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Instituto de Histologia e Embriologia Abel Salazar Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Coordenao: Dr Sandra Rebelo

Relatrio de estgio realizado por: Patrcia Alves, aluna do 10 ano, Escola Secundria de guas Santas, Maia Joo S, aluno do 10 ano, Escola Secundria Alcaides de Faria, Barcelos

Porto, 9-20 de Agosto de 2004

A arte em movimento: a clula

Introduo

No dia 9 de Agosto, inicimos um estgio no Instituto de Histologia e Embriologia Abel Salazar, da Faculdade de Medicina na Univerisade do Porto, orientado pela Dr Sandra Rebelo no mbito do Programa Cincia Viva, denominado Ocupao dos Jovens no Vero.

A arte em Movimento: a clula o ttulo do estgio em que participmos, no entanto, como este tema muito vasto e abstracto, especificmo-nos nas reas da Biologia Molecular e Histologia. Os nossos objectivos ao participarmos neste estgio eram profundar os nossos conhecimentos, realizar novas experincias, ambientarmo-nos com o local de trabalho dos cientistas e, o mais importante, constatarmos se o nosso futuro profissional passa pela rea da cincia.

Neste relatrio, apresentaremos de forma sucinta as experincias mais relevantes que realizmos durante o perodo do estgio.

Tcnicas laboratoriais efectuadas Preparaes Histolgicas

Observaram-se vrias lminas de preparaes histolgicas, que com a ajuda de atlas permitiram a identificao dos vrios constituintes tecidulares.

A primeira pea observada foi a polpa do dedo humano, onde pode-se ver as trs camadas da pele: epiderme, derme e a hipoderme. A epiderme consta de uma camada germinativa formada por clulas cilndricas, um estrato espinhoso que formado por clulas polidricas, o estrato granuloso constitudo por um nmero reduzido de camadas celulares, o estrato lcido e o estrato crneo, que a camada mais superficial formada por clulas mortas e de espessura varivel. A derme composta por um tecido conjuntivo sobre o qual se apoia a epiderme, ambas as camadas interdigitam-se formando as papilas. Abaixo da derme encontra-se a hipoderme, rica em adipcitos.

Fig. 1 Camadas da pele

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A arte em movimento : a clula

De seguida, observmos a lngua de co que constituda pelas papilas, que se

encontram periferia da lngua. No interior, localiza-se o epitlio e no seu seio encontra-se o msculo esqueltico (voluntrio), onde esto os vasos sanguneos.

Msculo Esqueltico

Vasos Sanguneos

Epitlio

fig. 2 lngua de co A terceira observao foi o estmago fundo de co. O estmago fundo ou corpo

formado por uma mucosa gstrica, a muscular da mucosa, a submucosa e a muscular. Abaixo da muscular encontram-se as glndulas fndicas que so tubulosas simples, mas s vezes ramificadas.

Fig.3 Estmago fundo

1. Epitlio estratificado pavimentoso 2. Tecido conjuntivo 3. Corpsculos gustativos 4. Glndulas serosas 5. Tecido adiposo 6. Msculo liso

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De seguida, observmos a traqueia de coelho. Esta constituda por um epitlio,

abaixo do qual se encontra a mucosa respiratria. No seu seio encontram-se os vasos sanguneos. Abaixo da mucosa observa-se o esqueleto cartilagnio, formado por anis incompletos de cartilagem, e em baixo de tudo, encontra-se a camada adventcia.

Fig.4 - Traqueia

A preparao do corao do ratinho constituda por quatro cavidades: dois

ventrculos e duas aurculas, a separar os ventrculos existe o septo e a parede cardaca. A parede cardaca formada por uma camada interna o endocrdio, e uma camada externa ao endocrdio o miocrdio e acima deste temos o epicrdio. A separar as aurculas dos ventrculos, encontram-se as vlvulas.

Fig. 5 - Corao

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Por ltimo, observmos o sangue. Este um tecido conjuntivo que se distribui por

todo o organismo e que realiza uma importante funo de transporte de mltiplas substncias (nutrientes, oxignio, dixido de carbono, catabolitos, hormonas,etc).

Na observao realizada vimos os constituintes do sangue: plasma, hemcias ou glbulos vermelhos, leuccitos ou glbulos brancos e plaquetas (no entanto, no foram visualizadas).

