con aire era mayor que la necesaria para

mantener el pulmon lleno con soluciones salinas. Richard Pattle en 1955 estudio los lavados

pulmonares y encontro que contienen un material que podrıa reducir la tension superficial a

valores cercanos de 0mN/m [Zuo and Possmayer, 2007]. En 1956 John Clements demostro

que los extractos pulmonares generan pelıculas superficiales que podrıan ser comprimidas

y ası alcanzar valores de tension superficial por debajo de 10mN/m; siendo el primero en

denominar esta sustancia tensoactiva como SP, estos estudios los realizo utilizando la ba-

lanza de Langmuir-Wilhelmy [Zuo and Possmayer, 2007,Jimenez and Reyes, 2009]. Estudios

posteriores permitieron elucidar la composicion del surfactante pulmonar caracterizandolo

principalmente como una sustancia lipo-proteica, que recubre la superficie interna de los

alveolos, modulando la tension superficial alveolar, favoreciendo el intercambio gaseoso.

La primera experiencia clınica de administracion de surfactante exogeno, como tratamiento

a las dificultades respiratorias neonatales, fue reportada por el pediatra Japones Tetsuro

Fujiwara en la decada de 1980, el cual describe el uso de un surfactante natural de origen

bovino que aseguro una supervivencia del 80 % de los neonatos prematuros que fueron trata-

dos. Posteriormente este medicamento fue aprobado para uso en humanos y desde entonces

se han hecho numerosos estudios y ensayos clınicos que han permitido usar cada vez con

mayor eficacia un surfactante exogeno, bien sea de origen natural, mixto o suplementado

con elementos sinteticos.

Uno de los primeros paıses en latinoamerica en contar con esta terapia fue Argentina, que

desde 1992 promueve el estudio del surfactante pulmonar, haciendolos acreedores de un

producto con desarrollo y fabricacion nacional, Surfactante B Richet (R). Otros paıses la-

tinoamericanos pioneros de estos estudios son Cuba, Brazil y Venezuela [Travieso Novelles,

2006]. En Colombia se han realizado algunos estudios clınicos y terapeuticos, ası como estu-

dios a nivel biofısico, donde se evalua la actividad del surfactante pulmonar de origen porcino

y bovino en la interfase, a partir de mediciones de la presion superficial (π) en funcion del

tiempo, tambien llamadas isotermas de adsorcion π(t). Indicando que las presiones de equi-

librio en el surfactante son aproximadamente de 45mN/m para temperaturas de 25 y 37oC

en un surfactante de origen bovino [Angela Alvarez, 2014].

En contribucion a generar un espectro amplio de conocimiento sobre el surfactate pulmonar

Colombiano, el presente trabajo desde su interdisciplinariedad expone el estudio de los ciclos

isotermicos de compresion-expansion in vitro de pelıculas interfaciales del surfactante pulmo-

nar de origen porcino, en funcion de la temperatura (T ), la cantidad de materia depositada

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1.1 Sistema pulmonar 3

en la interfase (m) y la velocidad de compresion (v). Este estudio permite un acercamiento

al comportamiento de las pelıculas de surfactante pulmonar, donde se evalua la capacidad

para alcanzar las maximas presiones en el proceso de compresion interfacial y la histeresis

del proceso de compresion-expansion a partir de las isotermas de presion en funcion del area

(π−A), encontrandose una relacion entre la variacion del area de compresion-expansion y el

trabajo de la pelıcula interfacial, para mantener una estabilidad en el proceso respiratorio.

1.1. Sistema pulmonar

La respiracion es uno de los procesos mas importantes e inherente a los seres vivos que con-

siste en la absorcion de O2 del medio ambiente y la eliminacion de CO2 del cuerpo, y se

lleva a cabo en dos movimientos cıclicos e involuntarios de inspiracion (aumento del volu-

men pulmonar) y espiracion (reduccion del volumen pulmonar). Para realizar el proceso de

respiracion se requiere de unas estructuras anatomicas ordenadas que permiten el intercam-

bio gaseoso en el interior del pulmon, los sacos alveolares. De esta forma, el aire inspirado

inicialmente entra por las fosas nasales, pasando por la faringe donde es atemperado, luego

pasa por la traquea hasta los alveolos a traves de los bronquios, bronquiolos y conductos

alveolares (ver figura 1-2).

Figura 1-2.: . Estructura ramificada del arbol bronquial de los pulmones y alveolos agru-

pados formando los sacos alveolares. Esquema tomado de [la Serna, 2006]

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4 1 Introduccion

Una de las caracterısticas estructurales de los pulmones es que los alveolos presentan una

estructura multilobulada asociada a una geometrıa fractal [Malacrida, 2014], que posibilita

una mayor area de intercambio gaseoso y eficiencia en el proceso de respiracion; a partir del

adecuado flujo de gases a los alveolos, una mınima produccion de entropıa en la mecanica

respiratoria y un mınimo costo en materia y energıa [Canals et al., 1998]. A favor de este

intercambio tambien esta involucrado el revestimiento de un epitelio alveolar especifico, que

se encuentra formado principalmente por dos tipos de celulas fundamentales para el inter-

cambio gaseoso, estas son los neumocitos tipo I y II (ver figura 1-1). Los neumocitos tipo I

son celulas planas y finas que recubren el 90 % de la superficie alveolar, y su principal funcion

es el intercambio gaseoso. Los neumocitos tipo II son celulas de forma cubica que recubren

la superficie alveolar restante y son los que intervienen en la distension y recuperacion del

tamano de los alveolos mediante la sıntesis y secrecion de SP.

Edad gestacional del surfactante pulmonar en el humano

Como se dijo anteriormente, son los neumocitos tipo II las celulas que sintetizan y secretan el

surfactante pulmonar. Sin embargo, la sıntesis del SP en el feto coincide con el proceso dado

por la etapa dinamica de maduracion pulmonar, la cual ocurre en la semana 35 de gesta-

cion [Lopez, 2012]. Los mayores cambios que se producen en esta etapa son: la proliferacion de

los tipos celulares que recubren el epitelio alveolar, la aparicion de mas alveolos terminales, el

adelgazamiento del epitelio y un incremento tanto dimensional como en cantidad de los cuer-

pos lamelares, siendo estas estructuras lamelares las responsables del almacenamiento del SP.

Se calcula que el pulmon humano al termino de la gestacion tiene alrededor de 10 a 15

millones de alveolos, por tanto el parto en la semana 35 genera un nacimiento pre-termino,

lo cual podrıa explicar la susceptibilidad a las patologıas bronco-pulmonar del recien naci-

do [Perea, ], como el SDRI o MAS. Varias tecnicas han surgido para estudiar la maduracion

pulmonar; un ejemplo de ello es el descubrimiento de Louis Gluck en 1970, el cual revela

que se puede indicar la madurez fetal del pulmon, considerando el estudio de los lıpidos del

SP inmerso en el lıquido amniotico, este estudio contribuyo al reconocimiento de la primera

proteına del surfactante [Jimenez and Reyes, 2009]. Es caracterıstico de la semana 35 que la

fase de maduracion pulmonar no se complete, teniendo como consecuencia la inmadurez del

epitelio que sintetiza y segrega el SP pulmonar, siendo uno de los casos de mayor morbilidad

y mortalidad neonatal [Iniguez and Sanchez, 2008].

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1.2 Surfactante pulmonar 5

1.2. Surfactante pulmonar

1.2.1. Mecanismo de sıntesis del surfactante pulmonar

En los alveolos el intercambio gaseoso debe producirse primero a traves de una fina pelıcula

lipoproteica, el surfactante pulmonar, que se ubica entre el aire y la capa capilar de lıquido

que recubre la superficie alveolar que se conoce como hipofase alveolar (ver figura 1-3). Para

que el surfactante se ubique en la interfase, antes de ser secretado a la hipofase alveolar, es

almacenado en organulos especiales denominados cuerpos lamelares (CL), en forma de mem-

branas altamente empaquetadas [Gil, 2010,Perez-Gil, 2008]. Al ser secretados por exocitosis

hacia la hipofase, que es la fina fase acuosa que recubre las celulas alveolares, los cuerpos

lamelares liberan el surfactante que se dispone en forma de agregados ricos en fosfolıpidos

y en una estructura denominada mielina tubular. Estas estructuras son la principal fuente

de material para la formacion de una pelıcula de SP en la interfase aire-lıquido alveolar, que

al estar sometida a ciclos respiratorios, disminuye la tension superficial a valores cercanos a

1mN/m cuando se lleva al estado de mayor compresion [Notter, 2000, Perez-Gil, 2008, Zuo

et al., 2008,Ospina, 2011]

Figura 1-3.: Esquema representativo de la ubicacion del surfactante pulmonar. Los neumo-

citos tipo II sintetizan el surfactante pulmonar, que es una mezcla lipoproteica

almacenada en los cuerpos lamelares (CL) y secretada a la hipofase acuosa en

forma de agregados y mielina tubular que se adsorbe en la interfase aire-lıquido

alveolar. Esquema tomado de [Ospina, 2011]

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6 1 Introduccion

1.2.2. Composicion del surfactante pulmonar

Estudios obtenidos de lavados broncoalveolares (LBA) de pulmones de animales [Ospina,

2011], han permitido identificar una composicion lipo-proteica del surfactante pulmonar,

donde el 90 % del peso corresponde a lıpidos y el restante a proteınas especificas del surfac-

tante (ver figura 1-4).

Figura 1-4.: Distribucion de porcentaje en masa de los componentes del surfactante pul-

monar. Esquema tomado de [Ospina, 2011]

Composicion lipıdica: Un 90 % de la composicion lipıdica esta dada por los fosfolıpi-

dos, los cuales tiene la caracterıstica de ser moleculas anfipaticas; es decir que tienen

un extremo hidrofılico, el cual presenta un grupo polar y otro hidrofobico con un grupo

apolar (ver figura1-5).

La region hidrofobica de los fosfolıpidos esta formada por dos acidos grasos que pueden

ser saturados (sin dobles enlaces) o insaturados (con uno o mas dobles enlaces). Cada

lıpido posee cadenas de acilo de longitud y saturacion caracterıstica que determinan

su organizacion conformacional. Cuanto mas ordenada sea la disposicion en la que

se encuentre una molecula de fosfolıpido, menor energıa conformacional tendra. Esta

estructura le confiere al fosfolıpido una organizacion especifica que esta directamente

comprometida con la formacion de una pelıcula tensioactiva en la interfase aire-lıquido

alveolar [Veldhuizen et al., 1998]. Ademas de esta funcion, los fosfolıpidos forman una

base o matriz sobre la cual se ensamblan las diferentes estructuras del surfactante

[Perez-Gil, 2008].

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1.2 Surfactante pulmonar 7

Figura 1-5.: Esquema representativo de la estructura basica de los fosfolıpidos identificando

las regiones hidrofılica e hidrofobica de cada uno. Tomado de [Ospina, 2011]

Dependiendo de la apariencia de la barrera que forman los fosfolıpidos se pueden or-

ganizar en bicapas, monocapas o multicapas.

Las bicapas se forman al considerar una fase acuosa con condiciones normales, a pre-

sion atmosferica y temperatura ambiente. Estas membranas delgadas se ordenan de

tal manera que las cadenas de acilo de una hemicapa se ubican frente a las cadenas de

acilo de otra hemicapa, con las cabezas polares de cada hemicapa expuestas hacia la

fase acuosa [Ospina, 2011].

Por otro lado la monocapa, esta dada por la relacion de una interfase polar-no polar

como la interfase aire-lıquido alveolar, donde la orientacion de su cabeza polar es hacia

el agua y de la region no polar es hacia el aire, como se observa en la pelıcula de surfac-

tante de la figura 1-3. En 1932 Irving Langmuir fue galardonado con el premio Nobel

de Quımica por sus estudios de la quımica de superficies, usando monocapas flotantes

para estudiar la naturaleza de las fuerzas intermoleculares, abriendo de ese modo una

importante lınea de investigacion en biofısica de membranas e interfases lipo-proteicas.

El fosfolıpido que mas abunda y contribuye al papel tensioactivo del surfactante es la

dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), con una masa molar de 734, 04g/mol. La DPPC

tiene la capacidad de reducir la tension superficial a valores cercanos a 2mN/m, en

altos grados de compresion [Ospina, 2011].

El otro 10 % esta dado por los lıpidos neutros, que en su mayorıa es colesterol, es

importante en la fluidificacion del SP, lo que facilita la re-extension de la pelıcula ten-

sioactiva despues de la compresion; debido a que puede incrementar la separacion entre

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8 1 Introduccion

las moleculas de fosfolıpido [Daniels and Orgeig, 2003,Creuwels et al., 1997].

Composicion proteica: La fraccion proteica esta dada por cuatro proteınas denomi-

nadas SP-A, SP-B, SP-C, SP-D. Las proteınas SP-B y SP-C se encuentran asociadas a

los lıpidos del surfactante, ası que permiten que los fosfolıpidos se adsorban y ubiquen

de forma rapida en la interfase aire-lıquido alveolar. Las proteınas SP-A y SP-D son

proteınas hidrofılicas que influyen en el mecanismo de defensa del pulmon, actuando

como una barrera ante los patogenos [Blanco and Perez-Gil, 2007].

