Upload
others
View
10
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Řešení struktury proteinů pomocí NMR spektroskopie
J.W. Emsley: “NMR started as the plaything of the physicists, became the
favourite toy of the chemists and finally went on to seduce biochemists.”
Využití NMR spektroskopie v jednotlivých oborech podle nositele
Nobelovy ceny za chemii Prof. Richarda Ernsta:
Medicine
Biochemistry
Chemistry
Physics
fyziologické prostředí
jednoduchá příprava vzorku
vysoce selektivní odezva
široký rozsah fyzikálně-chemických vlastností
protože se zabýváme NMR spektroskopií
Důvody pro využití NMR spektroskopie ke studiu biomolekul
1. Jaké typy biologicky aktivních molekul ? peptidy a proteiny
nukleové kyseliny
oligosacharidy
2. Jaký typ informace může být pomocí NMR získán? identifikace substrátu
prostorová struktura molekuly
studium dynamického chování systému
prostorová struktura komplexu
zkoumání vazby ligandu a substrátu
Strategie pro určování struktur biomolekul
Obecné informace o
molekule (primární
struktura, kovalentní
vazby…)
Oprava přiřazení NMR
parametrů, signálů
Zhodnocení kvality struktur
Odhad přibližné struktury
Výpočet souboru struktur
Výpočet statistických údajů pro soubor
konečných struktur
Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi
(Procheck, Whatif….)
NMR vzorek
NMR experimenty
NMR spektra Přiřazení signálů
Přiřazení experimentálních NMR
parametrů (NOE…)
Požadavky na vzorek pro NMR experimenty
Vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný během NMR experimentů !!!
rozpouštědlo H2O + 5-10% D2O (časová stabilizace magnetického pole)
pufr nejběžnější je fosfátový pufr, neobsahuje žádné protony
acetátový pufr (lze pořídit deuterovaný)
teplota podle požadavků studovaného materiálu (15 – 40C)
aditiva nutná aditiva je možné někdy zaměnit za deuterovaná analoga
koncentrace pro NMR experimenty musí být v rozsahu alespoň 0.1-1.0 mM, vzorek
nesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení v tomto konc. rozmezí
stabilita nutná dlouhodobá stabilita v rozsahu minimálně několika týdnů
Úspěšné řešení proteinových struktur
bezpodmínečně vyžaduje kvalitní
spolupráci mezi NMR specialisty a
biochemiky !
Příprava vzorku proteinu pro NMR měření
1. Získání DNA proteinu
2. Příprava plasmidové DNA
3. Exprese rekombinantního proteinu, např. v E.Coli
4. Izolace a čištění
5. Zakoncentrování vzorku
6. Zopakování procesu se značeným médiem
CO C N CO
C
C
H H H
H H C
C
Exprese proteinů: - v minimálním médiu (15NH4Cl, 15NH4SO4 - jediný zdroj 15N ) (13C-glukosa, 13C-glycerol - jediný zdroj 13C) - izotopově obohacené růstové médium
Příprava vzorků se zvýšeným obsahem 13C/15N
Segmentové izotopové obohacení
N-terminální doména
C-terminální doména
Capsidový protein HIV-1
N-term Intein N-term Cys C-term Tag
N-term
N-term
Intein N-term Tag Cys
Cys
C-term
C-term
1. Obě domény se exprimují zvlášť
2. Intein se odštěpí thiolem a Tag proteasou
3. Domény se spojí vytvořením peptidové vazby
Segmentové izotopové obohacení
Segmentové izotopové obohacení
1H
15N celý protein obohacen (15N) 1 doména obohacena (15N)
„Cell-free“ expresní systém
Zdroj: propagační materiál firmy Promega
http://www.protein-nmr.org.uk/labelling.html
Přehled metod pro izotopové obohacení proteinů
Postup přípravy izotopově obohaceného vzorku
• Příprava neznačeného vzorku proteinu o příslušné koncentraci
kontrola správného sbalení proteinu
kontrola dostatečně vysoké koncentrace
sledování dlouhodobé stability
