E Regulación de la expresión génica Regulation of gene ... · PDF fileE.12 División Celular Bacteriana y ... Parody, Salvador Iborra, Maxy B. de los ... 246-250 Quijada, L., Soto,

ERegulación de laexpresión génica

E.1 Molecular parasitology

E.2 Gene expression in human Tlymphocytes

E.3 Molecular biology ofextremophilicmicroorganisms

E.4 Genome maintenance andvariability: enzymology ofDNA repair.

E.5 Estructura y función delribosoma

E.6 Protein synthesis and itsregulation in eukaryotes

E.7 Gene expressionStreptomyces and yeast

E.8 Hormonal regulation of geneexpression

E.9 Chromatin structure andtranscription

E.10 Cell envelopes

E.11 Molecular basis of metabolic diseases

E.12 Bacterial Cell Division andAntibiotics Resistance

E.13 Biotechnology and geneticsof extreme thermophilicbacteria

E.14 Regulation of the tissue-specific gene expression

E.15 Internal initiation oftranslation in eucarioticmRNAs

Regulation ofgene expresion

E.1 Parasitología molecular

E.2 Expresión génica en linfocitosT humanos

E.3 Biología molecular demicroorganismos extremofilos

E.4 Mantenimiento y variabilidaddel genoma: enzimología de lareparación de DNA.

E.5 Estructura y función delribosoma

E.6 Síntesis de proteínas y suregulación en eucariontes

E.7 Expresión génica enStreptomyces y levaduras

E.8 Regulación de la actividadgenética por hormonas

E.9 Estructura cromatínica ytranscripción

E.10 Envolturas celulares

E.11 Bases Moleculares de lasEnfermedades Metabólicas

E.12 División Celular Bacteriana yResistencia a Antibióticos

E.13 Biotecnología y genética debacterias termofilas extremas

E.14 Regulación de la expresióngénica específica de tejido

E.15 Iniciación interna de latraducción en mRNASeucarióticos.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Las especies de Leishmania son protozoos

parásitos, agentes etiológicos de las

Leishmaniosis, un grupo de enfermedades

que afectan a la población de 79 países,

en los que producen unos 400.000 casos

nuevos cada año, existen unos 12 millones

de personas infectadas y 350 millones están

en riesgo de contraer la enfermedad. Los

perros son el principal reservorio de L.

infantum en la cuenca mediterránea, Oriente

Próximo y Centro y Sudamérica. La

prevalencia de la leishmaniosis visceral

canina en la región mediterránea varía

desde el 1 al 37%.

La principal actividad investigadora de

nuestro grupo se dirige hacia la

caracterización de antígenos de L. infantum

y el análisis de los aspectos inmunológicos

del húesped que son inducidos durante la

infección. Hemos identificado a proteínas

evolutivamente conservadas como

antígenos prominentes de Leishmania que

son específicamente reconocidos por los

sueros de humanos y perros con

leishmaniasis visceral (LV). Además,

algunas de estas proteínas (p. ej., las

proteínas de choque térmico (HSP) 70 y

83, y la proteína ribosomal ácida LiP2a)

tienen destacables propiedades

inmunoestimuladoras como son una

actividad adjuvante para producir

anticuerpos frente a proteínas

acompañantes y un efecto mitogénico sobre

esplenocitos de ratones no inmunizados.

Por otro lado, venimos estudiando

parámetros inmunológicos y clínicos

asociados a la infección por L. infantum de

hámsteres dorados como un modelo

experimental que se asemeja a las

infecciones de LV en humanos y cánidos.

Otra parte de nuestra actividad investigadora

se viene realizando en el campo de la

biología molecular de L. infantum. En

particular, estamos estudiando mecanismos

de regulación que, en este parásito, operan

a niveles post-transcripcionales. En estos

estudios estamos empleando los genes de

histonas y de HSP como sistemas modelo.

Nuestro grupo está colaborando con los

Drs. Ignacio Navarrete y Luis C. Gómez-

Nieto (Facultad de Veterinaria, UEX,

Cáceres) en el análisis de la LV canina y

la infección experimental en perros. También

estamos colaborando con la Dra. Carmen

Navarro-Ranninger y el Dr Jose M. Pérez

(Departamento de Química Orgánica, UAM)

en la identificación de las vías bioquímicas

por las que algunos compuestos metálicos

ejercen su actividad antitumoral.

Jefe de Línea / Group Leader:

Carlos Alonso

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Jose Mª Requena

Manuel Soto

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

María José Pérez

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

Ana Isabel Rico, Ruth Larreta, Nuria

Parody, Salvador Iborra, Maxy B. de los

Santos

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Miguel A. Fuertes, María D. Doria, Javier

Carrión, Carlos Mey, David Navarro.

Parasitología molecularE.1

88

Macrófago de hámster infectado por L. infantum (Tinción de Giemsa)

Pérez, J.M., Camazón, M., Alvarez-Valdes, A., Quiroga, A.G., Kellnad, L.R.,Alonso, C. and Navarro- aninger, M.C. (1999). Synthesis, characterization andDNA modification induced by a novel Pt(IV)-bis(monoglutarate) complexwhich induces apoptosis un glioma cells. Clin. Biol. Interaction 117, 99-115

Gonzalez, V.M., Fuertes, M.A., Jimenez-Ruiz, A, Alonso, C. and Perez, J.M.(1999). The formation of DNA interstrand-cross-links by a novel Bis-[Pt2-Cl4(diminacene aceturate)2Cl4.4H2O complexes inhibits the B to Z formation.Mol. Pharmacol. 85, 770-778

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Quiroga, A.G., Perez, J.M., Montero, E.I., West, D.X., Alonso, C. and Navarro-Ranninger, C. (1999). Synthesis and characterization of Pd(II) and Pt(II)complexes of p-isopropylbenzaldehyde N-protected thiosemicarbazones.Cytotoxic activity against ras-transformed cells. J. Inorg. Biochem. 75, 293-301

Perez, J.M., Matesanz, A.I., Martin-Ambite, A., Navarro, P., Alonso, C. andSouza, P. (1999). Synthesis and characterization of complexes of p-isopropylbenzaldehyde and methyl 2-pyridyl ketone thiosemicarbazones with Zn(II) andCd(II) metallic centers. Cytotoxic activity and induction of apoptosis in Pam-ras cells. J. Inorg. Biochem. 75, 255-261

Onoa, G.B., Moreno, V., Font-Bardia, M., Solans, X., Perez, J.M. and Alonso,C. (1999). Structural and cytotoxic study of new Pt(II) and Pd(II) complexeswith the bi-heterocyclic ligand mepirizole. J. Inorg. Biochem. 75, 205-212

Puentes, F., Guzman, F., Marin, V., Alonso, C., Patarroyo, M.E. and Moreno,A. (1999). Leishmania: fine mapping of the Leishmanolysin molecule'sconserved core domains involved in binding and internalization. Exp Parasitol.93, 7-22

Olivares, M., Thomas, M.C., Alonso, C. and Lopez, M.C. (1999). The L1Tc,long interspersed nucleotide element from Trypanosoma cruzi, encodes aprotein with 3'-phosphatase and 3'-phosphodiesterase enzymatic activities. J.Biol. Chem. 274, 23883-23886

Perez, J.M., Quiroga, A.G., Montero, E.I., Alonso, C. and Navarro-Ranninger,C. (1999). A cycloplatinated compound of p-isopropylbenzaldehydethiosemicarbazone and its chloro-bridged derivative induce apoptosis in cis-DDP resistant cells which overexpress the H-ras oncogene. J. Inorg. Biochem.73, 235-243

Fuertes, M.A., Berberich, C., Lozano, R.M., Gimenez-Gallego, G. and Alonso,C. (1999). Folding stability of the kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11)from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 260, 559-67

- Nieto, C.G., García-Alonso, M., Requena, J.M., Mirón, C., Soto, M., Alonso,C. and Navarrete, I. (1999). Analysis of the humoral immune response againsttotal and recombinant antigens of Leishmania infantum: correlation withdisease progression in canine experimental leishmaniasis. Vet. Immunol.Immunopathol. 67, 117-130

Rico, A.I., Angel, S.O., Alonso, C. and Requena, J.M. (1999).Immunostimulatory properties of the Leishmania infantum heat shock proteinsHSP70 and HSP83. Mol. Immunol. 36, 1131-1139

Cervantes, G., Marchal, S., Prieto, M.J., Perez, J.M., Gonzalez, V.M., Alonso,C. and Moreno, V. (1999). DNA interaction and antitumor activity of a Pt(III)derivative of 2-mercaptopyridine. J. Inorg. Biochem. 77, 197-203

Perez, J.M., Lopez-Solera, I., Montero, E.I., Brana, M.F., Alonso, C.,Robinson, S.P. and Navarro-Ranninger, C. (1999). Combined effect ofplatination and intercalation upon DNA binding of novel cytotoxic Pt-bis(naphthalimide) complexes. J. Med. Chem. 42, 5482-5486

Fuertes, M.A., Perez, J.M., Gonzalez, V.M. and Alonso, C. (1999). Empiricalvalidation of a two-state kinetic model for the B-Z transition of double-strandedpoly[d(G-m5C)]. J. Biol. Inorg. Chem. 4, 759-765

Perez, J.M., Montero, E.I., Gonzalez, A.M., Alvarez-Valdes, A., Alonso, C. andNavarro-Ranninger, C. (1999). Apoptosis induction and inhibition of H-rasoverexpression by novel trans-PtCl2(isopropylamine) (amine')] complexes. J.Inorg. Biochem. 77, 37-42

Montero, E.I., Diaz, S., Gonzalez-Vadillo, A.M., Perez, J.M., Alonso, C. andNavarro-Ranninger, C. (1999). Preparation and characterization of noveltrans-[PtCl(2) (amine) (isopropylamine)] compounds: cytotoxic activity andapoptosis induction in ras-transformed cells. J. Med. Chem. 42, 4264-4268

Thomas, M.C., Garcia-Perez, J.L., Alonso, C. and Lopez, M.C. (2000).Molecular characterization of KMP11 from Trypanosoma cruzi: a cytoskeleton-associated protein regulated at the translational level. DNA Cell. Biol. 19, 47-57

Soto, M., Quijada, L., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Histone synthesisin Leishmania infantum is tightly linked to DNA replication by a translationalcontrol. Biochem. J. 346, 99-105

Boceta, C., Alonso, C. and Jimenez-Ruiz, A. (2000). Leucine rich repeats arethe main epitopes in Leishmania infantum PSA during canine and humanvisceral leishmaniasis. Parasite Immunol. 22, 55-62

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Perez-Perez; J., Fernandez-Caldas, E., Marañón, F., Sastre, J., Lluch-Bernal,M., Rodriguez, J. and Alonso, C. (2000). Molecular Cloning of Paramyosin, anew allergen of Anisakis simplex. Allergy Immunol. 642, 1-10

Requena, J.M., Alonso, C. and Soto, M. (2000). Evolutionarily conservedproteins as prominent immunogens during Leishmania infections. Parasitol.Today 16, 246-250

Quijada, L., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Identification ofa putative regulatory element in the 3’-untranslated region that controlsexpression of HSP70 in Leishmania infantum. Mol. Biochem. Parasitol. 110,79-91

Olivares, M., Thomas, M.C., López-Barajas, A., Requena, J.M., García-Pérez,J.L., Angel, S., Alonso, C. and López, M.C. (2000). Genomic clustering of theTrypanosoma cruzi nonlong terminal L1Tc retrotransposon with definedinterspersed repeated DNA elements. Electrophoresis 21, 2973-2982

Larreta, R., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Leishmaniainfantum: gene cloning of the GRP94 homologue, its expression asrecombinant protein, and analysis of antigenicity. Exp. Parasitol. 96, 108-115

Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). The Leishmania infantumacidic ribosomal protein LiP2a induces a prominent humoral response in vivoand stimulates cell proliferation in vitro and interferon-gamma (IFN-)production by murine splenocytes. Clin. Exp. Immunol. 122, 212-218

Requena, J.M., Soto, M., Doria, M.D. and Alonso, C. (2000). Immune andclinical parameters associated with Leishmania infantum infection in thegolden hamster model. Vet. Immunol. Immunopathol. 76, 269-281

Molecular parasitology

Publicaciones /Publications:

Research summary

Leishmania spp. are protozoan parasites,

etiological agents of Leishmaniasis, a

group of diseases affecting the population

of 79 countries at a rate of 400,000 cases

per year with 12 million currently infected

and 350 million at risk. Dogs are the

major reservoir of L. infantum in the

Mediterranean Basin, the Middle East,

and South and Central America. The

prevalence of canine visceral

leishmaniasis in the Mediterranean

region has been shown to vary from 1

to 37%.

The main research activity of our group

is directed towards the characterization

of L. infantum antigens and the

understanding of host immunological

aspects elicited by the infection. We have

identified evolutionarily conserved

proteins as prominent Leishmania

antigens that are specifically recognized

by sera from both humans and dogs with

visceral leishmaniasis (VL). Furthermore,

some of these proteins (e.g., heat-shock

proteins (HSP) 70 and 83, and acidic

ribosomal protein LiP2a) possess

remarkable immunostimulatory

properties such as adyuvant activity to

induce antibody production against an

accompanying protein and mitogenic

effect on splenocytes from unprimed

mice. On the other hand, we are studying

immunological and clinical parameters

associated with the L. infantum infection

in Golden hamsters as the experimental

model mimicking the human and canine

VL infections.