De manera particular la SP-B es fundamental para la biogenesis de complejos lipi-

proteicos del SP y participa en el empaquetameinto de estos en los cuerpos lamela-

res [Perez-Gil and Weaver, 2010], su efecto en la adsorcion interfacial de fosfolıpidos

se ve favorecido por la liberacion de fosfolıpidos insaturados en la monocapa duran-

te los estados de alta compresion [Longo et al., 1993,Lipp et al., 1996,Cruz et al., 2000].

Varios estudios han mostrado que la SP-C promueve la exclusion de fosfolıpidos desde

la interfase durante la compresion [Taneva and Keough, 1994], favorece la formacion

de estructuras tridimensionales de complejos lipoproteicos asociados a la interfase [von

Nahmen et al., 1997] y facilita la re-extension y reposicion de las pelıculas interfaciales

durante los procesos de expansion [Creuwels et al., 1995]. Sus principales funciones

respecto al SP es la capacidad para promover la adsorcion de fosfolipidos en la interfase

alveolar y la capacidad para formar y estabilizar reservorios de surfactante asociados

con la interfase [Ospina, 2011].

Deficiencias en proteınas como SP-A o SP-C no son crıticas en primera instancia, aunque los

modelos animales deficientes en SP-A desarrollan infecciones pulmonares con mayor facilidad,

mientras que los deficientes en SP-C desarrollan enfermedades pulmonares cronicas. Sin

embargo, la deficiencia en SP-B resulta letal a los pocos minutos tras el nacimiento, debido

a la funcion esencial de la proteına SP-B en la reduccion de la tension superficial y la

estabilizacion de una superficie alveolar abierta al intercambio gaseoso [Lopez, 2012].

1.2.3. Funcion del surfactante pulmonar

El surfactante pulmonar presenta dos funciones esenciales:

1. Reducir la tension superficial en la interfase aire-lıquido durante la espiracion, evitan-

do el colapso alveolar y confiriendo estabilidad mecanica al alveolo, de esa manera

mantiene la homeostasis del lıquido alveolar previniendo los edemas.

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1.3 Fenomenos superficiales 9

2. Contribuye a la defensa del organismo frente a patogenos, ya que es la primera ba-

rrera fısica a la entrada de cualquier microorganismo a los pulmones. Esto se debe a

las proteınas hidrofılicas SP-A y SP-D, que se unen a la superficie de los patogenos

(incluyendo virus y bacterias) [Picardi, 2014] .

El sistema respiratorio ha desarrollado dos mecanismos fısicos para mantener estable la es-

tructura alveolar a lo largo de la continua dinamica cıclica, estos son el entramado tisular

de sosten y el surfactante pulmonar [Picardi, 2014].

Es ası que los tejidos circundantes evitan una expansion excesiva de los espacios alveolares

y por otro lado la composicion lipo-proteica del surfactante pulmonar facilita la apertura y

cierre de los alveolos mediante una transicion de fase a temperaturas cercanas a la fisiologi-

ca [Picardi, 2014], esta ultima es en la que se fundamenta este estudio, por tanto se ahondara

en la relacion fısica del surfactante pulmonar, teniendo como premisa la contextualizacion

teorica que permita comprender la actividad biofısica de la interfase de surfactante pulmonar.

De estas funciones el objetivo de este trabajo se centra en la primera, considerando los ciclos

isotermicos de compresion-expansion que relacionan la presion superficial en funcion del area,

permitiendo evidenciar in vitro la actividad interfacial de este tensioactivo pulmonar, para

la disminucion de la tension superficial.

1.3. Fenomenos superficiales

Los fenomenos superficiales, se distinguen por ser fenomenos que se producen cerca de la

superficie que separa dos medios continuos (Ver figura 1-6); considerando que los medios

estan separados por una capa de transicion fina que es tan delgada que puede considerarse

como una superficie. En esta investigacion se estudiaran pelıculas de surfactante pulmonar

formadas en una interfase aire-lıquido, siendo este lıquido una solucion tamponadora, com-

puesta de Tris 5mM pH 7 conteniendo NaCl 150mM, en la cual se deposita la muestra.

Esta pelıcula interfacial entre dos medios inmiscibles de densidades δ1 y δ2, presentan dos

casos principales que la caracterizan para poder relacionarla como un fenomeno de tipo

capilar [Levich and Krylov, 1969]:

1. Cuando la superficie de separacion entre las fases posee una curvatura considerable.

2. Cuando la tension superficial varıa de un punto a otro en la superficie.

En ambos casos, surgen fuerzas cerca del lımite de interfase, llamadas fuerzas de tension

superficial, a la que se ven sometidas las moleculas en fase acuosa en la superficie de la

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10 1 Introduccion

pelıcula de lıquido que recubre el epitelio pulmonar, que son las principales responsables del

colapso alveolar.

Figura 1-6.: (A) Modelo de interfaz bidimensional. (B) Interfase donde ocurre una tran-

sicion continua de las coordenadas extensivas, donde δ hace referencia a la

densidad de la interfase. Modelo Tomado de [Rabockal, 1997]

1.3.1. Tension superficial

Los fenomenos interfaciales presentan condiciones especiales debido a que las moleculas de

la capa lımite del lıquido, a diferencia de las moleculas de su interior, no estan rodeadas por

todas partes por moleculas del mismo lıquido (ver figura 1-7).

Figura 1-7.: Esquema de las fuerzas de atraccion en el interior del lıquido A; y de las

partıculas en la interfase aire-lıquido B. Tomado de [Picardi, 2014]

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1.3 Fenomenos superficiales 11

Parte de las moleculas superficiales limıtrofes son las partıculas de un segundo medio, con

el cual colinda el lıquido, por tanto las moleculas de la capa superficial tiene una interaccion

diferente, por eso las fuerzas que actuan en cada molecula en esta capa no se encuentran

equilibradas, existiendo una resultante dirigida hacia el lado del volumen del lıquido. Trayen-

do como consecuencia el desplazamiento de las moleculas desde la capa superficial al interior

del lıquido, acompanado de un trabajo, [Kikoin, 1971,Pijush K. Kundu, 2001]. El desplaza-

miento de la molecula de la superficie al interior del lıquido se considera como un trabajo

positivo, por ejemplo al reducirse la superficie. El paso de las moleculas desde el volumen

del lıquido a la superficie va acompanado de un trabajo negativo, por tanto es necesario un

gasto de trabajo exterior.

Lo anterior se describe matematicamente como:

dW = −γdA (1-1)

El signo menos indica que el aumento de superficie (dA) va acompanado de trabajo negativo

(dW ). El coeficiente (γ) caracteriza las fuerzas superficie del lıquido, y es llamado coeficiente

de tension superficial, el cual se mide por el trabajo necesario para aumentar la superficie del

lıquido en una unidad a temperatura constante; sus dimensiones en el sistema SI son J/m2.

Este tambien puede ser determinado como una magnitud igual a las fuerzas de superficie

que actuan de manera tangencial sobre el lıquido, correspondiente a la unidad de longitud

de la linea divisoria con unidades N/m [Kikoin, 1971,Pijush K. Kundu, 2001]. Considerando

la ecuacion 1-1 se obtiene el trabajo dado por la tension superficial para una temperatura

constante, resultando:

γ = −(dW

dA

)T

(1-2)

La variacion de trabajo se puede expresar en terminos de la energıa libre que necesita el

sistema para reducir la tension superficial. Ası que la energıa libre de un sistema se mide por

el trabajo que puede producir el sistema, cambiando isotermica y reversiblemente su estado

desde aquel estado en que se encontraba anteriormente al estado inicial, en el cual se admite

que la energıa libre es igual a cero [Kikoin, 1971,Nelson et al., 2005].

Las moleculas de la capa superficial del lıquido poseen un exceso de energıa potencial (Up), la

cual se debe a las fuerzas de atraccion y repulsion con las moleculas del entorno; esta energıa

se mide por el trabajo que puedan realizar las moleculas de la superficie, desplazandose al

interior del lıquido bajo la accion de la fuerza de atraccion por parte de las moleculas del

volumen lıquido [Kikoin, 1971].

Esta energıa es proporcional al area (A) pues depende de la superficie del lıquido, por tanto

las variaciones del area lleva consigo el cambio de la energıa potencial

dUp = γdA (1-3)

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12 1 Introduccion

que a su vez implica una variacion en el trabajo.

dW = −dUp = −γdA (1-4)

Si el cambio de la superficie se realiza en condiciones isotermicas, el trabajo requerido es

igual a la variacion de la energıa libre de Helmholtz (F )

dW = −dF (1-5)

de modo que la ecuacion 1-2 queda de la forma siguiente:

γ =

(dF

dA

)T

(1-6)

Teniendo en cuenta la primera ley de la termodinamica, el trabajo realizado por el sistema es

la ganancia total de energıa libre. Considerando lo escrito por Lamb [Sir Horace Lamb M.A.

LL.D. Sc.D. F.R.S., 1975] “Puesto que la condicion de equilibrio estable es que la energıa

libre sea un mınimo, la superficie tiende a contraerse tanto como sea consistente con las

demas condiciones del problema”, lo cual implica la existencia de una fuerza que dificulta el

aumento de la superficie del lıquido ayudando a la reduccion de este, es ası que en el pulmon

se hace necesario una sustancia que contraponga esta fuerza y evite el colapso pulmonar.

Desde la termodinamica la funcion energıa libre de Helmholtz se caracteriza por brindar

una informacion exhaustiva en torno a un sistema termodinamico, utilizando como variables

independientes la temperatura T , entropıa S, volumen V , presion P ; es ası que la funcion

potencial F se define de la forma:

F = U − TS (1-7)

Es conveniente para aquellos casos en que exista variaciones en la presion, la expresion

diferencial de la ecuacion 1-7 es:

dF = dU − TdS − SdT (1-8)

Y considerando la ecuacion Gibbs-Duhemde que es consecuencia de la primera ley de la

termodinamica,

TdS = dU +∑i

Widwi (1-9)

Donde∑

iWidwi es el termino que hace referencia al trabajo y puede ser dividido de la

forma:∑i

Widwi = PdV +∑i

W′

i dw′

i (1-10)

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1.3 Fenomenos superficiales 13

Donde∑

iW′i dw

′i constituye el conjunto de fuerzas generalizadas; de lo cual se infiere que

la energıa total de un sistema termodinamico complejo, en forma de trabajo, esta integrada

por diversas contribuciones. Por tanto∑

iW′i dw

′i se considera como el trabajo util o trabajo

no-mecanico y refleja la energıa en forma de trabajo como consecuencia del acoplamiento

del sistema con los alrededores [Tejerina Garcıa, 1977].

Entonces teniendo en cuenta la ecuacion 1-8 y 1-9, para un sistema complejo se obtienen:

dF = −SdT −∑i

Widwi (1-11)

Sustituyendo el trabajo segun la ecuacion 1-10, se obtiene el trabajo en todas sus contribu-

ciones, de acuerdo el sistema de trabajo.

dF = −SdT − PdV −∑i

W′

i dw′

i (1-12)

Considerando el trabajo que intervienen en la frontera de separacion de dos fases, el cual esta

relacionado con el coeficiente de tension superficial γ, se obtienen la funcion termodinamica

dada por:

dF = −SdT + γdA (1-13)

Esta funcion contiene la informacion necesaria en torno al sistema termodinamico. Es ası

que la primera derivada de la ecuacion 1-13 con respecto al area dA, permite determinar las

fuerzas generalizadas de la tension superficial, tal como se muestra en la ecuacion 1-6.

Podemos hablar de un trabajo mecanico si la superficie entre dos medios sufre una variacion

en su desplazamiento (dz), considerando un elemento de volumen infinitesimal (dzdA), entre

el punto inicial y final del desplazamiento de la superficie (ver figura 1-8). Teniendo en

cuenta que en la curvatura de una superficie interfacial, las presiones cercanas a la interfase

son diferente para ambas fases, siendo p1 y p2 las presiones en ambos medios [Landau and

Liftshitz, 1969], entonces podemos representar el trabajo necesario para realizar la variacion

de volumen como:∫(−p1 + p2) dzdA (1-14)

Donde el trabajo esta dado por la diferencia de presiones y el volumen desplazado. Por tanto,

el trabajo total debido al desplazamiento de la superficie, se obtiene sumando a la ecuacion

1-14 la variacion de area de la superficie dada por la tension superficial.

δW = −∫

(p1 − p2)dzdA+ γδA (1-15)

Considerando R1 y R2 como los radios de curvatura en un punto determinado de la super-

ficie (ver figura 1-8), cuando la superficie sufre un desplazamiento, se puede determinar la

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14 1 Introduccion

variacion total del area de la superficie de separacion, entre un momento inicial y otro final

el cual esta dado por [Landau and Liftshitz, 1969]:

δA =

∫dz

(1

R1

+1

R2

)dA (1-16)

Figura 1-8.: El esquema representa el cambio de volumen comprendido entre dos fases,

teniendo en cuenta una superficie de separacion inicial y final.

