Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma Marie-Claire Arrieta, Leah T. Stiemsma, Pedro A. Dimitriu, et. al. The

Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma

Marie-Claire Arrieta, Leah T. Stiemsma, Pedro A. Dimitriu, et. al. The CHILD Study Investigators, William W. Mohn, Stuart E.

Turvey, B. Brett Finlay Sci Transl Med. 2015 Sep 30;7(307):307ra152.

Apresentação: Lais Leão Oliveira (R2 em Pediatria)Coordenação: Paulo R. Margotto

Unidade de Pediatria do HRAS/HMIB/Faculdade de Medicina da Universidade Católica de Brasília

Brasília, 21 de novembro de 2015www.paulomargotto.com.br

Alterações microbiana e metabólica precoces afetam o risco de asma nainfância

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26424567

Introdução

• A asma é uma doença inflamatória crônica que afeta mais de 300 milhões de pessoas em todo o mundo.

• É mais prevalente no ocidente. Como outras doenças imuno mediadas, sua fisiopatologia envolve fatores genéticos e ambientais

• Genética descobriu vários genes relacionados à asma, porém eles não explicam o aumento da asma

Introdução

• Estudos epidemiológicos vem relacionando outros fatores que explicam o aumento da prevalência da asma nos últimos 30 anos.

• Grande parte desses eventos estão relacionados com eventos precoces na vida das crianças capazes de alterar a microbiota intestinal.– Uso pré e perinatal de antibióticos (ATB)– Parto por cesareana– Vida urbana– Uso de fórmulas

Introdução

• A hipótese da microflora pode ser o link entre as mudanças ambientais e nosso sistema imune.6-9

A microbiota intestinal é um alvo potencial terapêutico na prevenção de asma e atopia.• Há agora evidências, tanto em ratos como

em humanos que exista uma janela crítica precoce na qual os efeitos da disbiose

intestinal mais influenciam no desenvolvimento imune.

Introdução

• Em ratos, o uso de antibiótico perinatal exacerbou a inflamação das vias aéreas:– Aumento de IgE– Diminuição de linfócitos T no colón

• Pesquisas relacionadas às alterações precoces da microbiota intestinal e asma não foram traduzidas para humanos

Introdução• As alterações da microbiota intestinal não se limitam a

prevalência dos micróbios mas também a produção de metabólitos derivados deles, como os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC).

• Acetato e propionato reduziram a inflamação das vias aéreas em ratos

• Redução dos AGCC estão relacionados a alergia alimentar em crianças

• Ainda não há pesquisas que objetivam estabelecer alterações metabólicas precoces antes do diagnóstico de asma que potencialmente possam ser usados como biomarcadores.

Introdução• The Canadian Healthy Infant Longitudinal

Development (CHILD) Study é um estudo multicêntrico, longitudinal e de coorte que segue crianças desde a gravidez até os 5 anos de idade.

• O presente estudo envolveu 319 crianças participantes do CHILD:• Relacionou a disbiose da microbiota intestinal aos primeiros 100 dias de vida caracterizada pela redução de 4 gêneros de bacterias: Lachnospira,

Veillonella, Faecalibacterium, e Rothia e o aumento do risco de desenvolver asma.

Introdução

• O modelo foi confirmado em ratos e comprovou que ratos suplementados com essas 4 bactérias tiveram melhora da inflamação das vias aéreas.

• Além disso, foi feita uma análise do potencial funcional da microbiota intestinal , combinada à medida dos AGCC fecais e análise dos metabolomas ( conjunto de todos os metabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo ) urinários.

Introdução

• Essa análise proporciona o entendimento das alterações, na vida precoce, do metabolismo dos

micróbios e do hospedeiro que precedem o desenvolvimento da

asma nas crianças.