Another part of our research activity is

being developed in the field of the

molecular biology of L. infantum. In

particular, we are studying mechanisms

of gene regulation that, in this parasite,

are operating at these post-transcriptional

levels. In this studies were are using

histone and HSP genes as system

models.

Our group is collaborating with Dr Ignacio

Navarrete and Dr Luis C. Gómez-Nieto

(Facultad de Veterinaria, UEX, Cáceres)

on the analysis of canine VL and the

experimental infection in dogs. Also, we

are collaborating with Dr Carmen

Navarro-Ranninger and Dr Jose M.

Pérez (Departamento de Química

Orgánica, UAM) in the identification of

the biochemical pathways by which

certain metallic compounds exert their

antitumour activity.

89

Hamster macophage infected by L. Infantum (Giemsa staining)




La compartimentalización de las

membranas celulares en microdominios o

balsas (“rafts”) es un nuevo concepto en

biología. A diferencia de la mayor parte de

las membranas celulares, que están

constituidas fundamentalmente por

fosfolípidos y empaquetadas de una

manera desordenada, los microdominios

de membrana enriquecidos en glicolípidos

y colesterol (GEM) parecen adoptar una

estructura más ordenada. La captación

selectiva de proteínas en el Golgi en este

tipo de balsas fue propuesta inicialmente

como modelo para explicar la segregación

y posterior transporte de proteínas de

nueva síntesis a la superficie apical de las

células epiteliales polarizadas. Mas

recientemente, este modelo ha sido

extendido como un mecanismo general

para el reclutamiento específico de

proteínas implicadas en otros procesos

celulares.

El proteolipido MAL, una proteína integral

de membrana expresada de forma

diferencial durante la ontogenia de los

linfocitos T, se expresa también en células

formadoras de mielina y en células

epiteliales polarizadas. En todos estos

tipos celulares la proteína MAL ha sido

identificada como un componente de los

microdominios ricos en glicolípidos y

colesterol. Uno de los logros más

sobresalientes de nuestro grupo en los

últimos años ha sido la demostración del

papel de MAL como un componente

esencial de la maquinaria integral de

proteínas implicada en el transporte apical

de células epiteliales polarizadas MDCK y

FRT. Teniendo en cuenta este papel

central de MAL en el transporte apical, y la

existencia de una familia de proteínas, la

“familia MAL de proteolípidos”,

relacionada con MAL, nuestros objetivos

presentes son: 1) el esclarecimiento del

mecanismo por el que MAL promueve el

transporte apical en células epiteliales

polarizadas, 2) la identificación en

linfocitos T de rutas de transporte

semejantes a la mediada por MAL en

células epiteliales, y 3) la caracterización

bioquímica y funcional de nuevos

miembros de la familia MAL de

proteolípidos que pudieran desempeñar

también un papel como maquinaria de los

microdominios ricos en glicolípidos y

colesterol en otros procesos celulares.

Expresión génica en linfocitos T humanosE.2

90


Miguel A. Alonso



Jaime Millán

Susana Guerra (desde 1-7-00)

Fernando Martín (desde 1-9-00)


Graduate Students:

Rosa Puertollano (hasta 1-9-99)

Fernando Martín-Belmonte

María del Carmen de Marco

Alicia Batista (desde 1-4-99)

Estudiante de la Escuela Taller/

Workshop School Student

Sergio Gómez (desde 1-6-2000)

Gene expression in human T lymphocytes


Research summary

The compartmentation of cellular

membranes in microdomains or rafts is

an emerging concept in cell biology.

Unlike the bulk of membranes, which

are enriched in phospholipids and

packed in a disordered state, glycolipid

and cholesterol-enriched membrane

(GEM) rafts appear to be packed in a

liquid-ordered state. Recruitment of

specific proteins into GEM rafts in the

Golgi was initially proposed to explain

the segregation and subsequent

transport of newly synthesized apical

proteins in polarized epithelial cells,

and more recently has been extended

as a general mechanism to

concentrate specific proteins for

processes such as intracellular protein

transport and signaling.

The MAL proteolipid is a 17-kDa

integral membrane protein, initially

identified in our laboratory as a protein

specifically expressed during T cell

differentiation, is expressed also in

myelin-forming cells and epithelial

polarized cells. In all these cell types,

MAL has been found to be selectively

present in GEM rafts. One of the major

achievements of our group in the last

two years has been the identification of

the MAL proteolipid as an essential

component of the integral protein

machinery for raft-mediated apical

transport in epithelial renal MDCK and

thyroid FRT cells. Keeping in mind this

central role of MAL in apical transport

and the existence of a family of

proteins, the “MAL proteolipid family”,

highly related to MAL, our current

objectives are: 1) the elucidation of the

molecular mechanism by which MAL

promotes apical transport in epithelial

cells, 2) the identification in T cells of

GEM raft-mediated pathways of

transport reminiscent of that of apical

transport in polarized epithelial cells,

and 3) the biochemical and functional

characterization of novel members of

the MAL proteolipid family which,

similar to MAL, might play a role as

machinery for cellular processes

mediated by GEM rafts.

91

Puertollano, R., Martín-Belmonte, F., Millán, J., de

Marco, M. C., Albar, J. P., Kremer, L., and Alonso, M. A.

(1999) The MAL proteolipid is necessary for normal

apical transport and accurate sorting of the influenza

virus hemagglutinin in Madin-Darby canine kidney

cells. J. Cell Biol. 145, 141-151.

Puertollano, R., and Alonso, M. A. (1999) MAL, an

integral element of the apical sorting machinery, is an

itinerant protein that cycles between the trans-Golgi

network and the plasma membrane. Mol. Biol. Cell 10,

3435-3477.

Copie-Bergman, C., Gaulard, P., Maouche-Chrétien,

L., Brière, J., Alonso, M. A. Roméo, P.-H., and Leroy, K.

(1999) The MAL gene is expressed in primary

mediastinal large B-cell lymphoma. Blood 94, 3567-

3575.

Puertollano, R., and Alonso, M. A. (1999) Substitution

of the two carboxyl-terminal serines by alanine causes

retention of MAL, a component of the apical sorting

machinery, in the endoplasmic reticulum. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 260, 188-192.

Luque, C. M., Lallena, M.-J., Pérez-Ferreiro, C. M., de

Isidro, Y., de Cárcer, G., Alonso, M. A. and Correas, I.

(1999) The N-terminal 209-aa domain of high

molecular weight 4.1R isoforms abrogates 4.1R

targeting to the nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,

14925-14930.

Puertollano, R., Menéndez, M., and Alonso M. A.

(1999) Incorporation of MAL, an integral protein

element of the machinery for the glycolipid and

cholesterol-mediated apical pathway of transport, into

artificial membranes requires neither of these lipid

species. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266, 330-

333.

Martín-Belmonte, F., López-Guerrero, J. A., Carrasco,

L., and Alonso, M. A. (2000) The amino-terminal nine

amino acid sequence of poliovirus capsid VP4 protein

is sufficient to confer N-myristoylation and targeting to

detergent-insoluble membranes. Biochemistry 39,

1083-1090.

Martín-Belmonte, F., Alonso, M.A., Zhang,, X., and

Arvan, P. (2000) Thyroglobulin is selected as luminal

cargo protein for apical transport via detergent-

resistant membranes in epithelial cells. J. Biol. Chem.

275, 41074-41081.

Martín-Belmonte, F., Puertollano, R., Millán, J., and

Alonso, M.A. (2000) The MAL proteolipid is necessary

for the overall apical delivery of membrane proteins in

the polarized epithelial Madin-Darby canine kidney and

Fischer Rat thyroid cell lines. Mol. Biol. Cell 11, 2033-

2045.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Rosa Puertollano Moro: “El Proteolípido MAL como

Componente de la Maquinaria de Transporte Apical de

Células Epiteliales Polarizadas”. Universidad

Autónoma de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.




El grupo de Biología Molecular de

extremófilos posee distintas líneas de

investigación, cuyos objetivos principales

se resumen a continuación:

- Biohidrometalurgia: ecología, biología

molecular y biotecnología de

microorganismos que se desarrollan en

ambientes acidófilos, con especial énfasis

en los aspectos aplicados de los mismos

(biominería, biodesulfuración de carbones,

secuestro específico de metales,

fitorremediación)

- Ecología microbiana de ambientes

extremos terrestres como modelos de vida

de interés astrobiológico: geomicrobiología

del Río Tinto y de las lagunas hipersalinas

de la Mancha (en colaboración con el Centro

de Astrobiología).

- Funciotipo: estudio de la evolución

funcional del ribosoma utilizando inhibidores

de la traducción con distinta especificidad.

- Caracterización estructural y funcional de

chaperonas de haloarqueas.

- Metanogénesis: tratamiento anaerobio de

aguas contaminadas, con especial énfasis

en la caracterización de inhibidores del

proceso y en la degradación de compuestos

recalcitrantes en condiciones anaerobias.

- Cambios en la expresión global de genes

de dinoflagelados nocivos sometidos al

stress de fosfato: a) identificación y

clonación de proteínas relacionadas con la

producción de toxinas PSP por diferentes

especies del género Alexandrium, y b)

desarrollo de kits para la deteccion de

dinoflagelados toxicos productores de

toxinas diarreicas (DSP) contaminates de

alimentos de origen marino.

- Sistemas enzimáticos en el control de

hongos fitopatogénicos.

Biología molecular de microorganismosextremofilos

E.3

92

Jefe de Línea/Group Leader:

Ricardo Amils


Personnel

Irma Marín, Francisco Santamaría;

José Luis Sanz

Becarios Posdoctorales /

Posdoctoral Fellows:

Consuelo Durán, Angéles Aguilera,

Felipe Gomez*

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Elena González-Toril,

Elayne Culubret,

Patricia Rojas,

Enrique Marín,

Javier Chichón,

Eva Lospitao

Emiliano Díaz,

Moustafa Malki

Técnicos de Investigación/

Technical Assistance:

Nuría Rodriguez*,

Raquel Mesa,

Juan Francisco Morales,

Raquel García

Científicos Visitantes/ Visiting

Scientists:

Antonio Lazcano (U. Autónoma de

Mexico),

Ana Mª Amaro (U. de Chile), Violaine

Bonnefoy (CNRS Marsella),

Linda Amaral Zettler (Marine Biological

Laboratories, Woods Hole),

Erik Zettler (Marine Biological

Laboratories, Woods Hole).

*Miembros del Centro de Astrobiología

(CAB)

Molecular biology of extremophilicmicroorganisms


Research summary

The Extremophiles group has different

research projects in which the main

objectives are the following:

- Biohydrometallurgy: ecology, molecular

biology and biotechnology of acidophilic

microorganisms, with special emphasis

in their applied potential (biomining, coal

biodesulfurization, specific heavy metal

sequestering, fitoremediation).

- Microbial ecology of terrestrial extreme

environments as models of

astrobiological interest:

greomicrobiology of the Tinto River and

hypersaline ponds from la Mancha (in

colaboration with the Centro de

Astrobiología).

- Functiotype: ribosomal functional

evolution using translational inhibitors

with different specificity.

- Structural and functional

characterization of haloarchaeal

chaperons.

- Methanogenesis: anaerobic

wastewater treatment with special

emphasis in the characterization of

inhibitors of the process and the

degradation of recalcitrant compounds

in anaerobic conditions.

- Changes in the global expression of

genes from toxic dinoflagellates under

phosphate stress: a) identification and

cloning of the proteins related with the

production of PSP by different species

of the genus Alexandrium, and b)

development of kits for the detection of

toxic dinoflagelates responsible of DSP

in sea food.

- Enzymatic systems involve in the

control of fitopathogenic fungi.

93

D. Cid, R. Sanz, I. Marín, H. de Greve, J.A. Ruiz SantaQuiteria, R. Amils, R. de la Fuente. (1999) Characterizationof nonenterotoxigenic Escherichia coli strains producingF17 fimbriae isolated from diarrheic lambs and goat kids.J. Clin. Microbiol, 37: 1370-1375.

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C. Rodríguez-Fonseca, H. Phan, K.S. Long, B.T. Porse,S.V. Kirilov, R. Amils, R. Garret. (2000)

Puromycin-rRNA interactions sites at the peptidyltransferase center. RNA, &: 744-754.

C. Briones, R. Amils. (2000) Nucleotide sequence of the23S rRNA from Haloferx mediterranei and phylogeneticanalysis of halophilic Archaea based on LSU rRNA. Syst.Appl. Microbiol., 23: 124-131.

R. Sanz, I. Marín, J.A. Ruiz-Santa-Quiteria, J.A. Orden,D. Cid, R.M. Diez, K.S. Silhadi, R. Amils, R. de la Fuente.(2000) Catalase deficiency in Staphylococcus aureussubsp. anaerobius is associated with natural loss-of-function mutations within the structural gene. Microbiol.,146: 465-475.

J.L. Sanz, N. Rodriguez, J. Ferrer, A. Moreno, J.L. Berna(2000) Evaluation of the inhibition potential of linearalkylbenzene sulfonate (LAS) to the methanogenicprocess. The Clear View, 6: 26-30.