Estimando la exigencia de la condicion de equilibrio termodinamico en relacion al trabajo;

δW = 0, que es validado por el principio de mınima energıa, entonces se sustituye la expresion

1-16 en 1-15, y se obtiene la ecuacion de equilibrio del sistema:∫dz

{(p1 − p2)− γ

(1

R1

+1

R2

)}dA = 0 (1-17)

De la expresion entre llaves se reconoce la ecuacion de Young-Laplace:

p1 − p2 = γ

(1

R1

+1

R2

)(1-18)

Esta formulacion es estudiada desde 1805 por Young y Laplace, y esta relacionada con la

atraccion desequilibrada de las moleculas en la interfase, que conduce a la aparicion de fuer-

zas que actuan sobre el lıquido generando un incremento de presion a traves de una interfaz

curvada.

Recordando que los alveolos pulmonares presentan una forma ovalada figura 1-9, al reducir

el area superficial, el alveolo tiende a hacerse mas pequeno, por tanto cuanto menor es el

alveolo mayor es la presion que soporta sus paredes. La presion varia inversamente con el

radio y directamente con la tension superficial.

Se tiene un caso particular de la ecuacion 1-18 al considerar que los radios de curvatura

para el alveolo son R1 = R2 = R y solo se tienen en cuenta la presion interna puesto que la

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1.3 Fenomenos superficiales 15

externa esta en contacto con el tejido tisular es decir, p1 = p y p2 = 0; de esta manera la

expresion es de la forma:

p =2γ

R(1-19)

Sin embargo, lo anterior es un modelo para un alveolo, pero en el pulmon hay aproximada-

mente 150 millones de estos y se encuentran interactuando entre sı, ademas no todos tienen

el mismo radio de curvatura, lo cual implica un desequilibrio a nivel pulmonar, puesto que la

presion interna de los alveolos de menor radio es mayor, a diferencia de los de mayor radio;

como se observa en el esquema de la figura 1-9 para dos alveolos contiguos.

Figura 1-9.: Segun la ley de Laplace, dos alveolos esfericos de diferente radio, R1 y R2 , con

la misma γ y que estan interconectados, no pueden coexistir en equilibrio a

una presion determinada. La presion P1, en el alveolo de radio menor, tiende a

colapsarlo en el alveolo de radio mayor. El SP disminuye la tension superficial

de acuerdo con el tamano del alveolo, estabilizando la interfase contra las

fuerzas que tienden a su colapso. Tomado de [Ospina, 2011].

Lo que implica que al momento de la inspiracion los alveolos de mayor diametro sigan au-

mentando mas su volumen y se genere una diferencia significativa con los alveolos de menor

diametro. En cambio en el momento de la espiracion debido a la mayor presion en el alveolo

pequeno este libera mas aire llegando a un colapso; lo cual general el fenomeno llamado

atelectasia (disminucion del volumen pulmonar). Mientras que el alveolo de mayor diametro

incrementara su volumen respecto al aire que no sale del pulmon.

En este punto la naturaleza genera un mecanismo de homeostasis a partir de la formacion

y segregacion de surfactante pulmonar, el cual no solo disminuye la tension superficial sino

que tambien cambia el diametro alveolar, por eso se reduce el trabajo necesario para realizar

esta actividad, permitiendo llegar a un equilibrio pulmonar. Es ası que las concentraciones de

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16 1 Introduccion

surfactante pulmonar son mayores en los alveolos pequenos, haciendo que en ellos la tension

superficial sea menor, reduciendo la presion interna [Iglesias, 2007].

1.3.2. Presion superficial

El cambio en la tension superficial a menudo se describe en terminos de la presion superficial

(π). Matematicamente la presion superficial se define:

π = γ0 − γ (1-20)

Donde γ0 es la tension superficial de la subfase lıquida y γ es la tension superficial con una

pelıcula de surfactante. Tanto π como γ tienen las mismas unidades pero sus direcciones son

opuestas; es decir que cuando γ es grande la π es pequena. En consecuencia el lımite de la

presion superficial esta entre 0 ≤ π ≥ γ [Notter, 2000].

Mecanismo de medicion de la presion superficial en la interfase

El mecanismo utilizado para medir la presion superficial esta dado por la Balanza de Lang-

muir, la cual consta de una base, unas barreras, una cubeta en teflon, un sensor de superficie

de presion, denominado tambien brazo de balanza y una unidad de interfaz, como se muestra

en la figura 1-10. Las barreras o cintas son responsables de la compresion del tensioactivo

en la superficie, y el sensor es el encargado de medir la presion en la interfase durante la

compresion-expansion de SP.

Figura 1-10.: Sistema basico de la balanza de Langmuir. 1) Base, 2) Barreras, 3) Tina de

teflon, 4) sensor de presion de superficie, 5) Inmersor mecanico, 6) Unidad de

interfaz. Tomado del manual KSV NIMA.

El fundamento fısico de medicion de la presion superficial esta dado por la mecanica del brazo

de balanza, la cual presenta un sensor de fuerza anclado a la bandera de papel sumergida

verticalmente dentro del fluido como se muestra en la figura 1-11.

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1.3 Fenomenos superficiales 17

Figura 1-11.: Diagrama de la bandera. Tomado de [la Serna, 2006]

El extremo superior de la balanza, donde cuelga la bandera, permite la medida de la com-

ponente vertical de la fuerza que actua sobre la balanza al contacto con las moleculas super-

ficiales del lıquido, la cual coincide con la tension superficial.

La bandera al entrar en contacto con el lıquido se humedece y forma un menisco a lo largo

de la lınea de longitud de contacto, de esta manera se diagrama las fuerzas que interactuan

con la placa (Ver figura 1-11). Considerando la segunda ley de Newton se obtiene de manera

vectorial la sumatoria de fuerzas:

Σ~F = ~FE + ~Fγ + ~W = ~0 (1-21)

Descomponiendo en las coordenadas cartesianas x, y y z se obtiene;

ΣFj = FE − 2Fγy −W = 0

ΣFi = Fγx − Fγx = 0

ΣFk = Fγz − Fγz = 0

Donde:

FE = ρgV es el empuje, ρ es la densidad del fluido, g la gravedad y V hace referencia al volu-

men desplazado por la bandera, el cual se puede representar como lda, por tanto, FE = ρglda.

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18 1 Introduccion

Fγy = (l + a)γ0 cos θ donde l hace referencia a la linea de contacto a lo largo y a a lo ancho,

a pesar de ser a muy pequeno se toma en cuenta puesto que se hace un analisis completo

del sistema en el cual a escala molecular interviene de manera que no se puede despreciar,

γ0 denota la tension superficial de la superficie limpia, θ el angulo de contacto del menisco;

Fγx y Fγz, componente vertical, horizontal y profundo de la fuerza de tension superficial.

W = mg, el peso de la banderita, m es la masa de esta que a su vez se puede escribir como

ρbVb = ρblha.

Por tanto la ecuacion 1-21 se representa como:

F0 = ρgdla− 2(l + a)γ0 cos θ − gρblha (1-22)

La fuerza que experimenta la bandera en la subfase se establece considerando el material

de referencia, esta fuerza se encuentra en funcion de la tension superficial del lıquido, dada

por γ0 la cual tienen un valor de 72mNm

. La tension superficial se determina considerando

una diferencia de fuerzas F −F0; tomando como referencia la superficie limpia, es ası que al

agregar el surfactante pulmonar se inicia la toma de datos segun las variaciones al distribuirse

en la superficie. Al realizar la diferencia de fuerza se obtiene:

F − F0 = 2(l + a)(γ − γ0) cos θ (1-23)

Despejando la diferencia de tensiones se obtiene:

∆γ =∆F

2(l + a) cos θ(1-24)

La gran ventaja de este metodo es que la medida de la presion superficial se hace de forma

directa, ya que ∆γ = −∆π, y por lo tanto

∆π = − ∆F

2(l + a) cos θ(1-25)

Como se deduce de este desarrollo, el angulo de contacto es un aspecto crıtico para poder

realizar este tipo de medidas con precision: La clave de esta metodologıa consiste en conseguir

que este angulo sea realmente nulo o por lo menos conocido en todo momento, lo que requiere

ser especialmente cuidadoso con la eleccion del material de la bandera, ası como de la limpieza

del mismo [George L. Gaines, 1966].

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1.4 Ciclos isotermicos 19

1.4. Ciclos isotermicos

Para analizar el comportamiento dinamico de la pelıcula interfacial de surfactante pulmonar,

se estudia la presion superficial en funcion del area, a una temperatura constante, algunos de

los estudios mas usados son las isotermas de compresion (π−A) y ciclos isotermicos de com-

presion-expansion (π−A). Al modificar el area de la interfase se genera una re-organizacion

de las moleculas generando cambios en sus propiedades fısico-quımicas especıficas.

En la etapa de compresion, se tienen una fuente de calor a temperatura constante, la cual se

pone en contacto con el sistema, dado por el montaje de la balanza de Langmuir, la solucion

tamponadora y el SP; luego se inicia la reduccion del area interfacial a partir de la contrac-

cion de las barreras. Al no cambiar la temperatura tampoco varıa la energıa interna, ası que

considerando la primera ley de la termodinamica, nos permite comprender que se ejerce un

trabajo sobre el sistema relacionado con una transferencia de calor. Esta compresion genera

cambios en la organizacion de las moleculas denominadas fases moleculares de la interfase,

las cuales depende de la cantidad de materias, la velocidad de compresion de la barrera, y

la temperatura.

La etapa de expansion del ciclo isotermico inicia cuando el area superficial esta en su mınimo

valor, la extension lleva consigo la organizacion de las moleculas, aumentando el camino libre

medio entre las moleculas e insertando los componentes previamente excluidos durante la

compresion (fosfolıpidos insaturados, anionicos, colesterol) y cuya presencia habıa contribui-

do a fluidificar el material facilitando su adsorcion [Picardi, 2014].

El ciclo isotermico de compresion-expansion, se presenta como un proceso irreversible, pues-

to que se ha tenido que realizar un trabajo adicional relacionado con la organizacion de las

moleculas para que el sistema llegue a su estado inicial, el grado de irreversibilidad esta

relacionado con la histeresis del sistema, es decir el proceso directo e inverso no presenta

el mismo ordenamiento de los estados intermedios durante el proceso. Entre mayor sea la

histeresis mayor sera la irreversibilidad del sistema.

A continuacion se detallan las fases moleculares que ocurren en la interfase al momento de

reducir el area superficial del sistema.

1.4.1. Fases moleculares en la subfase

Analogamente a los tres estados de la materia que se observan en gases inmersos en un

volumen especifico, en una superficie las moleculas se organizan en la interfase aire-lıquido;

esta organizacion presenta tres fases;

Gaseoso (G): las moleculas estan expandidas en la subfase y no interactuan de manera

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20 1 Introduccion

significativa, por lo que la pelıcula obedece a una ley de dos dimensiones de los gases

ideales πS = kT .

Expandido (LE): Hay una interaccion entre las cadenas de la mono capa, ası que el

empaquetamiento molecular esta mas cerca que en las pelıculas de gases y la movilidad

es mas limitada.

Condensado (LC): En esta fase el comportamiento de la pelıcula es suficientemente

compresible ası que se puede hacer una analogıa con los lıquidos; por tanto presentan

una mayor viscosidad y una menor compresibilidad.

Tambien hay una transicion entre las fases gaseoso-expandido (G−LE) y expandido-condensado

(LE − LC), los cuales son relevantes en la interfase [Ospina, 2011].

Una forma de estudio de las propiedades de las monocapas de un material anfipatico esta

dado por la medicion de la presion superficial en funcion del area de la superficie a tempera-

tura constante y es conocido como isotermas de compresion un ejemplo de esta se representa

en la figura 1-12, que representa una pelıcula fosfolıpidica de DPPC.

Figura 1-12.: Se observa una grafica de una isoterma de compresion de una monocapa de

DPPC a 250C con las indicaciones de los estados dimensionales.

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1.4 Ciclos isotermicos 21

En la anterior figura se observa en la parte superior un fenomeno denominando colapso (C),

el cual se debe al punto donde no hay suficiente espacio disponible para acomodar todas

las moleculas en una sola capa debido a la compresion, por tanto se puede generar la for-

macion de multiples capas en la parte superior de la monocapa o algunas moleculas son

“expulsadas”(squeezed-out) debido a la energıa libre de los componentes con menor prefe-

rencia por la interfase [Arthur W. Adamson, 1997].

El paso de una forma ordenada a una desordenada no sucede de manera espontanea, sino

que requiere proporcionar una energıa externa al sistema, que usualmente se transfiere en

forma de calor. Cuando esta energıa ocasiona un aumento en la temperatura, es decir, au-

menta la energıa cinetica promedio, el sistema tiende a desordenarse. El paso de un estado

ordenado a uno desordenado sucede en muchos casos asociado a una transicion de fase, y

esta determinado por la temperatura a la que dicha transicion se produce [Ospina, 2011] .

