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EGFR pharmDx™

English Code K1492 35 tests for manual use Edition 12/2018 Intended use For In Vitro Diagnostic Use. The EGFR pharmDx™ assay is a qualitative immunohistochemical (IHC) kit system to identify epidermal growth factor receptor (EGFR) expression in normal and neoplastic tissues routinely-fixed for histological evaluation. EGFR pharmDx specifically detects the EGFR (HER1) protein in EGFR-expressing cells. EGFR pharmDx is indicated as an aid in identifying colorectal cancer patients eligible for treatment with ERBITUX™ (cetuximab), or Vectibix™ (panitumumab). Summary and explanation Introduction Epidermal growth factor receptor is a 170 kD transmembrane receptor encoded by the human HER1 gene. The EGFR protein contains an extracellular ligand binding domain, a transmembrane region and an intracellular domain with intrinsic protein-tyrosine kinase activity. EGFR is homologous to other members of the EGF receptor/erbB family including HER2/erbB2 or neu, HER3/erbB3 and HER4/erbB4.1,2 The EGFR protein is expressed by a variety of normal cells including many epithelial cell types and tumors derived from them.3-9 Non-epithelial cell types that express EGFR include smooth muscle, fibroblasts, and nerve.10

Specificity Mouse monoclonal anti-human EGFR, clone 2-18C9 is provided as a hybridoma tissue culture supernatant produced from a mouse immunized with EGFR immunoprecipitated from the A431 cell line (human epidermoid carcinoma). Epitope mapping studies indicate that the antibody recognizes an epitope in the extracellular cysteine-rich region of the molecule spanning sub-domain S2 and proximal to the transmembrane domain. Further mapping of critical amino acids indicates that the epitope is conformational and dependent on disulfide bridging in the native molecule.11 This monoclonal antibody clone has been shown not to cross react with HER2, HER3, or HER4 and the vector tag, myc. Cytoplasmic staining is commonly seen; however, the test should be repeated if significant cytoplasmic staining makes it difficult to distinguish the diagnostic membrane staining and interpret the results.

Principle of Procedure The EGFR pharmDx IHC kit system contains reagents required to complete an IHC staining procedure for routinely-fixed, paraffin-embedded specimens. Following incubation with the primary monoclonal antibody, clone 2-18C9, to human EGFR protein, this kit employs a ready-to-use visualization reagent based on dextran technology. This reagent consists of both secondary goat anti-mouse antibody molecules and horseradish peroxidase molecules linked to a common dextran polymer backbone, thus eliminating the need for sequential application of link antibody and peroxidase conjugate. The enzymatic conversion of the subsequently added chromogen results in formation of a visible reaction product at the antigen site. The specimen may then be counterstained and coverslipped. Results are interpreted using a light microscope. Control slides containing two formalin-fixed, paraffin-embedded human cell lines with staining intensity scores of 2+ and 0 are provided for quality control of the kit reagent performance. Reagents EGFR pharmDx for Manual Use. The materials listed are sufficient for 35 tests (35 slides incubated with Primary Antibody to EGFR Protein and 35 slides incubated with the corresponding Negative Control Reagent). The number of tests is based on the use of 3 drops of each ready-to-use reagent per slide. The kit provides materials sufficient for a maximum of 5 individual staining runs.

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Materials provided Quantity Description

1x8 mL Proteinase K

< 0.1% Proteinase K proteolytic enzyme diluted in a Tris-HCl buffer containing 0.015 mol/L sodium azide.

1x8 mL Peroxidase Block

3% hydrogen peroxide.

1x4 mL EGFR pharmDx Monoclonal Mouse IgG1 Antibody

Monoclonal mouse anti-human EGFR (clone 2-18C9) IgG1 antibody tissue culture supernatant in a Tris-HCl buffer, containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.

1x4 mL Mouse IgG1 Negative Control Reagent

Monoclonal mouse IgG1 antibody tissue culture supernatant in a Tris-HCl buffer, containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.

1x8 mL Labelled Polymer, HRP

Dextran polymer conjugated with horseradish peroxidase and affinity-isolated goat anti-mouse immunoglobulins. Supplied in Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent.

1x10 mL DAB+ Substrate Buffer

Substrate buffer solution, pH 7.5, containing < 0.1% hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers and an antimicrobial agent.

1x1 mL Liquid DAB+ Chromogen

5% 3,3’-diaminobenzidine in chromogen solution.

1x1 L Wash Buffer 10x

Tris buffered saline solution containing Tween 20, pH 7.6.

5 slides EGFR pharmDxTM Control Slides

Each slide contains sections of two pelleted, formalin-fixed, paraffin-embedded human cell lines, which represent a moderate level of EGFR protein expression and no EGFR expression. The IHC staining scores of the cell pellets are 2+ and 0.

Cell Line: CAMA-1 Expression Level: 0

Cell Line: HT-29 Expression Level: 2+

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Materials required, but not supplied Ammonium hydroxide, 15 mol/L diluted to 0.037 mol/L Counterstain: Hematoxylin, alcohol or water-based such as Dako’s Hematoxylin (code S3302). or Dako’s Automation Hematoxylin

(code S3301) Coverslips Distilled or deionized water (reagent-quality water) Drying oven, capable of maintaining 56–60°C Ethanol, absolute and 95% Humidity chamber Light microscope (4x–40x objective magnification) Mounting medium, such as Dako’s Faramount (code S3025)

or Dako’s Glycergel (code C0563) or Dako’s Ultramount (code S1964) Positive and negative tissues to use as process controls (see Quality control section) Slides, Fisher’s SuperFrost Plus, poly-L-lysine-coated slides, charged slides, or Dako’s Silanized Slides (code S3003) (see Specimen

preparation section) Staining jars or baths Timer (capable of 2–30 minute intervals) Wash bottle Xylene, toluene, or xylene substitutes Note: All reagents included or available separately such as Dako’s Wash Buffer (code S3006) are formulated specifically for use with this test. For the test to perform as specified, no substitutions can be made. Specimen preparation Biopsy specimens must be handled to preserve the tissue for IHC staining. Standard methods of tissue processing should be used for all specimens. 13

Specimens preserved in the following fixatives are suitable for testing with EGFR pharmDx: 10% (v/v) neutral buffered formalin, 10% (v/v) unbuffered formalin, 25% (v/v) unbuffered formalin, AFA (acetic formalin alcohol), Richard-Allen Scientific’s Pen-fix and Bouin’s fixative. Tissues fixed in Anatech’s PreFer are not suitable for EGFR pharmDx testing. Use of EGFR pharmDx on PreFer fixed tissues results in unsatisfactory preservation of morphology and may cause erroneous results.14 Paraffin-embedded sections Routinely processed and paraffin embedded tissues are suitable for use. Specimens from the biopsy should be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed for the time period appropriate to the fixative. The tissues are then dehydrated and cleared in a series of alcohols and xylene, followed by infiltration by melted paraffin. The paraffin temperature should not exceed 60°C. Properly fixed and embedded tissue blocks expressing the EGFR protein will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a cool place (15–25°C).13,15

Tissue specimens should be cut into sections of 3–5 µm. After sectioning, tissues should be mounted on slides and placed in drying racks. The following slides are recommended for use: Fisher’s SuperFrost Plus, Dako’s Silanized (code S3003), charged or poly-L-lysine coated slides. The slide racks should be pounded on an absorbent towel to remove water trapped under paraffin and on glass and then dried at room temperature for one hour. The rack of slides should then be placed in a 56–60°C incubator for one hour. Any excess water remaining on slides after removal from the incubator should be removed by pounding slides on towels and drying for one additional hour in the incubator. After removal from the incubator, slides should be held at room temperature until cool and paraffin has hardened. To preserve antigenicity, tissue sections, mounted on slides (Fisher’s SuperFrost Plus, poly-L-lysine, charged or Dako’s Silanized slides (code S3003), should be stained within 2 months of sectioning when held at room temperature (20–25°C).14 Consult the Dako Handbook: “Immunochemical Staining Methods”16 or References 13 and 15 for further details on specimen preparation. The use of this test on decalcified tissues has not been validated and is not recommended. The slides required for EGFR evaluation and verification of tumor presence should be prepared at the same time. A minimum of 5 slides is recommended, 1 slide for tumor presence, 2 slides for EGFR protein evaluation (one slide for primary antibody and one slide for Negative Control Reagent), and 2 slides for back-up. Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as

hazardous, build-ups of NaN3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.17

3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used for specimens as well as reagents. 4. Minimize microbial contamination of reagents to avoid nonspecific staining. 5. Incubation times, temperatures, or methods other than those specified may give erroneous results. 6. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen staining. 7. Do not substitute primary antibodies or negative control reagents with primary antibodies and negative control reagents of different

manufactured lots (lot numbers appear on vial labels) or with reagents from other manufacturers. 8. The Labeled Polymer, Liquid DAB+ Chromogen and prepared DAB+ Substrate-Chromogen solution may be affected adversely if

exposed to excessive light levels. Do not store system components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 9. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin.18 Unused solution should be disposed of according

to local, State, and Federal regulations. 10. Peroxidase Block, Labelled Polymer, HRP: Safety Data Sheet available for professional users on request. 11. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the

proper work procedures, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to Safety Data Sheet (SDS) for additional information.

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12. DAB+ Chromogen:

Danger Contains 3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochloride H350 May cause cancer. H341 Suspected of causing genetic defects. H319 Causes serious eye irritation P201 Obtain special instructions before use. P202 Do not handle until all safety precautions have been read and understood. P264 Wash hands thoroughly after handling P280 Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective clothing. P305 + P351+ P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P308 + P313 IF exposed or concerned: Get medical attention. P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention. P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and international regulations. 13. DAB+ Buffered Substrate

Danger Conains Imidazole H360 May damage the unborn child. P201 Obtain special instructions before use. P202 Do not handle until all safety precautions have been read and understood. P280 Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective clothing. P308 + P313 IF exposed or concerned: Get medical attention. P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and international regulations. 14. Wash Buffer (10X):

Warning H319 Causes serious eye irritation. P280 Wear eye or face protection. . P264 Wash hands thoroughly after handling. P305 + P351 + P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention. Contains: 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. May produce an allergic reaction. 15. Proteinase K:

Warning H319 Causes serious eye irritation. P280 Wear eye or face protection. P264 Wash hands thoroughly after handling. P305+P351+ P338 IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do.

Continue rinsing. P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention.

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Storage Store EGFR pharmDx kit system at 2–8°C. Control slides must also be stored at 2–8°C. Do not use the kit after the expiration date printed on the outside of the kit box. There are no obvious signs to indicate instability of this product, therefore, positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimens. If the reagents are stored under any conditions other than those specified in the package insert, they must be validated by the user.12

Reagent Preparation The following reagents must be prepared prior to staining: Wash Buffer Solution Prepare a sufficient quantity of wash buffer by diluting Wash Buffer 10x, 1:10 using distilled or deionized water (reagent-quality water) for the wash steps. Discard buffer if cloudy in appearance. DAB+ Substrate-Chromogen Solution This solution should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate developing in the solution does not affect staining quality. The following procedure yields 1 mL of DAB+ Substrate-Chromogen Solution. STEP 1. Transfer 1 mL of DAB+ Substrate Buffer to a test tube. STEP 2. Add one drop of Liquid DAB+ Chromogen. Mix and apply to tissue sections with a pipette. Prepared Substrate-Chromogen Solution (DAB) is stable for approximately 5 days when stored at 2–8°C. Important Note: The color of the Liquid DAB+ Chromogen in the bottle may vary from clear to light lavender-brown. This will not affect the performance of this product. Dilute per the guidelines above. Addition of excess Liquid DAB+ Chromogen to the DAB+ Substrate Buffer will result in deterioration of the positive signal. Counterstain Prepare ammonia water for counterstain bluing if required. Ammonia water (0.037 mol/L) is prepared by mixing 2.5 (±0.5) mL of 15 mol/L (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of reagent quality water. Unused 0.037 mol/L ammonia water may be stored at room temperature (20–25°C) in a tightly capped bottle for up to 12 months. Mounting Medium Mounting media such as Dako’s Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) or Dako’s Glycergel Mounting Medium (code C0563) is recommended for aqueous mounting. Liquify Glycergel by warming to approximately 40(±5)°C prior to use. Non-aqueous, permanent mounting is also suitable, such as Dako’s Ultramount (code S1964). Staining procedure Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components prior to use (see Precautions section). All reagents should be equilibrated to room temperature (20–25°C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. To avoid drying of tissues, place slides in a humid chamber. Deparaffinization and Rehydration Prior to staining, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased nonspecific staining. STEP 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat once. STEP 2. Tap off excess liquid and place slides in absolute ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once. STEP 3. Tap off excess liquid and place slides in 95% ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once. STEP 4. Tap off excess liquid and place slides in reagent-quality water for 5 (±1) minutes. Begin staining procedure as outlined in

Section C, Staining Protocol. Xylene and alcohol solutions should be changed after 40 slides. Toluene or xylene substitutes, such as Histoclear, may be used in place of xylene. Staining Protocol STEP 1. Proteinase K Proteolytic Digestion

Tap off excess reagent-quality water. Using a lintless tissue (such as a Kimwipe® or gauze pad), carefully wipe around specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents within the prescribed area.

Apply enough Proteinase K solution to cover specimen (minimum 3 drops (100 µL)). Incubate 5 (±0.5) minutes. Rinse gently with reagent-quality water from a wash bottle (do not focus stream directly on tissue). Place in a fresh reagent-quality water bath for 5 (±1) minutes. EGFR pharmDx includes pretreatment by means of a proteolytic enzyme digestion step. Tissue sections may occasionally be overdigested, causing disruption of cell membranes and overall tissue architecture. Run the assay with careful attention to the duration of the proteolytic digestion step.

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Note: If overdigestion is a persistent problem, 10% neutral buffered formalin-fixed tissues may be post-fixed in 10% neutral buffered formalin for 10 minutes after deparaffinization. See procedure below: Post-fixation procedure 1. Deparaffinize sections and immerse in reagent quality water. 2. Immerse slides in a 10% neutral buffered formalin for 10 minutes. 3. Rinse slides twice in deionized or distilled water. 4. Continue with the EGFR pharmDx staining procedure. STEP 2. Peroxidase Block

Tap off excess water and wipe slides as before. Apply enough Peroxidase Block to cover specimen (minimum 3 drops (100 µL)). Incubate 5 (±1) minutes. Rinse gently with Wash Buffer from a wash bottle (do not focus stream directly on tissue). Place in a fresh Wash Buffer bath for 5 (±1) minutes. STEP 3. Primary Antibody or Negative Control Reagent

Place slides in a humid chamber during the Primary Antibody/Negative Control Reagent and Labeled Polymer incubations to avoid drying of tissues.

Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough Primary Antibody or Negative Control Reagent to cover specimen (minimum 3 drops (100 µL)). Incubate 30 (±1) minutes in a humid chamber. Rinse slides as in Step 2. STEP 4. Labelled Polymer, HRP

Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough Labelled Polymer to cover specimen (minimum 3 drops (100 µL)). Incubate 30 (±1) minutes in a humid chamber. Rinse slides as in Step 2. STEP 5. DAB+ Substrate-Chromogen Solution

Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough DAB+ Substrate-Chromogen Solution to cover specimen (minimum 3 drops (100 µL)). Incubate 10 (±1) minutes. Rinse gently with reagent-quality water from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue). Collect DAB+

Substrate-Chromogen Solution waste in a hazardous materials container for proper disposal. Place in a reagent-quality water bath for 2–5 minutes. Counterstain (instructions for Hematoxylin) The colored end-product of the staining reaction is alcohol and water insoluble. Hematoxylin, either alcohol or water-based such as Dako’s Hematoxylin (code S3302) or Dako’s Automation Hematoxylin (code S3301) may be used. Do not use regressive counterstains. STEP 1. Immerse slides in a bath of hematoxylin. Incubate for 2–5 minutes, depending on the strength of hematoxylin used. STEP 2. Rinse gently in a reagent-quality water bath. Ensure that all residual hematoxylin has been cleared. Optional: Dip slides 10 times into a bath of 0.037 mol/L ammonia water (see Reagent preparation section). The ammonia water step is not required when using Dako’s Hematoxylin (code S3302) or Dako’s Automation Hematoxylin (code S3301). Note: The use of Dako’s Hematoxylin (code S3302) or Dako’s Automation Hematoxylin (code S3301) is strongly recommended. Using a 5-minute incubation, this counterstain produces a mild purple/blue end product that does not obscure specific immunostaining. Strong counterstaining may mask weak EGFR expression. STEP 3. Rinse gently in a reagent-quality water bath for 2–5 minutes. Mounting Mounting media such as Dako’s Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) or Dako’s Glycergel Mounting Medium (code C0563) is recommended for aqueous mounting. Liquify Glycergel by warming to approximately 40(±5)°C prior to use. Non-aqueous, permanent mounting is also suitable such as Dako’s Ultramount (code S1964). Note: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are coverslipped with an aqueous mounting medium and exposed to strong light. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20–25°C). Quality control Deviations in the recommended procedures for tissue fixation, processing and embedding in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the Dako-supplied Control Slides. In the USA, consult the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. See also CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline,19 and References 20–23 for additional information. EGFR pharmDx Control Slides (provided) Each of the supplied Control Slides contains two pelleted, formalin-fixed, paraffin-embedded human cell lines with staining intensity scores of 2+ and 0. One slide should be stained in each staining procedure. The evaluation of the Dako-supplied Control Slide cell lines indicates the validity of the staining run. They should not be used as an aid in interpretation of patient results. Positive Control Tissue Controls should be fresh autopsy/biopsy/surgical specimens fixed, processed and embedded as soon as possible in the same manner as the patient sample(s). Positive tissue controls are indicative of correctly prepared tissues and proper staining techniques. One positive tissue control for each set of test conditions should be included in each staining run.

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The tissues used for the positive tissue controls should give weak positive staining so they can detect subtle changes in the primary antibody sensitivity. The Control Slides supplied with this system or specimens processed differently from the patient sample(s) validate reagent performance only and do not verify tissue preparation. Known positive tissue controls should only be utilized for monitoring the correct performance of processed tissues and test reagents, NOT as an aid in formulating a specific diagnosis of patient samples. If the positive tissue controls fail to demonstrate appropriate positive staining, results with the test specimens should be considered invalid. Normal cell types that may be used as a weak EGFR positive include glandular epithelial cells of the prostate and normal lung bronchial epithelium. Because the EGFR staining pattern is heterogeneous, weakly staining normal tissue elements can also be negative. A strong positive internal tissue control is perineurium. Normal cells that demonstrate moderate EGFR positive staining include epithelial cells of the cervix and skin. Negative Control Tissue Use a negative control tissue (known to be EGFR protein negative) fixed, processed and embedded in a manner identical to the patient sample(s) with each staining run to verify the specificity of the primary antibody and to provide an indication of specific background staining. The variety of different cell types present in most tissue sections offers internal negative control sites (this should be verified by the user). If specific staining occurs in the negative control tissue, results with the patient specimens should be considered invalid. Tissue elements which may be used as negative controls include cardiac myocytes of the heart. Pancreatic acinar cells are also EGFR negative, whereas pancreatic bile duct epithelium stains positively. Lymphocytes when present do not stain with EGFR pharmDx and can be used as a negative internal control. Nonspecific Negative Control Reagent Use the supplied Negative Control Reagent in place of the primary antibody with a section of each patient specimen to evaluate nonspecific staining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site. The incubation period for the Negative Control Reagent should correspond to that of the primary antibody. Assay Verification Prior to initial use of a staining system in a diagnostic procedure, the user should verify the assay’s performance by testing it on a series of in-house tissues with known IHC performance characteristics representing known positive and negative tissues. These verification procedures should be repeated for each new test lot. Refer to the quality control procedures previously outlined in this section of the product insert and to the quality control requirements of the CAP Certification Program for Immunohistochemistry and/or CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline.19 Carcinomas with known EGFR protein staining intensities and negative tissues are suitable for assay verification. Table 1: The Purpose of Daily Quality Control

Tissue: Fixed and Processed Like Patient Sample

Specific Antibody & Detection System Background: Non-specific Antibody (Mouse IgG1 Negative Control Reagent) provided

Dako-supplied Control Slide. Controls staining procedure only. The evaluation of the Dako-supplied Control Slide cell lines indicates the validity of the staining run.