• Příprava 15N obohaceného vzorku proteinu
kontrola čistoty proteinu
kontrola správného sbalení proteinu
kontrola dostatečně vysoké koncentrace
• Příprava 13C/15N (13C/15N/2H) obohaceného vzorku proteinu
vlastní strukturní studie
Zakoncentrování vzorku
Koncentrace měřeného vzorku ~ 0,5 – 1,0 mM
v případě využití chlazené sondy ~ 0,1 – 0,5 mM
Objem roztoku 250 - 500 l
Srovnání NMR spekter sbalené a nesbalené struktury proteinu
7.07.58.08.59.09.5 ppm
108
110
112
114
116
118
120
122
124
126
128
7.07.58.08.59.09.5 ppm(1H)
(15
N)
10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm
WVQPI 107 AA (12 kDa) IMMCS
WVQPI 107 AA (12 kDa) IMMCS
83 AA (9 kDa)
(1H)
správně sbalená forma proteinu
nesbalená forma téhož proteinu
1H- 15N korelace v oblasti amidických vodíků (vzorek nespecificky obohacen 15N)
čerstvě připravený
vzorek
vzorek po 5 dnech
Strategie pro určování struktur biomolekul
Obecné informace o
molekule (primární
struktura, kovalentní
vazby…)
Oprava přiřazení NMR
parametrů, signálů
Zhodnocení kvality struktur
Odhad přibližné struktury
Výpočet souboru struktur
Výpočet statistických údajů pro soubor
konečných struktur
Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi
(Procheck, Whatif….)
NMR vzorek
NMR experimenty
NMR spektra Přiřazení signálů
Přiřazení experimentálních NMR
parametrů (NOE…)
Biomolekulární NMR spektroskopie: měřená jádra
vysoké přirozené zastoupení (99.98%) vysoká citlivost (1.00) malá disperze chemických posunů NMR signálů (~15.0 ppm)
velká disperze chemických posunů NMR signálů (~200.0 ppm) nízké přirozené zastoupení (1.108%), možné uměle navýšit až na
100% nízká citlivost (1.76x10-4), po 100%ním izotopovém obohacení
(1.59x10-2) střední disperze chemických posunů NMR signálů (~30.0 ppm)
(oproti 13C nezávislost na typu aminokyseliny) nízké přirozené zastoupení (0.37%), možné uměle navýšit až na
100% velmi nízká citlivost (3.85x10-6), po 100%ním izotopovém
obohacení (1.04x10-3) používá se pro speciální účely
1H
13C
15N
2H
Potlačení signálu vody
Signál H2O je 104-105 násobně intenzivnější než odezva měřené molekuly.
Proč H2O?
1. Voda je fyziologické prostředí
2. Nelze použít D2O z důvodů chemické výměny s amidickými protony.
1H spektrum proteinu po presaturaci H2O
zbytkový signál H2O
CW-ozařování
90°
Během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým RF polem.
Potlačení signálu vody: metoda presaturace
Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE
Selektivní manipulace se signály vody a rozpuštěné látky doplněná o čistící gradientní echo.
t t
G G
180°
90°
1H
G
Selektivní 180° puls
Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE
Multidimensionální NMR spektroskopie
F3(1H)
F1(15N)
F2(13C)
8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5
N
H
H
H
H H
H H
1H - spektrum
ppm
aromatic H
NH-backbone
NH-SC
CH
aliphatic H
methyl H
1D 1H spektrum proteinu
kuřecí lysozym
129 AA, Mw = 14.6 kDa
Odezva více jader v jednom spektru
13C
13C
13C
13C’
15N
H H
H HHN
13C’
13C
13C
55Hz 15Hz
90Hz
35Hz
7Hz
<1Hz
130Hz
140Hz
35Hz
35Hz
11Hz 55Hz
při zobrazení jednoho jádra pH(H),pN(N) a pC(C)
pH (0 ≤ pH ≤ 1)
pN (0 ≤ pN ≤ 1)
pC (0 ≤ pC ≤ 1)
při zobrazení dvou jader (H-N) najednou P = pH . pN
při zobrazení tří jader (H-N-C) najednou P = pH . pN . pC
pravděpodobnost překryvu
F1(1H)
1D
Korelační spektroskopie jako nástroj pro
zjednodušení NMR spekter
Lepší rozlišení je ve vícedimenzionálních spektrech zajištěno využitím izotopového obohacení 15N a 13C.