R. Amils (2000) Impacto de la biotecnología en el medioambiente. En “Bioética 2000”, M. Palacios (ed.), EdicionesNobel, Oviedo, pp. 387-403.

E. González-Toril, F. Gómez, R. Amils (2000) Biodiversidaden condiciones extremas de acidez y metales pesados:el caso del río Tinto. Actualidad Tecnológica Ibérica, 463-464.

E.N. Culubret, M. Luz, R. Amils, J.L. Sanz (2000)Biodegradation of 1,1,1,2-tetrachloroethane undermethanogenic conditions. En “VI Latin-american WorkshopWastewater anaerobic treatment”, pp. 215-220.

Tesis Doctorales/ Doctoral thesesPatricia Rojas. “Tratamiento y post-tratamiento deefluentes ganaderos”, U. Autónoma de Madrid, septiembre2000, Apto cum laude.




El interés de nuestra línea de investigación

se centra actualmente en la identificación

de nuevas DNA polimerasas de reparación

de DNA en mamíferos, cuyo papel podría

ser muy relevante tanto para el

mantenimiento de la estabilidad genómica,

como para proporcionar un cierto grado de

variabilidad, necesario en determinados

genes como en el caso de los receptores

de antígeno, pero indeseable en su

contribución a incrementar el fenotipo

mutador que se haya asociado a una gran

mayoría de procesos tumorales.

En nuestro laboratorio hemos identificado

dos nuevas DNA polimerasas eucarióticas,

denominadas Pol lambda y Pol mu, que

pertenecen al grupo de DNA polimerasas

homólogas a la Pol beta, implicada

específicamente en la reparación del DNA

nuclear (ver figura).

El análisis de expresión de la Pol lambda,

tanto murina como humana, sugiere su

participación específica en células

germinales, en reparación de DNA asociada

a la meiosis, y un papel mas general en

células somáticas, en la reparación de

dobles roturas en la cadena de DNA. El

análisis bioquímico de la Pol lambda

humana expresada en E. coli demuestra

su analogía funcional con la Pol beta,

compartiendo propiedades de distributividad

y relativa fidelidad de inserción, ambas

compatibles con una función en reparación

de DNA. Estamos estudiando alteraciones

de expresión y polimorfismos de la Pol

lambda humana que pudieran tener relación

con el desarrollo de determinados tumores.

La Pol mu, 42% idéntica (aminoácidos) a

la TdT, es una DNA polimerasa de muy baja

fidelidad de copia (mutador), capaz de

introducir un elevado número de

mutaciones, tanto "in vitro" como "in vivo".

El análisis de expresión de la Pol µ sugiere

su participación específica en el proceso

de hipermutación somática de los genes

de inmunoglobulinas. Estamos analizando

la contribución de la Pol mu al desarrollo

de los linfomas B en los que el proceso de

hipermutación somática está activo.

Mantenimiento y variabilidad del genoma:enzimología de la reparación de DNA.

E.4

94

Jefe de Línea/Group Leader:

Luis Blanco Dávila

Becarios Posdoctorales /

Posdoctoral Fellows:

Orlando Domínguez López (hasta Enero

2000)

Tomas Kirchhoff

Esther García Palomero (desde Julio

2000)

Rosario Sabariegos Jareño (desde Julio

2000)


Students:

José Ruiz Pérez

Miguel García Díaz

Estudiantes / Students:

Josana Rodríguez Sánchez (hasta

Septiembre 2000)

Raquel Juárez Santos (desde

Septiembre 2000)

Genome maintenance and variability:enzymology of DNA repair.


Research summary

Our reserach interest is the identification

of novel mammalian DNA polymerases

involved in DNA repair and variability.

These novel enzymes are predicted to

be relevant to maintain the equilibrium

between genome stability and the levels

of variability required, not only for

evolution, but also for the normal

function of specific genes. Moreover,

disregulation of these enzymes could

be responsible for the mutator phenotype

associated to carcinogenesis.

We have identified two novel eukaryotic

DNA polymerases named Pol lambda

and Pol mu, that belong to the DNA

polymerase family X, whose paradigm

is Pol beta, a polymerase specifically

involved in nuclear DNA repair (see

figure).

Expression analysis of both murine and

human Pol lambda indicated its specific

participation in DNA repair associated

to meiosis, together with a more general

role in double-strand break DNA repair

in somatic cells. Biochemical analysis

of Pol lambda demonstrated its functional

analogy to Pol beta, sharing similar

properties and base-discrimination

parameters that are compatible with its

function in DNA repair. Alterations of

expression and single-nucleotide

polymorphisms associated to human

Pol lambda potentially related with

tumorogenesis, are being studied.

Pol mu shares 41% amino acid identity

with terminal transferase (TdT). Our

biochemical analyses demonstrated that

Pol mu is an error-prone DNA

polymerase that behaves as a strong

DNA mutator, both in vitro and in vivo.

Expression analysis suggest that Pol

mu plays a specific role in somatic

hypermutation of inmunoglobulin genes.

We are analyzing the contribution of Pol

mu to the development of those B-cell

lymphomas that are constitutively

hypermutating their inmunoglobulin

genes.

95

V. Truniger, L. Blanco and M. Salas (1999) Role ofthe "YxGG/A" motif of ø29 DNA polymerase inprotein-primed replication. J. Mol. Biol., 286, 57-69.

B. Illana, J.M. Lázaro, C. Gutiérrez, W.J.J. Meijer,L. Blanco and M. Salas (1999) Phage ø29 terminalprotein residues Asn80 and Tyr82 are recognitionelements of the replication origins. J. Biol. Chem.274, 15073-15079.

A. Bonnin, J.M. Lázaro, L. Blanco and M. Salas(1999) A single tyrosine prevents insertion ofribonucleotides in the eukaryotic-type ø29 DNApolymerase. J. Mol. Biol. 290 , 241-251.

M. de Vega, L. Blanco and M. Salas (1999)Processive proofreading and spatial relationshipbetween polymerase and exonuclease active sitesof bacteriophage ø29 DNA polymerase. J. Mol. Biol.292, 39-51.

V. Truniger, L. Blanco and M. Salas (2000) Analysisof ø29 DNA polymerase by partial protelysis: Bindingof terminal protein in the double-stranded DNAchannel. J. Mol. Biol. 295, 441-453.I.

E. Dufour, J. Méndez, J.M. Lázaro, M. de Vega, L.Blanco and M. Salas (2000) An aspartic acid residuein TPR-1, a specific region of protein-priming DNApolymerases, is required for the functional interactionwith primer terminal protein. J. Mol. Biol. 304, 289-300.

O. Domínguez, J.F. Ruiz, M. García-Díaz, M. Laín,M. González, C. Martínez-A., A. Bernad and L.Blanco (2000) DNA polymerase mu (Polµ,homologous to TdT, could act as a DNA mutatorin eukaryotic cells. The EMBO J. 19, 1731-1742.

M. García-Díaz, O. Domínguez, L.A. López-Fernández, T. Laín de Lera, M.L. Saníger, F.J. Ruiz,M. Párraga, M.J. García, T. Kirchhoff, J. del Mazo,A. Bernad and L. Blanco (2000) DNA polymeraselambda (Pol ?), a novel eukaryotic DNA polymerasewith a potential role in meiosis. J. Mol. Biol. 301,851-867.

Patentes/ Patents

Título : "DNA polimerasa lambda, un nuevo marcadortumoral”.Inventores (p.o. de firma): Luis Blanco, AntonioBernad, Orlando Domínguez y Miguel García-Díaz.Nº de solicitud : P9902169. País de prioridad :España. Fecha de prioridad : 8 de Octubre de 1999.Entidad titular : CSIC. International patentapplication No : PCT/GB00/03784.

Título : "DNA polimerasa mu (Pol µ), una DNApolimerasa mutadora”. Inventores (p.o. de firma):Luis Blanco. N.º de solicitud : P200000517. Paísde prioridad : España. Fecha de prioridad : 3 deMarzo de 2000. Entidad titular: CSIC.

La familia X de DNA polimerasa humanas. Los cuatro DNA polimerasas presentas cuatro subdominios denominados:

“8 kDa”, “dedos” (F), “palma” (P), “pulgar” (T), que se indican en verde, amarillo, rojo y magenta, respectivamente.

Además, las DNA polimerasas Pol lambda, Pol mu y TdT comparten un dominio adicional, denominado BRCT (indicado

en azul) que probablemente juega un papel regulador. La porción equivalente a la Pol beta (core) se encuadra sobre

fondo oscuro. Las barras blancas indican secuencias adicionales en los distintos subdominios.

The Pol X family of DNA polymerases. All members have the same four subdomains, named: “8 kDa”, “fingers” (F),

“palm” (P) and “thumb” (T), indicated in green, yellow, red and magenta, respectively. Additionally, Pol lambda, Pol mu

and TdT also share an additional subdomain, named BRCT (shown in blue), that likely has a regulatory role. The generally

conserved Pol β core is shown as a dark box. The presense of additional sequences is indicates by the white bars.



Resumen de investigación

Papel del Tallo Ribosómico y del Centro

GTPasa como Reguladores de la

Traducción en S.cerevisiae.

A.- Estudio de la dinámica de las

interacciones entre los diferentes

componentes del tallo, (P0, P1α, P1β, P2α,

P2β, L12) y de ellos con los factores del

sobrenadante y con compuestos inhibidores.

Se usan técnicas de puenteo químico,

espectroscopía de fluorescencia clásica

(colaboración con Dr. J. Jameson, Univ.

Hawaii), de fluorescencia de dos fotones

(colaboración con Dr. Gratton Univ, Illinois).

Se realizan en paralelo estudios con

Aspergillus fumigatus para entender su

resistencia a antifúngicos inhibidores del

centro GTPasa

B.- Caracterización de los tres dominios

funcionales de la proteína P0.

La proteína P0 es el componente central

del tallo ribosómico desempeñando

simultáneamente tres funciones esenciales:

1.- Se une el RNA en el centro GTPasa; 2.-

Forma un complejo con las proteínas P1

y P2; 3.- Interacciona con los factores

solubles. Se están caracterizando funcional

y estructuralmente los dominios

responsables de cada una de estas

funciones. Se utilizan técnicas de genética

y biología molecular (deleciones,

mutaciones puntuales, etc) y bioquímicas

(doble híbrido, cambio de movilidad de

bandas en gel, etc).

C.- Caracterización de mRNAs cuya

traducción es regulada por la composición

del tallo ribosómico. Se utilizan cepas

mutantes con alteraciones en el tallo y

técnicas de microarrays y de proteómica.

D.- Regulación de la síntesis y ensamblaje

del tallo ribosómico. Se ha identificado un

mecanismo que implica degradación por

proteasas especificas que se intentan

identificar.

Análisis del genoma de S. cerevisiae(dirigido por M. Remacha).

Completado el análisis sistemático, donde

se generaron deleciones en 30 genes, se

ha profundizado en la función de dos de

ellos. Ydl097c es una proteína esencial,

constituyente del proteasoma. Su ausencia

produce un arresto en G2/M por un defecto

celular en la degradación de ciclinas.

Ydl100p es una proteína periférica de

membrana implicada en homeostasis de

metales. En el caso de zinc, su localización

celular depende de la presencia/ausencia

de metal, regulando la endocitosis del

receptor de alta afinidad Zrt1.

Jefe de Línea / Group leader:

Juan Pedro García Ballesta

Personal Científico / Scientific Staff:

Miguel Remacha

Técnico de investigación / Technical

Assistance:

Mari Carmen Fernández Moyano

Becarios Postdoctorales / Post-

doctoral Fellows:

Cruz Santos, Gretel Nusspaumer,

Esther Guarinos


Students:

Sonia Zúñiga, Pilar Parada, Patricia

González Santamaría, Jorge Pérez

Fernández, De-yi Qiu, Alberto García

Marcos

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

David Jameson (30 dias), Dept.

Biología Molecular, Univ. de Hawaii,

USA

M. Helms (30 dias), Dept. Biología

Molecular, Univ. de Hawaii.

Dra. Sophia Kouyanou, (30 dias) Dept.

Biología, Universidad de Atenas

Estructura y función del ribosomaE.5

96

M.E. Gagou, M.A. Rodriguez-Gabriel, Ballesta, J.P.G. and Kouyanou,

S. (1999) Isolation and expression of genes encoding the acidic

ribosomal phosphoproteins P1 and P2 of the medfly Ceratitis capitata.

Gene, 226, 365-373.

S. Zúñiga, J. Boskovic, A. Jimenez, J.P.G. Ballesta, M. Remacha

(1999) Disruption of six Saccharomyces cerevisiae novel genes and

phenotypic analysis of the deletants. Yeast 15, 945-953.

M.A. Rodriguez-Gabriel, G. Bou, E. Briones, R. Zambrano, M.

Remacha, and J.P.G. Ballesta (1999) Structure and function of the

stalk, a putative regulatory element of the yeast ribosome. Role of

stalk protein phosphorylation. Folia Microbiol. 44, 153-163.

R. Zambrano, E. Briones, J. Avila and J.P.G. Ballesta (1999)

Phosphorylation of P1 serine inhibits peptide bond sensitivity to

Staphylococcus aureus V8 protease. Arch. Biochem. Biophys. 368,

207-209.