Plasma

Hemcias

Leuccito neutrfilo

Leuccito neutrfilo

Leuccito linfcito

Fig. 6 Sangue

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Imunohistoqumica

A imunohistoqumica um mtodo histolgico para a determinao histoqumica de protenas especficas, mediante os anticorpos marcados. Os anticorpos podem estar ligados a enzimas, a fluorescncia, entre outros. Os mtodos histoqumicos baseiam-se na utilizao de anticorpos especficos, marcados mediante um enlace qumico com uma substncia que se torna visvel, sem afectar a capacidade do anticorpo para formar um complexo com o antignio.

A realizao desta tcnica veio a propsito do artigo The Paired Homeodomain Protein DRG11 is required for the Projection of Cutaneous Sensory Affernt Fibers to the Dorsal Spinal Cord, do qual iremos falar mais adiante. O objectivo desta experincia foi verificar se num embrio de 18.5 dias, haveria um terceira vaga de neurognese, ao nvel dos neurnios das lminas superficiais da medula espinhal. Como controlo usaram-se lminas de medula espinhal e DRG de ratinhos com uma semana de idade ps-natal, uma vez que nesta fase os neurnios daquelas regies esto perfeitamente diferenciados. Deste modo, os anticorpos utilizados foram o DRG11 (marcao verde), que marca os neurnios nociceptivos existentes na poro dorsal da medula espinhal e os neurnios sensitivos do DRG, e o Neu-N (marcao encarnada) que marca todos os neurnios ps-mitticos (j formados).

Imagens captadas no confocal:

Fig.7 Imagem da medula espinhal de embrio de ratinho com 18.5 dias embrionrios (E18.5) marcada com Neu-N e DRG11

Nesta imagem de medula espinhal de embrio de E18.5 verifica-se que a zona mais

superficial do corno dorsal da medula espinhal est marcada com DRG11, mas curiosamente o anticorpo pan-neuronal NeuN s marca os neurnios das lminas mais profundas e do corno ventral. Isto parece sugerir que nesta altura poder haver uma nova vaga de proliferao neuronal, que est a ser investigada.

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A arte em movimento: a clula De modo a validar estes resultados usaram-se como controlo lminas com medula

espinhal e DRGs provenientes de ratinho P7. Aqui mostramos apenas a imagem de um corte transversal de gnglio raquidiano. Podemos observar marcao dupla com os dois anticorpos. Como se pode reparar a maior parte do gnglio est marcado de amarelo devido sobreposio do verde com o encarnado. Isto quer dizer que o que est amarelo no s so neurnios nociceptivos como tambm so neurnios completamente formados. Estes resultados esto de acordo com a literatura.

Fig. 8 Gnglio raquidiano de um ratinho com 7 dias (P7) marcado duplamente com Neu-N e DRG11

Discusso de um artigo cientfico Com a leitura e discusso do artigo The Paired Homeodomain Protein DRG11 is required for the Projection of Cutaneous Sensory Affernt Fibers to the Dorsal Spinal Cord alargmos os nossos conhecimentos acerca do desenvolvimento embrionrio do circuito nociceptivo. At ento, s tnhamos uma noo muito superficial do que era a medula espinhal. Com este artigo aprendemos que a medula pode ser dividida em duas partes: corno dorsal e corno ventral. O corno ventral comanda a motricidade do animal, enquanto que o corno dorsal recebe as informaes sensitivas, do tacto, da dor, entre outros. Na parte superficial do corno dorsal expresso o Drg11. Este o ponto focral do artigo, ou seja, pesquisava-se a importncia do Drg 11. O Drg11 um factor de transcrio que expresso durante o desenvolvimento no corno dorsal e no DRG (Dorsal Root Ganglia) dos nervos sensitivos. Atravs de estudos realizados, chegou-se concluso que o Drg11 importante para a formao inicial das ligaes entre os nervos sensitivos aferentes e os seus alvos centrais, isto , vital para o bom desenvolvimento do sistema nociceptivo. Isto foi provado porque ao causar mutaes no Drg11 verificava-se que os ratinhos mutantes, eram menos sensveis a estmulos dolorosos que os seus irmos selvagens, enquanto que a motricidade encontrava-se normal. Portanto, as anormalidades sensitivas detectadas s poderiam ser devido ausncia do Drg11.

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Desenvolvimento embrionrio do ratinho (E12.5) De modo a perceber em que estado do desenvolvimento se encontra um embrio de ratinho em E12.5 procedemos a cortes transversais seriados e posteriormente sua colorao e observao microscpica. Um embrio foi cortado em criostto e o outro em micrtomo de parafina.