Positive Control: Tissue or cells containing target antigen to be detected (could be located in patient tissue). The ideal control is weakly positive staining tissue to be most sensitive to antibody or antigen degradation.

Controls all steps of the analysis. Validates reagents and procedures used for EGFR staining.

Detection of nonspecific background staining.

Negative Control: Tissues or cells expected to be negative (could be located in patient tissue or positive control tissue).

Detection of unintended antibody cross-reactivity to cells/cellular components.

Detection of nonspecific background staining.

Patient Tissue. Detection of specific staining. Detection of nonspecific background staining.

Interpretation of staining procedure Slide evaluation should be performed by a pathologist using a light microscope. All assessments are to be made on the tumor region of the specimen. For evaluation of the immunocytochemical staining and scoring, an objective of 10X or 20X magnification is appropriate. Use intact cells for interpretation of staining results; necrotic or degenerated cells often stain nonspecifically.19

Positive and negative cell lines are included in each EGFR pharmDx kit to validate staining runs, every time the assay is performed. Appropriate staining of the control cell lines provides evidence that the EGFR pharmDx assay is functioning properly. No membrane staining of the CAMA-1 control cell line (0) and moderate brown complete or incomplete membrane staining in the HT-29 control cell line (2+) indicates that the staining run is valid. If the staining intensity of the positive control cell line is too weak or too strong, a false negative or false positive result may be obtained and the test should be repeated. Reference images are available in the EGFR pharmDx Interpretation Guide.

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EGFR pharmDx primarily stains cell membranes, demonstrating both complete and incomplete circumferential staining. The immunostaining pattern is frequently heterogeneous, exhibiting various staining intensities within a single neoplasm. Staining has also been observed in the cytoplasm and extracellular spaces. Cytoplasmic staining is commonly seen, however the test should be repeated if significant cytoplasmic staining makes it difficult to distinguish membrane staining and interpret the results. Tumors should be reported as EGFR-positive or EGFR-negative using membrane staining as the evaluable structure. A tumor cell is EGFR-positive if it possesses any membrane staining above background, whether or not it is completely circumferential. A tumor with no membrane staining above background in any tumor cell is reported as an EGFR-negative tumor. Depending on the incubation length and potency of the hematoxylin used, counterstaining will result in a pale to dark blue coloration of the cell nuclei. Excessive or incomplete counterstaining may compromise interpretation of results. Table 2: EGFR pharmDx Staining Results

Report to treating physician Definition EGFR negative tumor Absence of membrane staining above background in all tumor cells

EGFR positive tumor

EGFR-Positive staining is defined as any IHC staining of tumor cell membranes above background level; whether it is complete or incomplete circumferential staining.

Staining intensity Percent of tumor cells staining 1+, 2+ or 3+ >0%

These definitions of positive and negative results are in accord with published literature,24 but may require modification in specific context. (See Product Specific Limitations section) Limitations General Limitations IHC is a multistep diagnostic process that requires specialized training in the selection of the appropriate reagents; tissue selection, fixation, and processing; preparation of the IHC slide; and interpretation of the staining results. Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or fluids may produce artifacts, antibody trapping, or false-negative results. Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. The clinical interpretation of any positive staining or its absence must be made within the context of clinical presentation, morphology and other histopathological criteria. The clinical interpretation of any staining, or its absence must be complemented by morphological studies and proper controls as well as other diagnostic tests. It is the responsibility of a qualified pathologist who is familiar with the antibodies, reagents and methods used to interpret the stained preparation. Staining must be performed in a certified licensed laboratory under the supervision of a pathologist who is responsible for reviewing the stained slides and assuring the adequacy of positive and negative controls. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase.25

Reagents may demonstrate unexpected reactions in previously untested tissues. The possibility of unexpected reactions even in tested tissue groups cannot be completely eliminated due to biological variability of antigen expression in neoplasms, or other pathological tissues.22 Contact Dako technical support with documented unexpected reactions. False-positive results may be seen due to non-immunological binding of proteins or substrate reaction products. They may also be caused by pseudoperoxidase activity (erythrocytes) and endogenous peroxidase activity (cytochrome C).21

Note: The reagents and instructions supplied in this system have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous or discordant results. Product Specific Limitations The cetuximab response rate for EGFR-negative patients and patients with EGFR-positive staining in less than one percent of tumor cells is unknown because no such patients were present in the clinical drug trials. Tumors with EGFR-positive staining in >1% of their cells are considered EGFR-expressing with regard to the current cetuximab indications for use. Patients with EGFR membrane staining in less than one percent of tumor cells were not included in the panitumumab randomized control trial and therefore the activity of panitumumab in this patient population is not known. Tumors with EGFR-positive staining in >1% of their cells are considered EGFR-expressing with regard to the current panitumumab indications for use. False-negative results could be caused by degradation of the antigen in the tissues over time. Specimens should be stained within 2 months of mounting of tissues on slides when stored at room temperature (20–25°C).14,26 For optimal and reproducible results, the EGFR protein requires proteolytic digestion when tissues are routinely fixed and paraffin-embedded.

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Performance characteristics Specificity The EGFR antibody, clone 2-18C9 (2-18C9) has been tested for reactivity against cell lines expressing EGFR, HER2, HER3 and HER4. In Western blots of SKBR3 and A431 cell lysates, 2-18C9 recognized a 170 kD band which is consistent with the known molecular weight of EGFR. Clone 2-18C9 has also been found to recognize the EGFRvIII (145 kD) form of the receptor in immunohistochemistry, flow cytometry and Western blotting of EGFRvIII transfected cell lines. In Western blotting experiments, 2-18C9 was unreactive with HER2 positive CAMA-1 cell lysates, HER3-transformed E. coli BL-21 protein extracts and CHO-HER4 transfected cell lysates. Additionally, Chinese Hamster Ovary (CHO) transfectants expressing myc (vector tag), either alone or coexpressed with one of the HER family members, were grown in chamber slides that were formalin-fixed and paraffin-embedded, and stained with anti-myc and 2-18C9. The myc antibody stained all five CHO transfectants, whereas 2-18C9 only stained the CHO cells transfected with HER1. Clinical Trials Cetuximab Clinical trials Three colorectal carcinoma (CRC) cetuximab drug trials (EMD 62202-007, IMCL CP02-9923 and IMCL CP02-0141) were performed in which Dako EGFR-expressing immunohistochemistry (IHC) staining test results were used as one of the criteria for study eligibility. In 2 of 3 studies including the pivotal trial (EMD 62202-007), the threshold for EGFR-expressing tumors was set at 1+ out of a possible 0 to 3+ for EGFR-positive staining intensity in > 1% of the total tumor cells. This threshold was selected because subgroup analysis of a full range of different thresholds of membrane staining criteria and other differentiating criteria could detect no significant difference in clinical outcome. Cetuximab Pivotal trial The pivotal trial (EMD 62202-007), allowed enrollment of patients with tumors for which any EGFR-positive cells were detected using the Dako EGFR pharmDx test. All such tumors encountered in the study had at least 1% EGFR-positive cells, and these tumors were designated as EGFR-expressing. The patients with EGFR-expressing tumors were treated with cetuximab in combination with irinotecan or with cetuximab alone. 577 tumor specimens were tested. 474/577 (82%, 95% CI = 78.1%, 86.1%) of the CRC specimens tested were EGFR-expressing. 329 EGFR pharmDx patients were available for 2:1 randomization to the two arms of the pivotal drug trial. In this trial, patients who received irinotecan plus cetuximab achieved a response rate of 50/218 (22.9%, 95% CI = 17.5%, 29.1%). Patients who received cetuximab alone achieved a response rate of 12/111 (10.8%, 95% CI = 5.7%, 18.1%). Only patients with Dako EGFR-expressing tumors, as described above, received cetuximab treatment. The response rate for tumors that are not EGFR-expressing is unknown, and therefore cannot be compared. There was no correlation between the degree of tumor response and the percentage of EGFR-positive cells or EGFR staining intensity. (See Table 3) Table 3: Cetuximab Pivotal Trial (EMD 62202-007) Response Rates

Total number of patients tested

Response Rate# of cases treated with cetuximab and irinotecan

Response Rate# of cases treated with cetuximab alone

EGFR pharmDx + (>1%) 474* 50/218 (22.9%, 95% CI = 17.5%, 29.1%)

12/111 (10.8%, 95% CI = 5.7%, 18.1%)

EGFR pharmDx - 103 None treated None treated *329 Patients were available for 2:1 randomization to the two arms of the drug trial # Response rate was the proportion of patients in the entire study population with a decrease by ≥50% in the sum of the perpendicular diameter of all measurable tumor (i.e., a 50% or more decrease in tumor by surface area) that persisted for at least 28 days. Cetuximab Supportive Studies The EGFR pharmDx assay was used to enroll patients in the pivotal trial (EMD 62202-007) and one supportive study (IMCL CP02-0141) during cetuximab development. In study IMCL CP02-0141, 140 specimens were tested. Of these specimens, 105 /140 (75%, 95% CI = 66.9%, 83.1%) specimens had tumors that were EGFR -expressing. A total of 61 patients were enrolled in this study; 57 patients received cetuximab. In an additional supportive study (IMCL CP02-9923), a prototype EGFR pharmDx kit (composed of the same primary antibody and detection system as above), was used to enroll patients. A total of 412 specimens from 401 patients were tested. 292/401 (72.8%, 95% CI = 68.0%, 77.6%) patients had a positive test result. 139 patients were enrolled; 138 received cetuximab plus irinotecan. Table 4: Summary of EGFR -Expressing Percent in Colon Cancer Patients

Study ID EGFR-Expressing Ratio (# expressing/# tested)

% EGFR- Expressing 95% Confidence Intervals

Pivotal Trial EMD 62202-007 474/577 82.1% 78.1 – 86.1%

Supportive Study IMCL CP02-0141 105/140 75.0% 66.9 – 83.1%

Prototype EGFR Study IMCL CP02-9923 292/401 72.8% 68.0 – 77.6%

Panitumumab Clinical Studies Efficacy data supporting panitumumab use in the treatment of patients with refractory metastatic colorectal cancer (mCRC) were provided by studies of patients whose tumors were EGFR-expressing, as assessed by Dako EGFR pharmDx™ assay. Panitumumab Randomized Controlled Trial This multicenter, randomized, open-label, comparative study of panitumumab (20020408, companion extension study 20030194) plus best supportive care (BSC) versus BSC alone enrolled mCRC patients who failed oxaliplatin- and irinotecan-containing chemotherapy regimens and whose tumors expressed EGFR membrane staining in ≥ 1% of evaluated tumor cells.

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In both treatment groups, the median percentage of tumor cells with positive EGFR membrane staining was 20% (range: 1% to 100%). In study 20020408, a statistically significant improvement in the primary endpoint of progression-free survival (PFS) was observed for the panitumumab plus BSC group compared with the BSC alone group (p < 0.0001, stratified log-rank test). In this randomized controlled trial, the response rate was 8.3% (19/229, 95% CI: 5.1%, 12.6%) and defined as either a complete or partial response (modified RECIST), with a confirmed duration of at least 4 weeks. The corresponding response rate in the 174 patients who crossed over from BSC to panitumumab in the companion extension study was 9.8% (17/174, 95% CI: 5.8%,15.2%). There was no correlation between the treatment effect on PFS and the percentage of EGFR tumor membrane staining or EGFR staining intensity. (See Table 5 below) Table 5: Treatment Effect on Progression-free Survival by EGFR Staining

Study 20020408 N-patients/

Events Hazard Ratioa 95% Confidence

Interval for Hazard Ratio p-value All Randomized 463 / 401 0.54 (0.44, 0.66) <0.0001 % EGFR Membrane Stainingb

1-<10% 114 / 91 0.46 (0.30, 0.71) 0.0004 10-35% 182 / 157 0.55 (0.40, 0.76) 0.0004 >35% 164 / 150 0.56 (0.40, 0.78) 0.0007

Maximum Intensity of EGFR Membrane Stainingc 1+ 138 / 113 0.61 (0.41, 0.90) 0.0140 2+ 235 / 206 0.49 (0.37, 0.65) <0.0001 3+ 88 / 80 0.61 (0.39, 0.97) 0.0379

a Hazard ratios for panitumumab plus BSC relative to BSC alone is estimated from a Cox proportional hazards model adjusted for ECOG performance score and geographic region. A value < 1.0 indicates a lower average event rate and longer time to event for panitumumab plus BSC relative to BSC alone.

b excluded 3 patients whose tumors expressed < 1 % EGFR membrane staining (protocol violations) c excluded 2 patients whose tumors expressed < 1 % EGFR membrane staining and < 1+ maximum intensity EGFR membrane staining (protocol violations)

Table 6: Summary of EGFR -Expressing Percent in Colon Cancer Patients

Study ID EGFR-Expressing Ratio (# expressing/# tested)

% EGFR-Expressing 95% Confidence Intervals

Pivotal Trial 20020408 735/1004 73.2% 70.4 – 75.9%

Reproducibility Inter-run reproducibility Inter-run reproducibility was tested using manual methodology at two laboratories by two technicians in each laboratory over 3 days with 5 different specimens (4 positive, 1 negative in each lab), of different staining intensity scores randomized and masked. Excellent reproducibility (100%) was seen for EGFR-positive versus EGFR-negative results (0 vs. 1+, 2+ and 3+). Staining intensity varied by 1+ in two of the positive specimens and by 2+ in one specimen (in one of the tests, the positive tissue element was mostly washed off the slide). The two negative specimens remained negative. Inter-laboratory reproducibility of staining Inter-laboratory reproducibility was tested at three geographically separated laboratories with 30 randomized and masked specimens of various IHC staining intensity scores. Freshly cut slides were forwarded to each testing laboratory for manual and automated staining and evaluation by a pathologist. Inter-laboratory percent agreement was 100% for a dichotomous positive/negative determination where 0 was negative and 1+, 2+ and 3+ were positive for EGFR protein expression for both manual and automated testing procedures. Immunoreactivity A summary of the EGFR pharmDx immunoreactivity on the recommended panel of normal tissues is presented in Table 7. All tissues were formalin-fixed and paraffin-embedded.

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Table 7: Evaluation of Normal Tissue Staining by EGFR pharmDx* Tissue Type (# tested) EGFR-Positive Tissue Element Staining and Staining Pattern

Adrenal (2) Cortical cells (2+): Cytoplasmic

Bone Marrow (3) None Breast (2) Lobular epithelial cells (2+): Membrane and cytoplasmic

Brain/Cerebellum (3) Molecular layer (1+): Extracellular

Brain/Cerebrum (3) None Cervix (3) Basalar squamous epithelial cells (2+): Membrane

Colon (3) None**

Esophagus (2) Basalar squamous epithelial cells (2+): Membrane Heart (3) None

Kidney (3) Tubules (1+): Cytoplasmic staining (granular)

Liver (3) Hepatocytes (sinusoids) (3+); Bile ducts (3+): Membrane and cytoplasmic Lung (3) Alveolar lining cells/ basalar bronchial cells (myoepithelial cells) (2+):

Membrane and cytoplasmic Mesothelial Cells (3) Mesothelial cells (2+): Membrane and cytoplasmic

Ovary (3) None

Pancreas (3) Ducts (2+): Membrane Parathyroid (1) None

Peripheral Nerve (3) Nerve cell processes (1+): Fibrous

Pituitary (3) None Prostate (3) Glandular epithelial cells (2+): Membrane

Salivary Gland (3) Ductal elements (1+): Cytoplasmic Skeletal Muscle (3) None

Skin (3) Squamous cells, adnexal structures (2+): Membrane and cytoplasmic

Small Intestine (3) None Spleen (3) None

Stomach (3) None

Testis (3) None Thymus (3) None

Thyroid (3) None

Tonsil (3) Squamous epithelium (3+): Membrane and cytoplasmic Uterus (3) Endometrial gland epithelium (2+): Membrane and cytoplasmic

Endometrial stromal cells (2+): Membrane and cytoplasmic Myometrium: None

*The majority of tissues tested had staining of fibroblasts in stromal tissue (1+, fibrous) as well as perineurium and myoepithelial cells. Endogenous peroxidase-induced staining of eosinophils has been observed occasionally. **Variable immunostaining of normal colonic epithelium has been observed.

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Troubleshooting Table 8: Troubleshooting

Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of slides. 1a. Reagents not used in proper

order. 1b. Sodium azide in wash buffer

bath.

1a. Review application of reagents. 1b. Use fresh, azide-free wash buffer

provided in the kit. 2. Weak staining of slides. 2a. Inadequate Proteinase K

proteolytic digestion. 2b. Sections retain too much

solution after wash bath. 2c. Slides not incubated long

enough with antibodies or DAB+ Substrate-Chromogen Solution.

2d. Inappropriate fixation method used.

2a. Verify that the Proteinase K solution is incubated for a full 5 minutes.

2b. Gently tap off excess solution before wiping around section.

2c. Review recommended incubation times. 2d. Ensure that patient tissue is not over-

fixed and that an approved fixative is being used. (See Specimen preparation section)

3. Excessive background staining of slides.

3a. Paraffin incompletely removed.

3b. Starch additives used in

mounting sections to slides. 3c. Slides not thoroughly rinsed. 3d. Sections dried during staining

procedure.

3e. Nonspecific binding of

reagents to tissue section.

3a. Use fresh cleaning solutions and follow procedure outlined in the Deparaffinization and Rehydration section.

3b. Avoid using any additives for adhering sections to glass slides. Many of these are immunoreactive.

3c. Use fresh solutions in buffer baths and wash bottles.

3d. Use humid chamber. Verify that the appropriate volume of reagent is being applied to slides. Wipe only 3 to 4 slides at a time before applying reagent.

3e. Check for proper fixation of the specimen and/or the presence of necrosis.

4. Tissue detaches from slides.

4a. Use of incorrect slides.

4a. Use charged (Fisher’s SuperFrost Plus) or silanized slides such as Dako’s Silanized Slides (code S3003).

5. Excessively strong specific staining.

5a. Inappropriate fixation method used.

5b. Reagent incubation times too

long. 5c. Inappropriate wash solution

used.

5a. Ensure that only approved fixatives and fixation methods are used. (See Specimen preparation section)

5b. Review Staining Protocol instructions. 5c. Use only the diluted wash buffer that is

supplied with the kit. 6. Weak staining of the

2+ control slide cell line. 6a. Inadequate Proteinase K

proteolytic digestion. 6b. Slides not incubated long

enough with antibodies or DAB+ Substrate-Chromogen Solution.