Resultados• Avaliação do risco de asma • Alterações na microbiota intestinal em lactentes

com risco de asma• Alterações funcionais derivadas da micróbios em

lactentes com elevado risco de asma– Sequenciamento genético das bactérias da microbiota – Medida de AGCC nas fezes– Dosagem de metabolomas na urina

• Melhora da inflamação pulmonar em ratos livres mediada por bactérias do gênero FLVR (Faecalibacterium,Lachnospira, Veillonela e Rothia)

Avaliação do risco de asma• Usando um desenho caso-controle, foram

selecionadas 319 crianças do CHILD Study para a análise do microbioma intestinal.

• Com 1 ano de vida foram classificados quanto aos fenótipos:- Atópicos (A) : aqueles que o prick test foi positivo- Sibilantes (W) : que sibilaram no 1º ano de vida- Atópicos e Sibilantes (AW)- Grupo controle

• Essas crianças foram acompanhadas, sendo comprovado o fenótipo classificado no primeiro ano de vida pelo quadro clínico apresentado até 3 anos.

Avaliação do risco de asma

– Foi aplicado questionário validado: Asthma Predictive Index (API) aos 3 anos que prediz a chance de desenvolver asma ativa na idade escolar

– Um API positivo aos 3 anos relaciona-se com 77% de chance de apresentar asma ativa na idade escolar.

– Dos que tiveram API negativo, apenas 3% desenvolveram asma em idade escolar.

Avaliação do risco de asma• Estar com 1 ano no grupo AW implica em ter

um API positivo– 13,6 vezes [P = 0.0003; 95% CI, 3.2 to 57.4] do que

os controles– 5.6 vezes (P = 0.0037; 95% CI, 1.8 to 17.5) do que

o grupo A– E 4.9 vezes (P = 0.0036; 95% CI, 1.8 to 14) do que

o grupo W


• As crianças do grupo AW tiveram chance– 21.5 vezes do que o grupo controle (P = 0.002;

95% CI, 2.4 to 196.0)– 3.9 vezes do que o grupo A (P = 0.0429; 95% CI,

1.09 to 14.5)– e 5.4 vezes mais do que o grupo W (P = 0.0137;

95% CI, 1.5 to 19.0) de serem diagnosticadas com asma aos 3 anos

(Figura 1)



• Juntos, o API (chance de desenvolver asma ativa na idade escolar) e o diagnóstico de asma aos 3 anos enfatizam a relevância clinica do grupo AW comparado aos controles.

Avaliação do risco de asma• Exposição a Antibiótico (ATB) no primeiro ano

de vida (OR, 5.6; P = 0.009) e dermatite atópica (OR, 6.4; P = 0.005) com 1 ano foram fatores que aumentaram o risco de ser classificado no grupo AW.

* Parto cesareana, uso de fórmulas, uso de ATB na infância também favorecem a disbiose da microbiota intestinal, porém SOMENTE A EXPOSIÇÃO AO ANTIBIÓTICO NO PRIMEIRO ANO DE VIDA ,MOSTROU-SE SIGNIFICANTE.

Alterações na microbiota intestinal em lactentes com risco de asma

• O estudo não revelou diferenças na composição global da microbiota intestinal nos 4 fenótipos aos 3 meses e 1 ano de idade (Figura 2A)

Fig.2A


• O estudo não revelou diferenças significantes na diversidade da microbiota dos 4 fenótipos (Figura 2B)

Fig. 2B)


• Houve diferença na comparação entre a quantidade relativa de bactérias, aos 3 meses de vida, entre os grupos .