1.4.2. Histeresis

La tendencia de un sistema a volver a su estado inicial de manera irreversible se denomina

histeresis. Los fenomenos de histeresis en las pelıculas de SP surgen cuando se comprimen y

se expanden de manera no equilibrada implicando una disipacion de energıa [Notter et al.,

1982]. El comportamiento de histeresis en la reduccion de la tension superficial de una pelıcula

interfacial de SP, hace referencia a la diferencia en los ciclos isotermicos de presion o tension

superficial en funcion del area (π −A) o (γ −A), como se observa en la figura 1-13. Varıas

son las variables que influyen en la histeresis de las pelıculas de SP, como es la temperatura,

la velocidad de compresion y la masa.

Area relativa (%)0 20 40 60 80 100

n su

perfi

cial

(mN

/m)

oTe

nsi

0

10

20

30

40

50

60

70

/min)2g - 25cmµC - 25 ormico (25eCiclo isot

Compresión

Expansión

Area relativa (%)0 20 40 60 80 100

n su

perfi

cial

(mN

/m)

oPr

esi

0

10

20

30

40

50

60

70

/min)2g - 25cmµC - 25 ormicos (25eCiclos isot

Compresión

Expansión

Figura 1-13.: A la izquierda se observa un ciclo isotermico (γ − A) a una temperatura de

250C, una masa de 25µg y una velocidad de compresion 25cm2/min con una

marcada histeresis. A la derecha se observa un ciclo isotermico de (π − A)

con las mismas condiciones.

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22 1 Introduccion

La histeresis pulmonar esta dada por las propiedades mecanicas de las pelıculas interfaciales,

que permite hacer una relacion entre el trabajo que debe hacer el pulmon durante los ciclos

respiratorios. En espiracion, la reduccion de area para expulsar aire mientras se alcanzan

bajas tensiones superficiales, y durante la inspiracion, el aumento de area superficial para

recambiar el area de los espacios aereos sin que aumente mucho la tension superficial. Este

trabajo se ve reflejado en el area encerrada en los ciclos isotermicos de compresion-expansion,

lo que constituye la histeresis, en el pulmon este debe ser realizado por los musculos invo-

lucrados en la fisiologıa respiratoria [Ospina, 2011, Notter et al., 1982, Escolar and Escolar,

2004].

La forma de la curva que describe la reduccion de tension superficial durante la compresion

de la pelıcula puede presentar en terminos generales dos morfologıas [Ospina, 2011]:

1. Las isotermas pueden, en primer lugar, aparecer como una lınea aproximadamente

recta, en donde a medida que el area superficial disminuye (compresion), la tension su-

perficial disminuye de manera proporcional y a medida que el area superficial aumenta,

durante la expansion, la tension superficial aumenta tambien con una dependencia li-

neal similar, regresando al valor inicial. En este tipo de curvas la histeresis se considera

practicamente nula, lo que quiere decir que el trabajo realizado por el pulmon es ex-

clusivo para la disminucion de la tension superficial [Picardi, 2014].

2. Cuando el trabajo realizado por el pulmon ademas de disminuir la tension superficial

debe reorganizar estructuralmente el material en la interfase, se observa al principio

una disminucion en la tension de forma proporcional con la disminucion de area, y

posteriormente la tension superficial se vuelve aproximadamente constante, lo cual es

denominado mesetas o plateaus, es donde el trabajo realizado por el pulmon se gasta en

reacomodar las moleculas en la interfase en vez de disminuir la tension superficial. Una

vez el material esta en las condiciones estructurales optimas, la compresion continua

reduciendo la tension superficial hasta llegar al squeeze-out.

El squeeze-out se presenta comunmente en pelıculas interfaciales con multicomponentes,

donde no todos tienen la misma energıa libre en la interfase, ni la misma movilidad para

abandonar la superficie durante el ciclo. Las moleculas expulsadas fuera de la interfase du-

rante la compresion no puede regresar o integrarse de nuevo a la pelıcula a un ritmo identico

durante la expansion, lo cual implica un mayor trabajo relacionado con un aumento de la

histeresis.

En la expansion de la pelıcula interfacial ocurre un fenomeno denominado, dinamica de re-

dispersion (dynamics respreading), en el cual las moleculas de SP expulsadas en el squeeze-out

son adsorbidas de nuevo en la pelıcula interfacial. Estas se pueden calcular con el estudio de

los ciclos consecutivos isotermicos (π − A) debido al desplazamiento de las curvas de com-

presion, puesto que esto muestra la materia que se ha perdido desde la interfaz. Pequenos

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1.4 Ciclos isotermicos 23

desplazamientos entre las sucesivas compresiones equivale a una mejor redistribucion de la

moleculas [Notter, 2000].

El papel de las propiedades mecanicas de las pelıculas de surfactante esta relacionado direc-

tamente con el trabajo necesario para estabilizar el pulmon en estados de alta compresion.

Entonces entre menos trabajo mecanico el pulmon sera mas eficiente y mas estable a medida

que se realizan los ciclos sucesivos de compresion-expansion, lo que significa una histeresis re-

ducida en las isotermas de los ciclos respiratorios. Adicionalmente las pelıculas de surfactante

deben mantener bajas tensiones superficiales aun cuando sean alteradas por movimientos,

desplazamientos, vibraciones, etc., eventos que pueden ocasionar un colapso de la pelıcula, y

el consiguiente aumento de la tension superficial en los estados de maxima compresion [Os-

pina, 2011].

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2. Objetivos

2.1. OBJETIVO GENERAL:

Describir y analizar isotermas de presion superficial en funcion del area, ciclos de

compresion-expansion, de pelıculas interfaciales de surfactante pulmonar, obtenidas

mediante la balanza de tension superficial tipo Langmuir.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Evaluar el comportamiento de la presion superficial en ciclos consecutivos de com-

presion-expansion de pelıculas interfaciales de surfactante pulmonar, en funcion de la

masa, la temperatura y la velocidad de compresion.

Analizar el trabajo de compresion y expansion de los ciclos consecutivos de presion

superficial en funcion del area, en pelıculas interfaciales de surfactante pulmonar.

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3. Materiales y Metodos

El material usado es de origen animal y proviene de los pulmones de especie porcina recien

sacrificados en la planta de desposte. Tambien se usaron una serie de soluciones necesaria

para la realizacion de protocolos. La metodologıa empleada incluye metodos de obtencion

del material de partida, ası como el metodo de obtencion y analisis de datos.

3.1. Materiales

3.1.1. Materiales de origen sintetico

Los materiales de origen sintetico se caracterizan por ser sustancias quımicas, necesarias para

la realizacion de los protocolos que permiten la extraccion purificacion y cuantificacion del

surfactante pulmonar.

Entres estos se uso: La sustancia tamponadora, que tienen la propiedad de mantener estable

el pH de una disolucion frente a la adicion de cantidades relativamente pequenas de acidos

o bases fuertes, siendo estas respectivamente el Tris 5mM y el NaCl 150mM . NaBr 0,

13 y 16 %, usadas en el gradiente de densidad para la purificacion del surfactante. Acido

ascorbico (Vitamina C) 10 %p/v; molibdato de amonio 2, 5 %p/v; fosfato de potasio mo-

nobasico KH2PO4 0,04mg/ml; son sustancias usadas para la realizacion de la cuantificacion

de fosfolıpidos. El agua utilizada en los experimentos fue agua destilada.

3.1.2. Surfactante Pulmonar de origen Porcino

El surfactante pulmonar se obtuvo a partir de lavados broncoalveolares de pulmones de cerdo

recien sacrificados, utilizando el metodo de aislamiento descrito por Curstedt y colaboradores

[Curstedt et al., 1987]. Para la escogencia de los pulmones, se visualizo que lucieran sanos,

que no presentaran nodulos y no tuvieran ningun corte en su superficie externa con el objetivo

de reducir los contaminantes de sangre.

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26 3 Materiales y Metodos

3.2. Metodo de obtencion del material

3.2.1. Lavado bronco-alveolar

A partir de un lavado bronco-alveolar de pulmones frescos de cerdo se obtienen el tensoactivo

pulmonar, el cual se basa en la instilacion por la traquea de una sustancia tamponadora de

pH basico, Tris 5mM y el NaCl 150mM , hasta una capacidad volumetrica aproximadamente

de 2, 5L en el par de pulmones. Se realizo masajes suaves en los tres lobulos pulmonares, con

el objetivo de permitir la liberacion del surfactante pulmonar. Luego la sustancia obtenida

se recolecto y filtro. La separacion de celulas y tejidos se realizo a partir de una cetrifugacion

a 1000g a 40C durante 5 minutos, se almaceno el sobrenadate y se elimino el sedimento

obtenido. Esta solucion, se denomina Lavado bronco-alveolar (LBA), que finalmente fue

almacenado a −20oC.

3.2.2. Extraccion y purificacion del surfactante pulmonar

Para obtener el surfactante pulmonar se realiza una serie de centrifugaciones consecutivas,

iniciando a 100000g a 40C durante 1 hora. El sedimento que se obtiene esta formado por

los agregados grandes del surfactante pulmonar, donde se encuentran los cuerpos lamelares,

la mielina tubular y otros componentes de tipo membranoso especıficos del surfactante,

responsables de una mayor actividad tensioactiva [Picardi, 2014]. Los sedimentos obtenidos

se recolectan y homogenizan, para continuar con la purificacion.

Luego se realiza una centrifugacion en un gradiente de densidad discontinuo, en la Ultracen-

trifuga Beckman. La preparacion se realizo a partir de soluciones 16 %, 13 % y 0 % de NaBr

en solucion salina de NaCl 0,15M. El material a centrifugar se situa como se muestra en la

figura 3-1. La centrifugacion se realiza a 100,000g a 4oC durante 2 horas y sin freno para no

romper el gradiente.

Figura 3-1.: Esquema del gradiente de densidad discontinuo. a. Comparacion de los gra-

dientes de densidad de Bromuro de sodio. b. Fraccion de surfactante obtenida.

Tomado de [Angela Alvarez, 2014]

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3.2 Metodo de obtencion del material 27

El surfactante purificado se recoge de la interfase entre el 0 % y 13 %, segun su densidad, y

se homogeniza en solucion salina. Finalmente de 2L de LBA se obtuvo entre 2 y 3mL de una

suspension blanquecina y densa que es el surfactante pulmonar nativo (SN) que se almacena

en alıcuotas de cantidad variable a −80oC.

3.2.3. Cuantificacion de fosfolıpidos

Se realiza por valoracion de fosforo segun el metodo de Rouser y colaboradores [Rouser et al.,

1966], en el cual se debe preparar una recta patron con una disolucion madre de 1mg/ml de

fosfato di-potasico monobasico, que debe ser diluida 1/20 es decir, 0.05 mg/ml.

Este metodo consiste en un previo secado de las muestras de SN y la curva patron. Luego

se realiza una mineralizacion de fosforo a partir de la adicion de acido perclorico (HClO4)

al 70 % (0, 45mL) en cada tubo donde se seco la muestra. Posteriormente se hace un calen-

tamiento de la muestra en bano de arena a una temperatura entre 250− 260oC durante 30

minutos. Se enfrıan los tubos y se agregan 3, 50mL de agua destilada, 0, 50mL de molibdato

de amonio (2,5 %p/v) y 0, 50mL de acido ascorbico (vitamina C) (10 %p/v) a cada mues-

tra. Despues se agitan los tubos con vortex y se incuban 7 minutos en agua 90oC, luego se

hace una interrupcion de la reaccion por medio de la inmersion de los tubos en agua con hielo.

Se mide la absorbancia de la sustancia coloreada en funcion de una longitud de onda de

820nm en un espectrofotometro de marca Agilent Cary. Este consta de una fuente de luz

“blanca” caracterizada por un espectro de emision continuo en un intervalo amplio de longi-

tudes de onda (en nuestro caso 325− 900nm) y de un monocromador que actua como filtro

optico transmitiendo un haz de luz de longitud de onda fija λ e intensidad I0. Este haz de

luz penetra en la cubeta de analisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a

la luz mide la intensidad del haz a la salida If (Ver figura 3-2).

Figura 3-2.: Esquema general de funcionamiento del espectrofotometro. Tomado de [Ange-

la Alvarez, 2014]

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28 3 Materiales y Metodos

El valor de absorbancia depende de la concentracion de fosforo en la muestra. Para determi-

nar la concentracion de fosfolıpido de las muestras, la absorbancia obtenida se interpola en

una recta patron realizada a partir de una solucion estandar de concentracion conocida de

fosfato inorganico (KH2PO4 0,05 mg/ml).

3.3. Metodo de obtencion y analisis de datos de isotermas

3.3.1. Balanza de Langmuir

Han sido varios los cientıficos involucrados en el estudio de las pelıculas superficiales, entre

ellos se destaca el fısico-quımico Irving Langmuir con el desarrollo de la herramienta de estu-

dio de la presion superficial de las monocapas, denominadas balanza de Langmuir [Ospina,

2011].

