elektroforesis

5/22/2018 elektroforesis

1/11

MODUL BIOLOGI MOLEKULER

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI III

ELEKTROFORESIS

Kelompok 2

Puspa Negara FAA 113 013

Nurul Hidayanti Maharani FAA 113 014

Efraim Said Sudarto FAA 113 015

Dian Triyeni Asi FAA 113 016

Sheren Vinera Lins FAA 113 017

Feromiya Oksa FAA 113 018

Sofia Eugenia Manginte FAA 113 019

Mira Aprilia FAA 113 020

Ismi Sholihah FAA 113 021

Widi Cahya Utami FAA 113 022

Pipin Septiana FAA 113 023

FASILITATOR/TUTOR:

Fatmaria,S.FARM.,APT

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS PALANGKA RAYA

2014


2/11

I. Pendahuluan1.1 Latar Belakang

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk

hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk

dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis

gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar

tekni kini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan

listrik. Dalam hal ini, molekul molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju

perpindahannya oleh gaya gerak listrik didalam matriks gel. Laju perpindahan

tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel

biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai

teknik preparatifuntuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-

metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau

immune -blotting yang merupakan metodemetode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis merupakan prosesbergeraknya molekul bermuatan pada suatu

medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung

pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat

digunakan untuk separasi makro molekul( seperti protein dan asam nukleat).

Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atauautoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Molekul DNA atau suatu fragmen DNA yang telah di amplifikasikan dapat

dipisahkan berdasarkan ukuran atau besarnya pasangan basany6a melalui Gel

elektroforesis. Deteksi fragmen DNA tersebut dapat dilakukan dengan cara

mewarnai gel dengan suatu zat yang dapat meng-interkalasi rantai ganda DNA

yaitu, misalnya ethidiumbromida. Metoda pemisahan atau reparasi DNA secara

luar digunakan untuk tujuan analisis molekul DNA atau tujuan preparative.

1.2 Tujuan Praktikum- Melakukan elektroforesis DNA hasil isolasi dari darah vena dan hasil

amplifikasi dengan gel agarosa.

- Melakukan analisis hasil elektroforesis total DNA genom manusia

dan hasil amplifikasi fragmen gen dengan metode PCR.


3/11

II. Dasar TeoriElektroforesisi DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran9berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan

untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga

20.000 pasang basa(bp) Elektroforesis gel agarosa besarnya digunakan untuk

analisis ukuran dan konpormasi sampel DNA, kualifikasi DNA, pemisahan dan

ekstrasi fragmen DNA.

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga didalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel melalui kutub positif(anoda). Makin besar ukuran

molekulnya makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar(DNA marker) yang telah diketahui

ukurannya.vasualisasi selanjutnya DNA dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah lebih dahulu gel dalam pembuatnya ditambahkan larutan

etidiumbromida atau dengan paparan di atas sinar ultraviolet.

III.Metodologi Praktikum3.1 Waktu Dan Tempat

Praktikum Gel Elektroforesis DNA ini berlangsung pada hari senin,

tanggal 2 Mei 2014 pukul 11.30 - 14.00 WIB diruang praktikum Fakultas

Kedokteran Universitas Palangka Raya.

3.2 Alat Dan Bahan

1. Alat

Satu set alat elektroforesis DNA berikut power supply, terdiri dari :

- Chamber elecktroforesis

- Tray elecktroforesis

- Sisir

- Power supply

2. Bahan

- Larutan hasi; isolasi DNA darah vena

- Larutan hasil PCR (produk PCR )

- Larutan TAE 1X ( tris-base, glacical acetic acid dan EDTA)

- Marker DNA + loading dye

- Ethidiumbromida


4/11

3.3 Cara Kerja

a. Timbang bubuk agarosa untuk membuat 1,5% gel agarosa dalam larutan

TBE ( catatan :1,5% untuk DNA yang panjangnya 300-10000bp).

b. Masak larutan agarosa tersebut sampai mendidih dan larut semua.

c. Biarkan larutan tersebut dingin sampai kira-kira 70o

C kemudian masukan

5ul 0,1% ethidiumbromida.

d. Tuang larutan agarosa ke dalam tray elektroforesis yang telah disiapkan

terlebih dahulu dan dipasangi sisir.

e. Biarkan agarosa dingin dan mengeras.

f. Sementara menunggu sampai mengeras siapkan larutan untuk maker DNA

dengan larutan loading dye dengan komposisi, 2ul loading dye + 3ul larutan

marker DNA + 3ul ddH2O

g. Setelah gel agarosa mengeras, pasang tray berikut beserta isinya kedalam

chamber. Elektroforesis, ambil atau cabut sisir pada gel, kemudian tuang

larutan TAE sampai melebihi permukaan gel.

h. Masukan larutan DNA hasil PCR kedalam struktur yang terbentuk dari

sisir yang telah terangkat, secara hati-hati dan perlahan-lahan.

i. Hubungkan alat elektroforesis tersebut dengan power suplly yang telah

diatur dengan voltage 90 volt selama 1 jam.

j. Amati pita-pita (bands) yang terbentuk dengan menggunakan UV

transluminator, dan apabila diperlukan dapat difoto dengan kamera .