6c. Degradation of Control Slide.

6a. Verify that the Proteinase K solution is incubated for a full 5 minutes.

6b. Review recommended incubation times. 6c. Check expiration date and kit storage

conditions printed on the package label. 7. Overdigestion of tissue. 7a. Overincubation with

Proteinase K. 7b. Inadequate fixation.

7a. Verify that the Proteinase K solution is incubated for no more than 5 minutes.

7b. Use post-fixation procedure listed under staining protocol on new slides and stain using existing procedure.

Note: Refer also to the Troubleshooting section in the Dako Handbook: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition,16 the Atlas of Immunohistology,23 or Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.20 Contact Dako Technical Support to report unusual staining.

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Français Réf. K1492 35 tests pour utilisation manuelle Édition 06/2018 Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. Le dosage EGFR pharmDx™ est un kit de dosage immunohistochimique (IHC) qualitatif conçu pour identifier l'expression du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) dans des tissus sains et néoplasiques fixés en routine pour évaluation histologique. Le kit EGFR pharmDx détecte spécifiquement la protéine EGFR (HER1) dans des cellules exprimant le EGFR. Le kit EGFR pharmDx est indiqué pour faciliter l'identification des patients atteints d'un cancer colorectal éligibles au traitement par ERBITUX™ (cetuximab) ou Vectibix™ (panitumumab). Résumé et explication Introduction Le récepteur du facteur de croissance épidermique est un récepteur transmembranaire de 170 kD codé par le gène HER1 humain. La protéine EGFR contient un domaine liant le ligand extracellulaire, une région transmembranaire et un domaine intracellulaire avec une activité protéine-tyrosine kinase intrinsèque. Le EGFR est homologue à d'autres membres de la famille des récepteurs du FCE /erbB qui comprend HER2/erbB2 ou neu, HER3/erbB3 et HER4/erbB41,2. La protéine EGFR est exprimée par diverses cellules normales, notamment de nombreux types de cellules épithéliales et de tumeurs qui proviennent de celles-ci3-9. Les types de cellules non épithéliales exprimant le EGFR incluent notamment le muscle lisse, les fibroblastes et les nerfs.10

Spécificité L’EGFR anti-humain monoclonal de souris, clone 2-18C9 est fourni sous la forme d'un surnageant de culture tissulaire hybridome produit à partir d'une souris immunisée par un EGFR immunoprécipité à partir de la lignée cellulaire A431 (carcinome épidermoïde humain). Des études de cartographie de l'épitope indiquent que l'anticorps reconnaît un épitope dans la région extracellulaire riche en cystéine de la molécule, qui inclut le sous-domaine S2 et proximal du domaine transmembranaire. Une cartographie plus approfondie des acides aminés critiques indique que l'épitope est conformationnel et dépend de la formation d'un pont disulfure dans la molécule native11. Ce clone d'anticorps monoclonal n'a pas démontré de réactivité croisée avec les HER2, HER3 ou HER4 et avec le vecteur Tag, myc. Une coloration cytoplasmique est couramment observée mais le test doit être répété si une coloration cytoplasmique importante empêche de bien distinguer la coloration membranaire et donc, compromet l'interprétation des résultats.

Principe de la procédure Le kit IHC EGFR pharmDx contient les réactifs requis pour effectuer une procédure de coloration IHC sur des échantillons fixés en routine et inclus en paraffine. Après incubation avec l'anticorps monoclonal primaire, clone 2-18C9, dirigé contre la protéine EGFR humaine, ce kit utilise un réactif de visualisation prêt à l'emploi à base de dextrane. Ce réactif comporte des molécules d'anticorps secondaire de chèvre anti-souris et des molécules de peroxydase de raifort liées à une chaîne polymère de dextrane commune, ce qui permet d'éliminer l'application séquentielle d'un conjugué peroxydase-anticorps de liaison. La conversion enzymatique du chromogène ajouté par la suite entraîne la formation d'un produit de réaction visible sur le site de l'antigène. L'échantillon peut alors être contre-coloré et recouvert d'une lamelle de protection. Un microscope optique est utilisé pour l'interprétation des résultats. Des lames de contrôle contenant deux lignées cellulaires humaines fixées au formol et incluses en paraffine présentant une intensité de coloration notée 2+ et 0 sont fournies pour le contrôle qualité des performances des réactifs du kit. Réactifs EGFR pharmDx pour utilisation manuelle. Les matériels indiqués permettent d'effectuer 35 tests (35 lames incubées avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine EGFR et 35 lames incubées avec le réactif de contrôle négatif correspondant). Le nombre de tests est basé sur l'utilisation de 3 gouttes de chaque réactif prêt à l'emploi par lame. Le kit fournit la quantité suffisante de matériels pour un maximum de 5 cycles de coloration.

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Matériel fourni Quantité Description

1x8 mL Proteinase K (Protéinase K)

Enzyme protéolytique Protéinase K < 0,1% diluée dans un tampon Tris-HCl contenant de l'azide de sodium à 0,015 mol/L.

1x8 mL Peroxidase Block (Agent de blocage de la peroxydase)

Peroxyde d'hydrogène à 3%.

1x4 mL EGFR pharmDx Monoclonal Mouse IgG1 Antibody (Anticorps IgG1 monoclonal de souris EGFR pharmDx)

Surnageant de culture tissulaire d'anticorps IgG1 anti-EGFR humain (clone 2-18C9) monoclonal de souris dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et de l'azide de sodium à 0,015 mol/L.

1x4 mL Mouse IgG1 Negative Control Reagent (Réactif de contrôle négatif IgG1 de souris)

Surnageant de culture tissulaire d'anticorps IgG1 monoclonal de souris dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et de l'azide de sodium à 0,015 mol/L.

1x8 mL Labelled Polymer, HRP (Polymère marqué, HRP)

Polymère de dextrane conjugué à la peroxydase de raifort et des immunoglobulines anti-souris de chèvre isolées par affinité. Fourni dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

1x10 mL DAB+ Substrate Buffer (Tampon de substrat DAB+)

Solution tampon de substrat, pH 7,5, contenant moins de 0,1% de peroxyde d'hydrogène, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien.

1x1 mL Liquid DAB+ Chromogen (Chromogène DAB+ liquide)

3,3'diaminobenzidine à 5% dans une solution chromogène.

1x1 L Wash Buffer 10x (Tampon de lavage 10x)

Solution saline de tampon Tris contenant du Tween 20, pH 7,6.

5 lames EGFR pharmDx™ Control Slides (Lames de contrôle EGFR pharmDxTM)

Chaque lame contient deux lignées cellulaires humaines fixées au formol, incluses en paraffine et enrobées, ce qui représente un niveau modéré d'expression de la protéine EGFR et aucune expression du EGFR. Les notes de coloration IHC des pellets cellulaires sont 2+ et 0.

Lignée cellulaire : CAMA-1 Niveau d'expression : 0

Lignée cellulaire : HT-29 Niveau d'expression : 2+

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Matériels requis mais non fournis Hydroxyde d'ammonium, 15 mol/L, dilué à 0,037 mol/L Contre-colorant : hématoxyline, à base d'alcool ou d'eau, tels les produits Hematoxylin (réf. S3302) de Dako. ou Automation Hematoxylin

(réf. S3301) de Dako Lamelles de protection Eau distillée ou déionisée (eau de qualité réactif) Étuve de séchage, capable de maintenir une température de 56 à 60 °C Éthanol, absolu et à 95% Chambre humide Microscope optique (grossissement de 4x à 40x) Milieu de montage, de type Faramount de Dako (réf. S3025)

ou Glycergel de Dako (réf. C0563) ou Ultramount de Dako (réf. S1964) Tissus positifs et négatifs à utiliser comme contrôles du processus (voir la section Contrôle qualité) Lames, SuperFrost Plus de Fisher, lames enduites de poly-L-lysine, lames chargées, ou Silanized Slides (réf. S3003) de Dako (voir la

section Préparation des échantillons) Cuves ou bains de coloration Chronomètre (pouvant accepter des intervalles de 2 à 30 minutes) Flacon de lavage Xylène, toluène ou substituts de xylène Remarque : tous les réactifs inclus ou vendus séparément, tel le tampon de lavage (réf. S3006) de Dako, sont formulés spécifiquement pour être utilisés avec ce test. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée. Préparation des échantillons Les échantillons de biopsie doivent être manipulés de sorte à préserver le tissu pour la coloration IHC. Des méthodes standard de traitement des tissus doivent être utilisées pour tous les échantillons13. Les échantillons conservés dans les fixateurs suivants sont adaptés au test avec le kit EGFR pharmDx : formol neutre tamponné à 10% (v/v), formol non tamponné à 10% (v/v), formol non tamponné à 25% (v/v), AFA (alcool-formol acétique), Pen-fix de Richard-Allan Scientific et fixateur de liquide de Bouin. Les tissus fixés dans du PreFer d'Anatech ne sont pas adaptés au test avec le kit EGFR pharmDx. L'utilisation du kit EGFR pharmDx sur des tissus fixés au PreFer conduit à une préservation insatisfaisante de la morphologie et peut entraîner des résultats erronés14. Coupes incluses en paraffine L'utilisation de tissus traités en routine et inclus en paraffine est adaptée. Les échantillons de biopsie doivent être inclus dans 3 à 4 mm de paraffine et fixés pendant la durée appropriée au fixateur. Les tissus sont ensuite déshydratés et nettoyés dans une série de bains d'alcools et de xylène, puis infiltrés par la paraffine fondue. La température de la paraffine ne doit pas dépasser 60 °C. Les blocs de tissus inclus et fixés correctement et exprimant la protéine EGFR se conservent indéfiniment avant la coupe et le montage sur lame, sous réserve qu'ils soient conservés dans un endroit frais (entre 15 et 25 °C)13,15. L'épaisseur des coupes d'échantillons tissulaires doit être comprise entre 3 et 5 µm. Après la coupe, les tissus doivent être montés sur des lames et placés dans des égouttoirs. Il est recommandé d'utiliser les lames suivantes : SuperFrost Plus de Fisher, Silanized Slides (réf. S3003) de Dako, lames enduites de poly-L-lysine ou lames chargées. Les portoirs à lames doivent être tapotés sur une serviette absorbante afin d'éliminer l'eau piégée entre le verre et la couche de paraffine, puis séchés à température ambiante pendant une heure. Le portoir à lames doit alors être placé dans un incubateur entre 56 et 60 °C pendant une heure. Tout excès d'eau restant sur les lames après leur sortie de l'incubateur doit être éliminé en tapotant les lames sur des serviettes et en les faisant sécher pendant une heure supplémentaire dans l'incubateur. À leur sortie de l'incubateur, les lames doivent être maintenues à température ambiante jusqu'à refroidissement et durcissement de la paraffine. Afin de conserver l'antigénicité, les coupes de tissu, montées sur lames (SuperFrost Plus de Fisher, lames enduites de poly-L-lysine, lames chargées ou Silanized Slides (réf. S3003) de Dako), doivent être colorées dans les 2 mois suivant la coupe, en étant conservées à température ambiante (entre 20 et 25 °C)14. Consulter le Dako Handbook : "Immunochemical Staining Methods"16 ou les références 13 et 15 pour plus de détails sur la préparation des échantillons. L'utilisation de ce test sur des tissus décalcifiés n'a pas été validée et n'est pas recommandée. Les lames nécessaires à l'évaluation du EGFR et à la vérification de la présence d'une tumeur doivent être préparées simultanément. Il est recommandé d'utiliser au moins 5 lames : 1 lame pour la présence d'une tumeur, 2 lames pour l'évaluation de la protéine EGFR (une lame pour l'anticorps primaire et une autre lame pour le réactif de contrôle négatif), et 2 lames de secours. Précautions d'emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l'azide de sodium (NaN3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit,

bien que non classé comme dangereux, l'accumulation de NaN3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l'élimination, rincer abondamment à l'eau pour empêcher toute accumulation d'azide dans les canalisations.17

3. Comme avec tout produit d'origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être utilisées pour les échantillons comme pour les réactifs.

4. Réduire au minimum la contamination microbienne des réactifs afin d'éviter toute coloration non spécifique. 5. Toute durée, température ou méthode d'incubation autres que celles indiquées peuvent entraîner des résultats erronés. 6. Les réactifs sont à la dilution optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de coloration des antigènes. 7. Ne pas remplacer les anticorps primaires ou les réactifs de contrôle négatif par des anticorps primaires ou des réactifs de contrôle

négatif provenant d'autres lots (les numéros de lot figurent sur les étiquettes des flacons) ou par des réactifs fournis par d'autres fabricants.

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8. Le polymère marqué, le chromogène DAB+ liquide et la solution de substrat DAB+ chromogène peuvent être endommagés en cas d'exposition à des niveaux de lumière excessifs. Ne pas conserver les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière directe du soleil.

9. Porter un équipement de protection individuelle approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau.18 Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales.

10. Peroxidase Block, Labelled Polymer, HRP (agent de blocage de la peroxydase, polymère marqué, HRP) : la fiche de données de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande.

11. En règle générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent être formés aux procédures de travail adéquates, aux propriétés dangereuses du produit et aux instructions de sécurité nécessaires. Se reporter à la fiche de données de sécurité pour plus d'informations.

12. DAB+ Chromogen (Chromogène DAB+) :

Danger Contient de la 3,3'-diaminobenzidine tétrahydrochloride H350 Peut provoquer le cancer. H341 Susceptible d'induire des anomalies génétiques. H319 Provoque une sévère irritation des yeux. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d'avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. Porter un vêtement de

protection. P305 + P351 + P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les

lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. P308 + P313 EN CAS d'exposition prouvée ou suspectée : Consulter un médecin. P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient conformément à l'ensemble des réglementations locales, régionales, nationales et

internationales. 13. DAB+ Buffered Substrate (Tampon substrat DAB+)

Danger Contient de l'imidazole H360 Peut nuire au fœtus. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d'avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. Porter un vêtement de

protection. P308 + P313 EN CAS d'exposition prouvée ou suspectée : Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient conformément à l'ensemble des réglementations locales, régionales, nationales et

internationales. 14. Wash Buffer (Tampon de lavage) (10X) :

Avertissement H319 Provoque une sévère irritation des yeux. P280 Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P305 + P351 + P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les

lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin. Contient du 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. Peut provoquer une réaction allergique.

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15. Protéinase K :

Avertissement H319 Provoque une sévère irritation des yeux. P280 Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P305 + P351 + P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever

les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin.

Conservation Conserver le kit EGFR pharmDx entre 2 et 8 °C. Les lames de contrôle doivent être conservées entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser le kit après la date de péremption indiquée sur la boîte. Aucun signe évident n'indique l'instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles positifs et négatifs doivent être analysés en même temps que les échantillons de patient. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées dans la notice, celles-ci doivent être validées par l'utilisateur.12

Préparation des réactifs Les réactifs suivants doivent être préparés avant de procéder à la coloration : Solution de tampon de lavage Préparer une quantité suffisante de tampon de lavage en diluant du Wash Buffer 10x, à 1:10 en utilisant de l'eau distillée ou déionisée (eau de qualité réactif) pour les étapes de lavage. Jeter le tampon s'il semble trouble. Solution de substrat chromogène DAB+ Cette solution doit être bien mélangée avant utilisation. La formation d'un précipité dans la solution n'affecte pas la qualité de la coloration. La procédure suivante permet d'obtenir 1 mL de solution de substrat DAB+ chromogène. ÉTAPE 1. Verser 1 mL de tampon substrat DAB+ dans un tube à essai. ÉTAPE 2. Ajouter une goutte de chromogène DAB+ liquide. Mélanger et appliquer aux coupes de tissu à l'aide d'une pipette. La Substrate-Chromogen Solution (Solution de substrat chromogène) (DAB) est stable pendant environ 5 jours lorsqu'elle est conservée entre 2 et 8 °C. Remarque importante : la couleur du chromogène DAB+ liquide dans le flacon peut varier de transparent à lavande-marron clair. Cela n'affecte en rien les performances de ce produit. Diluer conformément aux instructions indiquées ci-dessus. L'ajout d'une quantité trop importante de chromogène DAB+ liquide dans le tampon de substrat DAB+ entraîne une détérioration du signal positif. Contre-coloration Préparer de l'ammoniaque pour le bleuissement de contre-coloration si nécessaire. L'ammoniaque (0,037 mol/L) est préparée en mélangeant 2,5 mL (± 0,5 mL) d'hydroxyde d'ammonium à 15 mol/L (concentré) et 1 litre d'eau de qualité réactif. La solution aqueuse d'ammoniaque à 0,037 mol/L inutilisée peut être conservée à température ambiante (entre 20 et 25 °C) durant 12 mois, dans un flacon hermétiquement fermé. Milieu de montage Les milieux de montage tels le Faramount Aqueous Mounting Medium de Dako, Ready-to-Use (réf. S3025) ou le Glycergel Mounting Medium de Dako (réf. C0563) sont recommandés pour le montage aqueux. Liquéfier le Glycergel en le chauffant à environ 40 °C (± 5 °C) avant utilisation. Un milieu de montage permanent non aqueux, tel Ultramount (réf. S1964) de Dako, est également adapté. Procédure de coloration Remarques sur la procédure L'utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les composants avant utilisation (voir la section Précautions d'emploi). Tous les réactifs doivent être ramenés à température ambiante (entre 20 et 25 °C) avant de procéder à l'immunocoloration. De même, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Ne pas laisser les coupes de tissu sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Pour éviter le dessèchement des tissus, placer les lames dans une chambre humide. Déparaffinage et réhydratation Avant la coloration, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d'éliminer le milieu de montage, puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Tout résidu de milieu d'inclusion entraîne une coloration non spécifique plus importante. ÉTAPE 1. Placer les lames dans un bain de xylène et incuber pendant 5 minutes (± 1 minute). Renouveler les bains et recommencer

l'opération une fois. ÉTAPE 2. Tapoter afin d'éliminer l'excès de liquide et placer les lames dans de l'éthanol absolu pendant 3 minutes (± 1 minute). Renouveler

les bains et recommencer l'opération une fois.

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ÉTAPE 3. Tapoter afin d'éliminer l'excès de liquide et placer les lames dans de l'éthanol à 95% pendant 3 minutes (± 1 minute). Renouveler les bains et recommencer l'opération une fois.

ÉTAPE 4. Tapoter afin d'éliminer l'excès de liquide et placer les lames dans de l'eau de qualité réactif pendant 5 minutes (± 1 minute). Lancer la procédure de coloration comme indiqué à la section C du Protocole de coloration.

Les solutions de xylène et d'alcool doivent être renouvelées toutes les 40 lames. Du toluène ou des substituts de xylène, comme l'Histoclear, peuvent être utilisés à la place du xylène. Protocole de coloration ÉTAPE 1. Digestion protéolytique par la protéinase K

Tapoter afin d'éliminer l'excès d'eau de qualité réactif. Avec un tissu non pelucheux (ex. : Kimwipe® ou gaze), essuyer avec précaution autour de l'échantillon pour enlever tout liquide restant et maintenir les réactifs dans la zone indiquée.