El instrumento que se uso para medir la tension o presion superficial de surfactante pulmo-

nar en funcion del area que ocupa la interfase aire-lıquido recibe el nombre de balanzas de

superficie (ver figura 3-3). En el presente trabajo se empleo una balanza de Langmuir fabri-

cada por Nima Technology. Esta balanza se ha empleado para la obtencion de isotermas de

compresion-expansion, tomando dos valores de temperatura controlados por un bano termos-

tatado que se encuentra en contacto con la balanza. Esta tecnica ha servido para establecer

la base de las diferentes hipotesis que han tratado de explicar el mecanismo de accion del

surfactante. Para obtener los ciclos de compresion-expansion se comprime lateralmente de

forma progresiva la pelıcula interfacial de material, lo que refleja de alguna forma un modelo

que pretende acercarse a la dinamica respiratoria, dado que la velocidad de compresion-

expansion en un adulto humano es de 20 ciclos por minuto 20C/min. Se trata por tanto de

analizar procesos dinamicos que ocurren en condiciones fuera del equilibrio [la Serna, 2006].

En estos experimentos el material se deposita una cantidad suficientemente pequena para

que se esparza por toda la superficie interfacial sin que aumente mucho la presion super-

ficial (< 10mN/m). Tras dejar equilibrar la interfase para que los diferentes componentes

se dispongan libremente en todo el area de la balanza de superficies, se comienza el pro-

ceso de reduccion progresiva del area interfacial monitorizando la presion superficial. Este

cambio progresivo de area disponible para las moleculas confinadas en la interfase produce

obligatoriamente una reorganizacion en el empaquetamiento de las moleculas interfaciales

inducido por presion lateral, de manera similar a como debe ocurrir en los pulmones durante

los procesos de compresion alveolar. La diferente reorganizacion del material en la estructura

interfacial genera transiciones de fase bidimensionales y aumentos de la presion superficial

por el mayor grado de empaquetamiento progresivo [la Serna, 2006].

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3.3 Metodo de obtencion y analisis de datos de isotermas 29

Area relativa (%)0 20 40 60 80 100

n su

perf

icia

l (m

N/m

)o

Pre

si

0

10

20

30

40

50

60

70

/min2g - 25cmµC - 25 ormicos A 25eCiclos isot

CICLOS

ciclo 1 ciclo 5 ciclo 10

Figura 3-3.: A la izquierda se presenta la balanza de Langmuir del laboratorio de Biofısica

de la Universidad Javeriana, PUJ; empleada para la obtencion de datos de

ciclos isotermicos de compresion-expansion como se observa al lado derecho.

La balanza de superficie se encuentra constituida por una cubeta de teflon, la cual tienen

a su alrededor una barrera movil que permite variar el area de la superficie del lıquido

agregado, solucion tamponadora. En la superficie del lıquido es incorporado el material

de estudio, surfactante pulmonar, por medio de una jeringa de Hamilton, y se procede a

esperar 10 minutos mientras este se distribuye por la superficie. Se debe tener en cuenta

que dentro del lıquido hay una bandera de papel absorbente, Bandera de Wilhelmy; de

geometrıa rectangular de largo 2,37cm, ancho 1,00cm y espesor 0,002cm, el cual al entrar

en contacto con la superficie del lıquido interacciona con las moleculas de la interfase, que

permite a traves de un sensor de fuerza dar los valores de presion superficial al variar el area

de superficie en los ciclos de compresion y expansion.

3.3.2. Analisis de Datos

Las graficas fueron realizadas a partir del uso de los paquetes que proporciona el sistema

ROOT, desarrollado por el CERN, que por ser codigo libre, permitio hacer un perfilamiento

para el analisis de los datos obtenidos por la balanza de Langmuir. Las graficas obtenidas

presentan la variacion de la presion superficial en funcion del area (Ver figura 3-3.derecha).

Este programa es de gran aplicacion para el analisis de datos cientıficos, y se implemento

para hallar el area de histeresis entre los ciclos de compresion-expansion. El anexo A muestra

el codigo que se uso para graficar los datos de presion superficial en funcion del area, mientras

que el anexo B, senala el codigo usado para hallar el trabajo dado por el area de histeresis

de los ciclos de compresion-expansion.

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4. Resultados

4.1. Valoracion de fosfolıpido de surfactante pulmonar

La concentracion de fosfolipidos de SP se determino al medir la absorbancia de dos purifica-

ciones de surfactante, SP1 y SP2. Para ello se realizo una interpolacion en una recta patron,

dada a partir de una solucion estandar de concentracion conocida de fosfato inorganico como

se observa en la tabla 4-1. Teniendo en cuenta los valores de la tabla 4-1, se determina la

relacion lineal entre la absorbancia (Ab) en funcion de la cantidad de fosfato (Cf ) presente

en la muestra (Ver figura 4-1).

Volumen Cantidad Absorbancia

(µl) (µmol) (Ab)

00 0

0 -0.0156

100.0037 0.0062

0.0037 0.0063

400.015 0.0663

0.015 0.0695

1000.037 0.1736

0.037 0.1956

25092 0.4973

92 0.4879

400147 0.7780

147 0.7934

Tabla 4-1.: Valores de la cuantificacion de

fosfolıpidos.

mol)µn (oConcentraci0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16

Ads

orba

ncia

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

/ ndf 2χ 0.001384 / 11

p0 0.004091± -0.006816

p1 0.05859± 5.387

/ ndf 2χ 0.001384 / 11

p0 0.004091± -0.006816

p1 0.05859± 5.387

ATLAS

pidosin de fosfoloValoraci

Figura 4-1.: Grafica de la absorbancia en

funcion de la cantidad de moles

de fosfato. Donde p0 hace refe-

rencia al punto de corte y p1 la

pendiente de la recta.

De la grafica anterior se obtiene una ecuacion lineal de la forma:

Ad = 5,39Cf − 0,007 (4-1)

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4.2 Ciclos isotermicos de compresion-expansion 31

Despejando la cantidad de fosfato (Cf ), se determina la concentracion de fosfolıpido con la

masa molar de la DPPC mediante la ecuacion:

C = mg/mlfosfolipido =Cf ∗ 734, 04(g/mol)

noµl(4-2)

De esta manera se obtuvo los datos de la Tabla 4-2, con el respectivo valor de concentracion

(C) para los dos muestras de SP.

Muestra SP Ab Cf C(mg/ml) X C(mg/ml) X CTotal(mg/ml)

SP1.1 0,36 0,06 50,79

51,0

49,5

SP1.2 0,37 0,07 52,17

SP1.3 0,36 0,06 50,65

SP2.1 0,16 0,03 47,83

48,0SP2.2 0,16 0,03 47,94

SP2.3 0,16 0,03 48,10

Tabla 4-2.: Valores de absorbancia cantidad de moles de fosfato y concentracion para las

muestras de surfactante pulmonar, para un volumen de 10µl 1/10 la muestra

SP1 y 1/20 la muestra SP2.

De la tabla se concluye que la concentracion del surfactante pulmonar es de 49,5mg/ml, lo

cual es un valor importante para estudiar la cantidad de materia que se aplica a la balanza

antes de realizar los ciclos de compresion-expansion.

4.2. Ciclos isotermicos de compresion-expansion

Los ciclos isotermicos de compresion-expansion realizados en la balanza de Langmuir per-

mite hacer una analogıa in vitro respecto a los ciclos fisiologicos de respiracion, en cuanto

al proceso per se de compresion-expansion. Para obtener los ciclos isotermicos se utilizo la

balanza de Langmuir descrita en la seccion 3.3.1, considerada como uno de los metodos mas

utilizado en el estudio de pelıculas interfaciales. Para ello se deposito el surfactante en la

interfase, por medio de una micro-jeringa, dejando caer pequenas gotas de SP, en diferentes

lugares dentro del area definida por la cinta de teflon que hace de barrera. A continuacion, se

dejo equilibrar la pelıcula permitiendo la reorganizacion del material durante 10 minutos. Al

cabo de este tiempo, se procedio a comprimir la pelıcula interfacial, permitiendo la obtencion

de los ciclos isotermicos de compresion-expansion.

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32 4 Resultados

Para este experimento se procedio a realizar diez ciclos consecutivos de compresion-expansion

(Ver figura 4-2) entre dos cotas maximas y mınimas de areas, 155−16cm2, evaluando el efec-

to de la cantidad de SP en la interfase (m), la temperatura (T ) y la velocidad de compresion

(v). La cantidad de surfactante estudiada fue de 10µg, 25µg y 50µg, ademas se considero

la variacion respecto a la razon de cambio del area por minuto, la cual se denomino como

velocidad de compresion de barrera, siendo los valores analizados los siguientes; 25cm2/min,

47cm2/min y 65cm2/min. Estos valores fueron tomados como referencia de experimentos

de la caracterizacion biofısica del surfactante como el planteado en el artıculo [Blanco et al.,

2012]. Las isotermas fueron obtenidas a temperaturas de 25oC ± 1 y 37oC ± 1; siendo la

primera una de las mas estudiadas y la segunda la temperatura fisiologica.

El ciclo isotermico presentado en la figura 4-2, es un experimento representativo donde se

evalua la variacion de la presion superficial en funcion del area (π−A), despues de al menos

tres repeticiones de 10 ciclos sucesivos, en la cual se grafica los ciclos 1, 5 y 10 representa-

dos por una linea densa de color y los ciclos intermedios de color negro tenue. Estos ciclos

presentan como caracterısticas, una temperatura constante de 250C, una masa de 25µg

y una velocidad de compresion de 25cm2/min, que es equivalente a una velocidad lineal

3, 7cm/min; en estas condiciones la pelıcula se comprime y expande a su menor velocidad

efectuando aproximadamente tres ciclos por minuto (3C/min). En el primer ciclo se pueden

determinar los cambios en la estructura interfacial dados por la compresion. A su vez se ob-

serva una maxima presion superficial de 61mN/m, que corresponde a una tension superficial

de 12mN/m, para una compresion de 90 %, pasando de 165cm2 a 16cm2. Se evidencia en el

ciclo 1 una pendiente poco pronunciada entre 45 y 50mN/m, conocida como “squeeze out o

plateau” relacionado con la organizacion de las moleculas sin que se genere un aumento de

la presion superficial. Mientras tanto al inicio de la expansion se observa una caıda drastica

de π desde 61mN/m hasta un valor aproximado de 40mN/m, lo cual implica un camino

diferente de retroceso, relacionado con el re-establecimiento de la pelıcula interfacial.

A medida que continuan los ciclos se observa que es menor la compresion para alcanzar

el valor mas alto de presion superficial, el cual se va reduciendo a medida que transcurren

los ciclos. En el ciclo 5 y 10 se percibe un cambio que permite estudiar la evolucion de las

curvas de histeresis a medida que se comprime y expande consecutivamente la pelıcula. Por

consiguiente, se tiene que el primer ciclo presenta una area de histeresis mayor, y a medida

que se forman los otros se reduce esta area, siendo menor en el ciclo 10, en el que se muestra

casi que un mismo camino tanto para la compresion y expansion de la pelıcula de surfactante,

tendiendo a un proceso reversible en el cual la disipacion de energıa del sistema es mınima.

El hecho de que el ciclo no vuelva sobre la primer curva y que se observe una reduccion del

valor maximo de π esta relacionado con la organizacion de las moleculas en la interfase, las

cuales se van acomodando en la fase de menor energıa.

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4.2 Ciclos isotermicos de compresion-expansion 33

Area relativa (%)0 20 40 60 80 100

n su

perf

icia

l (m

N/m

)o

Pre

si

0

10

20

30

40

50

60

70

/min2g - 25cmµC - 25 ormicos A 25eCiclos isot

CICLOS

ciclo 1 ciclo 5 ciclo 10 otros ciclos

Figura 4-2.: La grafica muestra los diez ciclos consecutivos de compresion-expansion a

250C, 25µg y 25cm2/min; donde solamente se remarcan los ciclos 1, 5 y 10.

La figura 4-3 expone una matriz de graficas de isotermas de compresion-expansion a 25oC,

en la cual las columnas indican las masas y las filas las velocidades. En la primer columna

se identifica, la variacion de la presion en funcion del area con respecto a una masa de 10µg

para las tres razones de cambio de area por minuto.

Se observa que la variacion de los ciclos es mınima en relacion al area de histeresis, por tanto

tienden a estar superpuestos, sin embargo a medida que transcurren los ciclos se requiere

una menor compresion para alcanzar los valores de presion superficial. Se puede decir que

el trabajo del sistema se mantiene para alcanzar una presion superficial en promedio, para

los tres ciclos, de 46mN/m equivalente a una tension de 26mN/m, comparando esta pri-

mer columna con las otras se indica que no presenta una meseta que caracterice el squeeze out.

En la columna 2 y 3 se observa que al aumentar la cantidad de surfactante, existe una

marcada meseta en la coordenada vertical entre 45 y 50mN/m, sin embargo el intervalo de

area en el que se presenta es menor para una cantidad de masa de 25µg que para 50µg, esto

debido a una menor transicion tridimensional del material [Schief et al., 2003]. En la columna

3 al efectuarse la expansion de la superficie los valores mınimos de π son aproximadamente

20mN/m y 10mN/m respectivamente para el ciclo 1 y 5 senalados en la grafica, lo cual no

ocurre con las otras masas pues estas llegan a un valor cercano a cero.