J.P.G. Ballesta, M.A. Rodriguez-Gabriel, G. Bou, E. Briones, R.

Zambrano, M. Remacha (1999) Phosphorylation of yeast ribosomal

stalk. Functional effects and enzymes involved in the process FEMS

Microbiol. Lett. 23, 537-550.

S. Zúñiga, J. Boskovic, J.M. Garcia-Cantalejo, A. Jimenez, J.P.G.

Ballesta, M. Remacha (1999) Deletion of 24 open reading frames

from chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae and phenotypic

analysis of the deletants. Gene, 233, 141-150.

M.A. Rodriguez-Gabriel, M. Remacha, y J.P.G.Ballesta (2000) The

RNA interacting domain but not the protein interacting domain is

highly conserved in ribosomal protein P0 J. Biol. Chem. 275, 2130-

2136.

G. Bou, M. Remacha y J.P.G. Ballesta (2000) Ribosomal stalk

protein phosphorylating activities in Saccharomyces cerevisiae. Arch.

Biochem. Biophys. 375, 83-89.

M.E. Gagou, M.A. Rodriguez-Gabriel, J.P.G. Ballesta, S. Kjouyanou

(2000) The ribosomal P-proteins of the merfly Ceratitis capitata form

a heterogenous stalk structure interacting with the endogenous P-

proteins, in conditional P0-null strains of the yeast Saccharomyces

cerevisiae Nucleic Acid Res. 28, 736-743

M. Gómez-Lorenzo, C.M.T. Spahn, R.K. Agrawal, R.A. Grassucci,

P. Penczek, K. Chakraburtty, J.P.G. Ballesta, J.L. Lavandera, J.F.

Garcia-Bustos, J. Frank (2000) Threre-dimensional cryo-localization

of EF2 in the Saccharomyces cerevisiae 80S ribosome at 17.5Å

resolution. EMBO J. 19, 2710-2718.

J. Zurdo, P. Parada, A. van den Berg, G. Nusspaumer, A. Jimenez-

Diaz, M. Remacha, J.P.G. Ballesta (2000) Assembly of

Saccharomyces cerevisiae stalk: Binding of P1 proteins is required

for the interaction of P2 proteins. Biochemistry 39, 8929-8934.

J. Zurdo, C. Gonzalez, J.M. Sanz, M. Rico, M. Remacha, J.P.G.

Ballesta (2000) Structural differences between Saccharomyces

cerevisiae ribosomal protein P1 and P2 support their functional

diversity. Biochemistry 39, 8935-8943.

G. Nusspaumer, M. Remacha and J.P.G. Ballesta (2000)

Phosphorylation and N-end region of the yeast ribosomnal prtoein

P1 mediate its degradation, which is prevented by protein P2 EMBO

J. 19, 6075-6084.

C. Briones and J.P.G. Ballesta (2000) Conformational changes

induced in the S. cerevisiae GTPase associated RNA by ribosomal

stalk components and a translocation inhibitor. Nucleic Acid Res.

28, 4497-4505.

Structure and function of the ribosome


Research Summary

Role of the ribosomal stalk and the

GTPase center as translation regulators

in S. Cerevisiae.

A.- Dynamic of interactions among the

different stalk components (P0, P1α, P1β,

P2α, P2β, L12) and the supernatant

factors, and effect of inhibitors. Chemical

cross-linkig, classic fluorescence

spectroscopy (in collaboration with D. J.

Jameson , Univ. of Hawaii) as well as

two-photons flourescence (in

collaboration with Dr. E, Gratton, Univ, of

Illinois) are being used. Similar parallel

studies are being carried out using

Aspergillus fumigatus, trying to understand

its resistance to antifungals that inhibit

the ribosomal GTPase Center.

B.- Characterization of the three functional

domains in the ribosomal stalk protein

P0.

Protein P0 is the central component of

the ribosomal stalk and carries out three

essential functions: 1.- Binds to rRNA at

the GTPase center; 2.- Forms a complex

with proteins P1 and P2; 3.- Interacts with

the supernatnat factors. We are

functionally and structurally characterizing

the protein domains involved in each one

of these functions using genetic and

molecular biology approaches (deletions,

site directed mutations, ect) as well as

biochemical techniques (two-hybrids, gel

band-shifts, etc).

C.- Ribosomal stalk-dependent

translational regulation. Characterization

of mRNAs whose translation is affected

by the ribosomal stalk composition using

stalks mutant strains with microarrays

and proteomic techniques.

D.- Regulation of the synthesis and

assembly of the ribosomal stalk. We have

studying in detail a recently found

regulatory mechanisms that differentially

control stalk components by degradation

with specific proteases.

Analysis of the S. cerevisiae genome.

(Directed by M. Remacha)

A systematic analysis by gene deletion

of 30 genes was completed. Two of them,

Ydl097c and Ydl100p, have been studied

in more detail. Ydl097c encodes an

essential proteasomal protein whose

deletion causes a G2/M cell arrest due

to a deffect in cyclin degradation.

Ydlo100p is a peripheral membrane

protein involved in metal homeostasis. In

the case of Zn, the metal directs its cellular

location by regulating the high affinity

receptor Zrt1 endocytosis.

97

Tesis Doctorales/ Doctoral thesesEl tallo ribosómico de S. cerevisiae. Estudio estructural

y funcional. Esther Guarinos Viñals, 1999, Universidad

Autonóma de Madrid, Sobresaliente cum laude

Control de la expresión de las proteínas ribosómicas

P1/P2 en S. cerevisiae. Gretel Nusspaumer da Costa,

1999, Universidad Autónoma de Madrid, Sobresaliente

cum laude.

Análisis funcional de seis ORFs de Saccharomyces

cerevisiae. Implicación de YDL100c en la homeostasis

de metales. Sonia Zúñiga Lucas. 2000, Universidad

Autonóma de Madrid, Sobresaliente cum laude.




Control de la traducción por las eIF-2 αquinasas

Cuatro proteínas quinasas diferentes

regulan la traducción en células eucarióticas

fosforilando el eIF2α en el residuo Ser-51.

Estas son, el inhibidor regulado por hemina

(HRI); la proteína quinasa dependiente de

RNA (PKR); la proteína quinasa del retículo

endoplásmico (PERK) y el GCN2. Estas

proteínas quinasas se activan por distintos

estímulos, a saber: el HRI, por deficiencia

de hemina: la PKR, por RNA de doble

cadena; la PERK, por estrés del retículo

endoplásmico y el GCN2 de S. cerevisiae,

por limitación de aminoácidos. Previamente,

nosotros clonamos el homólogo del GCN2

de embriones de Drosophila (DGCN2) y

demostramos que su expresión está

regulada durante el desarrollo. Ahora,

hemos continuado la búsqueda de nuevos

miembros de esta familia de proteínas

quinasas. Hemos identificado el primer

homólogo del GCN2 en mamíferos

(MGCN2). La escasez de suero aumenta

la fosforilación del eIF-2α en células 293T

humanas transfectadas con MGCN2.

Hemos clonado la PERK de embriones de

Drosophila y su expresión también está

regulada durante el desarrollo y además,

su actividad en células S2 es sensible a

estrés del retículo endoplásmico.

Finalmente, hemos caracterizado los dos

primeros genes que codifican por una nueva

subfamilia de eIF-2α quinazas en

Schizosaccharomyces pombe (SEK1 y

SEK2). Ahora, estamos interesados en

determinar los mecanismos de regulación

y las funciones de estas nuevas eIF-2αquinasas en el control traduccional de

proteínas reguladoras del crecimiento en

células eucarióticas.

Proteínas implicadas en el

reconocimiento y unión del mRNA al

ribosoma durante la iniciación de la

traducción y su papel en el desarrollo y

crecimiento celular.

Las proteínas eIF (eukaryotic initiation factor)

4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B forman parte de

un complejo proteico implicado en el

reconocimiento y unión del mRNA al

ribosoma. Resultados previos de nuestro

laboratorio permitieron el aislamiento y

caracterización de eIF4E y eIF4G de

Drosophila, así como la clonación y

caracterización de los genes

correspondientes, iniciándose el estudio de

su expresión. Recientemente hemos

completado la clonación y expresión durante

el desarrollo de los genes eIF4A y eIF4B.

Actualmente nuestros intereses se centran

en la caracterización bioquímica de los

factores eIF4A y eIF4B de Drosophila y,

especialmente, en el posible papel de eIF4E,

eIF4G, eIF4A y eIF4B en la regulación

traduccional de genes implicados en el

desarrollo de Drosophila. Con este fin

estamos utilizando mutantes defectivos en

cada una de estas proteínas y moscas

transgénicas que las sobreexpresan en

distintas condiciones. También deseamos

detectar mRNAs cuya traducción se active

preferentemente en células en cultivo que

sobreexpresan eIF4E o eIF4G. Con estos

abordajes experimentales esperamos

identificar genes implicados en la regulación

del crecimiento celular y/o en el desarrollo

embrionario, que estén regulados a nivel

de su traducción.


César de Haro, José M. Sierra



Juan José Berlanga


Students:

Mónica Elías, Greco Hernández (hasta

31-Agosto-1999), Saturnino Herrero,

Natalia Pomar

Técnico de Investigación /


José Alcalde

Síntesis de proteínas y su regulación eneucariontes

E.6

98

Expresión de la PERK de Drosophila durante el desarrollo embrionario

(N. Pomar, J.J. Berlanga, S. Campuzano, and C. de Haro)

Expression of Drosophila PERK during embryonic development (N.

Pomar, J.J. Berlanga, S. Campuzano, and C. de Haro)

Protein synthesis and its regulation ineukaryotes

Research Summary

Translational control by eIF-2 α kinases

Four distinct protein kinases regulate

translation in eukaryotic cells by

phosphorylating eIF2α at Serine-51. There

are the heme-regulated inhibitor (HRI);

the interferon inducible RNA-dependent

kinase (PKR); the endoplasmic reticulum

(ER)-resident kinase (PERK) and the

GCN2 kinase. These kinases are

activated by distinct stimuli as follows :

HRI, by heme deficiency; PKR, by the

occurrence of double-stranded RNAs;

PERK, by ER stress and GCN2 of S.

cerevisiae by amino acid deprivation.

Previously, we cloned the GCN2 kinase

from Drosophila (DGCN2) and

demonstrated that its expression is

developmentally regulated.

We have continued with the search for

new members of this family of kinases.

We found the first mammalian GCN2

homolog (MGCN2). Serum starvation

increased eIF2α phosphorylation in

MGCN2-transfected human 293T cells.

Also, we cloned the Drosophila PERK

homolog (DPERK). Expression of DPERK

transcripts is also developmentally

regulated and the endogenous DPERK

activity from Drosophila S2 cells is

sensitive to ER stress. Finally, we have

characterized the first two genes of a new

subfamily of eIF2α kinases from

Schizosaccharomyces pombe (SEK1 and

SEK2). We are now interested in

determining which are the regulatory

mechanisms and the functions of these

novel eIF2α kinases in the translational

control of key growth regulatory proteins

in eukaryotic cells.

Proteins involved in the recognition

and binding of the mRNA to the

ribosome during translation initiation

and their role on development and cell

growth.

The proteins eIF (eukaryotic initiation

factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B are part

of a protein complex involved in the

recognition and binding of the mRNA to

the ribosome. Previous results from our

laboratory led to the isolation and

characterization of eIF4E and eIF4G from

Drosophila, as well as the cloning and

characterization of the corresponding

genes, beginning the study of their

expression. Recently, we have finished

the cloning and expression during

development of the genes eIF4A and

eIF4B. At present, our aims are the

biochemical characterization of Drosophila

eIF4A and eIF4B factors and, especially,

the study of the possible role of eIF4E,

eIF4G, eIF4A y eIF4B on the translational

regulation of the genes involved in

Drosophila development. To this end, we

are using mutants lacking each of these

proteins and transgenic flies

overexpressing them at different

conditions. Also, we want to detect

mRNAs whose translation is preferentially

activated in culture cells overexpressing

eIF4E or eIF4G. Based on these

experimental approaches, we hope to

identify genes involved in cell growth

regulation and/or embryonic development

regulated at the translational level.

99


Berlanga, J.J., Santoyo, J., and de Haro, C. (1999)

Characterization of a mammalian homolog of the GCN2

eukaryotic initiation factor 2α kinase. Eur. J. Biochem.

265, 754-762

Muñoz, F., Martín, M. E., Manso-Tomico, J., Berlanga,

J. J., Salinas, M., and Fando, J. L. (2000) Ischemia-

induced phosphorylation of initiation factor 2 in

differentiated PC12 cells. Role for initiation factor 2

phosphatase. J. Neurochem. 75, 2335-2345

Tesis Doctorales/ Doctoral theses

Greco Hernández Ramírez: “Estructura y expresión de

los genes de Drosophila de los factores de iniciación de

la traducción involucrados en la unión del mRNA al

ribosoma”. Universidad Autónoma de Madrid. 1999.

Calificación: Apto cum laude.

Saturnino Herrero: "Clonaje y caracterización de nuevas

eIF2α quinasas reguladas por hemina". Universidad

Autónoma de Madrid. 2000. Calificación : Sobresaliente

cum laude.