• A principal está relacionada ao gênero das bactérias– Bactérias dos gêneros Lachnospira, Veillonella,

Faecalibacterium, e Rothia estavam presentes em menores quantidades no grupo AW

(Figura 3C)

• Comprovou-se através da técnica de PCR que os 4 gêneros de bactérias estavam presentes de forma significativamente

menos abundante , aos 3 meses, no grupo AW, em relação aos controles. (Figuras 3C e 3D)

Fig.3C

Fig.3D


• Os resultados sugerem que a menor abundância dessa bactérias em idade precoce está associada com o maior risco de desenvolver asma aos 3 anos

Mudanças funcionais derivadas dos micróbios em lactentes com risco

aumentado de asma• Para determinar a importância da disbiose

precoce em lactentes com maior risco de asma, o potencial funcional da microbiota fecal foi predito usando o método PICRUSt (um algoritmo que infere o genoma funcional das bactérias)


aumentado de asma

• Dos 6911 genes pesquisados– 2364 genes eram significativamente diferentes

aos 3 meses– Apenas 125 genes eram diferentes com 1 ano de

vida (Figura 3A;3B)

Fig.3

Fig.3B


aumentado de asma• O genes foram classificados conforme a via

metabólica que determina• A maior diferença entre os grupos foi

observada no genes que determinam a biossíntese de lipopolissacarideos (LPS)

• Foi realizada a dosagem de LPS nas amostras fecais dos grupos AW e controle, sendo verificado que a concentração era significativamente menor no grupo AW


aumentado de asma• Portanto, os dados bioquímicos e genéticos

sugerem uma modificação funcional real na composição das bactérias entre o grupo AW e o controle , aos 3 meses de vida

• Este achado demonstra a importância das alterações precoces, uma vez que , com 1 ano de vida essa diferença na vias metabólicas não foi observada entre os 2 grupos.


aumentado de asma

• As implicações funcionais da microbiota intestinal no grupo AW também foram pesquisadas utilizando a dosagem de AGCC (ácidos graxos de cadeia curta) nas fezes e de metabolomas na urina .


aumentado de asma• Aos 3 meses, amostras fecais de crianças AW,

mostraram concentração significativamente baixa de acetato (Figura 4A)

Fig.4A

• 8 substâncias foram detectadas na urina das crianças AW com 3 meses de vida.

• Com 3 meses a excreção de ácidos biliares sulfatados: glycothicolato, glycholenato e glychoyocolate era maior no grupo AW enquanto a excreção de tauroursodesoxycolato estava diminuída, comparados ao grupo controle.

• A maior diferença, porém, foi o aumento de urobiligenio, produto direto da microbiota intestinal.

(Figura 4B)


aumentado de asma

Fig.4B


aumentado de asma• Não foram encontradas diferenças entre a

quantidade de bactérias e essas alterações metabólicas

• Porém, é possível que a alteração desses metabólitos urinários sejam o resultado da combinação entre a atividade metabólica do hospedeiro e da microbiota.

• Ainda assim são marcadores da disbiose intestinal precoce que podem ser detectados da urina e estão relacionados ao risco aumentado de asma.

Melhora da inflamação pulmonar em ratos FLVR mediada

• Em ratos adultos “germ free” (livres de germens) foram inoculadas fezes de paciente de 3 meses, AW, ou com FLVR vivas.

• A microbiota intestinal dos filhotes nascidos de pais suplementados com FLVR era claramente diferente da microbiota dos outros filhotes (Figura 5A).

Fig.5A


• Filhotes nascidos de pais inoculados com FLVR, mantiveram essas cepas (Figura B; 5C)

Fig.5C

• Quantidade relativa de famílias de bactérias no intestino dos filhotes

.

Fig.5B


• Para determinar se FLVR poderia modular a resposta inflamatória das vias aéreas, os ratos foram inoculados com ovoalbumina com 7 a 8 semanas de vida

• Ratos inoculados com microbiota AW desenvolveram importante inflamação das vias aéreas. Os ratos suplementados com FLVR desenvolveram inflamação muito menos grave, com menores contagem de neutrófilos e linfócitos no lavado broncoalveolar.

(Fig.5D,E,F,G)

D - Contagem de células no lavado broncoalveolar dos ratos após 3 semanas de indução de inflamação das vias aéreas.

E - Contagem diferencial de células no lavado broncoalveolar. Houve redução significativa de linfócitos e neutrófilos.