Cortes em Criostto

O criostto usado para fazer cortes de peas previamente congeladas com um gel (OCT). Os cortes realizados neste aparelho so fceis de talhar, contudo a morfologia da amostra nem sempre bem conseguida.

Fig.9 Criostto

Futuro cortex

Terceiro ventrculo Aqueduto cerebral

Sulcus limitans

Telencfalo vescula

Hiptalamo cerebral

Fig. 10 Embrio cortado no criostto (zona da cabea)

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Cortes em micrtomo de parafina

Neste caso, usou-se a parafina como matriz de incluso. Esta tcnica embora mais longa e complexa que a anterior, permite cortes com uma morfologia muito melhor. Antes da incluso da pea em parafina, necessrio passa-la por uma concentrao crescente de alcois (70, 90, 100) para a remoo da gua que se encontra nos tecidos. Isto porque a parafina imiscvel com a gua e ento, se no se tivesse retirado toda a gua, a parafina no iria preencher os espaos que continham gua e consequentemente os cortes ficariam deformados. Termina-se com uma passagem de meia hora em benzol. Posteriormente a pea colocada numa soluo 1:1 benzol:parafina antes de ser includa em parafina lquida (60C). A pea fica definitivamente includa em parafina, quando em molde apropriado e temperatura ambiente, se deixa solidificar a parafina que rodeia a pea. Agora j se pode cortar em micrtomo de parafina.

Medula espinhal

Discos Canal central intervertebrais Fig. 11 Embrio cortado em parafina

(zona da cauda) Tcnica de colorao pela hematoxilina-eosina

Estes cortes foram corados pela tcnica de colorao hematoxilina-eosina. A hemotoxilina, que um corante bsico (roxo) cora as estruturas cidas, e a eosina (vermelho), que um corante cido cora as estruturas bsicas. O objectivo desta tcnica visualizao do ncleo e do citoplasma das clulas.

Fig. 12 Diferenciador, Eosina, Hematoxilina

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Fig. 13 Embries (E12.5, E13.5, E16.5, E18.5)

Fig. 14 Cortes de embries corados pela

Tcnica de hematoxilina-eosina Electroforese de ADN

Denomina-se electroforese ao transporte de partculas num campo elctrico. A electroforese de ADN feita normalmente em gel de agarose. O gel feito dilundo a agarose numa soluo tampo, com o auxlio de calor; de seguida, adiciona-se brometo de etdio que se vai incorporar entre as bases do ADN, permitindo a sua futura visualizao. A soluo colocada num molde prprio de acordo com o tamanho do gel que se pretende fazer, colocam-se os pentes que marcam os poos e deixa-se arrefecer. O gel colocado numa tina de electroforese que contm a soluo de tampo, adicionam-se em cada poo a respectiva amostras (previamente coradas com um marcador que possibilita a vizualizao da frente de migrao durante a electroforese) e ligam-se os elctrodos corrente elctrica. Neste caso, como o ADN tem carga negativa a pH neutro, as amostras migram do plo negativo para o plo positivo, ao longo do gel. As amostras so identificadas por bandas que se formam e que se tornam visveis quando colocados em luz ultravioleta. Isto possvel, devido presena de brometo de etdio, proporcionando s bandas, quando expostas luz ultravioleta, emitirem uma fluorescncia visvel alaranjada.

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ADN fingerprinting

O ADN figerprinting uma tcnica bsica de biologia molecular que nos d a impresso digital do ADN. Este tcnica usada em testes de paternidade, na identificao de indivduos em incidentes, etc.

Nesta experincia, o objectivo era encontrar um criminoso para um determinado crime. Para isso, recolhida a amostra de ADN da cena do crime, procedemos recolha de ADN de 5 suspeitos. Posteriormente, cortmos o ADN com enzimas de restrio apropriadas, que vo cortar em locais especficos de acordo com a sua capacidade para reconhecer pequenas sequncias nucletidas ao longo do ADN; e de seguida, fizmos a electroforese em gel de agarose. Depois, de realizada a electroforese comparmos o padro de bandas presentes no gel.

Resultado ADN fingerprinting

Com estes resultados descobrmos que o crimonoso era a Patrcia.