Se ha continuado el estudio del cluster

pur, determinante de la ruta de biosíntesis

de puromicina en Streptomyces alboniger.

El gen pur4 se ha comprobado que

participa en la ruta biosintética mediante

deleción y complementación génicas. Se

supone que su producto introduce un

grupo –NH2 en la posición 3’ de la

adenosina para dar lugar a 3’-amino-3’-

desoxiadenosina. De acuerdo con esto,

un mutante pur4- produce puromicina al

ser complementado por 3’-amino-3’-

desoxiadenosina. El gen pur6 de este

cluster determina un producto (Pur6) que

participa en esta ruta biosintética, como

se ha demostrado por deleción y

complementación génicas. Pur6 se ha

expresado en Escherichia coli, con una

solubilidad muy limitada, y en

Streptomyces lividans. Se ha demostrado

que es una sintetasa del tipo de las

péptidosintetasas no ribosómicas, ya que

lleva a cabo la unión de 3’-amino-3’-

desoxiadanosina y tirosina formando un

enlace amida entre los grupos 3’-amino y

carboxilo de estos dos precursores,

respectivamente. Esta reacción da lugar

al esqueleto carbonado de puromicina

(tridesmetilpuromicina). Sin embargo,

Pur6 también es capaz de realizar esta

misma unión pero utilizando N6,N6-dimetil-

3’-amino-3’-desoxiadenosina como

sustrato. En este caso se obtiene O-

desmetilpuromicina, un intermediario que

se supone derivado de

tridesmetilpuromicina. Esta relativamente

baja especificidad no es sorprendente

dentro de los enzimas biosintéticos de

antibióticos. Ambas reacciones requieren

ATP y Mg2+, como es característico de las

péptidosintetasas. En relación al cluster

de biosíntesis del nucleósido A201A,

relacionado químicamente con

puromicina, de Streptomyces capreolus

se ha completado la secuenciación del

posible cluster génico a201A. Esto ha

permitido establecer una hipotética ruta

de biosíntesis de este antibiótico.

En relación a la biosíntesis de puromicina

en cultivos de S. alboniger, se ha

comprobado que el fosfato desreprime la

represión de esta biosíntesis inducida por

glucosa.

En relación a levaduras se han terminado

los proyectos EUROFAN I y II,

estudiándose la funcionalidad de una

variedad de ORFs de función

desconocida. Además se ha continuado la

preparación de levaduras industriales con

capacidad amilolítica y obtenido

organismos panaderos con este fenótipo.

Se ha estudiado la actividad del promotor

del gen SWA2 de Schwanniomyces

occidentalis en S. cerevisiae y analizado

su regulación por fuente de carbono. En la

secuencia de este promotor se han

localizado dos motivos implicados en

represión catabólica, no reconocidos por

la proteína Mig1 de S. cerevisiae. Se ha

aislado y secuenciado el gen de

Schwanniomyces occidentalis homólogo

a Mig1 de S. cerevisiae.

Jefe de Línea / Group leader:

Antonio Jiméndez

Personal Científico /

Scientific Personnel:

María Fernández-Lobato



Eloísa Sanz Martínez,

Natalia Martínez Romero (hasta Junio

2000)


Students:

Juan Alva Rabanal (hasta Octubre

2000),

Teresa A. Carmona,

Dolores Marín Alberdi (hasta Julio 2000,

Irene Saugar Gómez,

Mercedes Tiemblo (hasta Julio 2000)

Tecnicos de Investigación /


Bárbara Asunción Martín Redondo

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

María Josefa Elena Fernández-

Fernández

Expresión génica en Streptomyces y levadurasE.7

100

Gene expression in Streptomyces and yeast

Research Summary

The study of the pur cluster, which

determines the biosynthetic pathway of

the puromycin antibiotic in

Streptomyces alboniger, was continued.

Gene deletion and complementation

experiments proved that the pur4 gene

is implicated in this pathway. It was

hypothesized that the Pur4 enzyme

catalyzes the linking of a –NH2 group to

the 3’ position of adenosine to produce

3’-amino-3’-deoxyadenosine. Indeed,

cultures of a pur4- mutant produced

puromycin in the presence of 3’-amino-

3’-deoxyadenosine. Similarly to pur4,

the pur6 gene was shown to determine

an ezyme of the pathway. The Pur6

enzyme was expresed in Escherichia

coli as a poorly soluble His-tailed protein

and in Streptomyces lividans. It links 3’-

amino-3’-deoxyadenosine and tyrosine

by forming an amide bond between the

3’-amino and the carboxyl group of

these two intermediaries, respectively,

giving rise to the carbon backbone of

puromycin (tridemethylpuromycin). In

addition, Pur6 is able to perform this

bond by using N6,N6-dimethyl-3’-amino-

3’-deoxyadenosine as a substrate. This

renders O-demethylpuromycin, an

intermediary presumed to derive from

tridemethylpuromycin. This relatively

low specificity of Pur6 is not unfrequent

in enzymes of secondary metabolism.

Both rections require ATP and Mg2+ as

it is characteristic of non ribosomal

aminopeptidases. Therefore, it was

concluded that Pur6 pertains to this

group of enzymes.

Sequencing of the a201a cluster, which

encodes the A201A biosynthetic

pathway from Streptomyces capreolus,

was completed. This has permitted to

propose a hypothetical biosynthetic

pathway for A201A. This

aminonucleoside antibiotic is chemically

related to puromycin. Indeed, a201a

contains all the genes encoding the

common biosynthetic moiety, N6,N6-

dimethyl-3’-amino-3’-deoxyadenosine,

between both drugs. Moreover, three of

the homologous genes (pur4, pur5 and

pur10) from S. capreolus complement

the relevant mutants from S. alboniger.

On a different subject, the glucose-

induced repression of puromycin

biosynthesis by S. alboniger, was

shown to be derepressed by phosphate.

This finding widen up initial results on

this repression.

Concerning yeasts, the EUROFAN I and

II projects of the EU were ended.

The functionality of a variety of ORFs of

unknown function was studied.

Furthermore, the preparation of

industrial yeasts with amylolytic function

was pursued and baker’s yeast strains

expressing this phenotype were

obtained. Activity of Schwanniomyces

occidentalis SWA2 gene promoter as

expressed in S. cerevisiae was studied

and its regulation by the carbon source

analysed. It carries two motives, which

could be implicated in catabolic

repression. However, they are not

recognized by the Mig1 protein from

Saccharomyces cerevisiae. A

Schwanniomyces occidentalis gene

which is homologous to Mig1 from S.

cereisiae was cloned.

101


L. del Pozo, L. Osaba, J. Corchero and A. Jiménez.

(1999). “A single nucleotide change in the MNR1

(VCX1/HUM1) gene determines resistance to

manganese in Saccharomyces cerevisiae”. Yeast, 15,

371-375

S. Zúñiga, J. Boskovic, A. Jiménez, J. P. G. Ballesta and

M. Remacha. “Disruption of six Saccharomyces

cerevisiae novel genes and phenotypic analysis of the

deletants”. YEAST 15, 945-953 (1999).

S. Zúñiga*, J. Boskôvic*, A. Jiménez, J. P. G. Ballesta

and M. Remacha (1999). “Deletion of twenty four ORFs

from chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae

and phenotypic analysis of the deletants”. GENE 233,

141-150 *Estos dos autores contribuyeron igualmete a

este trabajo.

J. C. Espinosa, M. A. Rubio, E. Fernández, J. A. Tercero

and A. Jiménez. (1999). “The pur7 gene from the

puromycin biosynthetic pur cluster of Streptomyces

alboniger encodes a nudix hydrolase”. J. Bacteriol. 181,

4914-4918.


Irene Saugar Gómez. “Caracterización del clúster

génico a2a de la ruta biosintética del antibiótico A201A

de Streptomyces capreolus”. Universidad Autónoma de

Madrid. 2000. Apto Cum Laude.

Teresa de los Ángeles Carmona Delgado. “Estudio de

la actividad del promotor del gen SWA2 de

Schwanniomyces occidentalis expresado en

Saccharomyces cerevisiae. Regulación por fuente de

carbono”. Universidad Autónoma de Madrid. 2000. Apto

cum Laude.




Nuestro objetivo es el estudio de los

mecanismos moleculares de la acción de

las hormonas esteroides así como de la

hormona polipeptídica prolactina.

Regulación por hormonas esteroides

del gen de la uteroglobina (UG).

El gen de uteroglobina (UG) se expresa

en varios tejidos del conejo y de otros

mamíferos. En cada tejido el gen es

regulado específicamente por una

determinada hormona, entre las que están

los glucocorticoides, la progesterona y los

estrógenos. Un elemento de respuesta a

estrógenos (ERE) y varios posibles

elementos de respuesta a

glucocorticoides/progesterona

(GRE/PRE) se han observado en el

promotor a –0,26 Kb y a 2,6 Kb

respectivamente. Varios estudios han

demostrado que todos esos elementos de

respuesta pueden ser modulados por

otros factores de transcripción que se

unen a diferentes sitios en el promotor de

ug. Nosotros nos hemos centrado de

varias E-box (sitios de unión de factores

de transcripción HLH) presentes en el

promotor. Nuestros estudios indican que

una de esas E-box, localizada cerca de la

TATA-box, une dos factores nucleares y

que ese elemento parece ser importante

en la determinación de la expresión

específica de tejido del gen ug. Nuestros

estudios también indican que otra E-box

es necesaria para la adecuada inducción

del gen por estrógenos. Nosotros también

investigamos la actividad de los GRE/PRE

del gen de ug en el contexto de diferentes

promotores. Los resultados indican que la

estructura de los promotores es de gran

importancia para la respuesta hormonal.

Mecanismos moleculares de la acción

de la prolactina.

La hormona polipeptídica prolactina (PRL)

ejerce numerosos efectos en múltiples

células blanco, incluyendo la estimulación

del crecimiento y la diferenciación. Uno de

nuestros objetivos es entender los

mecanismos moleculares que envuelven

la proliferación celular inducida por PRL.

Nuestros resultados indican que este

efecto esta mediado a través de la

activación de sitios AP-1. Esta activación

es debida a un incremento en el contenido

de c-Jun de los complejos

transcripcionales AP-1. La proliferación

inducida por PRL de células epiteliales

mamarias esta inhibida por

glucocorticoides con un decrecimiento

concomitante del contenido de c-Jun. La

regulación del sitio AP-1 parece ocurrir a

través de una activación dependiente de

PRL de la quinasa de c-Jun (JNK),

mientras que los glucocorticoides

previenen la activación de JNK. Así, la

proliferación celular inducida por PRL,

parece ocurrir por la activación de JNK,

que a su vez activa los elementos

transcripcionales de un sitio de unión AP-

1 y este proceso es inhibido por

glucocorticoides de una manera no

dependiente de la unión a DNA.


Antonio Nieto


Staff:

J. Predestinación García-Ruiz



Marta Riffo, Eva Obregón


Students:

Aparicio Aguilar,

Karla Solorzano,

Henry Rivera,

Isabel Olazábal,

Samuel Ogueta

Técnico de Investigación /


Carlos García

Regulación de la actividad genética porhormonas

E.8

102

Estructura esquemática de la uteroglobina.

Hormonal regulation of gene expression

Research Summary

Our aim is the study of the molecular

mechanisms of action of steroid

hormones as well as of the polypeptide

hormone prolactin.

Steroid hormone regulation of the

uteroglobin (UG) gene.

The UG gene is expressed in several

tissues of the rabbit and other

mammals. In each tissue a determined

hormone, including glucocorticoids,

progesterone and estrogens,

specifically regulates the gene. An

estrogens response element (ERE) and

several putative glucocorticoid/

progesterone response elements

(GRE/PRE) have been observed in the

promoter at -0,26 Kb and -2,6 Kb,

respectively. Several studies have

demonstrated that all these response

elements can be modulated by other

transcription factors that bind at different

sites in the ug promoter. We have

focused on several E-box (binding sites

for HLH transcription factors) present in

the promoter. Our studies indicated that

one of these E-box, located close to the

TATA-box, bind two nuclear factors and

that element appear to be important in

determining the tissue-specific

expression of ug. Our studies also

indicated that other E-box is necessary

for an adequate induction of ug by

estrogens. We are also investigating the

activity of the GRE/PRE of ug in the

context of different promoters. The

results indicate that the structures of the

promoters are of great importance for

the hormonal response.

Molecular mechanisms of action of

the prolactin.

The polypeptide hormone prolactin

(PRL) exerts numerous effects on

multiple target cells, including

stimulation of growth and differentiation.

One of our goals is to understand the

molecular mechanisms involved in the

PRL-induced cell proliferation. Our

results indicate that this effect is

mediated through activation of AP-1

sites. This activation is due to an

increase in the c-Jun content of AP-1

transcriptional complexes. The PRL-

induced proliferation of mammary

epithelial cells is inhibited by

glucocorticoids with a concomitant

decrease of c-Jun content. The

regulation of the AP-1 site appears to

occur through a PRL-activation of c-Jun

kinase (JNK) while glucocorticoids

prevent the activation of JNK. Thus,

PRL-induced cell proliferation appears

to occur by activation of JNK that, in

turn, activates the transcriptional

elements of an AP-1 binding site and

this process is inhibited by

glucocorticoids in a DNA-binding

independent manner.