Figs.5D,E

• Escore histopatológico e cortes histológicos pulmonares dos ratos dos 3 grupos, mostrando redução da inflamação com a suplementação de FLVR

Figs.5 F,G


• Esses dados sugerem que a microbiota dos sujeitos do grupo AW induzem resposta imune mediada por celular T helper (TH1/TH2/ TH17)

• Colonização terapêutica com FLVR reduziu significativamente os componentes TH1 e TH 17 da resposta imune, produzindo menos inflamação na via aérea

Discussão• Os achados mostram que nos humanos, os primeiros

100 dias de vida representam uma janela critica precoce na qual disbiose da microbiota intestinal está relacionada ao risco de desenvolvimento de asma e doenças alérgicas. Esse achados são semelhantes aos estudos prévios com animais.

• A disbiose precoce é caracterizada pela redução de 4 gêneros específicos de bactérias: Faecalibacterium, Lachnospira, Veillonella e Rothia (FLVR).

Discussão

• O estudo também mostrou que essa alteração é muito menos aparente com 1 ano de vida, sugerindo que a intervenção terapêutica para correção da disbiose intestinal deve ser feita precocemente (até os 3 meses )na criança.

Discussão• Encontrou-se que as vias metabólicas de produção de

lipopolissacarideos (LPS) estavam significativamente reduzidas no grupo AW aos 3 meses.

• A exposição aos LPS é importante na regulação das células TH2 para a produção da IL 12 e promoção de resposta imune tipo TH1.

• Já foi demonstrado que a redução da exposição a LPS em ratos nascidos por parto cesareana impede o desenvolvimento de tolerância em células imunes intestinais.

• Assim a redução de apenas 1 grupo de bactérias intestinais produtoras de LPS no inicio da vida pode produzir profundas consequências imunológicas.

Discussão• Outro importante achado é que o acetato fecal

está diminuído no grupo AW aos 3 meses de vida. • A análise genômica também demonstrou, nos

sujeitos do grupo AW, redução da via metabólica dos glicanos, que produzem AGCC

• Em modelos animais os AGCC , acetato, butirato e propionato mostraram evitar a inflamação da via aérea, através da estimulação das células T reguladoras e células dendríticas capazes de inibir respostas TH2

Discussão• Outros metabólitos derivados dos micróbios intestinais

encontrados na urina no grupo AW, podem potencialmente funcionar como biomarcadores precoces do risco de asma.

• Alguns ácidos biliares encontrados na urina podem ter sua excreção alterada por aumento da produção ou por alteração da atividade enzimática bacteriana . Assim é possível que a redução de 4 gêneros bacterianos que sabidamente tem atividade enzimática na bile possa alterar sua excreção urinaria.

• Trabalhos futuros podem observar o papel dessas substâncias na asma.

Discussão

• A suplementação da FLVR foi protetora e induziu uma redução marcante na inflamação pulmonar em ratos, reforçando a idéia de que essas bactérias tem papel imunomodulador no desenvolvimento da asma.

• A partir da inoculação da FLVR houve redução de neutrófilos e linfócitos, de fatores imunes TH1 e TH 17 (IL 6, IL 17A e TNF). Fatores esses que estão notavelmente aumentados em pessoas com asma grave.

Discussão

Os dados encontrados reforçam a importância da disbiose precoce e transitória como um fator que influencia o desenvolvimento da asma e enfatizam o papel protetor dos 4 gêneros de

bactérias. • Foram identificados varias alterações

metabólicas precoces com potencial terapêutico ou de funcionar como biomarcadores, e poderão desencadear novos estudos que objetivem determinar seu papel na patogênese da asma.

Discussão

• Juntos, os achados, estabelecem um importante papel da microbiota intestinal precoce, na modulação do sistema imune, e suscita o potencial de criação de terapias baseada em micróbios para prevenir o desenvolvimento da asma e outras doenças alérgicas que iniciam-se na infância.