Gambar skematik proses elektroforesis(sumber : buku pedoman praktikum modul biomol)


5/11

IV.HasilGambar hasil pengamatan gel agarosa

V. PembahasanPraktikum kali ini digunakan agarosa karena agarosa memiliki beberapa

kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik,

serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak

dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gelagarosa akan menunjukkan warna

biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNAberwarna

orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh bahwa laju migrasi

elektroforesis gelaga rosa menunjukkan pergerakan kearah positif. Halini sesuai

dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik elektroforesis pada dasarnya

berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negativepada pH

netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan

elektroforesis dengan memberikan daya listrik dikedua kutub maka DNA akan

bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja elektro foresis gel agarosa. Agarosa

merupakan gel yang memilik solusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat

memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat

dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dinginakan

membentuk gelatinyang padat .

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan

listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel

yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan

Pita DNA Setelah

Elektroforesis dan Diamati di


6/11

listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.

Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium,

kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan

muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub

positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan

terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Secara

umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan

yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh

variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH

dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi

karena efek seleksi dan medium yang sesuai .Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan

elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri

dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase

gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya

gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam

kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang,

tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas,

dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang

menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul.

Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase

diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.

Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan

poliakrilamida sebagai gel media . Metoda Elektroforesis Gel Agarosa

didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks

stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel

agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk

memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan

dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat

memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid

biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).


7/11

Larutan DNA yang bermuatan negative dimasukkan kedalam sumur-

sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan dikutup negatif, apa bila

dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA

akan bergerak ke kutup positif.Laju migrasi DNA dalam medan listrik

berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh

ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecilakan

bermigrasi lebih cepat disbanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis

mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk

visualisasi maka ditambahkan larutan etidiumbromida yang akan masuk diantara

ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan

dibawah lampu UV. Panjang amplikon bias diperkirakan dengan

membandingkannya dengan pita DNA standar.Molekul DNA bermuatan negatif sehingga didalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar

ukuran molekulnya,makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen

DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju

migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNAmarker) yang telah

diketahui ukurannya.Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan dibawah paparan

sinarultra violet setelah terlebih dahu lugel dalam pembuatannya ditambahkan

larutan etidiumbromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel

direndam di dalam larutan etidium bromide sebelum dipaparkan diatas sinar

ultraviolet.

Elek troforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan

mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinisdan

pewarnaan laboratories dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat

sensitif dan tidak memerlukan radio isotop atau ultra sentrifugasi. Selanjutnya,

untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands - DNA pada gel

agarosa digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi

rendah, seperti intercalatingagent etidiumbromide (EtBr). Setelah elektroforesis,

gel diwarnai dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit. Hanya sedikit DNA

dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-

transilluminator.

Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam

arutan sebagai penghantar listrik


8/11

arutan sebagai penghantar listrik.

- Loading dye berfungsi sebagai pemberat agartidak keluar dari sumuran.

- Etidiumbromida sebagai pewarna DNAyang akan menyisip disela-

sela basa nukleotida.

- UV transiluminator untuk visualisasi DNA didalam gel agarosa

- Aquades sebagai pelarut- Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa

- TAE: Tribase sebagai buffer sesuai dengan ph

- Asam asetat glasial sebagai elektrolit

- EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DA

- Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran gel agarosa

- Tangki elektroforesis untuk running DNA

- Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA

dan loading dye

- Kertas parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan

loading dye

- Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak

DNA

Hubungan antara berat molekul DNA dengan kerapatan agarosa terhadap

laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk kerangka-kerangka atau

lubang

lubang yang kompleks untuk dilewati molekul DNA menuju elektroda

positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju migrasinya, sebaliknya

makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya. Komposisi

gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat dipisahkan. Jika

sumuran gel agarosa menyentuh dasar tempat pembuatan gel agarosa maka

DNAtidak dapat melakukan migrasi.

DNA gel elektroforesis adalah teknik biologi eksperimental penting dan

sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari

pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu.

Fragmen ini tersebar dimedia poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan

listrik diterapkan. Masing - masing fragmen memiliki muatan listrik yang

berbeda dan berat molekul, menyebabkan mereka harusbermigrasi pada tingkat

yang berbeda melalui gel.


9/11

VI.Kesimpulan1. DNA dari hasil isolasi darah vena dan hasil amplifikasi dapat dilihat pita-

pita bandnya dengan menggunakan metode elektroforesis..

2.

Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampelDNA berdasarkan atas ukuran(berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.

3. DNA dari hasil isolasi darah vena dan hasil amplifikasi dapat dilihat pita-

pita bandnya dengan menggunakan metode elektroforesis.


10/11

DAFTAR PUSTAKA

1. Buku pedoman Modul Biologi Molekuler. Fakultas kedokteran UniversitasPalangka Raya.2014.

2. Murray.RK.Granner.DK.,Rodwell.vw. Brahim. Biokimia Harper.Ed27.Jakarta.EGC.2009.

3. Yuwono T.Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.2005.4. Khopkar SM.Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.2002.5. Yepyhardi. 2009.Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular.

Sciencebiotech.net[web].http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-

penelitian-biologi-molekular
http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekularhttp://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular


11/11

LAMPIRAN

Gambar alat elektroforesis

beserta power suplly

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan

Diamati di Bawah Sinar UV

Documents

elektroforesis