103


Ogueta, S., Olazabal, I., Santos, I., Delgado-Baeza, E.

and García Ruiz,J.P. (2000). Transgenic mice

expressing bovine GH develop arthritic disorder and

self-antibodies. J. of Endocrinology. 165, 321-328

Olazabal, I., Muñoz, J., Ogueta, S., Obregón, E., and

García-Ruiz, J.P. (2000). Prolactin (PRL)-PRL receptor

system increases cell proliferation involving JNK (c-Jun

amino terminal kinase) and AP-1 activation: inhibition

by glucocorticoids. Mol. Endocrinology. 14, 564-575

Riffo, M. and Nieto, A. (1999). Lysophosphatidylcholine

induces changes in physicochemical, morphological,

and functional properties of mouse zona pellucida: a

possible role of phospholipase A2 in sperm-zona

pellucida interaction. Mol. Reprod. Dev. 53, 68-76

García, C. and Nieto, A. (1999). Two progesterone-

dependent endometrial nuclear factors bind to an E-box

in the rabbit uteroglobin gene promoter: involvement in

tissue-specific transcription. Arch. Biochem. Biophys.

362, 301-308


Isabel Olazabal Olarreaga: “ Efecto proliferativo de la

prolactina en células epiteliales y sus mecanismos

moleculares.” Universidad Autónoma de Madrid. 1999.

Calificación: Sobresaliente cum laude.

Samuel Ogueta Villarreal: “ Nuevo sistema regulador de

los tejidos articulares de la rodilla humana y murina.

Regeneración del cartílago articular.” Universidad

Autónoma de Madrid. 2000. Calificación: Sobresaliente

cum laude.

Schematic structure of uteroglobin.




Nuestro objetivo es el esclarecimiento en

cromatina de las relaciones básicas entre

estructura y función transcripcional,

utilizando para ello moldes

oligonucleosómicos definidos, ensamblados

sobre DNA con secuencias posicionantes

de nucleosomas regularmente espaciadas,

y un sistema sencillo y eficiente de

transcripción in vitro. Antes de 1999,

estudiamos los efectos sobre la

transcripción de la ausencia de los dímeros

H2A·H2B y los producidos por la acetilación

o la eliminación de los dominios histónicos

terminales. Durante los últimos dos años,

hemos investigado cómo se afecta la

elongación de las cadenas de RNA al

incorporarse a los moldes

oligonucleosómicos las histonas H1/H5,

las cuales interaccionan con el DNA

espaciador estabilizando la fibra de 30 nm.

La unión de H1/H5 podría afectar la

eficiencia transcripcional a tres niveles:

nucleosomas individuales, fibra de 30 nm

y agregados de las cadenas

oligonucleosómicas.

Para investigar estas posibilidades, se

determina paralelamente el grado de

compactación y la eficiencia transcripcional

de los distintos moldes en condiciones

salinas apropiadas para obtener diferentes

niveles de plegamiento. La formación de la

fibra de 30 nm requiere un nivel alto de

ocupación de las secuencias posicionantes.

Como la presencia de cada octámero de

histonas inhibe parcialmente el proceso de

elongación, el molde de DNA con 18

secuencias posicionantes anteriormente

empleado es inadecuado para estudiar el

efecto sobre la transcripción de la fibra de

30 nm, ya que la ocupación por octámeros

de 15 de las 18 secuencias posicionantes

inhibe totalmente la sintesis de RNA.

Para evitar este problema, se han empleado

especies de DNA semejantes a la ya

utilizada pero con solo 8 y 12 secuencias

posicionantes. En contra de lo inicialmente

esperado, la incorporación de H5 en las

cadenas oligonucleosómicas no parece

afectar la eficiencia de éstas como moldes

de transcripción, ni siquiera cuando H5

estabiliza la fibra de 30 nm.


Enrique Palacián


Francisco Hernández

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

Santiago Arenas,

Miguel Ángel Sánchez

Estudiante / Students :

Gonzalo Gómez

E.9

104

Estructura cromatínica y transcripción

Chromatin structure and transcription

Research Summary

The purpose of our research is to

elucidate the relationships between

chromatin structure and transcriptional

function. To accomplish this goal we use

defined oligonucleosome templates,

assembled on DNA containing regularly

spaced nucleosome positioning

sequences, and a simple and efficient in

vitro transcription system. Prior to 1999

we studied the effects on transcription

caused by the absence of H2A·H2B

dimers, and by acetylation or elimination

of the histone tail domains.

During the last two years, our group has

investigated how elongation of RNA

chains is affected by the incorporation of

histones H1/H5 into oligonucleosome

templates. H1/H5 bind to the linker DNA

stabilizing the 30-nm fiber. Binding of

H1/H5 might affect the transcriptional

efficiency of the templates at three

different levels: individual nucleosomes,

30-nm fiber, and aggregates of

oligonucleosomal chains. To investigate

these posibilities, the degree of

compaction and the transcription efficiency

of oligonucleosome templates were

determined in paralell under the salt

conditions required to obtain different

compaction levels. Formation of the 30-

nm fiber requires a high level of

occupancy of the positioning sequences,

and the binding of each histone octamer

partially inhibits the elongation process.

Therefore, the DNA template with 18

positioning sequences, which was that

previously employed, is unsuitable to

study the effect of the 30-nm fiber on

transcription, since the binding of histone

octamers to 15 of the 18 positioning

sequences totally inhibits RNA synthesis.

To avoid this problem, similar DNA species

with only 8 and 12 positioning sequences

were used. Against the expected results,

incorporation of histone H5 into the

oligonucleosomal chains does not appear

to affect their efficiency as transcription

templates, even when H5 stabilizes the

30-nm fiber.

105


Chirinos, M., Hernández, F., and Palacián, E. (1999)

Transcription of DNA templates associated with histone

(H3·H4)2 tetramers. Arch. Biochem. Biophys. 370, 222-

230




El tema de estudio de la linea es la biología

de la envoltura celular bacteriana, como

principal elemento morfogenético, de

relación con el medio y con otros otros

organismos y como sitio de acción de

agentes antibacterianos. En este contexto

nuestro trabajo se centra en los siguientes

aspectos:

a) Morfogénesis de Escherichia coli y

Salmonella typhimurium; Continuamos

nuestros estudios sobre la generación y

función de regiones topologicamente

diferenciadas en el sáculo y en la membrana

externa de la bacteria. Hemos demostrado

la existencia de regiones de larga vida

media y metabolicamente inertes en ambas

estructuras cuya génesis esta asociada al

fenómeno de división celular. Estamos

estudiando las bases estructurales y

metabólicas de las heterogeneidades asi

como su relevancia en la morfogénesis

bacteriana.

b) Adaptaciones y participación de la

envoltura bacteriana en la colonización de

células eucarióticas, y establecimiento de

estados de persistencia, por Salmonella

typhimurium. La envoltura celular de S.

typhimurium sufre cambios estructurales

radicales durante las primeras etapas del

proceso de colonización de células

eucarióticas, fenómeno base de la

patogenia de dicho organismo. Estamos

estudiando la relevancia de tales fenómenos

en la progresión de la infección, en la

multiplicación intracelular y en la capacidad

de persistencia de S. typhimurium. También

estamos estudiando la participación en

dichos procesos de una ámplia serie de

enzimas relacionadas con el metabolismo

del sáculo que se caracterizan por su

redundancia y dispensabilidad en cultivos

in vitro.

c) Cambios adaptativos en la estructura y

enzimología del sáculo de Helicobacter

pylori asociados a la generación de formas

cocoides. H. pylori sufre un drástico cambio

morfológico y fisiológico en respuesta a

condiciones de estress que implica la

generación a partir de bacterias con

morfología helicoidal de unas formas

cocoides, que posiblemente representan

una forma de resistencia asociada a la

transmisión del patógeno. Anteriormente

hemos demostrado cambios sustanciales

en el metabolismo de la pared reminiscentes

de los descritos en la esporulación de

Bacillus. Estamos estudiando la enzimología

del proceso, y la posibilidad de explotar la

singularidad de las reacciones para el

desarrollo de antibacterianos de alta

especificidad.


Miguel Angel de Pedro Montalban


Francisco García del Portillo



Graciela Pucciarelli Morrone.

Ana Dopazo González.

Ana María Alonso.

Antonio Cebriá.

Amparo Haro Castuera.

Silvia Gutierrez Erlandsson.


Students:

Katysulla Costa

Marina Martínez-Moya.

María José Rodríguez. Miguel Angel

Serrano Melgar


Assistance:

Juliana de la Rosa (1999)

Nuria Gómez López.

Maria Teresa Villalba Villacorta

E.10

106

Envolturas celulares

Demostracion de heterogeneidades topológias durante el crecimeinto del sáculo en

un mutante amiABC de S. typhimurium. Rojo: regiones inertes. Verde: regiones de

inserción zonal de precursores. Amarillo: regiones de inserción difusa de precursores.

Cell envelopes

Research Summary

The research topic of the group is the

biology of the bacterial cell envelope, as

the main element in morphogenesis and

relation with both the environment and

other organisms, and as site of action of

antibacterial agents. Our investigations

are focused on the following directions:

a) Morphogenesis of Escherichia coli; we

continue our investigations on the

generation and function of topologically

differentiated regions in the bacterial

sacculus and outer membrane. The

existence of long lived, metabolically

inert regions in both structures has been

positively demonstrated. Generation of

such regions is intimately linked with

bacterial division. At present we are

working on the structural and metabolic

basis of the heterogeneity as well as on

the evaluation of its relevance for bacterial

morphogenesis.

b) Adaptive modifications and involvement

of Salmonella typhimurium bacterial

envelope in eukaryotic cell colonization,

and in the establishment of the

persistence state. S. typimurium cell

envelope is severely modified during the

early stages of eukaryotic cell colonization,

a key process for Salmonella

pathogeneicity. We are currently

investigating the relevance of envelope

alterations for the outcome of the infection,

for intracellular proliferation and for the

persistence ability of S. typhimurium. The

possible involvement on S. typhimurium

pathogeneicity of cell wall metabolizing

enzymes is also under study.

c) Adaptive modifications in the structure

and enzymology of Helicobacter pylori

sacculus associated to the generation of

coccoid forms. Under stress conditions

H. pylori undergoes a morphological

transition from the vegetative spiral form

into a coccoid shape. Coccoid cells may

represent a resistance form mediating

transmission and spreading of the

pathogen. We have shown that during

the transition the cell wall is substantially

modified in a way reminiscent in some

aspects of endospore formation in

Bacillus. At present we are studying the

enzymology of the process, and the

possibility to exploit the uniqueness of

the process to search for high specificity

antibacterials.

107


García-del Portillo, F., M.G. Pucciarelli, y J. Casadesús

(1999). DNA methylase mutants of Salmonella

typhimurium show defects in protein secretion, cell

invasion, and M cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 96:11578-11583.

García-del Portillo, F. (1999). Pathogenic interference

with host vacuolar trafficking. Trends in Microbiology

7:467-469.

Hilbert, F., F. García-del Portillo y E.A. Groisman. (1999).

A periplasmic D-alanyl-D-alanine dipeptidase in the Gram

negative bacterium Salmonella enterica. J. Bacteriol.

181:2158-2165.

Costa, K., G. Bacher, G. Allmaier, M.G. Domínguez-Bello,

L. Engstrand, P. Falk, M.A. de Pedro, y F. García del

Portillo. (1999) The morphological transition of

Helycobacter pylori cells from spiral to coccoid is preceded

by a substantial modification of the cell wall. J. Bacteriol.

181:3710-3715.

Quintela, J.C., P. Zöllner, F. García del Portillo, G. Allmaier,

y M.A. de Pedro. (1999) Cell wall structural divergence

among Thermus spp. FEMS Microbiol. Lett. 172:223-

229.

Quintela,J.C.; F.G. del Portillo; E. Pittenauer, G. Allmaier,

de Pedro,M.A.(1999) Peptidoglycan fine structure of the

radiotolerant bacterium Deinococcus radiodurans Sark.

J. Bacteriol. 181:334-337


Martinez-Moya, M. (1999). “Estudio del fenómeno de

persistencia intracelular de Salmonella typhimurium en

células eucariotas no fagocíticas”. Tesis Doctoral.

Marzo 1999. Universidad Autónoma de Madrid.

Ilustration of topological heterogeneities in growing sacculi of an amiABC S. typhimurium

mutant strain. Red: Inert regions. Green: zonal insertion of new precursors. Yellow:

diffusse insertion of precursors.


Los objetivos principales de esta línea de

investigación consisten en la caracterización

de los genes implicados en distintas

enfermedades metabólicas, sus variantes

alélicas y el efecto de las mismas sobre la

relación estructura-función de las enzimas

codificadas.

Durante este periodo se ha continuado con

el estudio de las bases moleculares de la

fenilcetonuria (PKU), ampliando el estudio

epidemiológico a distintas regiones

españolas y a otras poblaciones, analizando

la relación fenotipo-genotipo y desarrollando

la metodología necesaria para expresar

mutaciones en sistemas eucariotas y

procariotas que permitan definir qué

mutaciones afectan al plegamiento,

ensamblaje y estabilidad de la proteína

PAH. Otros abordajes experimentales

aplicados con éxito han sido los ensayos

de doble híbrido para estudiar la interacción

entre subunidades PAH y ensayos de pulso-

caza en sistemas libres de células

(transcripción-traducción acopladas) para

estudiar la estabilidad de las proteínas

mutantes. Estos estudios se complementan

con el análisis estructural y modelado

molecular de las mutaciones en las

estructuras cristalinas disponibles de las

formas activas de la PAH.