ABSTRACT

Nota do Editor do site, DR. Paulo R. Margotto

Consultem também!• Como vimos grande parte destes fatos aqui

estudados relacionam-se com eventos precoces na vida das crianças ( “JANELA CRÍTICA”) capazes de alterar a microbiota intestinal e entre estes, o uso pré-natal e perinatal de antibióticos, o nascimento por cesariana e o uso de fórmulas

• O antibiótico neonatal aumentou o risco de chiado no peito tanto em termo como pré-termo (OR para 33 semanas foi de 2.9 (95% IC: 1.8–4.7), e para os RN de 37 semanas foi 2.9 (95% IC: 1.7– 4.9

• Nesta região da Suécia, entre 2004 e 2007, os RN que receberam antibiótico, 5% tinham displasia broncopulmonar (DBP), 18,4% tinham doença da membrana hialina e 8,2% tinham pneumonia. Assim, havia poucos RN com DBP, que é o principal link com o futuro chiado no peito

• A primeira semana de vida é mais importante para a mudança na flora intestinal. Estudo de Penders J et al evidenciou que a flora intestinal com 1 mês de idade foi influenciado pelo tratamento com antibiótico, com um padrão predisponente de eczema e chiado no peito aos 2 anos de idade.

Tratamento antibiótico neonatal é fator de risco para desenvolvimento de chiado no peito de crianças

Bernt Alm et al. Apresentação:Murilo Oliveira de Almeida, Daniel Bitela, André Cerqueira

• -Pergunta ao Dr. Neu: Os micróbios que se desenvolvem do trato gastrintestinal de um RN de parto normal versus cesariana são diferentes?

• Existe um estudo, que mostra que com 7 anos de idade as crianças tinham diferenças na espécie Clostidrium nos que nasceram de cesariana versus parto normal. Usando técnicas sem culturas vemos ainda diferenças com 6 meses. Recente artigo que revi também mostra diferenças importantes na cesariana versus parto normal. Em relação à ECN, não acho ter visto diferença nesta situação, seja cesariana ou parto normal, mas existe evidência que está sendo apresentada, que bebês que nascem de cesariana apresentam maior incidência de diabetes tipo 1, asma, alergia. Esta informação pode ser muito importante, considerando os altos níveis de cesarianas que estão ocorrendo. Nos EUA temos Hospitais com 90% de cesarianas e outros com 20%. Muitos obstetras estão fazendo cesarianas mais por conveniência própria do que diz respeito ao bebê e a mãe.

Enterocolite necrosante: considerações clínicas e cirúrgicas

Autor(es): Josef Neu (EUA). Realizado por Paulo R. Margotto

• o fluido amniótico não é um ambiente estéril a interação da microbiota das vias aéreas com as células do trato respiratório, influencia na susceptibilidade para ou proteção contra a doença, bem como afeta o desenvolvimento estrutural do pulmão em momentos críticos do desenvolvimentoMuitas destas interações são moduladas através do trato gastrintestinal

Pulmões, micróbios e o desenvolvimento do neonatoAutor(es): Aaron Hamvas (30th International Workshop on Surfactant Replacement,

Stockholm, June 4-6, 2015). Realizado por Paulo R. Margotto

Cross-talk ("conversa-trocada") entre o intestino e pulmão tem o potencial para existir em vários níveis, desde a transferência física direta de bactérias através de refluxo e microaspiração para efeitos

indiretos de seus subprodutos ou respostas imunes mediadas por mucosas comuns a ambos os tratos: gastrintestinal e pulmonar

LEITE HUMANO-AFETA AMBAS MICROBIOTAS intestinal e pulmonar DIETA EM FIBRA:protege as vias aéreas da inflamação alérgica! (aumento Bacterióides no intestino e

ácidos graxos de cadeia curta)