Appliquer assez de solution de Protéinase K pour recouvrir l'échantillon (au moins 3 gouttes, soit 100 µL). Incuber pendant 5 minutes ± 30 secondes. Rincer doucement avec de l'eau de qualité réactif contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les

tissus). Placer dans un nouveau bain d'eau de qualité réactif pendant 5 minutes ± 1 minute. Le kit EGFR pharmDx inclut un prétraitement par une étape de digestion par une enzyme protéolytique. Les coupes de tissu peuvent occasionnellement être digérées de manière excessive, ce qui entraîne une rupture des membranes cellulaires et de la structure tissulaire en général. Effectuer le test en faisant particulièrement attention à la durée de l'étape de digestion protéolytique. Remarque : si le problème de digestion excessive persiste, il est possible de post-fixer les tissus fixés dans du formol neutre tamponné à 10% dans du formol neutre tamponné à 10% pendant 10 minutes après le déparaffinage. Voir la procédure ci-après : Procédure de post-fixation 1. Déparaffiner les coupes et les immerger dans de l'eau de qualité réactif. 2. Immerger les lames dans du formol neutre tamponné à 10% pendant 10 minutes. 3. Rincer les lames deux fois dans de l'eau déionisée ou distillée. 4. Poursuivre la procédure de coloration EGFR pharmDx. ÉTAPE 2. Agent de blocage de la peroxydase

Tapoter afin d'éliminer l'excès d'eau et essuyer les lames comme précédemment. Appliquer assez de Peroxidase Block pour recouvrir l'échantillon (au moins 3 gouttes, soit 100 µL). Incuber pendant 5 minutes ± 1 minute. Rincer doucement avec du Wash Buffer (Tampon de lavage) contenu dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement

sur les tissus). Placer dans un nouveau bain de Wash Buffer pendant 5 minutes ± 1 minute. ÉTAPE 3. Anticorps primaire ou réactif de contrôle négatif

Placer les lames dans une chambre humide pendant les incubations de l'anticorps primaire/réactif de contrôle négatif et du polymère marqué afin d'éviter le dessèchement des tissus.

Tapoter afin d'éliminer l'excès de tampon et essuyer les lames comme précédemment. Appliquer assez d'anticorps primaire ou de réactif de contrôle négatif pour recouvrir l'échantillon (au moins 3 gouttes (100 µL)). Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute dans une chambre humide. Rincer les lames comme indiqué à l'étape 2. ÉTAPE 4. Labelled Polymer, HRP (Polymère marqué, HRP)

Tapoter afin d'éliminer l'excès de tampon et essuyer les lames comme précédemment. Appliquer assez de Labelled Polymer (polymère marqué) pour recouvrir l'échantillon (au moins 3 gouttes, soit 100 µL). Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute dans une chambre humide. Rincer les lames comme indiqué à l'étape 2. ÉTAPE 5. DAB+ Solution de substrat chromogène

Tapoter afin d'éliminer l'excès de tampon et essuyer les lames comme précédemment. Appliquer assez de DAB+ Substrate-Chromogen Solution (solution de substrat chromogène DAB+) pour recouvrir l'échantillon (au

moins 3 gouttes (100 µL)). Incuber durant 10 (± 1) minutes. Rincer doucement avec de l'eau de qualité réactif contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les

tissus). Recueillir les déchets de DAB+ Substrate-Chromogen Solution (solution de substrat DAB+ chromogène) dans un conteneur pour déchets biologiques pour les éliminer de manière appropriée.

Placer dans un bain d'eau de qualité réactif pendant 2 à 5 minutes. Contre-coloration (instructions pour l'hématoxyline) Le produit final de la réaction de coloration n'est soluble ni dans l'alcool ni dans l'eau. L'hématoxyline, qu'elle soit à base d'alcool ou d'eau, comme Hematoxylin (réf. S3302) de Dako ou Automation Hematoxylin (réf. S3301) de Dako, peut être utilisée. Ne pas utiliser de contre-colorants de régression. ÉTAPE 1. Immerger les lames dans un bain d'hématoxyline. Incuber pendant 2 à 5 minutes, en fonction de la puissance de l'hématoxyline utilisée. ÉTAPE 2. Rincer doucement dans un bain d'eau de qualité réactif. Vérifier qu'il n'y a plus de résidus d'hématoxyline. Facultatif : tremper les lames 10 fois dans un bain d'ammoniaque à 0,037 mol/L (voir Préparation des réactifs). L'étape avec l'ammoniaque n'est pas nécessaire lorsque les produits Hematoxylin (réf. S3302) de Dako ou Automation Hematoxylin (réf. S3301) de Dako sont utilisés. Remarque : l'utilisation de Hematoxylin (réf. S3302) de Dako ou de Automation Hematoxylin (réf. S3301) de Dako est fortement recommandée. Après une incubation de 5 minutes, ce contre-colorant entraîne la formation d'un produit bleu/mauve qui n'obscurcit pas la coloration immunologique spécifique. Une forte contre-coloration peut masquer une faible expression du EGFR.

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ÉTAPE 3. Rincer doucement dans un bain d'eau de qualité réactif pendant 2 à 5 minutes. Montage Les milieux de montage tels le Faramount Aqueous Mounting Medium de Dako, Ready-to-Use (réf. S3025) ou le Glycergel Mounting Medium de Dako (réf. C0563) sont recommandés pour le montage aqueux. Liquéfier le Glycergel en le chauffant à environ 40 °C (± 5 °C) avant utilisation. Un milieu de montage permanent non aqueux, tel Ultramount (réf. S1964) de Dako, est également adapté. Remarque : les lames peuvent être lues à tout moment. Cependant, une atténuation peut se produire si les lames sont recouvertes d'un milieu de montage aqueux et exposées à une forte lumière. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l'obscurité à température ambiante (20-25 °C). Contrôle qualité Des différences dans les procédures recommandées pour la fixation, le traitement et l'inclusion des tissus du laboratoire de l'utilisateur peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers, en complément des lames de contrôle fournies par DakoCytomation. Aux États-Unis, consulter les consignes de contrôle qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du College of American Pathologists (CAP). Voir également le document "Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline" du CLSI,19 et les références 20 à 23 pour plus d'informations. Lames de contrôle EGFR pharmDx (fournies) Chacune des lames de contrôle fournies contient deux lignées cellulaires humaines fixées au formol, incluses en paraffine et enrobées, présentant des notes d'intensité de 2+ et 0. Une lame doit être colorée lors de chaque procédure de coloration. L'évaluation des lignées cellulaires des lames de contrôle fournies par DakoCytomation indique la validité du cycle de coloration. Elles ne doivent pas être utilisées à des fins d'interprétation des résultats de patient. Tissu de contrôle positif Les contrôles doivent être des échantillons d'autopsie/de biopsie/de chirurgie récents fixés, traités et inclus aussi rapidement que possible de la même manière que les échantillons de patient. Les contrôles de tissu positifs indiquent si les tissus ont été préparés correctement et si des techniques de coloration appropriées ont été utilisées. Un contrôle de tissu positif pour chaque ensemble de conditions d'analyse doit être inclus dans chaque cycle de coloration.

Les tissus utilisés pour les contrôles de tissu positifs doivent présenter une faible coloration positive pour pouvoir détecter des changements minimes de sensibilité de l'anticorps primaire. Les lames de contrôle fournies avec ce kit ou les échantillons traités différemment du ou des échantillon(s) de patient valident les performances des réactifs uniquement et non la préparation des tissus. Les tissus de contrôle positif connus ne doivent être utilisés que pour vérifier les bonnes performances des tissus traités et des réactifs de test, et NON pour établir un diagnostic spécifique aux échantillons de patient. Si les tissus de contrôle positif ne présentent pas la coloration positive appropriée, les résultats des échantillons à analyser doivent être considérés comme non valides. Les types de cellules normales peuvent être utilisées comme faiblement positives à l'EGFR incluent les cellules épithéliales glandulaires de l'épithélium prostatique et bronchique de poumon sain. Le motif de coloration du EGFR étant hétérogène, des éléments tissulaires sains se colorant faiblement peuvent également être négatifs. La périnèvre est un contrôle de tissu interne fortement positif. Les cellules normales qui présentent une coloration positive modérée au EGFR incluent les cellules épithéliales du col de l'utérus et de la peau. Tissu de contrôle négatif Utiliser un tissu de contrôle négatif (connu pour être négatif à la protéine EGFR) fixé, traité et inclus de la même manière que le ou les échantillon(s) de patient avec chaque cycle de coloration pour vérifier la spécificité de l'anticorps primaire et fournir une indication de la coloration du bruit de fond spécifique. La variété des différents types cellulaires présents dans la plupart des coupes de tissu offre des sites de contrôle négatif internes (cela doit être vérifié par l'utilisateur). Si une coloration spécifique se produit dans le tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. Les éléments tissulaires pouvant être utilisés comme contrôles négatifs incluent les myocytes cardiaques. Les cellules acinaires du pancréas sont également négatives au EGFR, alors que l'épithélium du canal biliaire pancréatique présente une coloration positive. Les lymphocytes présents ne se colorent pas avec le kit EGFR pharmDx et peuvent être utilisés comme contrôle interne négatif. Réactif de contrôle négatif non spécifique Utiliser le réactif de contrôle négatif fourni au lieu de l'anticorps primaire avec une coupe de chaque échantillon de patient afin d'évaluer la coloration non spécifique et d'obtenir une meilleure interprétation de la coloration spécifique au niveau du site de l'antigène. La période d'incubation du réactif de contrôle négatif doit correspondre à celle de l'anticorps primaire. Vérification du dosage Avant toute première utilisation d'un kit de coloration lors d'une procédure diagnostique, l'utilisateur doit vérifier les performances du dosage en le testant sur une série de tissus en interne dont les performances IHC sont connues, représentant des tissus positifs et négatifs connus. Ces procédures de vérification doivent être répétées pour chaque nouveau lot de tests. Se référer aux Procédures de contrôle qualité décrites précédemment dans cette section de la notice produit, aux exigences de contrôle qualité du "Certification Program for Immunohistochemistry" du CAP et/ou du "Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline" du CLSI.19 Les carcinomes présentant des intensités de coloration de la protéine EGFR connues et des tissus négatifs sont adaptés à la vérification du dosage.

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Tableau 1 : objectif du contrôle qualité quotidien

Tissu : Fixé et traité comme un échantillon de patient

Anticorps spécifique et kit de détection Bruit de fond : anticorps non spécifique (réactif de contrôle négatif IgG1 de souris) fournis

Lame de contrôle fournie par Dako. Procédure de coloration des contrôles uniquement. L'évaluation des lignées cellulaires des lames de contrôle fournies par DakoCytomation indique la validité du cycle de coloration.

Contrôle positif : tissu ou cellules contenant l'antigène cible à détecter (peut être localisé dans le tissu du patient). Le contrôle idéal est un tissu présentant une faible coloration positive pour être plus sensible à l'anticorps ou à une dégradation de l'antigène.

Contrôle toutes les étapes de l'analyse. Valide les réactifs et les procédures utilisés pour la coloration du EGFR.

Détection d'une coloration de bruit de fond non spécifique.

Contrôle négatif : tissus ou cellules devant être négatifs (peuvent être localisés dans un tissu de patient ou un tissu de contrôle positif).

Détection d'une réactivité croisée inattendue de l'anticorps aux cellules/éléments cellulaires.

Détection d'une coloration de bruit de fond non spécifique.

Tissu de patient. Détection d'une coloration spécifique. Détection d'une coloration de bruit de fond non spécifique.

Interprétation de la procédure de coloration L'évaluation des lames doit être effectuée par un pathologiste à l'aide d'un microscope optique. Tous les examens doivent être réalisés dans la région tumorale de l'échantillon. Pour l'évaluation de la coloration immunocytochimique et la notation, un objectif à grossissement de 10x ou 20x est approprié. Utiliser des cellules intactes pour l'interprétation des résultats de coloration ; les cellules nécrotiques ou dégénérées se colorent souvent de manière non spécifique.19

Des lignées cellulaires positives et négatives sont fournies avec chaque kit EGFR pharmDx pour valider les cycles de coloration, à chaque fois qu'un dosage a lieu. Une coloration appropriée des lignées cellulaires de contrôle apporte la preuve que le dosage EGFR pharmDx fonctionne correctement. Aucune coloration membranaire de la lignée cellulaire de contrôle CAMA-1 (0) et une coloration membranaire complète ou incomplète brune modérée dans la lignée cellulaire de contrôle HT-29 (2+) indique que le cycle de coloration est valide. Si l'intensité de coloration de la lignée cellulaire de contrôle positif est trop faible ou trop forte, il est possible qu'il s'agisse d'un faux positif ou d'un faux négatif et le test doit être répété. Des images de référence sont disponibles dans le Guide d'interprétation du kit EGFR pharmDx. Le kit EGFR pharmDx colore principalement les membranes cellulaires, présentant une coloration périphérique à la fois complète et incomplète. Le motif de coloration immunologique est fréquemment hétérogène, montrant diverses intensités de coloration dans un seul néoplasme. Une coloration a également été observée dans le cytoplasme et les espaces extracellulaires. Une coloration cytoplasmique est couramment observée mais le test doit être répété si une coloration cytoplasmique importante empêche de bien distinguer la coloration membranaire et donc, compromet l'interprétation des résultats. Les tumeurs doivent être signalées comme positives ou négatives à l'EGFR en se référant à la coloration membranaire comme structure évaluable. Une cellule tumorale est positive à la EGFR si sa coloration membranaire est supérieure à la coloration du bruit de fond, qu'il s'agisse ou non d'une coloration périphérique complète. Une tumeur dont la coloration membranaire n'est pas supérieure à la coloration du bruit de fond dans toute cellule tumorale est indiquée comme négative à l'EGFR. En fonction de la durée d'incubation et de la puissance de l'hématoxyline utilisée, la contre-coloration donne une coloration bleu clair à foncé des noyaux cellulaires. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. Tableau 2 : résultats de coloration avec le kit EGFR pharmDx

Rapport au médecin traitant Définition Tumeur négative à l'EGFR Absence de coloration membranaire supérieure à la coloration du bruit de

fond dans toutes les cellules tumorales.

Tumeur positive à l'EGFR

La coloration positive à la EGFR se définit comme toute coloration IHC des membranes des cellules tumorales supérieure au niveau de la coloration du bruit de fond, que la coloration périphérique soit complète ou incomplète.

Intensité de coloration Pourcentage de coloration des cellules tumorales

1+, 2+ ou 3+ > 0% Ces définitions des résultats positifs et négatifs sont conformes à la littérature24 mais il se peut qu'elles doivent être modifiées dans des contextes particuliers. (Voir Limites spécifiques au produit) Limites Limites générales L'IHC est un processus diagnostique à plusieurs étapes qui requiert une formation spécialisée pour la sélection des réactifs appropriés ; la sélection, la fixation et le traitement des tissus ; la préparation des lames IHC ; et l'interprétation des résultats de coloration.

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La coloration des tissus dépend de la manipulation et du traitement corrects des tissus avant la coloration. Des procédures de fixation, congélation, décongélation, lavage, séchage, chauffage, coupe inadaptées ou une contamination par d'autres tissus ou fluides peuvent générer des artéfacts, un piégeage des anticorps ou des faux négatifs. Des résultats incohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d'inclusion, ou à des irrégularités inhérentes au tissu. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. L'interprétation clinique de toute coloration positive ou de son absence doit être effectuée dans le contexte de la présentation clinique, de la morphologie et d'autres critères histopathologiques. L'interprétation clinique de toute coloration, ou de son absence, doit être complétée par des études morphologiques et des contrôles appropriés ainsi que par d'autres tests diagnostiques. L'interprétation de la coloration est de la responsabilité d'un pathologiste qualifié devant être familiarisé avec les anticorps, les réactifs et les méthodes de coloration utilisés. La coloration doit être réalisée dans un laboratoire autorisé et certifié, sous le contrôle d'un pathologiste responsable de l'examen des lames colorées et vérifiant la pertinence des contrôles positifs et négatifs. Les tissus de patients infectés par le virus de l'hépatite B et porteurs de l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort25. Les réactifs peuvent présenter des réactions inattendues dans des tissus non testés précédemment. La possibilité de réactions inattendues même dans les groupes de tissus préalablement testés ne peut pas être complètement écartée, du fait de la variabilité biologique de l'expression des antigènes dans les néoplasmes ou autres tissus pathologiques22. Contacter l'assistance technique Dako pour faire part de ces réactions inattendues. Des faux positifs peuvent être dus à une liaison non immunologique des protéines ou des produits de réaction du substrat. Ils peuvent aussi être causés par une activité pseudoperoxydasique (érythrocytes) ou par une activité peroxydasique endogène (cytochrome C).21

Remarque : les réactifs fournis dans ce kit et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales. Toute dilution supplémentaire des réactifs du kit, ainsi que toute modification des temps ou températures d'incubation, peut produire des résultats erronés ou discordants. Limites spécifiques au produit Le taux de réponse au cetuximab des patients chez lesquels la coloration est négative à l'EGFR ou positive pour moins de 1% des cellules tumorales est inconnu car aucun patient de ce type n'était inclus dans les essais cliniques. Les tumeurs dont la coloration est positive à l'EGFR pour > 1% des cellules sont considérées comme exprimant l'EGFR pour ce qui est des indications d'utilisation actuelles du cetuximab. Les patients présentant une coloration membranaire de l'EGFR dans moins de 1% des cellules tumorales n'ont pas été inclus dans l'étude contrôlée et randomisée sur le panitumumab. De ce fait, l'activité du panitumumab dans cette population de patients n'est pas connue. Les tumeurs dont la coloration est positive à l'EGFR pour > 1% des cellules sont considérées comme exprimant l'EGFR pour ce qui est des indications d'utilisation actuelles du panitumumab. Les faux négatifs peuvent être dus à une dégradation de l'antigène dans les tissus au fil du temps. Les échantillons doivent être colorés dans les 2 mois suivant le montage des tissus sur les lames lorsqu'ils sont conservés à température ambiante (20–25 °C).14,26 Pour des résultats optimaux et reproductibles, la protéine EGFR requiert une digestion protéolytique lorsque les tissus sont fixés en routine et inclus en paraffine. Performances Spécificité La réactivité de l'anticorps EGFR, clone 2-18C9 (2-18C9) a été testée par rapport aux lignées cellulaires exprimant le EGFR, HER2, HER3 et HER4. Lors de tests Western blot des lysats cellulaires SKBR3 et A431, le clone 2-18C9 a reconnu une bande de 170 kD qui correspond au poids moléculaire connu du EGFR. Il a été observé que le clone 2-18C9 reconnaît également la forme EGFRvIII (145 kD) du récepteur lors d'une analyse immunohistochimique, d'une cytométrie de flux et d'un Western blot des lignées cellulaires transfectées par EGFRvIII. Lors d'analyses par Western blot, le clone 2-18C9 n'a pas réagi aux lysats cellulaires CAMA-1 positifs au HER2, aux extraits de protéine BL-21 d'E. Coli transformés par HER3 et aux lysats cellulaires transfectés par CHO-HER4. En outre, des transfectants d'ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant le myc (vecteur Tag), soit seul soit exprimé en même temps que l'un des membres de la famille HER, ont été mis en culture dans des lames d'incubation, fixés au formol et inclus en paraffine, puis colorés en utilisant l'anti-myc et le clone 2-18C9. L'anticorps myc a coloré les cinq transfectants de CHO, alors que le clone 2-18C9 a uniquement coloré les cellules CHO transfectées avec le HER1. Essais cliniques Essais cliniques sur le cetuximab Trois essais sur le cetuximab dans des cas de carcinome colorectal (CCR) (EMD 62202-007, IMCL CP02-9923 et IMCL CP02-0141) ont été réalisés. Les résultats du test de coloration immunohistochimique (IHC) d'expression de l'EGFR de Dako ont été utilisés comme l'un des critères d'admissibilité de l'étude. Dans 2 des 3 essais, dont l'essai pivot (EMD 62202-007), le seuil d'expression de l'EGFR a été établi à 1+ sur une échelle d'intensité de coloration positive à l'EGFR allant de 0 à 3+ pour > 1% du nombre total de cellules tumorales. Ce seuil a été choisi car l'analyse en sous-groupe de différents seuils pour les critères de coloration membranaire et d'autres critères de différentiation ne pouvait détecter aucune différence significative dans les résultats cliniques.