Asimismo, se ha continuado con el análisis

genético de la acidemia propiónica,

identificando mutaciones en los genes

implicados PCCA y PCCB. El análisis de

la correlación genotipo-fenotipo ha permitido

asociar la presencia de determinadas

mutaciones que se pueden predecir como

nulas funcionalmente, con la forma más

severa de la enfermedad, mientras que

algunas mutaciones de cambio de

aminoácido tienden a estar relacionadas

con la presentación tardía (más suave) de

la enfermedad. Por otra parte, se ha

analizado el efecto de mutaciones PCCA

y PCCB mediante distintos sistemas

(síntesis in vitro e importe mitocondrial,

doble híbrido) demostrando un defecto de

estabilidad intramitocondrial para la

mutación PCCA M348K y delimitando la

región carboxilo terminal de la proteína

PCCB implicada en la interacción

homomérica β−β.

En el último año se han caracterizado las

bases moleculares de la 3-metil-crotonil

glicinuria, identificando los dos genes

implicados mediante búsquedas

bioinformáticas (BLAST) en las bases de

datos públicas, clonaje de los cDNAs

humanos candidatos, caracterización de la

estructura genómica de ambos genes e

identificacón de mutaciones en pacientes.


Magdalena Ugarte


Mª José García Muñoz,

Begoña Merinero,

Belén Pérez,

Celia Pérez-Cerdá,

Pilar Rodríguez-Pombo,

Lourdes Ruiz Desviat.



Silvia Muro ,

Pedro Ruiz Sala.


Students:

Margarita Castro,

Sonia Clavero Alejandra Gámez, Jon

A. Gangoiti,

Fernando García,

Mª Angeles Martínez,

Angel L. Pey


Assistance:

Mª Jesús Ecay,

Mar Infante,

Rocío Martín,

Rosa Navarrete,

Ascensión Sánchez,

Paloma Sanz.

E.11

108



Bases Moleculares de las EnfermedadesMetabólicas

Molecular basis of metabolic diseases

Research Summary

The main research interests are the

characterization of genes involved in

metabolic diseases and of their variant

alleles and the effect on the structure-

function relationship of the encoded

enzymes.

During this period we have continued with

the study of the molecular basis of

phenylketonuria (PKU), characterizing

the mutational spectrum of different

Spanish regions and other populations,

analyzing the genotype-phenotype

correlations and setting up the techniques

for the expression of mutations in

eukaryotic and prokaryiotic systems which

allow us to define those mutations

affecting folding, assembly and stability

of the PAH protein.Two-hybrid assays

analyzing the interactions between

subunits and pulse-chase experiments in

cell-free systems (coupled transcription-

translation) to study mutant protein stability

have also been successfully performed.

All these studies are completed with the

structural analysis and molecular

modelling of the mutations on the available

crystal structures of the active PAH forms.

We have also progressed on the genetic

analysis of propionic acidemia, identifying

mutations in the two genes involved,

PCCA and PCCB. The study of the

genotype-phenotype correlation has

revealed that certain potentially null

mutations are associated with the most

severe form of the disease, while some

missense mutations are associated with

a late presentation (mild form) of the

disease.We have also analyzed the effect

of PCCA and PCCB mutations in different

systems (in vitro synthesis and

mitochondrial import, two hybrid assays),

demonstrating a defect in

intramitochondrial stability for the M348K

PCCA mutation, and the involvement of

the carboxy-terminal region of PCCB in

the homomeric β−β interaction between

beta subunits.

During the last year we have

characterized the molecular basis of 3-

methyl-crotonyl glicinuria, identifying the

genes after bioinformatic searches

(BLAST) in public databases, cloning the

human candidate cDNAs, characterization

of the genomic structure of both genes

and identification of mutations in patients.

109


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Tesis Doctorales/ Doctoral theses

Silvia Muro Galindo “Caracterización molecular delgen PCCB. Análisis y expresión de mutacionescausantes de Acidemia Propiónica”. UniversidadAutónoma de Madrid. Sobresaliente “Cum Laude”.




Nuestro equipo tiene centrado su interés,

desde su creación como línea

independiente, en el análisis, bajo

diversas aproximaciones moleculares, de

dos importantes procesos celulares en

bacterias, como son la septación durante

la división celular, y la aparición de los

diversos mecanismos de resistencia a

antibióticos β-lactámicos. Una gran parte

de los enzimas implicados en estos

procesos se encuentran agrupados en un

cluster denominado dcw (division and cell

wall), donde se incluyen, entre otros, los

genes mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3),

ftsW y ftsZ. El estudio de la regulación de

la expresión de estos genes del cluster y

la determinación funcional de MraW en

Escherichia coli son dos aspectos que

hemos desarrollado en este periodo.

Además, hemos ampliado el estudio a una

serie de estirpes patógenas en humanos y

de interés medioambiental, tales como

Shigella, Salmonella, Pseudomonas,

Mycoplasma y Thermus, con vistas a ser

utilizados como dianas para la búsqueda y

desarrollo de nuevos antimicrobianos

La proteína FtsZ es un componente

esencial del anillo septal para la división

bacteriana. Este anillo, con estructura que

presenta analogías al citoesqueleto

eucariota, parece ser un componente

universal para el mecanismo de división.

Dado que Acholeplasma laidlawwii tiene

todas las características de la célula

procariota mínima y algunos de los

procesos de las bacterias con envoltura,

es un modelo prometedor para el estudio

de los principios básicos del proceso de

división. En este periodo hemos iniciado el

estudio de esta proteína en este

microorganismo.

Tras la publicación de la secuencia

completa del genoma de Escherichia coli

se ha hecho patente la presencia de

genes parálogos para las PBPs no

previamente identificados por estudios

bioquímicos. Uno de estos genes codifica

para la β-lactamasa cromosómica de tipo

C (ampC), que no está presente en

Salmonella, en contraste con otros

miembros de la familia

Enterobacteriaceae, como Escherichia,

Citrobacter, o Enterobacter. Hemos

analizado esta proteína desde el punto de

vista génetico, enzimático y fisiológico, y

encontrado evidencia de la actividad

enzimática y de la implicación en el

proceso de invasión celular.

El peptidoglicano septal se sintetiza por la

proteína PBP3, que aporta la actividad

transpeptidasa (crosslinking) asociada a

otra proteína, posiblemente PBP1B, que

aporta la actividad transglicosilasa

(elongación de cadena). A pesar de los

esfuerzos de varios grupos para la

cristalización y determinación de la

estructura de estas proteínas, aun no se

han conseguido resultados positivos. No

obstante hemos avanzado en el

conocimiento de la estructura modular y

funcionalidad de cada dominio.

Los logros esenciales en los dos últimos

años han sido: 1.- Mejor definición como

gen esencial para mraW del cluster dcw

de Escherichia coli. 2.-Identificación de los

productos metilados por la actividad metil-

transferasa de la proteína MraW. 3.-

Caracterización del gen ftsZ de

Acholeplasma laidlawii y de su producto

génico. 4.- Purificación y caracterización

de los dos módulos catalíticos, glicosil-

transferasa y acil-transferasa, de la

proteína PBP1b polimerizadora de

peptidoglicano de la pared de Escherichia

coli. 5.- Análisis del coste biológico que

supone la producción de la proteína AmpC

para la supervivencia intracelular de

Salmonella enterica serotipo Typhimurium

Personal Científico / ScientificPersonnel:Juan Alfonso Ayala Serrano

Becarios Predoctorales /GraduateStudents:Julian Alberto FerrerasGuillermo Cobas PupoJose di ConzaBeatriz Lara ArnaudSilvina Sara DongarráAlfonso Alexander AguileraJenny Dussan Garzón

Técnicos de Investigación /Technical Assistance:Juliana de la RosaJose Manuel Rodríguez VadilloRodrigo Guardián Sevilla

Científicos visitantes / VisitingScientist:Dr. Sergei Borksenious (Academia Rusade Ciencias, San Petersburgo, Rusia)Dr. Gabriel Gutkind (Universidad BuenosAires, Argentina)Bouli Ali Diallo (Universite de Niamey,Niger)Felipe Fernández Cuenca (Universidadde Sevilla)Alma Hernández de Rojas (InstitutoProductos Lacteos, Oviedo)Dr. Claudine Parquet Universite deParis-Sud, Francia)Paz Bellido Armenteros (Universidad deNavarra)Jose Bravo (University of California,Irvine)

E.12

110

División Celular Bacteriana y Resistencia aAntibióticos

Relación de homologías entre las distintas PBPs de Salmonella Typhi. Los números

indican el puntaje obtenido con la utilización del programa BLASTA. La ausencia de

flecha entre dos proteínas indica un valor de E mayor de 2e-10.

Homology relationship among the different PBPs of Salmonella Typhi. The numbers

indicate the radio values obtained by the BLASTA program. Absence of an arrow

between two proteins indicates a value of E higher than 2e-10.

Bacterial Cell Division and AntibioticsResistance

Research Summary

Our main interest, from the initial step as

an independent group, is the analysis under

diverse molecular approaches of two

important cellular processes in bacteria,

i.e. septation during cell division and the

appearance of different resistance

mechanisms to β-lactam antibiotics. Most

of the gene coding for these enzymes

involved on these processes are grouped

in a so called dcw cluster (division and cell

wall), that include, among others, the genes

mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3), ftsW

and ftsZ. The study of the regulation of the

expression of these genes, and the

functional characterization of the MraW

protein has been two aspects with special

emphasis during this period. Also, we have

extended this type of studies to pathogenic

and environmental strains, as Salmonella,

Shigella, Pseudomonas, Mycoplasma and

Thermus, which will allow the search and

development of new antimicrobial agents.

The FtsZ protein is an essential

component of the bacterial cell division

ring. This cytoskeleton-like ring is

believed to be the universal way of

bacterial division. Acholeplasma laidlawii

possesses all features of the minimal cell

and some traits of cell-wall bacteria and

seems to be a promising object for study

of basic principles of the bacterial division

process. In this period we have started

the analysis of this protein in this model

microorganism.

After the complexion of the Escherichia

coli genome sequence, it has become

apparent that some paralogous PBP

genes have not been identified previously

by the biochemical methods. One of

these genes codes for a chromosomal

type C β-lactamase, which is not present

in Salmonella, in contrast with other

members of the Enterobacteriaceae

family, i.e. Escherichia, Citrobacter or

Enterobacter. We have analyzed this

protein from the genetic, enzymatic and

physiological point of view, and we have

found evidence for the enzymatic activity

and the involvement on the cellular

invasion process.

Septal peptidoglycan is synthesized by

the penicillin-binding protein PBP3. This

protein holds the transpeptidase activity

(crosslinking) in the C-terminal domain,

and associates with another protein,

probably PBP1B, which supplies the

transglycosylase activity (chain

elongation). In spite of the big effort of

several groups to crystallize and to

determine the 3D structure of these

proteins, there are no positive results.

However, we have advanced on the

knowledge of the modular structure and

functionality of each domain of both

proteins.

Our main achievements in the last two

years were: 1.-Further characterization of

mraW, as an essential gene at the dcw

cluster of Escherichia coli. 2.-.

Identification of the methylated product

by the methyltransferase activity of the

MraW protein. 3.- Characterization of

Acholeplasma laidlawii ftsZ gene and its

gene product. 4.- Characterization of the

two catalytic, glycosyl transferase and

acyl transferase, modules of the cell wall

peptidoglycan polymerizing penicillin-

binding protein 1b of Escherichia coli. 5-

Analysis of the biological cost of AmpC

production for Salmonella enterica

serotype Typhimurium

111


Carrión M., M. Gómez, R. Merchante-Schubert , S.

Dongarrá and J.A. Ayala*. 1999. mraW, an essential gene

at the dcw cluster of Escherichia coli codes for a

cytoplasmic protein with methyltransferase activity.

Biochimie 81: 879-888.

Kukelova A.V., A. Yu. Malinin, J.A. Ayala* and S.N.

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laidlawii ftsZ gene and its gene product. Biochem. Biophys.

Research Comm. 262(1): 44-49.

Terrak M., T.K. Gosh, J. van Heijenoort, J. Van Beeumen,

M. Lampilas, J. Aszodi, J.A. Ayala, J.M. Ghuysen and M.

Nguyen-Distèche 1999. The catalytic, glycosyl transferase

and acyl transferase, modules of the cell wall peptidoglycan

polymerizing penicillin-binding protein 1b of Escherichia

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Morosini M.I., J.A. Ayala, F. Baquero, J.L. Martínez and J.

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Salmonella enterica serotype Typhimurium. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy. 44(11): 3137-3143.

Tesis Doctorales/ Doctoral Thesis

Título: Actividad transglicosilasa del dominio B de la

penicillin-binding protein 3 y su proteína helper FtsW en

Escherichia coli Beatriz Lara Arnaud, Facultad de

Ciencias, Departamento de Biología Molecular,

Universidad Autónoma de Madrid 1999.