2D
F1(1H/X)
F2(1H)
3D
F3(1H)
F2(X)
F1(1H/X)
4D
F4(1H)
F1(1H)
F3(X)
F2(X)
Přiřazování rezonancí
• NMR experimenty pro přiřazení signálů pracují se dvěma nebo
třemi různými jádry najednou (experimenty s trojnásobnou rezonancí),
chemické posuny těchto jáder jsou navzájem zkorelovány.
• Názvy takovýchto experimentů se tvoří podle typu jader, která korelují:
HNCA koreluje amidický vodík s příslušným dusíkem a uhlíkem v
pozici .
HN(CO)CA koreluje stejné typy atomů (jader) jako HNCA, ale přes
CO. To naznačuje směr korelace, tj. H a N i-té aminokyseliny a C
aminokyseliny v pozici i-1.
• Směr přenosu magnetizace je v případě těchto experimentů
H N C a zpět. Experimenty se nazývají „out and back“
• Naproti tomu přenos magnetizace u experimentů např. CBCA(CO)NH
začíná na atomu CB (i-1) aminokyseliny a končí na amidickém H
aminokyseliny následující, tj. experimenty „out and stay“.
Strategie pro určování struktur biomolekul
Obecné informace o
molekule (primární
struktura, kovalentní
vazby…)
Oprava přiřazení NMR
parametrů, signálů
Zhodnocení kvality struktur
Odhad přibližné struktury
Výpočet souboru struktur
Výpočet statistických údajů pro soubor
konečných struktur
Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi
(Procheck, Whatif….)
NMR vzorek
NMR experimenty
NMR spektra Přiřazení signálů
Přiřazení experimentálních NMR
parametrů (NOE…)
Přiřazování rezonancí
13C
13C
13C
13C’
15N
H H
H HHN
13C’
13C
13C
55Hz 15Hz
90Hz
35Hz
7Hz
<1Hz
130Hz
140Hz
35Hz
35Hz
11Hz 55Hz
HNCA experiment
aminokyselinový zbytek I
aminokyselinový zbytek I-1
F3(1HN)
F2(15N )
F1(13C)
Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA
F3(1HN)
F1(13C)
F2(15N )
I
I-1
Přiřazování rezonancí
13C
13C
13C
13C’
15N
H H
H HHN
13C’
13C
13C
55Hz 15Hz
90Hz
35Hz
7Hz
<1Hz
130Hz
140Hz
35Hz
35Hz
11Hz 55Hz
HN(CO)CA experiment
F3(1HN)
F2(15N )
F1(13C)
Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA/HN(CO)CA
F3(1HN)
F1(13C)
F2(15N )
I
I-1
F2(15N )
I-1
Sekvenční přiřazení hlavního řetězce
HNCA HN(CO)CA
missing crosspík
Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C
13C
13C
13C
13C’
15N
H H
H HHN
13C’
13C
13C
55Hz 15Hz
90Hz
35Hz
7Hz
<1Hz
130Hz
140Hz
35Hz
35Hz
11Hz 55Hz
HNCACB experiment Výhoda: chemický posun C je charakteristický pro typ aminokyselinového zbytku
aminokyselinový zbytek I aminokyselinový zbytek I-1
Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C
13C
13C
13C
13C’
15N
H H
H HHN
13C’
13C
13C
55Hz 15Hz
90Hz
35Hz
7Hz
<1Hz
130Hz
140Hz
35Hz
35Hz
11Hz 55Hz
HN(CO)CACB experiment
Leu12 Leu14Thr13 Trp15Ser11
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