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Essai pivot sur le cetuximab L'essai pivot (EMD 62202-007) a permis l'enrôlement de patients présentant des tumeurs pour lesquelles des cellules positives à l'EGFR ont été détectées à l'aide du test EGFR pharmDx de DakoCytomation. Toutes les tumeurs de ce type étudiées au cours de l'essai comportaient au moins 1% de cellules positives à l'EGFR, et ces tumeurs ont été identifiées comme exprimant l'EGFR. Les patients présentant des tumeurs exprimant l'EGFR ont été traités par cetuximab et irinotécan ou par cetuximab seul. 577 échantillons tumoraux ont été testés. 474 sur 577 (82%, IC à 95% = 78,1%-86,1%) des échantillons de CCR testés se sont avérés positifs à l'expression de l'EGFR. 329 patients ayant subi le test EGFR pharmDx ont été randomisés à raison de 2:1 dans les deux groupes de l'essai clinique pivot. Dans cet essai, les patients ayant reçu de l'irinotécan plus du cetuximab ont présenté un taux de réponse de 50 sur 218 (22,9%, 95% IC = 17,5%, 29,1%). Les patients ayant reçu uniquement du cetuximab ont enregistré un taux de réponse de 12 sur 111 (10,8%, IC à 95% = 5,7%, 18,1%). Seuls les patients présentant des tumeurs exprimant l'EGFR, comme décrit ci-dessus, ont reçu un traitement par cetuximab. Le taux de réponse des sujets porteurs de tumeurs n'exprimant pas l'EGFR est inconnu et ne peut, par conséquent, être comparé. Il n'existe aucune corrélation entre le degré de réponse de la tumeur et le pourcentage de cellules positives à l'EGFR ou l'intensité de coloration de l'EGFR. (voir Tableau 3) Tableau 3 : taux de réponse lors de l'essai pivot sur le cetuximab (EMD 62202-007)

Nombre total de patients testés

Taux de réponse# des cas traités par cetuximab et irinotécan

Taux de réponse# des cas traités par cetuximab seul

EGFR pharmDx + (> 1%) 474* 50 sur 218 (22,9%, IC à 95% = 17,5%, 29,1%)

12 sur 111 (10,8%, IC à 95% = 5,7%, 18,1%)

EGFR pharmDx - 103 Aucun patient traité Aucun patient traité * 329 patients ont été randomisés à raison de 2:1 dans les deux groupes de l'essai clinique. # Le taux de réponse correspondait à la proportion de patients dans la population totale incluse dans l'étude présentant une diminution ≥ 50% de la somme des diamètres perpendiculaires de toutes les tumeurs mesurables (c'est-à-dire une diminution de 50% ou plus des tumeurs en termes d'étendue de la surface), observée pendant au moins 28 jours. Essais auxiliaires sur le cetuximab L'essai EGFR pharmDx a été utilisé pour enrôler des patients dans l'essai pivot (EMD 62202-007) et un essai auxiliaire (IMCL CP02-0141) au cours du développement du cetuximab. Au cours de l'essai IMCL CP02-0141, 140 échantillons ont été testés. 105 échantillons sur 140 (75%, IC à 95% = 66,9%-83,1%) contenaient des tumeurs ayant été identifiées comme exprimant l'EGFR. Au total, 61 patients ont été enrôlés dans cette étude ; 57 patients ont reçu du cetuximab. Au cours d'un essai auxiliaire supplémentaire (IMCL CP02-9923), un prototype de kit EGFR pharmDx (composé des mêmes anticorps primaires et kit de détection que celui décrit précédemment), a été utilisé pour inclure les patients. Au total, 412 échantillons provenant de 401 patients ont été analysés. 292 patients sur 401 (72,8%, IC à 95% = 68,0%, 77,6%) ont enregistré un résultat positif au test. 139 patients ont été inclus ; 138 ont reçu du cetuximab et de l'irinotécan. Tableau 4 : résumé de l'expression de l'EGFR en pourcentage chez les patients atteints de cancer du côlon

Nom de l'essai Ratio d'expression de l'EGFR (nbre d'échantillons exprimant

l'EGFR/nbre d'échantillons testés)

% d'expression de l'EGFR

Intervalles de confiance à 95%

Essai pivot EMD 62202-007 474/577 82,1% 78,1 – 86,1%

Essai auxiliaire IMCL CP02-0141 105/140 75,0% 66,9 – 83,1%

Essai sur prototype EGFR IMCL CP02-9923

292/401 72,8% 68,0 – 77,6%

Études cliniques sur le panitumumab Les données d'efficacité soutenant l'utilisation du panitumumab dans le traitement des patients souffrant d'un cancer colorectal métastatique réfractaire (CCRm) ont été fournies par des études de patients dont les tumeurs ont été identifiées grâce au dosage EGFR pharmDx™ de Dako comme exprimant l'EGFR. Essai contrôlé et randomisé sur le panitumumab Cette étude multicentrique, randomisée, en ouvert et comparative sur l'intérêt du panitumumab (20020408, étude d'extension 20030194) associé aux meilleurs soins de soutien (BSC) par rapport aux BSC seuls a été réalisée sur des patients souffrant de CCRm pour lesquels les traitements par chimiothérapie à base d'oxaliplatine et d'irinotécan ont échoué et dont les tumeurs ont montré une coloration membranaire de l'EGFR dans ≥ 1% des cellules tumorales. Dans les deux groupes de traitement, le pourcentage médian de cellules tumorales montrant une coloration membranaire positive de l'EGFR était de 20% (plage : entre 1% et 100%).

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Dans l'étude 20020408, une importante amélioration statistique du principal résultat final, c'est-à-dire de la survie sans progression (PFS), a été observée pour le groupe traité par panitumumab en plus des BSC, en comparaison du groupe recevant uniquement les BSC (p < 0,0001, test stratifié consistant à évaluer l'égalité des fonctions de survie). Dans cet essai randomisé et contrôlé, le taux de réponse a été de 8,3% (19/229, IC à 95% : 5,1%, 12,6%) et défini comme étant une réponse complète ou partielle (RECIST, version modifiée) sur une durée confirmée d'au moins 4 semaines. Les taux de réponse correspondants pour les 174 patients qui sont passés des BSC au panitumumab dans l'étude d'extension étaient de 9,8% (17/174, IC à 95% : 5,8%, 15,2%). Il n'existe aucune corrélation entre les effets du traitement sur la survie sans progression et le pourcentage de cellules tumorales présentant une coloration membranaire positive à l'EGFR ou l'intensité de cette coloration. (voir Tableau 5 ci-dessous) Tableau 5 : effets du traitement sur la survie sans progression en fonction des résultats de la coloration à l'EGFR

Étude 20020408 Nbre de patients/

Événements Rapport de

risquea Intervalle de confiance pour le

rapport de risque de 95% Valeur p Tous les sujets randomisés 463/401 0,54 (0,44, 0,66) < 0,0001 % de coloration membranaire de l'EGFRb

1 - < 10% 114/91 0,46 (0,30, 0,71) 0,0004 10 - 35% 182/157 0,55 (0,40, 0,76) 0,0004 > 35% 164/150 0,56 (0,40, 0,78) 0,0007

Intensité maximale de coloration membranaire de l'EGFRc 1+ 138/113 0,61 (0,41, 0,90) 0,0140 2+ 235/206 0,49 (0,37, 0,65) < 0,0001 3+ 88/80 0,61 (0,39, 0,97) 0,0379

a Le rapport de risque pour le panitumumab et les BSC par rapport aux BSC seuls est estimé à partir d'un modèle à risques proportionnels de Cox ajusté pour le score de performance ECOG et la région géographique. Une valeur < 1,0 indique une diminution du taux moyen d'événements et une augmentation du délai de survenue chez les patients recevant du panitumumab et des BSC par rapport aux patients recevant uniquement les BSC.

b 3 patients exclus car l'expression de la coloration membranaire de l'EGFR dans leurs tumeurs était < 1% (violations du protocole). c 2 patients exclus car l'expression de la coloration membranaire de l'EGFR dans leurs tumeurs était < 1% et l'intensité maximale de coloration membranaire était < 1+ (violations du protocole).

Tableau 6 : résumé de l'expression de l'EGFR en pourcentage chez les patients atteints de cancer du côlon

Nom de l'essai Ratio d'expression de l'EGFR (nbre d'échantillons exprimant

l'EGFR/nbre d'échantillons testés)

% d'expression de l'EGFR

Intervalles de confiance à 95%

Essai pivot 20020408 735/1004 73,2% 70,4 – 75,9%

Reproductibilité Reproductibilité inter-cycles La reproductibilité inter-cycles a été testée en utilisant la méthode manuelle dans deux laboratoires par deux techniciens dans chaque laboratoire pendant 3 jours et sur 5 échantillons différents (4 positifs, 1 négatif dans chaque laboratoire), présentant des notes d'intensité de coloration différentes, randomisés et masqués. Une reproductibilité excellente (100%) a été observée pour les résultats positifs par rapport aux résultats négatifs à l'EGFR (0 contre 1+, 2+ et 3+). L'intensité de coloration variait de 1+ dans deux des échantillons positifs et de 2+ dans un échantillon (dans l'un des tests, l'élément tissulaire positif avait été en grande partie éliminé de la lame). Les deux échantillons négatifs sont restés négatifs. Reproductibilité inter-laboratoires de la coloration La reproductibilité inter-laboratoires a été testée dans trois laboratoires géographiquement éloignés sur 30 échantillons randomisés et masqués présentant diverses notes d'intensité de coloration IHC. Des lames de coupes récentes ont été envoyées à chaque laboratoire d'analyse pour coloration manuelle et automatisée et pour examen par un pathologiste. Le pourcentage de correspondance inter-laboratoires était de 100% pour une détermination positive/négative dichotomique où 0 était négatif et 1+, 2+ et 3+ étaient positifs pour l'expression de la protéine EGFR lors des procédures d'analyse tant manuelle qu'automatisée. Immunoréactivité Le Tableau 7 résume l'immunoréactivité au EGFR pharmDx sur le panel de tissus sains recommandé. Tous les tissus étaient fixés au formol et inclus en paraffine.

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Tableau 7 : évaluation de la coloration de tissus sains par EGFR pharmDx* Type de tissu (nombre testé) Coloration d'élément tissulaire positive à l'EGFR et motif de coloration

Amygdale (3) Épithélium squameux (3+) : membranaire et cytoplasmique

Cellules mésothéliales (3) Cellules mésothéliales (2+) : membranaire et cytoplasmique Cerveau/Cerebrum (3) Aucune

Cerveau/Cervelet (3) Couche moléculaire (1+) : extracellulaire

Cœur (3) Aucune Col de l'utérus (3) Cellules épithéliales squameuses basales (2+) : membranaire

Côlon (3) Aucune**

Estomac (3) Aucune Foie (3) Hépatocytes (sinusoïdes) (3+) ; canaux biliaires (3+) : membranaire et

cytoplasmique Glande salivaire (3) Éléments canalaires (1+) : cytoplasmique

Hypophyse (3) Aucune

Intestin grêle (3) Aucune Moelle osseuse (3) Aucune

Muscle squelettique (3) Aucune

Nerf périphérique (3) Processus neuronaux (1+) : fibreuse Œsophage (2) Cellules épithéliales squameuses basales (2+) : membranaire

Ovaire (3) Aucune

Pancréas (3) Canaux (2+) : membranaire Parathyroïde (1) Aucune

Peau (3) Cellules squameuses, structures annexielles (2+) : membranaire et cytoplasmique

Poumon (3) Cellules épithéliales alvéolaires/cellules bronchiques basales (cellules myoépithéliales) (2+) : membranaire et cytoplasmique

Prostate (3) Cellules épithéliales glandulaires (2+) : membranaire Rate (3) Aucune

Rein (3) Tubules (1+) : coloration cytoplasmique (granulaire)

Sein (2) Cellules épithéliales lobulaires (2+) : membranaire et cytoplasmique Surrénale (2) Cellules corticales (2+) : cytoplasmique

Testicule (3) Aucune

Thymus (3) Aucune Thyroïde (3) Aucune

Utérus (3) Épithélium glandulaire de l'endomètre (2+) : membranaire et cytoplasmique Cellules stromales de l'endomètre (2+) : membranaire et cytoplasmique Myomètre : aucune

*La majorité des tissus testés a présenté une coloration des fibroblastes dans le tissu stromal (1+, fibreuse), ainsi que des cellules myoépithéliales et de la périnèvre. Une coloration des éosinophiles induite par la peroxydase endogène a été observée de manière occasionnelle. **Une coloration immunologique variable de l'épithélium du côlon sain a été notée.

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Dépannage Tableau 8 : résolution des problèmes

Problème Cause probable Mesure suggérée 1. Coloration d'aucune

lame. 1a. Les réactifs n'ont pas été

utilisés dans l'ordre. 1b. Azide de sodium dans un bain

de tampon de lavage.

1a. Revoir l'application des réactifs. 1b. Utiliser un nouveau bain de tampon de

lavage sans azide fourni dans le kit. 2. Coloration faible des

lames. 2a. Digestion protéolytique

inadéquate par la Proteinase K.

2b. Les coupes conservent trop de solution après un bain de lavage.

2c. Les lames ne sont pas incubées assez longtemps avec les anticorps ou la solution de substrat DAB+ chromogène.

2d. Méthode de fixation inappropriée.

2a. Vérifier que la solution de Protéinase K est incubée pendant 5 minutes exactement.

2b. Tapoter doucement pour éliminer l'excès de solution avant d'essuyer autour des coupes.

2c. Revoir les temps d'incubation recommandés.

2d. S'assurer que le tissu du patient n'est pas

fixé de manière excessive et qu'un fixateur approuvé est utilisé. (voir la section Préparation des échantillons).

3. Coloration de bruit de fond excessive des lames.

3a. La paraffine n'a pas été complètement enlevée.

3b. De l'amidon a été utilisé

comme additif lors du montage des coupes sur les lames.

3c. Les lames ne sont pas bien rincées.

3d. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration.

3e. Liaison non spécifique des

réactifs aux coupes de tissus.

3a. Utiliser de nouvelles solutions de nettoyage et suivre la procédure décrite à la section Déparaffinage et réhydratation.

3b. Éviter d'utiliser un additif pour faire adhérer les coupes aux lames de verre. Nombre d'entre eux sont immunoréactifs.

3c. Utiliser de nouvelles solutions dans les

bains de tampon et les flacons de lavage. 3d. Utiliser une chambre humide. Vérifier que

le volume de réactif approprié est appliqué sur les lames. Essuyer seulement 3 à 4 lames en même temps avant d'appliquer le réactif.

3e. Vérifier que la fixation des échantillons est correcte et/ou rechercher toute trace de nécrose.

4. Le tissu se détache des lames.

4a. Utilisation de lames inadéquates.

4a. Utiliser des lames chargées (SuperFrost Plus de Fisher) ou des lames silanisées telles les Silanized Slides (réf. S3003) de Dako.

5. Coloration spécifique trop forte.

5a. Méthode de fixation inappropriée.

5b. Durées d'incubation des

réactifs trop longues 5c. Une solution de lavage

inappropriée a été utilisée.

5a. S'assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés. (voir la section Préparation des échantillons).

5b. Consulter les instructions du Protocole de coloration.

5c. Utiliser uniquement le tampon de lavage dilué fourni avec le kit.

6. Faible coloration de la lignée cellulaire de la lame de contrôle 2+.

6a. Digestion protéolytique inadéquate par la Proteinase K.

6b. Les lames ne sont pas incubées assez longtemps avec les anticorps ou la solution de substrat DAB+ chromogène.

6c. Dégradation de la lame de contrôle.

6a. Vérifier que la solution de Protéinase K est incubée pendant 5 minutes exactement.

6b. Revoir les temps d'incubation recommandés.

6c. Vérifier la date de péremption et les

conditions de conservation du kit indiquées sur l'étiquette.

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7. Digestion excessive du tissu.

7a. Incubation excessive avec la Proteinase K.

7b. Fixation inadéquate.

7a. Vérifier que la solution de Protéinase K est incubée pendant 5 minutes maximum.

7b. Utiliser une procédure de post-fixation indiquée dans le protocole de coloration sur de nouvelles lames et effectuer la coloration en suivant la procédure existante.

Remarque : voir la section Dépannage du ''Dako Handbook : Immunochemical Staining Methods, 3ème édition16 et les ouvrages ''Atlas of Immunohistology'' 23, ou ''Immunoperoxidase Techniques''. ''Practical Approach to Tumor Diagnosis" 20. Contacter l'assistance technique Dako pour faire part de toute coloration inhabituelle.

Deutsch Code-Nr. K1492 35 Tests zur manuellen Verwendung Ausgabe 06/2018 Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Der EGFR pharmDx™-Assay ist ein immunhistochemisches (IHC) Kitsystem zur Identifizierung der Expression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (epidermal growth factor receptor, EGFR) in normalen und neoplastischen Geweben, die routinemäßig für eine histologische Auswertung fixiert wurden. Mit dem Test wird speziell das EGFR (HER1)-Protein in EGFR-exprimierenden Zellen nachgewiesen. EGFR pharmDx dient zur Identifizierung kolorektaler Krebspatienten, die für eine Behandlung mit ERBITUX™ (Cetuximab) oder Vectibix™ (Panitumumab) in Frage kommen. Zusammenfassung und Erklärung Einführung Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor ist ein durch das humane HER1-Gen kodierter Transmembranrezeptor von 170 kD. Das EGFR-Protein enthält eine Bindungsdomäne für extrazelluläre Liganden, eine Transmembranregion sowie eine intrazelluläre Domäne mit intrinsischer Protein-Tyrosinkinase-Aktivtät. EGFR ist zu anderen Mitgliedern der EGF-Rezeptor/erbB-Familie wie HER2/erbB2 oder -neu, HER3/erbB3 und HER4/erbB4 homolog.1,2 Das EGFR-Protein wird durch eine Vielzahl normaler Zellen sowie zahlreiche Epithelzelltypen und Tumore epithelialen Ursprungs exprimiert.3-9 Zu den nicht-epithelialen Zelltypen, die EGFR exprimieren, gehören glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Nervenzellen.10

Spezifität Monoklonales Maus-Anti-Human-EGFR, Klon 2-18C9, wird als Gewebekulturüberstand eines Hybridoms von einer Maus geliefert, die mit aus der Zelllinie A431 (humanes Epidermoidkarzinom) immunopräzipitiertem EGFR immunisiert wurde. Studien zum Epitop-Mapping zeigen, dass der Antikörper ein Epitop in der extrazellulären, zysteinreichen Region des sich über die Subdomäne S2 und proximal zur transmembranen Domäne erstreckenden Moleküls erkennt. Durch Mapping weiterer wichtiger Aminosäuren wurde nachgewiesen, dass dieses Epitop konformativ ist und von Disulfidbrücken im nativen Molekül abhängt.11 Dieser monoklonale Antikörperklon führt nachweislich nicht zu Kreuzreaktionen mit HER2, HER3 oder HER4 und dem Vektor-Tag myc. Die zytoplasmatische Färbung ist gut wahrnehmbar. Der Test sollte jedoch wiederholt werden, wenn eine übermäßige zytoplasmatische Färbung die Abgrenzung der diagnostischen Membranfärbung und somit die Auswertung der Ergebnisse erschwert.