As fortes interações entre a flora microbiana e respostas imunes têm levado ao foco natural de asma e doenças alérgicas. Estudos utilizando lavagem bronco-alveolar ou expectoração

induzida demonstraram que Proteobacteria (predominantemente Haemophilus spp.) são mais abundantes em vias aéreas distais dos indivíduos com asma e doença pulmonar obstrutiva

crônica (DPOC); Firmicutes (Staphylococcus spp.) são mais abundantes em crianças com asma de difícil controle[17, 50, 51]. Em contraste, Bacteroides, especialmente Prevotella spp., são mais

abundantes nos controles [50]. Além disso, observações em murino e estudos baseados em células sugeriram um papel para estas bactérias na doença. Estudos baseados em células

demonstraram aumento do TLR-2 ((Toll-like receptor 2) - independente de inflamação para a asma e DPOC associada a Proteobacteria (Haemophilus spp. e Moraxella) em comparação com Prevotella spp. comensais, que exibem fracas propriedades inflamatórias dependente de TLR-

2[52].

Atopic dermatitis is associated with Caesarean sections in Korean adolescents but asthma is not.

Yu M, Han K, Kim DH, Nam GE.Acta Paediatr. 2015. [Epub ahead of print]Article first published online: 20

NOV 2015 | DOI: 10.1111/apa.13212Publicação de dezembro de 2015

• A taxa de cesariana na Coréia do Sul foi de 18,1% e na de 1990, mas subiu para 40,5% em 2001 e 36,9% em 2012.

• Estes números recentes eram mais do que duas vezes maior que 5-15% de taxa recomendada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e também foram mais altas do que a taxa de 32% relatados nos Estados Unidos e a média de 25,8% da taxa da Organização para a Cooperação Econômica e Países de desenvolvimento (2).

• A cesariana deve ser realizada quando o parto normal é impossível ou quando a mãe ou o bebê estão em perigo, mas de acordo com a OMS, 10-

15% de cesarianas são realizadas sem justificação. O número crescente de cesariana desnecessária é extremamente susceptível

de aumentar o risco de condições tais como pneumonia aspirativa, broncoespasmo, hipotensão, sangramento e mortalidade mais elevada do que o parto vaginal na mãe. Ela também é considerado como um dos principais fatores que impede a amamentação. Além disso, tem sido publicada uma possível associação entre

cesariana e doenças alérgicas

• Os autores explicam esta associação da cesariana com dermatite atópica pelo interferência na amamentação, uma vez que os RN por distúrbios respiratórios e cardiovasculares atrasam o a ingesta de leite materno, além de que podem amamentar por um curto período e tempo, uma vez que iniciam a amamentação mais tardiamente

• Aqui vão observações (Dr. Paulo R. Margotto) -nossos índices de cesariana estão muito elevados, mesmo

na Rede Pública, chegando a quase 50% (na Rede Particular, mais de 80%!)

-por qualquer motivo, às vezes de forma rotineira, iniciamos “fórmula de partida” para RN GIG/PIG e por outros motivos não claros

-tornam-se necessárias atitudes esclarecedores da necessidade de se buscar mais o parto normal e evitar a exposição “rotineira” dos nossos bebês às fórmulas, uma vez que estas podem sim alterar a microbiota intestinal, constituindo fator de importância nos processos alérgicos na infância como já demonstrado pelo estudo aqui discutido de Arieta et al.

• Os autores do presente estudo detectaram associação significativa de dermatite atópica em adolescentes nascidos por cesariana em relação ao parto vagina (odds ratio de 1,50, com um intervalo de confiança de 95% (95% CI) de 1,01 -2,22, após o ajuste para idade e sexo.

• A associação permaneceu significativa após outros ajustes, como índice de massa corporal, a amamentação e níveis séricos de 25-hidroxivitamina D (odds ratio = 1,61, IC95% = 1,05-2,47) e quando a ingestão de gordura foi adicionado a essas variáveis (odds raio= 1,80, IC95% = 1,14-2,85).

No entanto, a asma não foi associada com o modo de nascimento .

OBRIGADO!

Dra. Lais Leão, Dr. Paulo R. Margotto e Dra. Joseleide de Castro

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