126.8 ppm123.7 ppm 124.7 ppm 119.9 ppm114.9 ppm
(1H) (
1H) (
1H) (
1H) (
1H)
(15N) (
15N)(
15N) (
15N) (
15N)
(13C
)
Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C
HNCACB/HN(CO)CACB experiment
C
C’ N
H H
H H N
C’ C
H
C
C H H
C H H
C H H
Přiřazování rezonancí postranních řetězců
55 50 55 50
60
50
40
30
35 30 35 30 30 2565 60
60
50
40
30
ppm
ppm
Pro4CG-CD-HD2
Pro4CD-CD-HD2
Pro4CG-CD-HD3
Pro4CD-CD-HD3
Pro4CA-CB-HB2
Pro4CG-CB-HB2
Pro4CB-CB-HB2
Pro4CA-CB-HB3
Pro4CB-CB-HB3
Pro4CG-CB-HB3
Pro4CB-CG-HG
Pro4CD-CG-HG
Pro4CG-CG-HG
Pro4CB-CA-HA
Pro4CA-CA-HA
H : 4.296 ppmH : 1.818 ppm H : 2.185 ppm H : 1.913 ppm H : 3.589 ppm H : 3.715 ppm
(1
3C
)
(13C)
Kompletní přiřazení Prolinu 4 proteázy M-PMV pomocí hCCH-COSY spektra
ON
H
H
H
H
H
H
H
OCH3
Přiřazování rezonancí postranních řetězců
3D
F3(13C)
F2(1H)
F1(13C)
)](....'[8 6
22
)(
cfsJ
rCH
CDH t
2R
H/ D ~ 6.6
Práce s velkými molekulami způsobuje dvojí komplikaci
• velmi komplikovaná spektra
• rychlá spin-spinová relaxace
Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa
Řešení: výměna atomů vodíku za deuterium
13C
13C
13C
13C’
15N
H H
H HHN
13C’
13C
13C
55Hz 15Hz
90Hz
35Hz
7Hz
<1Hz
130Hz
140Hz
35Hz
35Hz
11Hz 55Hz
D D
D D
Teoreticky může být R2 snížen až 44 násobně, prakticky většinou maximálně 15x.
CD3 CD3
C D
C
D
CO N
H
Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa
Exprese proteinu v růstovém médiu obohaceném o 13C/ 15N/ 2H
Fully protonated versus perdeuterated EIN protein
Fully protonated versus perdeuterated EIN protein
Missing crosspeaks are marked
www.protein-nmr.org.uk
Praktické návody-jak na to?
Strategie pro určování struktur biomolekul
Obecné informace o
molekule (primární
struktura, kovalentní
vazby…)
Oprava přiřazení NMR
parametrů, signálů
Zhodnocení kvality struktur
Odhad přibližné struktury
Výpočet souboru struktur
Výpočet statistických údajů pro soubor
konečných struktur
Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi
(Procheck, Whatif….)
NMR vzorek
NMR experimenty
NMR spektra Přiřazení signálů
Přiřazení experimentálních NMR
parametrů (NOE…)
chemický posun (chemické okolí jádra) NOE interakce (meziatomová vzdálenost)
interakční konstanta (dihedrální úhel)
zbytková dipolární interakce (orientace)
vodíková vazba (vzdálenost, vazebný úhel)
Získání experimentálních parametrů z NMR spekter.
Chemický posun Výpočet indexu chemického posunu
Přiřazení rezonancí hlavního řetězce: H,C, C’
Výpočet indexů chemického posunu, tzv. CSI
Odhad sekundární struktury na základě „lokální hustoty“
těchto indexů
Chemické posuny některých jader jsou ovlivněny typem pravidelné sekundární struktury, do které jsou zahrnuty!!!