Verfahrensprinzip Das EGFR pharmDx IHC-Kitsystem enthält Reagenzien für die Durchführung eines immunhistochemischen (IHC) Färbeverfahrens routinemäßig fixierter, paraffineingebetteter Proben. Im Anschluss an die Inkubation mit dem primären monoklonalen Antikörper gegen humanes EGFR-Protein verwendet dieses Kit ein gebrauchsfertiges Visualisierungsreagenz auf der Basis der Dextrantechnologie. Das Reagenz enthält sowohl sekundäre Ziegen-Anti-Maus-Antikörpermoleküle als auch mit einem gemeinsamen Dextranpolymer-Backbone verknüpfte Meerrettichperoxidasemoleküle, wodurch die sequentielle Anwendung von Link-Antikörper und Peroxidasekonjugat überflüssig wird. Die enzymatische Umwandlung des anschließend zugesetzten Chromogens führt zur Ausbildung eines sichtbaren Reaktionsprodukts an der Antigenstelle. Danach können die Proben gegengefärbt und mit Deckglas versehen werden. Ergebnisse werden mit Hilfe eines Lichtmikroskops ausgewertet. Zur Qualitätskontrolle der Kitreagenzleistung werden Kontrollobjektträger mit zwei formalinfixierten, paraffineingebetteten menschlichen Zelllinien mit Färbungsintensitätswerten von 2+ und 0 zur Verfügung gestellt. Reagenzien EGFR pharmDx für die manuelle Verwendung. Die aufgeführten Materialien reichen für 35 Tests (35 mit Primary Antibody gegen EGFR-Protein inkubierte Objektträger und 35 mit dem entsprechenden Negative Control Reagent inkubierte Objektträger). Die Anzahl der Tests beruht auf einer Menge von 3 Tropfen pro Objektträger jedes gebrauchsfertigen Reagenzes. Die im Kit gelieferten Materialien sind für maximal 5 Färbevorgänge ausreichend.

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Mitgelieferte Materialien Menge Beschreibung

1 x 8 mL Proteinase K

< 0,1% Proteinase K proteolytisches Enzym, verdünnt in Tris-HCl-Puffer mit 0,015 mol/L Natriumazid.

1 x 8 mL Peroxidase-Block

3% Wasserstoffperoxid.

1 x 4 mL EGFR pharmDx Monoclonal Mouse IgG1 Antibody

Monoklonaler Maus-Anti-Human-EGFR (Klon 2-18C9) IgG1 Antikörper-Gewebekulturüberstand in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und 0.015 mol/L Natriumazid.

1 x 4 mL Mouse IgG1 Negative Control Reagent

Gewebekulturüberstand eines monoklonalen Maus-IgG1-Antikörpers in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und 0.015 mol/L Natriumazid.

1 x 8 mL Labelled Polymer, HRP

Mit Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierten Ziegen-Anti-Maus-Immunoglobulinen konjugiertes Dextranpolymer. Geliefert in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und einer antimikrobiellen Substanz.

1 x 10 mL DAB+ Substrate Buffer

Substratpufferlösung, pH 7.5, enthält <0.1% Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Beschleuniger und eine antimikrobielle Substanz.

1 x 1 mL Liquid DAB+ Chromogen

5% 3,3'-Diaminobenzidin in Chromogenlösung.

1 x 1 L Waschpuffer10x

Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20, pH 7.6.

5 Objektträger EGFR pharmDxTM Kontrollobjektträger

Jeder Objektträger enthält Schnitte von zwei pelletierten, formalinfixierten und paraffineingebetteten menschlichen Zelllinien, die eine mäßige Expression des EGFR-Proteins und keine Expression des EGFR aufweisen. Die IHC-Färbungsintensitätswerte der Zellpellets betragen 2+ und 0.

Zelllinie: CAMA-1 Expressionsgrad: 0

Zelllinie: HT-29 Expressionsgrad: 2+

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Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien Ammoniumhydroxid, 15 mol/L, verdünnt auf 0.037 mol/L Gegenfärbung: Hämatoxylin, auf Alkoholbasis oder wässriger Basis, z. B. Dako Hematoxylin (Code-Nr. S3302) oder Dako Automation

Hematoxylin (Code-Nr. S3301) Deckgläser Destilliertes oder entionisiertes Wasser (Reagenzqualität) Trockenofen, der imstande ist, eine Temperatur von 56-60 °C aufrechtzuerhalten. Ethanol, absolut und 95% Feuchtigkeitskammer Lichtmikroskop (4-fache bis 40-fache Vergrößerung) Eindeckmedium, z. B. Dako Faramount (Code-Nr. S3025)

oder Dako Glycergel (Code-Nr. C0563) bzw. Dako Ultramount (Code-Nr. S1964) Positive und negative Gewebe zur Verfahrenskontrolle (siehe Abschnitt „Qualitätskontrolle“) Objektträger, Fisher SuperFrost Plus, Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger, elektrostatisch geladene Objektträger oder Dako Silanized

Slides (Code-Nr. S3003) (siehe Abschnitt Vorbereitung der Probe) Färbeschalen oder -bäder Zeitmesser (muss Intervalle von 2-30 Minuten anzeigen können) Waschflasche Xylol, Toluol oder Xylolersatz Hinweis: Sowohl die mitgelieferten als auch die separat erhältlichen Reagenzien wie Dako Wash Buffer (Code-Nr. S3006) wurden speziell für diesen Test entwickelt. Soll der Test wie beschrieben durchführbar sein, dürfen keine Bestandteile ausgewechselt werden. Gewebevorbereitung Mit Biopsieproben muss so umgegangen werden, dass sich das Gewebe noch für die IHC-Färbung eignet. Bei allen Proben sollten Standardverfahren der Gewebeverarbeitung eingesetzt werden 13

Die in den nachstehenden Fixiermitteln konservierten Proben eignen sich für Tests mit dem EGFR pharmDx: 10 (Vol.%) neutrales gepuffertes Formalin, 10 (Vol.%) nicht gepuffertes Formalin, 25 (Vol.%) nicht gepuffertes Formalin, AFA (saurer Formalinalkohol), Richard-Allen Scientific Pen-fix und Bouin-Fixiermittel. In Anatech PreFer fixierte Gewebe eignen sich nicht für Tests mit dem EGFR pharmDx. Bei Verwendung von EGFR pharmDx auf mit PreFer fixierten Geweben bleibt die Morphologie nur unzureichend erhalten, was zu fehlerhaften Ergebnissen führen kann.14 Paraffineingebettete Schnitte Geeignet sind routinemäßig verarbeitete und paraffineingebettete Gewebe. Biopsieproben sollten auf eine Dicke von 3 oder 4 mm gebracht und in dem für das entsprechende Fixiermittel angegebenen Zeitraum fixiert werden. Die Gewebe werden dann in einer Reihe von Alkoholen und Xylol dehydriert und anschließend mit geschmolzenem Paraffin infiltriert. Die Temperatur des Paraffins darf 60 °C nicht überschreiten. Korrekt fixierte und eingebettete Gewebeblöcke, die das EGFR-Protein exprimieren, sind vor der Anfertigung der Schnitte und deren Eindecken auf Objektträger unbegrenzt haltbar, wenn sie an einem nicht zu warmen Ort (15-25 °C) aufbewahrt werden.13,15

Gewebeproben sollten in Schnitte von 3-5 µm Stärke geschnitten werden. Nach Anfertigung der Schnitte werden die Gewebe auf einem Objektträger fixiert und in Trockenständer gesetzt. Es werden folgende Objektträger empfohlen: Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (Code-Nr. S3003), elektrostatisch geladene oder mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger. Die Trockenständer werden auf einem saugfähigen Handtuch abgeklopft, um unter dem Paraffin eingeschlossenes oder am Glas haftendes Restwasser zu entfernen, und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Der Ständer mit den Objektträgern wird dann eine Stunde in einen 56-60 °C warmen Inkubator gesetzt. Überschüssiges Wasser, das sich nach der Entnahme aus dem Inkubator noch auf den Objektträgern befindet, muss durch Abklopfen der Objektträger auf Handtüchern und nochmalige einstündige Trocknung im Inkubator entfernt werden. Nach der Entnahme aus dem Inkubator müssen die Objektträger solange bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, bis sie vollständig abgekühlt sind und das Paraffin hart geworden ist. Um die Antigenität zu bewahren, sollten auf Objektträger (Fisher SuperFrost Plus, Poly-L-Lysin, elektrostatisch geladen oder Dako Silanized Slides (Code-Nr. S3003)) aufgebrachte Gewebeschnitte innerhalb von 2 Monaten nach Anfertigung der Schnitte gefärbt werden, wenn sie bei Raumtemperatur (20-25 °C) aufbewahrt werden.14 Weitere Hinweise zur Probenvorbereitung siehe Dako-Handbuch: „Immunochemical Staining Methods“ (Immunhistochemische Färbeverfahren)16 und Literaturnachweis 13 und 15. Auf entkalkten Geweben wurde dieser Test noch nicht validiert und wird deshalb nicht empfohlen. Die für die EGFR-Auswertung und die Verifizierung der Tumorpräsenz notwendigen Objektträger sollten zur gleichen Zeit vorbereitet werden. Es sollten mindestens 5 Objektträger vorbereitet werden: 1 Objektträger für die Tumorpräsenz, 2 Objektträger für die Auswertung des EGFR-Proteins (ein Objektträger für Primary Antibody und ein Objektträger für Negative Control Reagent) und 2 Objektträger als Reserve. Vorsichtsmaßnahmen 1. Für Fachpersonal. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN3 können auch in

Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.17

3. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese Proben und Reagenzien entsprechend gehandhabt werden. 4. Die mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss so gering wie möglich gehalten werden, um eine unspezifische Färbung zu

verhindern. 5. Inkubationszeiten, Temperaturen oder Methoden, die hier nicht ausdrücklich beschrieben sind, können zu fehlerhaften Ergebnissen

führen. 6. Die Reagenzien wurden zur Verwendung in diesem Test optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu einer geringeren

Antigenfärbung führen. 7. Primärantikörper oder Negativkontrollreagenz nicht durch Primärantikörper oder Negativkontrollreagenzien aus anderen Chargen

(Chargennummern befinden sich auf den Etiketten der Behälter) oder durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzen.

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8. Labeled Polymer, Liquid DAB+ Chromogen und die vorbereitete DAB+ Substrate-Chromogen-Lösung werden durch Einwirkung zu starker Lichtquellen nachteilig beeinflusst. Systemkomponenten nicht bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie z. B. direktem Sonnenlicht, vornehmen.

9. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hauptkontakt zu vermeiden.18 Nicht verwendete Lösung ist entsprechend den Bestimmungen auf Länder-, Bundes- und EU-Ebene zu entsorgen.

10. Peroxidase-Block, Labelled Polymer, HRP: Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich. 11. In der Regel ist es Personen unter 18 Jahren nicht gestattet, mit diesem Produkt zu arbeiten. Anwender müssen gründlich über die

richtigen Arbeitsverfahren, das Gefahrenpotenzial des Produkts und die nötigen Vorsichtsmaßnahmen unterrichtet werden. Zusätzliche Informationen entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt (SDS).

12. DAB+ Chromogen:

Gefahr Enthält 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid H350 Kann Krebs erzeugen. H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen. H319 Verursacht schwere Augenreizung. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P202 Vor Gebrauch alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P280 Schutzhandschuhe tragen. Augen- oder Gesichtsschutz tragen. Schutzkleidung tragen. P305 + P351 + P338

BEI AUGENKONTAKT: Vorsichtig mehrere Minuten lang mit Wasser spülen. Gegebenenfalls Kontaktlinsen herausnehmen. Spülung fortsetzen.

P308 + P313 BEI Exposition oder falls betroffen: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen. 13. DAB+ Buffered Substrate

Gefahr Enthält Imidazol H360 Kann das Kind im Mutterleib schädigen. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P202 Vor Gebrauch alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. P280 Schutzhandschuhe tragen. Augen- oder Gesichtsschutz tragen. Schutzkleidung tragen. P308 + P313 BEI Exposition oder falls betroffen: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen. 14. Wash Buffer (10x):

Warnung H319 Verursacht schwere Augenreizung. P280 Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P305 + P351 + P338

BEI AUGENKONTAKT: Vorsichtig mehrere Minuten lang mit Wasser spülen. Gegebenenfalls Kontaktlinsen herausnehmen. Spülung fortsetzen.

P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. Enthält: 5-Brom-5-Nitro-1,3-Dioxan. Kann allergische Reaktionen auslösen.

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15. Proteinase K:

Warnung H319 Verursacht schwere Augenreizung. P280 Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P305 + P351 + P338 BEI AUGENKONTAKT: Vorsichtig mehrere Minuten lang mit Wasser spülen. Gegebenenfalls Kontaktlinsen

herausnehmen. Spülung fortsetzen. P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen.

Lagerung Das EGFR-pharmDx-Kitsystem bei 2-8 °C aufbewahren. Kontrollobjektträger müssen ebenfalls bei 2-8 °C aufbewahrt werden. Das Kit nach Ablauf des auf der Verpackung aufgedruckten Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Es gibt keine sichtbaren Anzeichen für eine Instabilität dieses Produkts, deshalb sollten Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitlaufen. Werden die Reagenzien nicht entsprechend den in der Produktinformation angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen die Bedingungen vom Anwender validiert werden.12

Vorbereitung der Reagenzien Folgende Reagenzien müssen vor der Färbung vorbereitet werden: Waschpufferlösung Für die Waschschritte eine ausreichende Menge Waschpuffer durch 1:10-Verdünnung von Wash Buffer 10x mit destilliertem oder entionisiertem Wasser (Wasser von Reagenzqualität) herstellen. Getrübten Puffer entsorgen. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Diese Lösung muss vor der Verwendung gründlich gemischt werden. In der Lösung auftretendes Präzipitat beeinträchtigt die Qualität der Färbung nicht. Das folgende Verfahren liefert 1 mL DAB+ Substratchromogenlösung. SCHRITT 1. 1 mL DAB+ Substrate Buffer in ein Reagenzglas geben. SCHRITT 2. Einen Tropfen Liquid DAB+ Chromogen hinzufügen. Mischen und mit einer Pipette auf Gewebeschnitte aufbringen. Die zubereitete Substratchromogenlösung (DAB) ist etwa 5 Tage haltbar, wenn sie bei 2-8 °C aufbewahrt wird. Wichtiger Hinweis: Die Farbe von Liquid DAB+ Chromogen kann in der Flasche von klar bis leicht lavendel-braun variieren. Die Leistung dieses Produkts wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Entsprechend den obigen Richtlinien verdünnen. Zugabe von überschüssigem Liquid DAB+ Chromogen zu DAB+ Substrate Buffer führt zu einer Abschwächung des positiven Signals. Gegenfärbung Gegebenenfalls Ammoniakwasser für die Bläuung und Gegenfärbung vorbereiten. Ammoniakwasser (0.037 mol/L) wird durch Mischen von 2.5 (±0,5) mL (konzentriertem) 15 mol/L Ammoniakhydroxid mit 1 Liter Wasser von Reagenzqualität zubereitet. Nicht verwendetes 0.037 mol/L Ammoniakwasser kann bei Raumtemperatur (20-25 °C) in einer gut verschlossenen Flasche bis zu 12 Monate aufbewahrt werden. Eindeckmedium Zum wässrigen Eindecken wird Eindeckmedium wie Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code-Nr. S3025) oder Dako Glycergel Mounting Medium (Code-Nr. C0563) empfohlen. Glycergel vor Gebrauch durch Erwärmen auf ungefähr 40 (± 5) °C verflüssigen. Nicht-wässriges, permanentes Eindecken wie mit Dako Ultramount (Code-Nr. S1964) ist ebenso geeignet. Färbeverfahren Verfahrensanweisung Der Benutzer sollte diese Anweisungen aufmerksam durchlesen und sich vor Gebrauch mit allen Komponenten vertraut machen (siehe Abschnitt „Vorsichtsmaßnahmen“.) Vor dem immunhistochemischen Anfärben müssen alle Reagenzien Raumtemperatur (20-25 °C) abgeglichen werden. Auch alle Inkubationen sind bei Raumtemperatur durchzuführen. Während des Färbeverfahrens dürfen Gewebeschnitte nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer stellen, damit das Gewebe nicht austrocknet. Entparaffinierung und Rehydrierung Zur Entfernung des Einbettungsmediums müssen die Gewebeschnitte vor der Färbung entparaffiniert und anschließend rehydriert werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Einbettungsmediums können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. SCHRITT 1. Die Objektträger in ein Xylolbad stellen und 5 (±1) Minuten inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. SCHRITT 2. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und die Objektträger 3 (±1) Minuten in absolutes Ethanol eintauchen.

Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen.

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SCHRITT 3. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und die Objektträger 3 (±1) Minuten in 95%iges Ethanol eintauchen. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen.

SCHRITT 4. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und Objektträger 5 (±1) Minuten in Wasser von Reagenzqualität eintauchen. Das Färbeverfahren entsprechend Abschnitt C des Färbeprotokolls beginnen.

Xylol- und Alkohollösungen nach 40 Objektträgern auswechseln. Toluen oder Xylol-Ersatz wie beispielsweise „Histoclear“ können anstelle von Xylol verwendet werden. Färbeprotokoll SCHRITT 1. Proteolytische Andauung durch Proteinase K

Überschüssiges Wasser von Reagenzqualität durch Abklopfen entfernen. Mit einem flusenfreien Tuch (z. B. Kimwipe® oder Gaze) sorgfältig den Bereich um die Probe herum abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen und um das Reagenz an der vorgesehenen Stelle zu behalten.