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34 4 Resultados

Comicos a 25aCiclos termodin

/min225cm

/min247cm

/min265cm

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

g µ 10

Ciclo 1

Ciclo 5

Ciclo 10

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

g µ 25

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

g µ50

0 20 40 60 80 100

n s

up

erf

icia

l (m

N/m

)

o P

resi

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

Area relativa 0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

Figura 4-3.: Ciclos isotermicos de compresion-expansion de SP a 25oC en funcion de la

cantidad de materia m; 10µg, 25µg y 50µg ubicado en las columnas y la velo-

cidad de compresion v 25cm2/min, 47cm2/min y 65cm2/min ubicado en las

filas.

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4.2 Ciclos isotermicos de compresion-expansion 35

Los valores mınimos de tension superficial, maximos de presion superficial, se observan cuan-

do hay gran masa, llegando a valores aproximados a 0mN/m, incluso a 50µg es alcanzado

con una menor area de compresion 39cm2, que equivale a un porcentaje de compresion de

72 %; mientras que a 25µg requiere una mayor compresion para obtener este valor siendo

aproximadamente 17cm2, es decir un porcentaje de compresion de 90 %. En la columna 3 a

pesar de obtenerse valores tan bajos de γ a una menor compresion, presenta mayor histeresis

en cada ciclo. Cabe destacar que el ciclo 10 a una masa de 50µg, es similar al primer ciclo

para una masa de 25µg, columna 2.

En la matriz al ver los cambios en la velocidad de compresion, se observa como influye la

cantidad de masa permitiendo obtener valores mayores de presion superficial al aumentar la

cantidad de surfactante sobre la pelıcula interfacial. Ası mismo se observan los tres cambios

de fase al momento de la compresion para las masas de 25µg y 50µg. En comparacion con la

masa 10µg se presenta mayor histeresis al aumentar la masa, aunque la columna dos referen-

ciada por una masa de 25µg en el ultimo ciclo, presenta en promedio con las tres velocidades,

una presion superficial 45mN/m y su histeresis es leve y semejante a la que se muestra en

los ciclos a 10µg, primera columna. De manera general para los ciclos isotermicos a 25oC no

se ven cambios significativos a medida que aumenta la velocidad de compresion a diferencia

de los cambios dados por la variacion de la masa.

Al graficar teniendo en cuenta el area relativa, se observa que a medida que se realiza los

sucesivos ciclos, la compresion es menor para alcanzar los mismos resultados de presion su-

perficial, esto se observa al aplicar masas de 10µg, 25µg a temperatura de 25oC. Cuando

se aplica 50µg de SP a la misma temperatura, cambian estos valores donde a medida que

transcurren los ciclos se necesita una mayor compresion para alcanzar valores cercanos a la

presion de equilibrio 45mN/m. Por otro lado el area de histeresis muestra que el trabajo

realizado es mayor cuando mas material se aplica a la interfase y mayor es la meseta que

representa la organizacion del material.

Los ciclos isotermicos de compresion-expansion a 37oC que se observan en la figura 4-4, pre-

sentan una marcada diferencia en la hiteresis en comparacion con los ciclos a 25oC, siendo

esta mayor a una temperatura de 37oC. Tambien se observa que estos no son estables en

cuanto al ordenamiento del material en el proceso de compresion, puesto que a esta tempe-

ratura, implica la necesidad de una mayor compresion para alcanzar valores altos de presion

superficial siendo estos valores en promedio 46,5mN/m, 53mN/m y 60mN/m para las res-

pectivas masas de menor a mayor; los cuales son valores menores a los alcanzados a 25oC.

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36 4 Resultados

Comicos a 37aCiclos termodin

/min225cm

/min247cm

/min265cm

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

g µ 10

Ciclo 1

Ciclo 5

Ciclo 10

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

g µ 25

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

g µ50

0 20 40 60 80 100

n s

up

erf

icia

l (m

N/m

)

o P

resi

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

Area relativa 0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

Figura 4-4.: Ciclos isotermicos de compresion-expansion de SP a 37oCen funcion de la can-

tidad de materia m; 10µg, 25µg y 50µg ubicado en las columnas y la velocidad

de compresion v 25cm2/min, 47cm2/min y 65cm2/min ubicado en las filas.

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4.2 Ciclos isotermicos de compresion-expansion 37

Los ciclos de la primer columna son similares a los de 25oC, alcanzan valores de π semejan-

tes, aunque a 37oC el primer ciclo presenta una mayor histeresis. En la columna 2 el primer

ciclo no coincide con los otros dos, presentando este primero una mayor histeresis y mayores

cambios en la compresion-expansion del material en la monocapa a diferencia de los ciclos a

25oC, desapareciendo estos cambios en los posteriores ciclos y estabilizando el trabajo que

se ejerce para el proceso de compresion-expansion coincidiendo en mayor medida el area de

histeresis a similares porcentajes de compresion. A mayor velocidad en el primer ciclo se

observa un valor mayor de presion superficial, aunque no es mucha la diferencia.

En la columna 3 se observa un aumento de area de histeresis en los tres ciclos. Al depositar el

material de SP en interfase, la presion superficial subio contundentemente a valores mayores

de 15mN/m, lo cual debe estar relacionado con el intervalo de area de la meseta que se

observa a valores de π entre 45mN/m y 50mN/m.

Para la velocidad de 47cm2/min se observa una trayectoria de compresion similar a la de los

ciclos 5 y 10, para un valor de masa de 50µg, sin embargo a una velocidad de 65cm2/min

se observa una gran disminucion del area de histeresis en los dos ultimos ciclos, incluso se

observa que los caminos de compresion y expansion son similares.

Cuando la interfase se re-expande, hay una fuerte caıda en la presion de la superficie causada

por los cambios estructurales en la interfase, relacionada con la re-insercion de material de la

superficie previamente excluido al momento de la compresion de la interfaz, esto se observa

en todas la graficas, sin embargo es mas notable cuando se ha aplicado una mayor cantidad

de SP (50µg). Pero solo a una temperatura de 37oC despues de este decaimiento de π se

presenta una meseta, denominadas mesetas de re-insercion.

Las isotermas a temperatura fisiologica (37oC) presentan un menor porcentaje de area de

compresion para los ciclos con una cantidad de SP de 10µg. En los ciclos a 25µg y 50µg el

primer ciclo alcanza el valor de presion de equilibrio a una menor compresion mientras que el

ciclo 5 y 10 requiere un mayor porcentaje de compresion. A pesar de esa menor compresion

para el ciclo 1 se requiere un mayor trabajo y es el unico ciclo que llega a valores mayores

de presion superficial, sin embargo a diferencia de una temperatura de 25oC los valores no

superan una presion mayor a (60mN/m) ası se aumente la velocidad del ciclo, por tanto se

requiere un mayor trabajo para reducir la tension superficial. Tambien se observa que para

el ciclo 1 la presion superficial en el proceso de expansion de la pelıcula interfacia, cae a un

valor mas bajo que el punto de partida del ciclo, lo que indica una perdida neta de material

de la interfase. De manera general el area de histeresis es mayor para los ciclos a temperatura

fisiologica con correspondiente masa de 25µg y 50µg.

Cabe destacar que los ciclos a 370C presentan un comportamiento distinto a los de a los

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38 4 Resultados

ciclos a 250C, por tanto hay que recordar que se trabaja con un sistema abierto que intenta

dar una semejanza in vitro de los procesos cıclicos de los pulmones, haciendo solo 3 ciclos

por minuto cuando en el sistema respiratorio se realizan 20 ciclos por minuto. Este com-

portamiento permite un mejor analisis de pelıculas interfaciales de SP a una temperatura

de 250C que a una fisiologica, puesto que se logra observar el ordenamiento de la pelıcula a

medida que se comprime y analizar la cantidad de trabajo necesaria para ello.

La re-organizacion de las moleculas esta relacionada con el trabajo que realiza el sistema y

ello se ve reflejado en la histeresis presente en los ciclos de compresion-expansion, como se

observa en la figura 4-5. Donde se ve una mayor area en el ciclo 1 y una reduccion signi-

ficativa en los ciclos 5 y 10, en los cuales tambien se observa una marcada reduccion de la

presion superficial.

Figura 4-5.: Area de histeresis para los respectivos ciclos de compresion-expansion a 25oC,

una masa de (25µg) y una razon de cambio de area de 25cm2/min. En color

gris se observa la histeresis del ciclo 1, en rosado el ciclo 5 y en verde el ciclo

10.

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4.2 Ciclos isotermicos de compresion-expansion 39

Al aumentar los ciclos se puede hablar de una menor compresion para alcanzar el valor de

la presion de equilibrio del sistema (45mN/m), siendo la compresion inicial de aproximada-

mente de un 85 %, la quinta un 80 % y la decima de 65 %; con la respectiva reduccion de

area de histeresis y por ende menor trabajo de re-organizacion; lo cual esta relacionado con

el comportamiento de la compresion a medida que transcurren los ciclos.

Para hallar los valores de trabajo realizado, se determino la mejor linea de tendencia que

ajusta los datos de compresion y expansion, la cual permitio obtener un ajuste polinomial

de grado 9, al integrar se obtuvo el area bajo la curva y de esa manera al hacer la diferencia

entre el valor hallado de compresion y expansion se consiguio el valor del area de histeresis,

la cual corresponde al trabajo realizado por la pelıcula de surfactante pulmonar para reorga-

nizar el material a medida que varıa el area, este trabajo se mide en Joules J y es del orden

de 1x10−6 como se muestra en la tabla 4-3 y 4-4.

Los resultados de la tabla 4-3 muestran como a medida que aumentan los ciclos el trabajo

se va haciendo menor; pero esto se evidencia solo para las masas de 10µg y 25µg, para una

cantidad de SP de 50µg el trabajo mayor es el del ciclo 1, se reduce en el ciclo 5 y vuelve a

aumentar en el ciclo 10, como se muestra en la tabla.

Histeresis ciclos a 25oC

v (cm2/min)

m (µg) 10 25 50ciclo

1x10−6 J 1x10−6 J 1x10−6 J

25

22,4 104 191 1

22,7 59,4 150 5

14,8 8,50 174 10

47

50,7 133 178 1

30,5 96,7 152 5

24,6 9,10 167 10

65

31,5 144 186 1

18,8 80,0 138 5

13,6 14,9 135 10

Tabla 4-3.: Valores calculados para el trabajo de compresion-expansion, representado por

el area de histeresis para los ciclos 1, 5 y 10; considerando la cantidad de SP

(m) y la velocidad de compresion (v) a una temperatura de 250C .

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40 4 Resultados

Considerando los ciclos de la figura 4-3 se observa tres condiciones por las cuales aumenta

el trabajo en el ciclo 10. La primera consiste en que para alcanzar la presion de equilibrio

(45mN/m), se requiere una mayor compresion en este ciclo. La segunda condicion esta rela-

cionada con la presencia de una meseta de re-organizacion de material con un porcentaje de

area relativa de ±25 %, la cual no se observa en los otros ciclos 10 a menor masa, los cuales

no alcanzan al squeezed-out. Por ultimo se destaca que al momento de la expansion el valor

de π se reduce rapidamente pasando de 72mN/m hasta ±28mN/m en un porcentaje de area

de ±5 %, esta diferencia de cambio de presion superficial es menor para el ciclo 1 y 5 de las

isotermas a 50µg para las tres velocidades.

Los valores de trabajo de los ciclos 10 a diferentes velocidades para una masa de 50µg son

aproximadamente iguales a los ciclos 1 para una velocidad de 47cm2/min y 65cm2/min a

una masa de 25µg. Comparando los ciclos 10 segun su masa presentan un mayor trabajo los

ciclos con un cantidad de SP de 10µg a diferencia de los ciclos a una masa de 25µg.

Las medidas de trabajo para los ciclos isotermicos a temperatura de 370C se observan en la

tabla 4-4, comparando con los resultados a 250C se observa que los primeros ciclos presentan

una mayor magnitud de histeresis y al igual que a 250C va disminuyendo al transcurrir los

ciclos; excepto para una masa de 50µg a velocidad de compresion de 25cm2/min. Compa-

rando los resultados de la tabla con la figura 4-4; se observa que a medida que se reduce el

porcentaje de compresion, menor es el trabajo visualizado en el area de histeresis; lo cual

se simplifica en que el porcentaje de compresion es proporcional a el trabajo realizado, en

dependencia de las propiedades de cada ciclo (m, v, T ).

Para una masa de SP de 50µg en las tres velocidades y en los tres ciclos el porcenta-

je de compresion es ±90 %, y unicamente en el ciclo 1 alcanza un valor de presion su-

perficial mayor, siendo estos de 57mN/m para un area de compresion de 25cm2/min,

63mN/m → 47cm2/min y 48mN/m → 65cm2/min. La histeresis para el ciclo 1 a una

masa de 50µg es menor para una velocidad de compresion de 25cm2/min; en la cual al ver

la figura 4-4, se observa dos diferencias en relacion a los otros ciclos 1 a mayor velocidad.