PCR Polimerase Chain Reaction Esta tcnica tem como objectivo amplificar pequenos segmentos de ADN a partir de uma quantidade mnima. A amplificao pela PCR necessita da presena de, pelo menos, uma cadeia de ADN molde. A PCR desenvolve-se em trs etapas: a desnaturaco, que a abertura da dupla cadeia de ADN, o annealing, no qual ocorrem as ligaes dos primers que vo flanquear o segmento a ser amplificado, e a polimerizao, na qual se sintetiza o ADN a partir da cadeia molde, pela ADN polimerase. A PCR possibilita a clonagem de genes com enorme eficincia. Esta tcnica s possvel graas s ADN -polimerases cuja actividade enzimtica no destruda pelas temperaturas elevadas usadas durante a PCR. Os primers oligonucleotdeos, utilizados durante o annealing, so sintetizados de modo a ligarem-se s extremidades opostas de cada uma das cadeias de ADN molde que se pretende amplificar.

Fotografia do gel de Agarose

1 2 3 4 5 6Legenda: 1 Amostra do Crime2 Suspeito Joo 3 Suspeito Patrcia 4 Suspeito X 5 Suspeito Y 6 Suspeito Sandra

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A ADN polimerase necessita dos primers para iniciar a replicao do ADN e

sintetizar novas cpias do ADN molde. As diferentes temperaturas usadas durante a PCR so precisas para a separao da dupla cadeia molde de ADN (quando a 94C), para a ligao dos primers sequncia complementar das cadeias separadas (quando a 64C) e para a extenso dos primers pela enzima Taq, sintetizando-se duas novas cpias de cadeia molde (quando a 72C). O termociclador o aparelho onde se desenrola a tcnica PCR e programvel de acordo com as situaes. Amplificao do elemento Alu do 8 intron do cromossoma 8 O objectivo desta experincia tentar identificar a presena ou ausncia do elemento Alu repetitivo no oitavo intron do cromossoma 8, depois de realizada a PCR e a electroforese. Os introns so regies no codificadas do ADN e no caso especfico do Alu no se sabe a sua origem nem funo. O elemento Alu est presente em alguns indivduos e ausente noutros. Os indviduos homozigticos e que possuem dois alelos (+/+), no gel de agarose, apresentam uma nica banda que por ser pesada corre mais devagar no gel, os individuos homozigticos que no possuem estes alelos (-/-) tambm contm uma nica banda, contudo esta mais leve e corre mais rpido. Os sujeitos heterozigticos (+/-) possuem alelos diferentes donde apresentam duas bandas, uma que pesada (+) e outra mais leve (-). Para a realizao desta experincia procedemos recolha de clulas epiteliais localizadas na mucosa oral, de modo a extrarmos o ADN. Este foi cortado pelas enzimas de restrio e de seguida realizmos a PCR. Depois de ocorrida a electroforese, tentmos identificar os indivduos que possuam o elemento Alu nos dois alelos, num s alelo ou em nenhum.

1 2 3 4

Resultados do gel de agarose

Legenda: 1- Joo 2- Patrcia3- X 4- Y

+/- -/- +/- +/+


Com estes resultados, constatmos que o Joo e o indivduo X so heterozigticos (+/-), uma vez que possuem duas bandas; enquanto que, a Patrcia homozigtica -/-, j que tem uma banda que migrou mais longe, logo no tem o elemento Alu em nenhum dos alelos, e o sujeito Y homozigtico +/+ possuindo o elemento nos dois alelos, uma vez que a sua nica banda correu pouco o gel.

Concluso No incio do estgio, foi um pouco complicado porque os nossos conhecimentos eram limitados e bsicos. Contudo, a nossa integrao no grupo de trabalho fez-nos no desistir de aprofundar os nossos conhecimentos. Ao longo do estgio, tivemos a oportunidade de visualizar algumas experincias que estavam a decorrer, nomeadamente a disseco de um rato, e participar numa investigao a decorrer no instituto, acerca da presena de neurnios pr-mitticos na medula espinhal. No final deste estgio, estmos contentes por termos tido a oportunidade de trabalhar num ambiente cientfico, onde aprendemos novidades ao nvel da biologia molecular e celular e da histologia. Com este estgio constatmos que a nossa escolha realmente pode passar pela rea da investigao. Por tudo isto, agradecemos o acolhimento, a pacincia, a oportunidade e os conhecimentos que nos foram oferecidos durante a nossa participao nesta aventura. Ainda, agradecemos ao Programa Cincia Viva por encorajarem e dar oportunidades aos jovens de trabalhar com verdadeiros cientistas. Por fim, queremos agradecer Dr Sandra Rebelo por nos ter aturado.

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