Ausreichend Proteinase-K-Lösung zugeben, so dass die Proben bedeckt sind (mindestens 3 Tropfen (100 µL)). 5 (±0.5) Minuten inkubieren. Mit Wasser von Reagenzqualität aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) gründlich spülen. 5 (±1) Minuten in ein frisches Wasserbad von Reagenzqualität stellen. Zum EGFR pharmDx gehört eine Vorbehandlung durch Andauung mit einem proteolytischen Enzym. Gewebeschnitte können gelegentlich zu stark angedaut werden, was zu einer Zerstörung der Zellmembran und der allgemeinen Gewebearchitektur führt. Während des Assays stets auf die Dauer der proteolytischen Andauung achten. Hinweis: Tritt häufig eine zu starke Andauung auf, können Gewebe, die in 10% neutralem, gepuffertem Formalin fixiert wurden, in 10% neutralem, gepuffertem Formalin 10 Minuten nach der Entparaffinierung nachfixiert werden. Siehe nachstehendes Verfahren: Verfahren nach der Fixierung 1. Gewebeschnitte entparaffinieren und in Wasser von Reagenzqualität tauchen. 2. Objektträger 10 Minuten in neutrales, gepuffertes Formalin tauchen. 3. Objektträger zweimal in entionisiertem oder destilliertem Wasser spülen. 4. Mit dem Färbeverfahren des EGFR pharmDx fortfahren. SCHRITT 2. Peroxidase-Block

Überschüssiges Wasser abklopfen und Objektträger wie oben beschrieben abwischen. Ausreichend Peroxidase-Block zugeben, so dass die Proben bedeckt sind (mindestens 3 Tropfen (100 µL)). 5 (±1) Minuten inkubieren. Mit Waschpuffer aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) vorsichtig spülen. 5 (±1) Minuten in ein frisches Waschpufferbad stellen. SCHRITT 3. Primary Antibody oder Negative Control Reagent

Die Objektträger während der Inkubation mit Primary Antibody/Negative Control Reagent und mit markiertem Polymer in eine Feuchtigkeitskammer stellen, um ein Austrocknen der Gewebe zu vermeiden.

Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger wie oben beschrieben abwischen. Ausreichend Primary Antibody oder Negative Control Reagent zugeben, so dass die Proben bedeckt sind (mindestens

3 Tropfen (100 µL)). 30 (±1) Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Objektträger wie in Schritt 2 spülen. SCHRITT 4. Labelled Polymer, HRP

Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger wie oben beschrieben abwischen. Ausreichend markiertes Polymer zugeben, so dass die Proben bedeckt sind (mindestens 3 Tropfen (100 µL)). 30 (±1) Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Objektträger wie in Schritt 2 spülen. SCHRITT 5. DAB+ Substrate-Chromogen Solution

Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger wie oben beschrieben abwischen. Ausreichend DAB+ Substratchromogenlösung zugeben, so dass die Proben bedeckt sind (mindestens 3 Tropfen (100 µL)). 10 (±1) Minuten lang inkubieren. Mit Wasser von Reagenzqualität aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) vorsichtig spülen.

Abfallprodukte der DAB+ Substratchromogenlösung in einem Sondermüllbehälter auffangen und entsprechend entsorgen. 2-5 Minuten in ein frisches Wasserbad von Reagenzqualität stellen. Gegenfärbung (Anweisungen für Hämatoxylin) Das gefärbte Endprodukt der Färbungsreaktion ist sowohl in Wasser als auch in Alkohol unlöslich. Es kann entweder Hämatoxylin auf Alkoholbasis oder auf wässriger Basis wie Dako Hematoxylin (Code-Nr. S3302) oder Dako Automation Hematoxylin (Code-Nr. S3301) verwendet werden. Keine regressive Gegenfärbung verwenden. SCHRITT 1. Objektträger in ein Hämatoxylin-Bad eintauchen. Je nach Stärke des benutzten Hämatoxylins 2-5 Minuten inkubieren. SCHRITT 2. Vorsichtig in einem Bad mit Wasser von Reagenzqualität spülen. Dabei müssen alle Hämatoxylinreste vollständig entfernt werden. Optional: Objektträger zehnmal in ein Bad mit 0.037 mol/L Ammoniakwasser tauchen (siehe Abschnitt Reagenzvorbereitung). Bei Verwendung von Dako Hematoxylin (Code-Nr. S3302) oder Dako Automation Hematoxylin (Code-Nr. S3301) ist der Ammoniakwasser-Schritt nicht erforderlich. Hinweis: Die Verwendung von Dako Hematoxylin (Code-Nr. S3302) oder Dako Automation Hematoxylin (Code-Nr. S3301) wird dringend empfohlen. Diese Gegenfärbung führt bei 5-minütiger Inkubation zu einem schwach violett-blauen Endprodukt, das keine spezifische Immunfärbung verdeckt. Eine starke Gegenfärbung kann eine schwache EGFR-Expression verdecken.

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SCHRITT 3. Vorsichtig in einem Bad mit Wasser von Reagenzqualität 2-5 Minuten spülen. Eindeckung Zum wässrigen Eindecken wird Eindeckmedium wie Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code-Nr. S3025) oder Dako Glycergel Mounting Medium (Code-Nr. C0563) empfohlen. Glycergel vor Gebrauch durch Erwärmen auf ungefähr 40 (± 5) °C verflüssigen. Nicht-wässriges, permanentes Eindecken wie mit Dako Ultramount (Code-Nr. S1964) ist ebenso geeignet. Hinweis: Objektträger können zu einem beliebigen Zeitpunkt abgelesen werden. Wenn die Objektträger jedoch mit einem wässrigen Eindeckmedium mit Deckglas versehen und hellem Licht ausgesetzt werden, kann die Farbe leicht verblassen. Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur (20-25 °C) aufbewahren, um Verblassen zu vermeiden. Qualitätskontrolle Abweichungen von den empfohlenen Verfahren zur Fixierung, Verarbeitung und Einbettung der Gewebeschnitte im Labor des Benutzers können erhebliche Unterschiede bei den Ergebnissen zur Folge haben. Aus diesem Grund müssen zusätzlich zu den von Dako gelieferten Kontrollobjektträgern regelmäßig auch Kontrollen vor Ort durchgeführt werden. Anwender in den USA müssen die Richtlinien zur Qualitätskontrolle des College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry beachten. Weitere Informationen siehe auch CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline19 sowie Literaturnachweis 20-23. EGFR pharmDx™ Kontrollobjektträger (mitgeliefert) Jeder der mitgelieferten Kontrollobjektträger enthält zwei pelletierte, formalinfixierte, paraffineingebettete Human-Zelllinien mit Färbungsintensitätswerten von 2+ und 0. Bei jedem Färbeverfahren sollte ein Objektträger gefärbt werden. Durch Auswertung der Zelllinien auf dem von Dako mitgelieferten Kontrollobjektträger wird der Färbedurchlauf validiert. Diese Zelllinien sollten nicht zur Auswertung der Patientenergebnisse verwendet werden. Positivkontrollgewebe Als Kontrollen dienen frische, durch Autopsie, Biopsie oder einen operativen Eingriff gewonnene Proben, die so schnell wie möglich und auf die gleiche Weise fixiert, verarbeitet und eingebettet werden wie die Patientenprobe(n). Positivkontrollgewebe deuten auf sachgemäß vorbereitete Gewebe und geeignete Färbetechniken hin. In jedem Färbedurchlauf sollte für jede Gruppe von Testbedingungen ein Positivkontrollgewebe mitgeführt werden.

Die für die positiven Gewebekontrollen verwendeten Gewebe sollten eine schwache, positive Färbung aufweisen, so dass feine Veränderungen der Primärantikörpersensitivität nachweisbar sind. Die in diesem Kit mitgelieferten Kontrollobjektträger und Proben, die abweichend von der(n) Patientenprobe(n) verarbeitet werden, validieren nur die Leistung der Reagenzien, bestätigen jedoch nicht die Gewebevorbereitung. Bekannt positive Gewebe sollten nur zur Überprüfung der korrekten Funktionsweise von verarbeiteten Geweben und Testreagenzien verwendet werden, NICHT aber als Hilfsmittel bei der spezifischen Diagnose anhand von Patientenproben. Wenn die positiven Kontrollgewebe keine Färbung aufweisen, müssen die Ergebnisse der Testproben für ungültig erklärt werden. Als schwach EGFR-Positivkontrollen geeignete normale Zelltypen sind beispielsweise Drüsenepithelzellen der Prostata und normales Bronchialepithel der Lunge. Da das EGFR-Färbemuster heterogen ist, können die Resultate bei schwach färbenden normalen Gewebeelementen auch negativ sein. Das Perineurium ist eine stark positive interne Gewebekontrolle. Zu den normalen Zellen, die eine mäßige positive EGFR-Färbung aufweisen, gehören Epithelzellen der Zervix und der Haut. Negativkontrollgewebe Bei jedem Färbedurchlauf eine Negativkontrollgewebeprobe (als EGFR-Protein-negativ bekannt) einsetzen, die in der gleichen Weise wie die Patientenprobe fixiert, verarbeitet und eingebettet wurde, um die Spezifität des Primärantikörpers zu verifizieren und Hinweise auf eine spezifische Hintergrundfärbung zu erhalten. Die in den meisten Gewebeschnitten anzutreffende Vielzahl verschiedener Zelltypen ermöglicht interne Negativkontrollstellen (vom Benutzer zu verifizieren). Falls das Negativkontrollgewebe Färbungen aufweist, sollten die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. Als Negativkontrolle geeignete Gewebeelemente sind beispielsweise Myozyten des Herzens. Azinuszellen des Pankreas sind ebenfalls negativ, während pankreatisches Gallengangepithel eine positive Färbung aufweist. Lymphozyten weisen mit dem EGFR pharmDx keine Färbung auf und können als negative interne Kontrollen verwendet werden. Unspezifisches Negative Control Reagent Zur Beurteilung unspezifischer Färbung und im Hinblick auf eine bessere Interpretation der spezifischen Färbung an der Antigenstelle sollte bei einem Teil jeder Patientenprobe das mitgelieferte Negative Control Reagent anstelle des Primary Antibody benutzt werden. Die Inkubationszeit für das Negative Control Reagent sollte mit der für den Primary Antibody übereinstimmen. Testbestätigung Vor dem erstmaligen Gebrauch eines Färbesystems in einem diagnostischen Verfahren sollte der Benutzer die Leistung des Assays durch Testen an einer Reihe eigener Gewebe mit bekannten IHC-Leistungseigenschaftenn verifizieren, unter denen sich bekannt positive und negative Gewebe befinden. Diese Maßnahmen müssen für jede neue Antikörpercharge wiederholt werden. Siehe die zuvor in diesem Abschnitt der Produktinformation dargestellten Qualitätskontrollmaßnahmen und die Qualitätskontrollanforderungen des CAP Certification Program for Immunohistochemistry und/oder CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline.19 Zur Testbestätigung eignen sich Karzinome mit EGFR-Protein bekannter Färbungsintensität und negative Gewebe.

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Tabelle 1: Zweck der täglichen Qualitätskontrolle

Gewebe: Fixiert und verarbeitet wie die Patientenprobe

Spezifischer Antikörper & Detektionssystem Hintergrund: Unspezifischer Antikörper (Maus-IgG1 Negative Control Reagent), mitgeliefert

Kontrollobjektträger, von Dako mitgeliefert. Kontrolliert nur das Färbeverfahren. Durch Auswertung der Zelllinien auf dem von Dako mitgelieferten Kontrollobjektträger wird der Färbedurchlauf validiert.

Positivkontrolle: Gewebe oder Zellen mit nachzuweisendem Zielantigen (kann sich im Patientengewebe befinden). Als ideal gilt eine Kontrolle aus schwach positiv färbendem Gewebe, das gegenüber einem Antikörper- oder Antigenabbau sehr empfindlich ist.

Kontrolliert alle Analyseschritte. Validiert Reagenz und Verfahrensweisen für die EGFR-Färbung.

Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung.

Negativkontrolle: Vermutlich negative Gewebe oder Zellen (können sich im Patientengewebe oder im positiven Kontrollgewebe befinden).

Nachweis unbeabsichtigter Antikörper-Kreuzreaktivität mit Zellen und Zellbestandteilen.

Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung.

Patientengewebe. Nachweis spezifischer Färbung. Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung.

Auswertung des Färbeverfahrens Die Auswertung von Objektträgern muss von einem Pathologen mithilfe eines Lichtmikroskops vorgenommen werden. Alle Untersuchungen müssen innerhalb der Tumorregion der Probe durchgeführt werden. Zur Auswertung der immunzytochemischen Färbung und Bestimmung der Färbungsintensität ist ein Objektiv mit 10facher oder 20facher Vergrößerung ausreichend. Zur Auswertung der Ergebnisse müssen intakte Zellen verwendet werden, da nekrotische oder degenerierte Zellen oft eine unspezifische Färbung aufweisen.19

Jedes EGFR pharmDx-Kit enthält positive und negative Zelllinien zur Validierung der Färbedurchgänge eines jeden Testdurchlaufs. Die entsprechenden Färbungen der Kontrollzelllinien zeigen an, dass der EGFR pharmDx-Assay korrekt funktioniert. Ausbleibende Färbung der Membran der CAMA-1 Kontrollzelllinie (0) und die mäßige braune komplette oder inkomplette Färbung der Membran der HT-29 Kontrolllinie (2+) weisen auf einen gültigen Testdurchlauf hin. Falls die Intensität der Färbung der positiven Kontrollzelllinien zu schwach oder zu stark ist, können falsch-negative oder falsch-positive Ergebnisse erhalten werden und der Test muss wiederholt werden. Abbildungen zum Vergleich sind im EGFR pharmDx Auswertungshandbuch zu finden. EGFR pharmDx färbt hauptsächlich Zellmembranen, wobei sowohl eine vollständige wie auch eine unvollständige periphere Färbung auftreten kann. Das Immunfärbungsmuster ist häufig heterogen und zeigt innerhalb eines einzigen Neoplasmas verschiedene Färbungsintensitäten. Im Zytoplasma und in extrazellulären Räumen trat ebenfalls eine Färbung auf. Die zytoplasmatische Färbung ist gut wahrnehmbar. Der Test sollte jedoch wiederholt werden, wenn eine übermäßige zytoplasmatische Färbung die Abgrenzung der diagnostischen Membranfärbung und somit die Auswertung der Ergebnisse erschwert. Testergebnisse von Tumoren sollten als EGFR-positiv oder -negativ angegeben werden, wobei die Membranfärbung als der Auswertung zugrunde liegende Struktur dient. Als positiv auf EGFR-Expression wird jede vollständige oder unvollständige periphere Membranfärbung einer Tumorzelle definiert, die stärker als die Hintergrundfärbung ist. Ein Tumor, der in keiner Tumorzelle eine Membranfärbung aufweist, die stärker als die Hintergrundfärbung ist, wird als EGFR-negativ bewertet. In Abhängigkeit von der Länge der Inkubationszeit und der Wirkungsintensität des genutzten Hämatoxylins resultiert die Gegenfärbung in einer blass- bis dunkelblauen Anfärbung der Zellkerne. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbungen können die Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. Tabelle 2: EGFR pharmDx Färbungsergebnisse

Mitteilung an den behandelnden Arzt

Definition

EGFR-negativer Tumor Fehlen einer Membranfärbung, die stärker als die Hintergrundfärbung ist, in allen Tumorzellen

EGFR-positiver Tumor

Als EGFR-positive Färbung werden alle IHC-Färbungen der Zellmembran des Tumors bezeichnet, die stärker sind als die Hintergrundfärbung, egal ob es sich um eine vollständige, unvollständige oder periphere Färbung handelt.

Färbungsintensität Prozentsatz der gefärbten Tumorzellen 1+, 2+ oder 3+ > 0%

Diese Definitionen positiver und negativer Ergebnisse stimmen mit der vorhandenen Literatur24 überein, müssen im speziellen Kontext allerdings eventuell modifiziert werden (siehe Abschnitt Produktspezifische Beschränkungen). Einschränkungen Allgemeine Beschränkungen IHC ist ein diagnostisches Mehrfachschritt-Verfahren, das hinsichtlich der Auswahl der geeigneten Reagenzien, der Auswahl, Fixierung und Verarbeitung von Geweben sowie der Vorbereitung des IHC-Objektträgers und der Auswertung der Färbungsergebnisse ein Spezialtraining erfordert.

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Gewebefärbungen hängen von der sachgemäßen Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor der Färbung ab. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen, Schneiden oder Verunreinigung durch andere Gewebe oder Flüssigkeiten kann zu Artefakten, Antikörper-Trapping oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Widersprüchliche Ergebnisse können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die sachgemäße Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. Die klinische Auswertung jeder positiven Färbung oder deren Ausbleiben muss im Rahmen des klinischen Bildes, der Morphologie und anderer histopathologischer Kriterien erfolgen. Die klinische Auswertung einer Färbung oder deren Ausbleiben muss durch morphologische Studien und geeignete Kontrollen sowie durch andere diagnostische Tests ergänzt werden. Für die Auswertung der gefärbten Präparate ist ein qualifizierter Pathologe zuständig, der mit den Antikörpern, Reagenzien und den zur Auswertung der gefärbten Präparate angewandten Methoden vertraut ist. Die Färbung muss in einem offiziell zugelassenen, lizenzierten Labor unter Aufsicht eines Pathologen erfolgen, dessen Aufgabe es ist, die gefärbten Objektträger zu überprüfen und die Eignung der Positiv- und Negativkontrollen zu gewährleisten. Gewebeproben von Personen mit Hepatitis-B-Infektion und mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase zu unspezifischer Färbung führen.25

Reagenzien können bei zuvor nicht getesteten Geweben unerwartete Reaktionen zeigen. Selbst in getesteten Gewebegruppen kann aufgrund von biologischen Unterschieden bei der Antigen-Expression in Neoplasmen oder anderen pathologischen Geweben die Möglichkeit unerwarteter Reaktionen nicht völlig ausgeschlossen werden.22 Bitte dokumentierte unerwartete Reaktionen dem technischen Kundendienst von Dako mitteilen. Aufgrund der nicht-immunologischen Bindung von Proteinen oder Substrat-Reaktionsprodukten können falsch-positive Ergebnisse auftreten. Sie können ebenfalls durch Pseudoperoxidaseaktivität (Erythrozyten) und endogene Peroxidaseaktivität (Zytochrom C) hervorgerufen werden.21

Hinweis: Die in diesem System enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnung der Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationszeiten oder -temperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen. Produktspezifische Beschränkungen Die Ansprechrate auf Cetuximab bei EGFR-negativen Patienten sowie bei Patienten, bei denen weniger als ein Prozent der Tumorzellen eine EGFR-positive Färbung zeigte, ist nicht bekannt, da keine derartigen Patienten an den klinischen Studien teilnahmen. Tumore mit einer EGFR-positiven Färbung bei > 1% der Zellen gelten hinsichtlich der geltenden Indikationen für Cetuximab als EGFR-exprimierend. Patienten, bei denen weniger als ein Prozent der Tumorzellen eine EGFR-positive Färbung zeigte, wurden nicht in die randomisierte, kontrollierte klinische Studie zu Panitumumab aufgenommen, weshalb die Panitumumab-Aktivität in dieser Patientenpopulation nicht bekannt ist. Tumore mit einer EGFR-positiven Färbung bei > 1% der Zellen gelten hinsichtlich der geltenden Indikationen für Panitumumab als EGFR-exprimierend. Falsch-negative Ergebnisse können die Folge eines mit der Zeit stattfindenden Antigenabbaus in den Geweben sein. Werden Proben bei Raumtemperatur (20-25 °C) aufbewahrt, so sollten diese innerhalb von 2 Monaten nach dem Eindecken der Schnitte auf Objektträger gefärbt werden.14,26 Zum Erzielen optimaler und reproduzierbarer Ergebnisse für das EGFR-Protein ist dieses einer proteolytischen Andauung zu unterziehen, wenn die Gewebe routinemäßig fixiert und paraffineingebettet werden. Leistungseigenschaften Spezifität Der EGFR-Antikörper, Klon 2-18C9 (2-18C9) wurde auf Reaktivität gegenüber Zelllinien getestet, die EGFR, HER2, HER3 und HER4 exprimieren. Beim Western-Blotting von SKBR3- und A431-Zelllysaten erkannte 2-18C9 eine 170 kD-Bande, die mit dem für EGFR bekannten Molekulargewicht übereinstimmt. Bei der Untersuchung von EGFRvIII transfizierten Zelllinien mittels Immunhistochemie, Durchflusszytometrie und Western-Blotting erkennt Klon 2-18C9 ebenfalls die EGFRvIII (145 kD)-Form des Rezeptors. Im Western Blotting blieb 2-18C9 gegenüber HER2-positiven CAMA-1-Zelllysaten, HER3-transformierten E. coli BL-21-Proteinextrakten und mit CHO-HER4 transfizierten Zelllysaten unreaktiv. Zusätzlich wurden Transfektanten von Eierstöcken chinesischer Hamster (Chinese Hamster Ovary/ CHO), die myc (Vektor-Tag) allein oder mit einem Mitglied der HER-Familie ko-exprimierten, in formalinfixierten, paraffineingebetteten Objektträgerkammern kultiviert und mit Anti-myc und 2-18C9 gefärbt. Der myc-Antikörper färbte alle fünf CHO-Transfektanten, wohingegen 2-18C9 nur die mit HER1 transfizierten CHO-Zellen färbte. Klinische Studien Klinische Studien zu Cetuximab Es wurden drei Cetuximab-Studien an kolorektalen Karzinomen (CRC) durchgeführt (EMD 62202-007, IMCL CP02-9923 und IMCL CP02-0141), bei denen die EGFR-positiven Testergebnisse der IHC-Färbung als eines der Kriterien für die Aufnahme in die Studie dienten. In 2 von 3 Studien, darunter der pivotalen Studie EMD 62202-007, wurde auf einer Skala von 0 bis 3+ der Positivitätsschwellenwert für die Färbungsintensität EGFR-exprimierender Tumore mit 1+ in > 1% der Gesamtzahl der Tumorzellen festgelegt. Dieser Schwellenwert wurde gewählt, da die Analyse einer Untergruppe verschiedener Schwellenwerte für Kriterien wie die Membranfärbung und andere Unterscheidungsmerkmale keine wesentlichen Unterschiede bei den klinischen Ergebnissen ergab.