La primera diferencia consiste en que el ciclo inicia a una presion superficial mayor de

25mN/m y finaliza la extension a una presion superficial de ±15mN/m. La segunda esta

dada al momento de la expansion, donde el cambio de la presion superficial es menor en

comparacion a los ciclos a mayor velocidad siendo este un valor maximo de ±57mN/m has-

ta alcanzar un valor mınimo de ±35mN/m, con una diferencia de cambio de ±22mN/m,

mientras que el ciclo 1 a una v de 47cm2/min presenta una diferencia de reduccion de π

de ±31mN/m y para 65cm2/min es ±29mN/m, al ser mayor esta diferencia de cambio de

presion superficial dada fuerte caıda de π debido a la re-expasion de la interface de SP, mayor

es la histeresis en los ciclos.

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4.2 Ciclos isotermicos de compresion-expansion 41

Histeresis ciclos a 37oC

v (cm2/min)

m (µg) 10 25 50ciclo

1x10−6 J 1x10−6 J 1x10−6 J

25

85,4 288 204 1

17,5 19,3 238 5

11,0 15,9 271 10

47

30,2 293 342 1

10,5 19,4 243 5

6,60 10,9 271 10

65

45,9 256 291 1

11,5 25,7 103 5

9,30 19,3 100 10

Tabla 4-4.: Valores calculados para el trabajo de compresion-expansion, representado por

el area de histeresis para los ciclos 1, 5 y 10; considerando la cantidad de SP

(m) y la velocidad de compresion (v) a una temperatura de 370C.

La variacion de trabajo para una masa de 25µg es mayor en el primer ciclo, siendo alrededor

de 279 J y de aproximadamente 18 J la histeresis para los ciclo 5 y 10 en las tres velocidades

de compresion; los valores de los ciclos 5 y 10 indican que la pelıcula ha alcanzado un estado

estable y la composicion de la monocapa se mantiene sin cambios durante las compresiones

y expansiones posteriores. Al comparar los ciclos 10 para una masa de 10µg y 25µg los

resultados de la tabla muestran que es mayor el trabajo a mayor masa y a una temperatura

fisiologica, lo cual es contrario a los valores de trabajo a una temperatura de 250C.

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5. Discusion de resultados

Los resultados de la caracterizacion del comportamiento de las pelıculas de surfactante pul-

monar se obtuvieron a traves del analisis de ciclos consecutivos de compresion-expansion, a

temperatura constante y considerando los cambios en funcion de la cantidad de materia y

la velocidad de compresion de las pelıculas. De esta manera, fue posible evaluar la capaci-

dad de las pelıculas interfaciales para alcanzar las maximas presiones al final del ciclo de

compresion y alcanzar las mınimas presiones al final de la expansion. Este estudio se realizo

a partir del trabajo mecanico externo que le conferıa la balanza al realizar la compresion

lateral de forma progresiva a la pelıcula interfacial de material, reflejando de alguna manera

el tipo de procesos que deben ocurrir durante la respiracion. Es importante considerar que el

analisis que se presenta a continuacion se hizo a procesos de compresion-expansion in vitro

, que ocurren en condiciones fuera del equilibrio, donde las condiciones de trabajo externo

son importantes para medir el trabajo de la pelıcula interfacial.

De manera general se obtuvo informacion acerca de la maxima presion que las pelıculas pue-

den alcanzar al final de la compresion, el plateau asociado a la reorganizacion tridimensional

de la pelıcula interfacial de SP y la histeresis asociada a la cantidad de energıa disipada a la

hora de aumentar la presion superficial.

El surfactante pulmonar es un tensoactivo natural, que debido a su composicion lipo-proteica,

permite reducir los valores de tension superficial en la interfase aire-lıquido-alveolar, lo cual

esta relacionado con valores maximos de presion superficial. En este estudio in vitro de

pelıculas interfaciales de surfactante pulmonar, se determino valores maximos de presion

superficial a una mayor cantidad de surfactante pulmonar dada por 50µg como se observa en

la tabla 5-1; donde para las tres razones de cambio de area a una masa de 50µg tanto el ciclo

1 como el ciclo 10 a 25oC alcanzan una presion superficial de 72mN/m, indicando valores de

tension superficial cercanos a 0mN/m, para un porcentaje de compresion de ±75 %. A una

masa de 25µg para el ciclo 1 se requiere un mayor porcentaje de compresion y una mayor

velocidad de compresion para alcanzar una presion superficial de 72mN/m. Cuando se aplica

una menor cantidad de SP, como es el caso de 10µg, la presion maxima alcanzada fue de

43mN/m, valor por debajo de la presion de equilibrio.

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43

Valores de presion superficial para los ciclos 1 y 10 a 25oC

v (cm2/min)

m (µg) 10 25 50ciclo

πm(mN/m) A( %) πm(mN/m) A( %) πm(mN/m) A( %)

25 43 90 61 90 72 73

147 48 90 72 80 72 75

65 48 90 72 90 72 76

25 42 76 45 68 72 81

1047 47 77 45 70 72 87

65 48 77 46 74 72 78

Tabla 5-1.: Valores de presion superficial maxima (πmax), y el area relativa de compresion

para alcanzar dicho valor (A%), para el primer y decimo ciclo de compresion-

expansion de las isotermas (π − A) a temperatura de 25OC en funcion de la

masa m y la velocidad de compresion v.,

El aumento de la temperatura de la isoterma de compresion-expansion a una temperatura de

37oC, se observa en la tabla 5-2, donde el mayor valor de presion superficial fue de 63mN/m

para una masa de 50µg y un porcentaje de compresion mayor al usado a una temperatura

de 25oC. Es ası que a una temperatura fisiologica in vitro se requiere una mayor compresion

para alcanzar valores altos de presion superficial, lo cual se encuentra relacionado con la

dificultad que presentan las moleculas para poder organizarse, reflejandose en una mayor

histeresis dada por un mayor trabajo que se requiere hacer sobre la pelıcula interfacial de

SP. Al transcurrir los ciclos de compresion-expansion se observa que el valor de la presion

superficial disminuye para el ciclo 10 y requiere un menor valor de porcentaje de compresion

para alcanzar presiones cercanas a la presion de equilibrio.

Los ciclos de compresion-expansion muestran una marcada diferencia en las isotermas de

temperatura, viendose a temperatura fisiologica mayor dificultad para alcanzar menores

valores de tension superficial, es decir mayores valores de presion superficial. Se destaca que

a mayor velocidad se alcanzan mayores valores de presion superficial para los ciclos a 25oC;

sin embargo a 37oC se observan valores mayores de presion superficial a una velocidad menor.

En los ciclos a 50µg, a una temperatura de 25oC se observa que para el ciclo 10 requiere un

mayor porcentaje de compresion a diferencia de el ciclo 1, lo cual diverge con los otros ciclos

de manera general para las dos temperaturas, puesto que es en el primer ciclo donde, por lo

general en estudios in vitro, se requiere una mayor compresion para organizar el material.

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44 5 Discusion de resultados

Valores de presion superficial para los ciclos 1 y 10 a 37oC

v (cm2/min)

m (µg) 10 25 50ciclo

πm(mN/m) A( %) πm(mN/m) A( %) πm(mN/m) A( %)

25 48 90 49 83 57 90

147 46 90 55 90 63 90

65 46 90 57 89 48 90

25 46 76 39 69 48 90

1047 44 71 44 66 50 90

65 44 76 46 70 46 82

Tabla 5-2.: Valores de presion superficial maxima (πmax), y el area relativa de compresion

para alcanzar dicho valor (A%), para el primer y decimo ciclo de compresion-

expansion de las isotermas (π − A) a temperatura de 37oC en funcion de la

masa m y la velocidad de compresion v.

Los cambios de temperatura pueden alterar el estado fısico y la densidad de empaqueta-

miento de los lıpidos en la interfase aire-lıquido [Daniels et al., 1999], alterando la actividad

superficial del surfactante. Sabiendo que la temperatura esta relacionada con la energıa

cinetica media de las moleculas [Kikoin, 1971], se debe tener en cuenta la diferencia entre

las dos isotermas, puesto que para una temperatura mayor el desorden aumenta, ası que

entre mas ordenada se encuentre una molecula de fosfolıpido, menor energıa conformacional

tendra [Ospina, 2011]. Por tanto es mayor el desorden molecular en una temperatura de

37oC, lo cual implica un mayor trabajo para ordenar las moleculas en la pelıcula interfa-

cial de SP, implicando una dificultad para aumentar la presion superficial. A continuacion

se detallan las graficas de los ciclos 1 y 10 para las diferentes masas y para los dos va-

lores de isotermas que se tienen, los cuales se observan en la figura 5-1 y 5-2. Donde se

logra diferenciar la cantidad de trabajo a medida que se comprime la pelıcula interfacial, de

acuerdo a la cantidad de material aplicado y la velocidad de compresion para los ciclos 1 y 10.

En la figura 5-1 se observa la grafica de ciclos isotermicos 1 y 10 de compresion-expansion

a una temperatura de 25oC, para las tres variaciones de cantidad de SP. Se detalla que

para el primer ciclo a 10µg y 25µg requiere una mayor compresion para alcanzar valores

altos de presion superficial, mientras que al transcurrir el ciclo 10 se reduce el porcentaje

de compresion reduciendose tambien el valor de la presion superficial. Es importante aclarar

que para una mayor cantidad de material se requiere una menor compresion para alcanzar

la presion de equilibrio ±45mN/m en los ciclos 1. En los ciclos 10 se observa que para

una masa de 10µg y 25µg se alcanza la presion de equilibrio para el mismo porcentaje de

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45

compresion, mientras que para una masa de 50µg requiere una menor compresion, la cual

es mayor a la del ciclo 1. A medida que aumenta la cantidad de SP se alcanza con mayor

facilidad valores altos de presion superficial, sin embargo se observa de manera atıpica,

respecto a las otras masas, que para 50µg se requiere una menor compresion en el ciclo 1 y

una mayor compresion en el ciclo 10. Es importante recalcar que para los ciclos 1 a una masa

de 25µg y 50µg despues de llegar a la presion de equilibrio se observa una meseta la cual

esta relacionada con la reorganizacion tridimensional de la pelıcula interfacial de surfactante,

este empaquetamiento molecular de los fosfolıpidos permiten dar un impulso a que aumente

la presion superficial a valores mayores de la presion de equilibrio como se observa en la

grafica. En los ciclos 10 solo se observa la meseta en los ciclos que presentan mayor cantidad

de surfactante.

Ciclos a 25°C

Figura 5-1.: Ciclos 1 y 10 (π − A) a 25oC,

detallados por color segun su

masa y graficados para las tres

velocidades de compresion.

Ciclos a 37°C

Figura 5-2.: Ciclos 1 y 10 (π − A) a 37oC,

detallados por color segun su

masa y graficados para las tres

velocidades de compresion.

En la figura 5-2 se observan los ciclos isotermicos 1 y 10 a una temperatura de 37oC, los

cuales presentan similitudes a las isotermas a 25oC respecto a la diferencia de porcentajes

de compresion en relacion al alcance de la presion superficial de equilibrio. Es notable que

para estos ciclos no se alcanzan valores tan altos de presion superficial y los ciclos donde se

observa la mesetas de organizacion, presenta un mayor porcentaje de area en relacion a la

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46 5 Discusion de resultados

temperatura de 25oC.

En la progresiva compresion de la superficie interfacial de SP, las moleculas de la pelıcula

interfacial empiezan a organizarse, esta distribucion se observa en los ciclos isotermicos de

la figuras 5-3 y 5-4, los cuales muestran el ciclo 1 a una masa de 25µg y una tasa de

compresion de 65cm2/min para una temperatura de 25oC y 37oC respectivamente. A medida

que es comprimida la pelıcula de SP, se puede identificar el cambio de fases de la pelıcula de

acuerdo a la variacion de la pendiente ( πA%

), llamado coeficiente de compresibilidad el cual

relaciona la re-organizacion de las moleculas, de acuerdo al trabajo realizado por las cintas

de la balanza de Langmuir. Esto permite identificar unas fases que adopta la membrana a

medida que transcurren los ciclos.

Figura 5-3.: Pendientes de compresion-

expansion del primer ciclo

isotermico para una masa de

25µg, una velocidad de compre-

sion de 65cm2/min para una

temperatura de 25oC

Figura 5-4.: Pendientes de compresion-

expansion del primer ciclo

isotermico para una masa de

25µg, una velocidad de compre-

sion de 65cm2/min para una

temperatura de 37oC

En la figura 5-3 el ciclo 1 a 25oC presenta en el ciclo de compresion cuatro pendientes ca-

racterısticas. La pendiente de color rojo aumenta de 0mN/m a ±17mN/m en un porcentaje

de compresion de 35 %, dado por un valor de pendiente de 0, 5mN/m%, lo que significa una

pelıcula de alta compresibilidad. La pendiente aumenta a medida que se comprime la pelıcula

(color azul), entre 17 y ±45mN/m, que denotan una pelıcula menos compresible siendo el

valor de la pendiente de 1, 5mN/m% para un porcentaje de compresion de aproximadamen-

te 25 %, esta pendiente esta relacionada con un estado o fase denominada lıquido-expandida

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47

(LE). Luego aparece una meseta (color verde) entre 45 y ±50mN/m, donde los lıpidos insa-

turados son generalmente incapaces de mantener presiones superficiales altas, y se empujan

hacia fuera de la interfaz hacia un deposito de material situado debajo de la pelıcula [Alonso

et al., 2004], por tanto el trabajo que se realiza esta dado en reorganizar la pelıcula y no en

aumentar el valor de la presion superficial, esta pendiente esta relacionada con el plateau.