(H)
-sheet „random coil“ -helix
Změna chemického posunu indukovaná sekundární strukturou
Histogram indexu chemického posunu jader H, C a C‘.
helix I helix II helix III helix IV
Sekvence aminokyselin
C N
+1 0
-1
Secondary structure of M-PMV PR from CSI
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
CSI
-1
0 1
H H
rIS < 5-6 Ǻ
• přímá spin-spinová interakce mezi jádry
Nukleární Overhauserův efekt NOE Experimentální omezení vzdáleností
6
2
422
41
6
104
ISc
c
cIS r
ht
t
t
IS - rychlost nárustu NOE
tc - korelační čas
rIS - meziatomová vzdálenost
- pracovní frekvence
• interakce mezi dipóly interagujících jader
• relaxační jev
• výměna energie mezi oběma jádry
• charakterizuje vzdálenost mezi oběma jádry
6 rfIS
Převod intenzity NOE krospíků na vzdálenost mezi atomy.
Dolní mez :1.8 Ǻ
Jedná se o součet vzdáleností van der Waalsovských
poloměrů dvou interagujících atomů vodíku
Horní mez :
Nastavuje se podle intenzity příslušného krospíku. Pro
větší molekuly se používá max. vzdálenost až 6 Å.
1.8 Ǻ r 2.5 Ǻ
1.8 Ǻ r 3.5 Ǻ
1.8 Ǻ r 5.0 Ǻ
4D 13C/ 15N-editované NOESY
1H
1H
13C
15N
Editovaná NOESY spektra
NOE
1H 1H
15N 13C JHC JHN
15N= 106.4 ppm 15N= 106.4 ppm 13C= 45.8 ppm
15N= 106.4 ppm 13C= 56.1 ppm
G78HN-G78H G78HN-S77H
3D 15N-editované NOESY 4D 13C/15N-editované NOESY
H
O
O
N
C
C
C
C
y
f c1
c2
C
H
H
H
Nepřímá spin-spinová interakční konstanta Experimentální omezení dihedrálních úhlů
3J
[Hz]
10
8
6
4
2
0
-120 60 0 120
Q
deg
H-NC-H
CO-NC-H
H-NC-C H-NC-CO
Karplusova rovnice 3J = A cos2Q B cosQ C
Vztah mezi interakční konstantou a dihedrálními úhly peptidu
Typické hodnoty interakčních konstant 3JHH
pro dihedrální úhel f
-helix f ~ 60 deg
J 6 Hz
typické nastavení pro úhel f:
110 f 10 deg
-struktura skládaného listu f ~ 10
6 J 9 Hz
typické nastavení pro úhel f:
170 f 70 deg
9.0 8.9 8.8 8.7 1H
118.0
1
22.0
120.0
15N
Jiso
121.0
1
22.0
1
20.0
8.86 8.84 1H
15N
119.0
D
isoanisoresid JJD
NMR experiments: - experiments for measurement J constants - IPAP experiments (better resolution)
Bo Azz
Ayy
Axx
Principal axis system
Residual dipolar couplings RDC Long-range constraint
N H
q
f
N
Janiso
– ~ 6% polyacrylamide gel (crosslinked with bisacrylamide)
– protein diffuses into dried gel
– axial stretching (radial compression) of the gel
Stretched polyacrylamide gel
squeeze alignment of protein in oblate pores
NMR tube
Vodíkové vazby v pravidelných strukturách Další omezení vzdáleností
-helix
-sheet-antiparalelní
N
C
N
C Měření: - výměnné experimenty s D2O - teplotní závislost labilních protonů (NH, OH…) Z NMR experimentů je možné získat pouze informaci o donoru! Informaci o příslušném akceptoru lze získat až z vypočtených struktur
Strategie pro určování struktur biomolekul
Výpočet statistických údajů pro soubor
konečných struktur
Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi
(Procheck, Whatif….)