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Pivotale Studie zu Cetuximab An der pivotalen Studie (EMD 62202-007) konnten Patienten teilnehmen, für deren Tumore mit dem Dako EGFR pharmDx Test EGFR-positive Zellen nachgewiesen wurden. Alle in der Studie untersuchten Tumore hatten mindestens 1% EGFR-positive Zellen; diese Tumore wurden als EGFR-exprimierend bewertet. Die Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren wurden mit Irinotecan und Cetuximab oder nur mit Cetuximab behandelt. Es wurden 577 Tumorproben getestet. 474/577 (82%, 95% CI = 78.1%, 86.1%) der getesteten CRC-Proben exprimierten EGFR. 329 EGFR pharmDx-Patienten standen für die 2:1 Randomisierung auf die zwei Arme der pivotalen Medikamentenstudie zur Verfügung. In dieser Studie wurde bei Patienten, die Irinotecan und Cetuximab erhielten, eine Reaktionsrate von 50/218 (22.9%, 95% CI = 17.5%, 29.1%) erzielt. Bei Patienten, die nur Cetuximab erhielten, betrug die Reaktionsrate 12/111 (10.8%, 95% KI = 5.7%, 18.1%). Mit Cetuximab wurden nur Patienten mit Dako EGFR-exprimierenden Tumoren, wie oben erläutert, therapiert. Die Reaktionsrate für nicht EGFR-exprimierende Tumore ist unbekannt und kann daher nicht verglichen werden. Es gab keine Korrelation zwischen der Tumorreaktion und dem Prozentsatz der EGFR-positiven Zellen oder der EGFR-Färbungsintensität. (Siehe Tabelle 3) Tabelle 3: Reaktionsraten der pivotalen Cetuximab-Studie (EMD 62202-007)

Gesamtzahl getesteter Patienten

Reaktionsrate# der mit Cetuximab und Irinotecan behandelten Fälle

Reaktionsrate# der mit nur Cetuximab behandelten Fälle

EGFR pharmDx + (> 1%) 474* 50/218 (22.9%, 95-%-KI = 17.5%, 29.1%)

12/111 (10.8%, 95-%-KI = 5.7%, 18.1%)

EGFR pharmDx – 103 Keine Behandlung Keine Behandlung *Für die 2:1 Randomisierung auf die zwei Arme der Medikamentenstudie standen 329 Patienten zur Verfügung # Die Reaktionsrate entsprach dem Anteil der Patienten der gesamten Studie, bei denen es zu einer mindestens 28 Tage andauernden Abnahme von ≥50% der Summe der diagonalen Durchmesser aller messbaren Tumore (entsprechend einer Verkleinerung der Tumoroberfläche um mindestens 50%) kam. Ergänzungsstudien zu Cetuximab Während der Entwicklung von Cetuximab wurde der EGFR pharmDx-Assay für die Aufnahme von Patienten in die pivotale Studie (EMD 62202-007) und eine Ergänzungsstudie (IMCL CP02-0141) verwendet. In der Studie IMCL CP02-0141 wurden 140 Proben getestet. Bei 105/140 (75%, 95-%-KI = 66.9%, 83.1%) dieser Proben wurden EGFR pharmDx-positive Tumore nachgewiesen. An dieser Studie nahmen 61 Patienten teil, von denen 57 mit Cetuximab behandelt wurden. In einer zusätzlichen unterstützenden (IMCL CP02-9923) Studie wurde ein Prototyp von einem EGFR pharmDx-Kit (enthält denselben Primärantikörper und dasselbe Detektionssystem wie oben) verwendet, um die Patienten einzutragen. Insgesamt wurden 412 Proben von 401 Patienten getestet. Bei 292/401 (72,8%, 95% KI = 68,0%, 77,6%) Patienten war das Testergebnis positiv. 139 Patienten wurden aufgenommen, von diesen erhielten 138 Cetuximab und Irinotecan. Tabelle 4: Zusammenfassung des Prozentsatzes der EGFR-Positivität bei Dickdarmkrebspatienten

Studien-ID Anteil EGFR-Expression (Anz. expr./Anz. getestet) % EGFR-Positivität 95% Konfidenzintervalle

Pivotale Studie EMD 62202-007 474/577 82.1% 78.1-86.1%

Ergänzungsstudie IMCL CP02-0141 105/140 75.0% 66.9-83.1%

Studie mit EGFR-Prototyp IMCL CP02-9923 292/401 72.8% 68.0-77.6%

Klinische Studien zu Panitumumab Die Wirksamkeitsdaten, die die Anwendung von Panitumumab zur Behandlung von Patienten mit refraktärem, metastasiertem, kolorektalem Karzinom (mCRC) unterstützen, stammen aus Studien an Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren laut dem Dako EGFR pharmDx™-Assay. Randomisierte, kontrollierte Studie zu Panitumumab An dieser multizentrischen, randomisierten Open-Label-Vergleichsstudie zu Panitumumab (20020408, Begleit-Erweiterungsstudie 20030194) plus Best Supportive Care (BSC) im Vergleich zu BSC allein nahmen mCRC-Patienten teil, bei denen ein Chemotherapieschema mit Oxaliplatin und Irinotecan fehlschlug und deren Tumore eine EGFR-Membranfärbung in ≥ 1% der ausgewerteten Tumorzellen exprimierten. In beiden Behandlungsgruppen lag der mediane Prozentsatz der Tumorzellen mit positiver EGFR-Membranfärbung bei 20% (Bereich: 1% bis 100%). In der Studie 20020408 wurde eine statistisch signifikante Verbesserung in Bezug auf den primären Endpunkt des progressionsfreien Überlebens (PFS) für die Gruppe mit Panitumumab plus BSC im Vergleich zur Gruppe mit BSC allein beobachtet (p < 0.0001, stratifizierter Log-Rank-Test). Die Ansprechrate in dieser randomisierten kontrollierten Studie lag bei 8.3% (19/229, 95-%-KI: 5.1%, 12.6%) und war definiert als entweder vollständiges oder partielles Ansprechen (modifizierte RECIST) mit einer bestätigten Dauer von mindestens 4 Wochen. Die entsprechende Ansprechrate der 174 Patienten, die in der Begleit-Erweiterungsstudie von BSC auf Panitumumab umgestellt wurden, lag bei 9.8% (17/174, 95-%-KI: 5.8%,15.2%). Es gab keine Korrelation zwischen dem Behandlungseffekt auf das PFS und dem Prozentsatz der EGFR-Tumormembranfärbung oder der EGFR-Färbungsintensität. (Siehe Tabelle 5)

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Tabelle 5: Behandlungseffekt auf das progressionsfreie Überleben nach EGFR-Färbung

Studie 20020408 Anz. Patienten/

Ereignisse Hazard-Ratioa 95-%-Konfidenzintervall für

Hazard-Ratio p-Wert Vollständig randomisiert 463/401 0.54 (0.44, 0.66) < 0.0001 EGFR-Membranfärbung (%)b

1- <10% 114/91 0.46 (0.30, 0.71) 0.0004 10-35% 182/157 0.55 (0.40, 0.76) 0.0004 > 35% 164/150 0.56 (0.40, 0.78) 0.0007

Max. Intensität der EGFR-Membranfärbungc 1+ 138/113 0.61 (0.41, 0.90) 0.0140 2+ 235/206 0.49 (0.37, 0.65) < 0.0001 3+ 88/80 0.61 (0.39, 0.97) 0.0379

a Das Hazard-Ratio für Panitumumab plus BSC relativ zu BSC allein wird anhand eines Cox Proportional Hazards-Modell geschätzt, bereinigt nach ECOG-Leistungs-Score und geografischer Region. Ein Wert < 1.0 weist auf eine niedrigere durchschnittliche Ereignisrate und einen längere Zeit bis zum Ereignis für Panitumumab plus BSC relativ zu BSC allein hin.

b Ausschluss von 3 Patienten, deren Tumore eine EGFR-Membranfärbung von < 1% exprimierten (Verstoß gegen das Protokoll) c Ausschluss von 2 Patienten, deren Tumore eine EGFR-Membranfärbung < 1% exprimierten und eine maximale Intensität der EGFR-Membranfärbung < 1+ aufwiesen (Verstoß gegen das Protokoll)

Tabelle 6: Zusammenfassung des Prozentsatzes der EGFR-Positivität bei Dickdarmkrebspatienten

Studien-ID Anteil EGFR-Expression (Anz. expr./Anz. getestet) % EGFR-Positivität 95% Konfidenzintervalle

Pivotale Studie 20020408 735/1004 73.2% 70.4-75.9%

Reproduzierbarkeit Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Durchläufen Die Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Durchläufen wurde mit manuellen Verfahren an 5 verschiedenen, randomisierten und maskierten Proben (4 positive, 1 negative pro Labor) mit unterschiedlichen Färbungsintensitäten in zwei Labors über drei Tage von zwei Mitarbeitern pro Labor ermittelt. Die Reproduzierbarkeit der EGFR-positiven und negativen Ergebnisse (0 und 1+, 2+ und 3+) war hervorragend (100%). Bei zwei positiven Proben variierte die Färbungsintensität um 1+ und bei einer Probe um 2+ (bei einem der Tests war das positive Gewebeelement größtenteils vom Objektträger abgewaschen). Die beiden negativen Proben blieben negativ. Reproduzierbarkeit der Färbung bei verschiedenen Labors Die Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Labors wurde in drei geographisch getrennten Labors mit 30 randomisierten und maskierten Proben mit unterschiedlichen IHC-Färbungsintensitätswerten getestet. Objektträger mit frischen Gewebeschnitten wurden an jedes Testlabor für das manuelle und automatisierte Anfärben und für die Evaluation durch einen Pathologen weitergeleitet. Sowohl bei manuellen als auch automatisierten Testverfahren lag die prozentuale Übereinstimmung für eine dichotome Positiv-/Negativ-Bestimmung zwischen den Labors bei 100%. Eine Expression des EGFR-Proteins von 0 wurde als negativ, Scores von 1+, 2+ und 3+ dagegen wurden als positiv bewertet. Immunreaktivität Eine Zusammenfassung der EGFR pharmDx-Immunreaktivität in dem empfohlenen Panel mit Normalgeweben ist in Tabelle 7 dargestellt. Alle Gewebe waren formalinfixiert und paraffineingebettet.

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Tabelle 7: Auswertung der Färbung von Normalgeweben durch EGFR pharmDx* Gewebetyp (Anz. getestet) EGFR-positive Gewebeelementfärbung und Färbungsmuster

Brust (2) Lobuläre Epithelzellen (2+): Membranös und zytoplasmatisch

Dickdarm (3) Keine Färbung** Dünndarm (3) Keine

Gehirn/Großhirn (3) Keine

Gehirn/Kleinhirn (3) Molekulare Schicht (1+): Extrazellulär Haut (3) Plattenepithelzellen, Adnexstrukturen (2+): Membranös und zytoplasmatisch

Herz (3) Keine

Hypophyse (3) Keine Knochenmark (3) Keine

Leber (3) Hepatozyten (Sinusoide) (3+); Gallengänge (3+): Membranös und zytoplasmatisch

Lunge (3) Alveolen auskleidende Zellen/basale Bronchialzellen (Myoepithelzellen) (2+): Membranös und zytoplasmatisch

Magen (3) Keine

Mandeln (3) Plattenepithelzellen (3+): Membranös und zytoplasmatisch Mesothelzellen (3) Mesothelzellen (2+): Membranös und zytoplasmatisch

Milz (3) Keine

Nebenniere (2) Kortikale Zellen (2+): Zytoplasmatisch Nebenschilddrüse (1) Keine

Niere (3) Tubuli (1+): Zytoplasmatische Färbung (granulär) Ovar (3) Keine

Pankreas (3) Gänge (2+): Membranös

Peripherer Nerv (3) Nervenzellfortsätze (1+): Fibrös Prostata (3) Drüsenepithelzellen (2+): Membranös

Schilddrüse (3) Keine

Skelettmuskulatur (3) Keine Speicheldrüsen (3) Gangelemente (1+): Zytoplasmatisch

Speiseröhre (2) Basale Plattenepithelzellen (2+): Membranös

Testis (3) Keine Thymus (3) Keine

Uterus (3) Endometranes Drüsenepithel (2+): Membranös und zytoplasmatisch Endometrane Stromazellen (2+): Membranös und zytoplasmatisch Myometrium: Keine

Zervix (3) Basale Plattenepithelzellen (2+): Membranös * Die Mehrzahl der getesteten Gewebe wies eine Färbung der Fibroblasten in Stromagewebe (1+, fibrös) sowie des Perineuriums und Myoepithelzellen auf. Gelegentlich wurde eine endogene peroxidaseinduzierte Färbung von Eosinophilen beobachtet. **Bei normalem Dickdarmepithel wird eine variable Immunfärbung beschrieben.

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Fehlerbehandlung Tabelle 8: Fehlerbehebung

Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der

Objektträger. 1a. Reagenzien in falscher

Reihenfolge verwendet. 1b. Natriumazid im

Waschpufferbad.

1a. Reagenzienverwendung überprüfen. 1b. Den im Kit enthaltenen frischen,

azidfreien Waschpuffer benutzen. 2. Schwache Färbung der

Objektträger. 2a. Unzureichende proteolytische

Andauung durch Proteinase K.

2b. Schnitte enthalten nach dem Waschbad zu viel Lösung.

2c. Objektträger nicht lange

genug mit Antikörpern oder DAB+ Substratchromogenlösung inkubiert.

2d. Ungeeignete Fixiermethode angewendet.

2a. Proteinase K Lösung muss volle 5 Minuten inkubiert werden.

2b. Überschüssige Lösung sorgfältig

abschütteln, bevor um den Schnitt herum abgewischt wird.

2c. Empfohlene Inkubationszeiten überprüfen.

2d. Patientengewebe darf nicht zu stark

fixiert sein, korrektes Fixiermittel benutzen (siehe Abschnitt Vorbereitung der Probe).

3. Zu starke Hintergrundfärbung der Objektträger.

3a. Paraffin nicht vollständig entfernt.

3b. Beim Eindecken der Schnitte

auf die Objektträger wurden Stärkezusätze verwendet.

3c. Objektträger nicht gründlich

gespült. 3d. Schnitte sind während des

Färbeverfahrens ausgetrocknet.

3e. Unspezifische Bindung der

Reagenzien an Gewebeschnitte.

3a. Frische Reinigungslösungen verwenden und die im Abschnitt Entparaffinierung and Rehydrierung beschriebenen Verfahren befolgen.

3b. Keinerlei Zusätze zur Haftung der Schnitte an der Glasoberfläche verwenden. Viele dieser Zusätze sind immunreaktiv.

3c. In Puffer-Bädern und Waschflaschen frische Lösungen verwenden.

3d. Feuchtigkeitskammer verwenden. Überprüfen, ob den Schnitten das korrekte Reagenzvolumen zugegeben wurde. Vor Reagenzzugabe jeweils nur drei bis vier Objektträger zugleich abwischen.

3e. Die Proben auf vorschriftsmäßige Fixierung und/oder Vorliegen von Nekrose überprüfen.

4. Gewebe vom Objektträger abgelöst.

4a. Empfohlene Maßnahme

4a. Geladene (Fisher SuperFrost Plus) oder silanisierte Objektträger wie Dako Silanized Slides (Code-Nr. S3003) verwenden.

5. Übermäßig starke spezifische Färbung.

5a. Ungeeignete Fixiermethode angewendet.

5b. Reagenzien zu lange

inkubiert. 5c. Ungeeignete Waschlösung

verwendet.

5a. Nur zugelassene Fixiermittel und Fixiermethoden benutzen. (siehe Abschnitt Vorbereitung der Probe).

5b. Anweisungen für Färbeprotokoll überprüfen.

5c. Nur den im Kit mitgelieferten Waschpuffer verwenden

6. Schwache Färbung der 2+ Zelllinie auf dem Kontrollobjektträger.

6a. Unzureichende proteolytische Andauung durch Proteinase K.

6b. Objektträger nicht lange genug mit Antikörpern oder DAB+ Substratchromogenlösung inkubiert.

6c. Abbau des Kontrollobjektträgers.

6a. Proteinase K Lösung muss volle 5 Minuten inkubiert werden.

6b. Empfohlene Inkubationszeiten

überprüfen. 6c. Das auf dem Etikett aufgedruckte

Verfallsdatum des Kits sowie dessen Lagerungsbedingungen überprüfen.

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7. Zu starke Andauung des Gewebes.

7a. Zu starke Inkubation mit Proteinase K.

7b. Unzureichende Fixierung

7a. Proteinase K Lösung darf nicht länger als 5 Minuten inkubiert werden.

7b. Bei neuen Objektträgern das im Färbeprotokoll beschriebene Verfahren nach der Fixierung anwenden und für die Färbung das übliche Verfahren verwenden

Hinweis: Siehe auch Abschnitt „Fehlerbehandlung“ im Dako-Handbuch: Immunochemical Staining Methods (Immunhistochemische Färbeverfahren), 3. Auflage,16 den Atlas of Immunohistology 23 oder Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.20 Bei ungewöhnlichen Färbungen den technischen Kundendienst von Dako verständigen.

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