La ultima pendiente (Color naranja) corresponde a una pelıcula menos compresible que la

pendiente azul con un valor de 2, 6mN/m% para una compresion menor a un 5 % donde los

valores de presion superficial va de 50mN/m a el valor maximo alcanzado de ±60mN/m;

esta pendiente ilustra el enriquecimiento en lıpidos saturados y acidos grasos que forman las

fases mas condensada de la pelıcula de SP [Alonso et al., 2004]. En el ciclos 10 en las mismas

condiciones no se observa esta ultima pendiente.

En el ciclo de extension se observan dos pendientes de expansion relacionadas con la re-

insercion y des-empaquetamiento de las moleculas hasta llegar a la fase gaseosa donde la

presion superficial es cero, la pendiente rosada es de 8, 6mN/m% donde hay un cambio

grande de presion superficial de 72mN/m a 35mN/m en un porcentaje de expansion de

5 %. La pendiente azul aguamarina presenta un valor de 0, 5mN/m% con un porcentaje de

compresion de 70 %.

Para una temperatura fisiologica se observa en el ciclo de compresion 4 pendientes carac-

terısticas (Ver figura 5-4), en las cuales no se observa una pendiente relacionada con la

fase gaseosa, sino que se observa que al aplicar el material a esta temperatura la presion

superficial aumenta a ±15mN/m y al empezar a comprimir la pelıcula de SP la pendiente

se comporta de manera analoga a una pelıcula en una fase lıquido expandida (LE); siendo

la pendiente de 0, 9mN/m% hasta alcanzar una presion de 42mN/m para un porcentaje

de compresion dado por 30 %. A continuacion se observa La pendiente relacionada con un

marcado plateau, la cual tiene un porcentaje de compresion mayor que a una temperatura

de 25oC, siendo este de aproximadamente 45 % presente entre 42mN/m y 49mN/m; lo que

indica que requiere una mayor compresion para organizar las moleculas de la pelıcula. La

fase condensada dada por la pendiente de color naranja, presenta un valor menor que a 25oC

y esta es de 2, 0mN/m%, a su vez se observa que el valor de la presion superficial tambien

es menor al alcanzado a 25oC siendo este de 55mN/m. Al continuar la compresion, como los

fosfolıpidos y demas moleculas ya se encuentran en su estado de mayor empaquetamiento

ocurre en la pelıcula una especie de ruptura o escape de moleculas de menor energıa libre a

una tercera dimension formandose unos reservorios de material, lo cual es denominado como

colapso y se observa en la grafica como la pendiente horizontal de color amarillo, la cual

tiene un valor muy pequeno de 0, 3mN/m%.

En la expansion se observan tres pendientes relacionadas con la re-insercion del material

expulsado en el momento colapso. La pendiente de color rosado, dada por el inicio de la

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48 5 Discusion de resultados

re-extension despues de pasar por el estado de colapso, presenta un valor de 4, 2mN/m%

para un porcentaje de expansion de mas o menos 5 % y un cambio de presion de 56mN/m

a 29mN/m, a continuacion de color aguamarina le sigue una pendiente de 0,7mN/m% con

un porcentaje de compresion de 25 % hasta alcanzar una presion superficial de ±20mN/m

y finaliza con una pendiente de 0,4mN/m% la cual podrıa estar en una fase gaseosa, donde

es evidente la ”perdida de material”puesto que el ciclo de compresion inicio a una presion

superficial de ±15mN/m.

De esta manera se destaca como en ambas temperaturas se observan unos cambios confor-

macionales que presentan ciertas diferencias las cuales se reflejan en los valores de presion

superficial y el trabajo necesario para alcanzar dicha presion.

Este trabajo presenta la caracterizacion biofısica dinamica de pelıculas interfaciales de sur-

factante pulmonar, mediante isotermas de compresion-expansion, que son los ciclos termo-

dinamicos, presentando a la comunidad cientıfica, calculos relacionados directamente con el

trabajo de compresion requeridos para alcanzar mınimas tensiones superficiales. Este tema

es de vital importancia en el estudio del surfactante pulmonar, dado que en el ser vivo se

espera que dicho trabajo sea mınimo, tanto en el momento del nacimiento, como en su pro-

ceso fisiologico de respiracion.

Un mayor costo energetico a menor masa se SP soporta la hipotesis que un ser vivo con un

SP inhibido, debe realizar mayor trabajo en el proceso de la respiracion, lo cual dificulta el

proceso de intercambio gaseoso.

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6. Conclusiones y recomendaciones

6.1. Conclusiones

Los estudios de ciclos isotermicos de compresion-expansion de pelıculas interfaciales de sur-

factante pulmonar, segun los cambios de temperatura, cantidad de masa y velocidad de

compresion dio como resultado las siguientes conclusiones:

1. La aplicacion en la interfase de una cantidad de surfactante de 10µg a una temperatura

de 25oC y 37oC, no es suficiente para alcanzar valores de presion mayores a la presion

superficial de equilibrio ±43mN/m, a pesar de que su porcentaje de compresion sea

de 90 % y se aumente la velocidad de compresion.

2. La variacion de los ciclos a 10µg y temperaturas de 25oC y 37oC es mınima y su

histeresis presenta valores pequenos de trabajo de aproximadamente 25, 5x10−6J .

3. Para las temperaturas de 25oC y 37oC se concluye que a medida que se aumenta la

cantidad de material en la pelıcula interfacial, es mas factible que se alcancen valores

de presion superficial cercanos a 72mN/m, aumentando a su vez el trabajo realizado.

4. A 25oC para masas de 25µg y 50µg se evidencia una aumento de la presion superficial

a valores cercanos a 72mN/m en la primer compresion, sin embargo se destaca que

se requiere un porcentaje de compresion mayor para 25µg. Para llegar a estos valores

de presion superficial se requiere un mayor trabajo debido a la organizacion de las

moleculas, siendo para el ciclo 1 con una masa de 25µg aproximadamente para las tres

velocidades de 127x10−6J y para una masa de 50µg el trabajo presenta un valor de

185x10−6J .

5. A medida que transcurren los ciclos se requiere un menor trabajo de compresion y

se alcanzan menores valores de presion superficial, un ejemplo de ello son los ciclos

isotermicos a 25oC con una cantidad de SP de 25µg donde el primer ciclo presenta

una presion superficial de 61mN/m correspondiente a un trabajo de 104x10−6J y el

ciclo 10 presenta una presion de 45mN/m y un menor trabajo dado por un valor de

8, 50x10−6.

6. A 37oC para masas de 25µg y 50µg alcanza valores de presion superficial del orden

de ±60mN/m menores a las de 25oC y con mayor trabajo en los ciclos 1, siendo este

valor en promedio de 279x10−6J para una masa de 25µg; y de 300x10−6J para 50µg.

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50 6 Conclusiones y recomendaciones

7. El trabajo realizado esta directamente relacionado con las fases fosfolipıdicas en las cua-

les se encuentra organizado el material surfactante en la interfase. Estas fases transitan

de una fase lıquida a una fase condensada, pasando por mesetas de exclusion-reinsercion

de lıpidos.

6.2. Recomendaciones

Con el objetivo de fomentar la investigacion en las pelıcula de surfactante pulmonar se su-

giere algunos posibles estudios que se pueden realizar para complementar este trabajo. Entre

estos se encuentra un estudio reologico de la pelıcula interfacial de surfactante pulmonar, el

cual podrıa brindar informacion referente a las propiedades de dilatacion de la monocapa,

permitiendo saber la viscosidad y elasticidad de esta sustancia y su influencia en la funcion

del SP, valores que se podrıan relacionar con los datos de compresibilidad mostrados previa-

mente. Tambien es importante realizar estudios que permitan obtener informacion detallada

por separado de la composicion del surfactante pulmonar, es decir de su porcion proteica y

lipıdica, a partir de columnas cromatograficas, para realizar comparaciones con los datos de

literatura publicados.

De esta forma se permitira identificar un surfactante nativo que pueda compararse con prepa-

raciones terapeuticas de surfactante pulmonar, como el Surfacen, Curosurf, Survanta, entre

otras; posibilitando la preparacion de surfactantes nativos y/o mixtos de origen colombiano.

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A. Anexo: Codigo de las graficas de

ciclos isotermicos

void ciclos(){

ifstream infile, infile2;

ifstream infile3, infile0;

infile0.open("ciclo4.dat");

infile.open("ciclo1_25_25_37.dat");

infile2.open("ciclo2_25_25_37.dat");

infile3.open("ciclo3_25_25_37.dat");

int i=1;

double area0[1000];

double ps0[1000];

double area[1000];

double ps[1000];

double area2[1000];

double ps2[1000];

double area3[1000];

double ps3[1000];

while(!infile.eof())

{

i++;

infile0 >> area0[i];

infile0 >> ps0[i];

infile >> area[i];

infile >> ps[i];

infile2 >> area2[i];

infile2 >> ps2[i];

infile3 >> area3[i];

infile3 >> ps3[i];

}

TMultiGraph *mg = new TMultiGraph();

mg->SetTitle("CICLOS ISOTERMICOS

(25^{o}C - 25 #mug - 25cm^{2}/min)");

TCanvas *c1 = new TCanvas("c1","ciclo

termodinamico",0,0,900,1000);

c1->SetFillColor(10);

TGraph *gr0=new TGraph(i,area0,ps0);

gr0->SetLineColor(0);

gr0->SetMarkerStyle(0);

gr0->SetMarkerColor(0);

gr0->SetMarkerSize(0.7);

//--------------------------

TGraph *gr1=new TGraph(i,area,ps);

gr1->SetLineColor(20);

gr1->SetMarkerStyle(20);

gr1->SetMarkerColor(1);

gr1->SetMarkerSize(0.7);

//-----------------------------

TGraph *gr2=new TGraph(i,area2,ps2);

gr2->SetLineColor(20);

gr2->SetMarkerStyle(31);

gr2->SetMarkerColor(2);

gr2->SetMarkerSize(0.7);

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52 A Anexo: Codigo de las graficas de ciclos isotermicos

//-----------------------------

TGraph *gr=new TGraph(i,area3,ps3);

gr->SetLineColor(20);

gr->SetMarkerStyle(22);

gr->SetMarkerColor(3);

gr->SetMarkerSize(0.7);

//-----------------------------

mg->Add(gr0,"");

mg->Add(gr1,"lp");

mg->Add(gr2,"lp");

mg->Add(gr,"lp");

mg->Draw("a");

mg->GetYaxis()->SetTitle("PRESION

SUPERFICIAL(mN/m)");

mg->GetXaxis()->SetTitle("AREA(cm^{2})");

//-----------------------------

TLegend* leg = new TLegend

(0.1, 0.8, 0.48, 0.9);

leg->SetHeader("CICLOS");

leg-> SetNColumns(3);

leg->AddEntry(gr1,"ciclo 1","lp");

leg->AddEntry(gr2,"ciclo 5","lp");

leg->AddEntry(gr,"ciclo 10","lp");

leg->Draw();

}

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B. Programacion Analisis de datos de

las isotermas

#include <iostream>

#include <stdlib.h>

#include <stdio.h>

#include <math.h>

#include <fstream>

#include "TMath.h"

const int arrMax = 10000;

void integrate() {

ifstream inFileExp, inFileCom;//

double x[arrMax], y[arrMax];

double xx[arrMax], yy[arrMax];

inFileExp.open("expan_org.dat");

inFileCom.open("compre.dat");

int n = 0;

while(!inFileExp.eof()){

n++;

cout << "n: " << n << endl;

inFileExp >> x[n];

inFileExp >> y[n];

cout << x[n] << " " <<

y[n] << " " << n << endl;

}

inFileExp.close();

int nn = 0;

while(!inFileCom.eof()){

nn++;

cout << "nn: " << nn << endl;

inFileCom >> xx[nn];

inFileCom >> yy[nn];

cout << xx[nn] << " " <<

yy[nn] << " " << nn << endl;

}

inFileCom.close();

TGraph *gExp=new TGraph(n,x,y);

gExp->SetMarkerColor(1);

TGraph *gCom=new TGraph(nn,xx,yy);

gCom->SetMarkerColor(2);

gExp->Draw("A*");

gCom->DrawClone("P*");

cout << "integral expan: "

<< gExp->Integral() <<endl;

cout << "integral compr: "

<< gCom->Integral() <<endl;

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