NMR vzorek
NMR experimenty
NMR spektra Přiřazení signálů
Přiřazení experimentálních NMR
parametrů (NOE…)
Obecné informace o
molekule (primární
struktura, kovalentní
vazby…)
Oprava přiřazení NMR
parametrů, signálů
Zhodnocení kvality struktur
Odhad přibližné struktury
Výpočet souboru struktur
Jak vše poskládat dohromady ????
Cray T3E
Info o kovalentní
struktuře
Omezení vzdáleností
(NOEs)
Omezení dihedrálních úhlů
(interakční konst.)
Výpočetní algoritmus: Molekulární mechanika
simulované žíhání s experimentálními omezeními (vzdálenosti,
dihedrální úhly…)
- molekula se ohřeje na vysokou teplotu (2000 – 50 000 K)
- pomalu se ochladí na teplotu blízkou nule
simulované žíhání v Kartézském prostoru (Newtonovy pohybové
rovnice)
simulované žíhání v prostoru torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)
potkintot EEE
Simulované žíhání (simulated annealing) typický průběh
časová osa [ns]
teplota [K] vysokoteplotní
perioda
perioda postupného
ochlazování
minimalizace
potenciálové
energie
Soubor struktur vyhovující nejlépe získaným experimentálním omezením
potkintot EEE
Ekin je kinetická energie vypočítávaná v každém kroku z teploty molekuly
Epot je součet energií produkovaných penalizačními funkcemi
Molekulární parametry (hmotnost atomů, délka vazby, vazebné úhly…
vstupují do výpočtu ve formě tzv „force fields“
Př: penalizační fukce pro NOE:
Jak vše poskládat dohromady ????
d
ENOE
0
dolní mez (1,8 Å) horní mez (< 6 Å)
Cílem je minimalizovat Epot
vdW kov NOE DIH
DIHNOEkovvdWpot DkDkDkDkE .....2222
2
0exp
2 )( ddD dexp je experimentální nebo aktuální hodnota
d0 je ideální hodnota
Prezentace vypočtených struktur
C N N C
helix I
helix III
helix II helix IV
N N
C C
Strategie pro určování struktur biomolekul
Výpočet statistických údajů pro soubor
konečných struktur
Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi
(Procheck, Whatif….)
Obecné informace o
molekule (primární
struktura, kovalentní
vazby…)
Oprava přiřazení NMR
parametrů, signálů
Zhodnocení kvality struktur
Odhad přibližné struktury
Výpočet souboru struktur
NMR vzorek
NMR experimenty
NMR spektra Přiřazení signálů
Přiřazení experimentálních NMR
parametrů (NOE…)
2. Rozptyl struktur v souboru
- mezi jednotlivými strukturami a průměrnou strukturou (mean)
- mezi jednotlivými strukturami navzájem
- počítá se buď pro celou molekulu, jednotlivé části nebo jednotlivé
aminokyseliny
n
xx
RMSD
n
i
i
1
2
Charakterizace vypočtených struktur
1. Shoda vypočtených struktur s experimentálními daty
- velikost potenciálová energie
- počet a velikost neshod s experimentálními parametry (NOE,
dihedrální úhly….
- počet a velikost špatných kontaktů mezi atomy (van der
Waalsovský příspěvek)
- počet a velikost neshod s ideálními hodnotami kovalentních
parametrů (délky vazeb, vazebné úhly, planarita aromatických
kruhů…)
Charakterizace vypočtených struktur
3. Porovnání strukturních parametrů vypočtených struktur
s parametry v databázích software Procheck, Whatif…
http://biotech.embl-heidelberg.de:8400
Ramachandranův diagram
f/y diagram je charakteristický
pro konformaci páteře proteinu
- takto lze porovnávat i ostatní
dihedrální úhly, vazebné úhly,
délky vazeb…
- lze vytypovat problémové oblasti
Malate synthase, 723 AA, 82 kDa
Tugarinov V., Choy W.Y., Orekhov, V.Y., Kay L.E.(2005) PNAS, 102, 622-627