SOBRESALIENTE CUM LAUDE




Durante los dos años anteriores hemos

centrado el trabajo de nuestro grupo de

investigación tanto en aspectos básicos de

la biología de Thermus thermophilus, como

en aplicaciones biotecnológicas de enzimas

y sistemas reguladores de expresión génica

de este organismo. En su vertiente básica,

hemos continuado nuestros estudios sobre

la regulación de la expresión del gen de la

capa S (slpA) y en el análisis del

agrupamineto génico para la respiración

de nitrato (nar), localizado en un plásmido

conjugativo autotransferible.

En el primer tema, hemos determinado

que las proteínas SlrA y SlpM, implicadas

en la regulación transcripcional de slpA,

pueden ser secretadas a través de la

membrana al igual que la proteína que

regulan. También hemos confirmado in vivo

la implicación de secuencias no traducidas

de slpA en su regulación transcripcional

y traduccional mediante el aislamiento de

mutantes de deleción en estas regiones.

Respecto al agrupamiento nar hemos

confirmado la cotranscripción de 7 genes

desde un promotor (Pnar), regulado por

nitrato y anoxia, en vez de los 4 que

aparecen en el resto de los organismos

analizados hasta ahora. Nuestros datos

demuestran que los dos últimos genes del

agrupamiento funcionan como

antiportadores nitrato/nitrito mutuamente

reemplazables in vivo. Actualmente estamos

analizando el posible papel del primer gen

del operón, un citocromo C dihemo

periplásmico, en la regulación por oxígeno

de este promotor.

A nivel aplicado, hemos transferido al sector

privado varias enzimas termoestables

purificadas (chaperoninas, pirofosfatasas,

DNAligasas) y plásmidos de clonaje y/o de

expresión para Thermus sp. Para el

desarrollo de éstos, hemos empleado

replicones autónomos aislados y

caracterizados por nuestro grupo, y

elementos de control de la expresión

obtenidos de los trabajos en biología básica

de T. thermophilus anteriormente

comentados. Uno de nuestros objetivos

prioritarios en este campo consiste en el

desarrollo de sistemas de expresión

termófilos que pudieran ser empleados

como factoría celulares para la expresión

de enzimas termófilas complejas.


José Berenguer


Graduate Students:

Cristina Vallés,

Pablo Castán,

Renata Moreno,

Felipe Cava (desde Octubre del 99),

Olga Zafra (desde Octubre del 99),

Edy Caro (desde Enero de 2000),

Martin Eckar (Noviembre a

Diciembre de 2000).

E.13

112

Biotecnología y genética de bacterias termofilasextremas

Micrografía confocal de los cuerpos multicelulares (MB’s) formados en mutantes de expresión de la capa S.

La detección se llevó a cabo in situ con un sustrato fluorogénico de una fosfatasa alcalina. El interior libre

de células de cada MB es equivalente al espacio periplásmico de bacterias Gram negativas.

Confocal microscopy micrograph of multicellular bodies (MB’s) from S-layer expression mutants of Thermus

thermophilus. The image was obtained by using a fluorescent substrate from thermostable alkaline phosphate

engineered to be overexpressed in the mutant. The intercellular space within each MB is functionally equivalent

to the periplasmic space of Gram negative bacteria.

Biotechnology and genetics of extremethermophilic bacteria

Research Summary

In the last two years we have focused

our work on both, basic research projects

on the biology of Thermus thermophilus,

and biotechnological applications of

enzymes and gene expression systems

for this microorganism. On the basic side,

we have continued our work on the

regulation of the gene encoding the S-

layer protein (slpA) and on the analysis

of the gene cluster for nitrate respiration

(nar), which is included in a self-

transferable conjugative plasmid.

In the first topic, we have demonstrated

that the SlrA and SlpM proteins, which

are implicated in the transcriptional

regulation of slpA, can be secreted

through the membrane as the protein

which expression they regulate does.

Also, we have confirmed the implication

of untranslated sequences of slpA in its

transcriptional and translational regulation

in vivo through the isolation of adequate

deletion mutants.

In relation to the nar cluster, we have

confirmed the co-transcription of 7 genes

from a nitrate and anoxia regulated

promoter (Pnar) instead of the 4 which

are found in all the microorganisms so

far studied. Our data demonstrate that

the last two genes of this cluster function

as nitrite/nitrate antiporters which can

replace each other in vivo. At present, we

are analyzing the putative implication of

the first gene of the nar operon, which

encodes a periplasmic di-heme

cytochrome C, in the regulation by oxygen

of its promoter.

From the applied point of view, we have

transferred to a private company different

thermophilic enzymes (chaperonins,

pyrophosphatase, DNA-ligase) and

plasmids for cloning and/or expression

in Thermus sp. For the development of

these plasmids, we have used

autonomous replicons isolated and

characterized by our group, and elements

for the control of the expression which

were obtained from the basic work above

commented. One of our priority objectives

on this field is the development of a

thermophilic expression system that could

be used as cell factory for the production

of complex thermophilic enzymes.

113


de Grado, M., Castán, P. y Berenguer J. (1999). A

high-transformation efficiency cloning vector for

Thermus thermophilus. Plasmid, 42: 241-245.

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and assembly of regular surface structures in Gram-

negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev, 24: 21-44

Ramírez, S., Moreno, R., Zafra, O., Castán, P., Vallés.

C., y J. Berenguer. (2000). Two nitrate/nitrite transporters

are encoded within the mobilizable plasmid for nitrate

respiration of Thermus thermophilus HB8. J. Bacteriol.

182: 2179-2183




El objetivo general de nuestra línea de

investigación es el estudio a nivel

molecular de la expresión génica

específica de tejido en células humanas.

Nuestro sistema modelo principal lo

constituye el gen humano HGH-N que se

transcribe específicamente en la hipófisis

anterior y que se localiza en el

cromosoma 17q23.3 dentro del locus

"HGH-HPL". A este locus pertenecen

genes que comparten una gran homología

de secuencia pero que se transcriben en

tejido placentario: HGH-V, HPL-3 y HPL-4.

Asimismo, hemos iniciado el estudio de

los mecanismos de restricción especifica

de tejido de otro locus génico humano:

"HLH-HCG", localizado en el cromosoma

19q13.3 y que también presenta un patrón

de expresión tisular semejante: hipófisis

vs placenta. Para ello se están analizando

las regiones promotoras y enhancers de

estos genes, identificando los elementos

que confieren restricción de expresión

específica de tejido, así como la

purificación de los factores de

transcripción que las regulan.

Otra área de desarrollo dentro de nuestra

línea de investigación, es la puesta a

punto de técnicas de análisis de expresión

diferencial de mRNAs: "Differential

Display RT-PCR" y DNA Microarrays" que

nos ha permitido establecer dos nuevos

objetivos:

(1) Identificación y clonaje de genes

específicamente expresados en tumores

hipofisarios humanos, que nos permitirán

profundizar en los mecanismos

moleculares de expresión génica

hipofisaria, así como en el desarrollo de

nuevos marcadores de progresión tumoral

hipofisaria.

(2) Identificación y caracterización de

genes específicamente expresados en

tejido endometrial humano durante la

"ventana" de implantación, para clonar

nuevos genes marcadores de

implantación embrionaria.


José Luis Castrillo Díez



Oscar Jiménez-Mateo


Graduate Students:

Silvia Avila Flores

Olga Bassy Alvarez

Martha Díaz Gallardo

Job García Liévana

Angelina Rodríguez Torres

Marina Romero Prado

E.14

114

Regulación de la expresión génicaespecífica de tejido

DNA Microarrays

El patrón de expresión génica específico en células deendometrio humano, se estudió utilizando sondas cDNAsmarcadas con 33P a partir de RNA total de células deendometrio humano. Los filtros de cDNAs (porción)humanos incluyen duplicados para cada cDNA. Nosotroshemos analizado simultáneamente la expresión de 375genes humanos en endometrio humano receptivo y no-receptivo. Los filtros fueron expuestos (phosphor screen)y mediante análisis densitométrico, se estudió el patrónde expresión génico diferencial.

DNA microarrays

Gene expression profiling using 33P-labeled cDNAprobes prepared from total RNA of human endometrialcells. The Atlas Arrays shown here (portion) includeduplicate spots of each cDNA. We have analyzed thedifferential expression of 375 human cDNAs in receptiveversus non-receptive human endometrium. Themembranes were exposed to a phosphor screen andthe differential gene expression patterns were analyzedby densiometric analysis.

Regulation of the tissue-specific geneexpression

Research Summary

The overall goal of this project is to

study at molecular level the tissue-

specific gene expression in human cells.

Our working model is the human growth

hormone gene (HGH-N) specifically

transcribed in the anterior pituitary and

mapped at chromosome 17q23.3 in the

"HGH-HPL" locus. This is a gene-cluster

with other four closely related genes

(HGH-V, HPL-3 y HPL-4), but

specifically transcribed in placenta

tissue. In addition, we started the study

of the tissue-specific transcriptional

control of the human "HLH-HCG" locus,

located at chromosome 19q13.3, and

also expressed in pituitary or placenta

tissues. We are analyzing the promotor

and enhancer regions, identifying the

cis-DNA elements, and cloning the

transcription factors involved in the

tissue-specific transcriptional control.

A new area of research and

development in our laboratory, is to set-

up new approaches to study differential

expression of mRNAs: DD-RTPCR and

DNA Microarrays techniques. We are

involved in two new goals: (1)

Identification and cloning of genes

specifically expressed in human

pituitary tumours. This approach can

lead us to improve our understanding of

pituitary gene-expression control, and

use this knowledge to develop new

therapeutic agents; (2) Identification of

genes diferentially expressed in

receptive versus non-receptive human

endometrium. Using two cell lines with

extreme receptive phenotype and

screening genome-wide gene

expression using DNA Microarrays and

DD-RTPCR, we are finding new genes

involved in the receptive or non-

receptive status. This approach can

lead us to improve our understanding of

endometrial receptivity and use this

knowledge to optimize it in infertility

patients or to alter it as an interceptive

procedure.

115


Castrillo, J.L. and Barrera-Saldaña,H.A. (1999) "El gen

HGH-N y su regulacion hipofisaria". Ciencia, 1 (4) 333

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Ana Güell Ferré. "El factor de transcripción GHF-1/PIT-

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hormonas". Abril-1999.

Differential display (DD-RT-PCR)

Geles de alta resolución DD-RT-PCR usando RNAstotales extraídos de tumores hipofisarios humanos y

analizados usando diferentes combinaciones de oligosespecíficos y aleatorios. Todas las reacciones DD-PCRsse realizaron y cargaron en duplicado para verificar sureproducibilidad. La representación diferencial de los

cDNSs permite detectar patrones específicos deexpresión génica. Nosotros hemos purificado 120 bandasexpresadas diferencialmente. Un 25% han sido clonadasy secuenciadas. Hemos identificado los genes mediante

análisis informático y estamos en la actualidadprofundizando en los estudios funcionales.

High resolution Differential Display (DD-RT-PCR) gelusing total RNAs from human pituitary tumors, analyzedwith different anchored and arbitary primer pairs. All DD-PCRs are run and loaded on the gel in duplicate to verifypattern reproducibility. Differential display of the cDNA

preparations shows distinct patterns of gene expression.We have currently purified 120 differentially expressedbands. Approximately 25% of them have been cloned

and sequenced. We are identifying the genes by computeranalysis before go forward with functional analysis.




Algunos mRNAs eucarióticos que son

traducidos en condiciones de estrés celular

agudo (apoptosis, infecciones virales, etc.)

contienen en su region 5´ no traducida

elementos que dirigen la entrada del

ribosoma a un codon de iniciación interno,

denominados IRES. Los objetivos de

nuestro grupo se han centrado en 1)

identificar regiones estructurales del IRES

del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y

hepatitis C (HCV) esenciales para su

actividad, 2) identificar interacciones del

IRES con proteínas celulares que reclutan

la maquinaria de traducción a las cercanías

del AUG iniciador, 3) determinar el valor

predictivo de la secuencia del IRES y NS5

en pacientes afectados de hepatitis C con

la respuesta al tratamiento combinado de

interferón y ribavirina, y 4) estudiar el

mecanismo de selección del AUG iniciador

de la traducción dependiente de IRES.

Estos estudios han sido claves para

entender la biología de los elementos IRES,

identificar regiones contra las que dirigir

drogas antivirales, así como potenciar el

uso de IRES en vectores de expresión

bicistrónicos.

La demostración de interacciones terciarias

RNA-RNA entre dominios del IRES de

FMDV in vitro, en condiciones que se

asemejan a las de una infección, tiene

implicaciones biológicas de gran relevancia.

El dinamismo encontrado en la formación

de estos complejos que depende de la

concentración de RNA, de la temperatura

y de las condiciones iónicas del ensayo,

sugiere que la eficiencia de traducción a lo

largo del ciclo infeccioso podría estar

modulada por cambios en la interacción

RNA-RNA entre dominios.

Recientemente hemos mapeado el sitio de

interacción de los factores de iniciación de

la traducción eIF4B y eIF4G en la región

3´ del IRES de FMDV. En particular, la

interacción de eIF4G es esencial para la

actividad del IRES, existiendo una

correlación perfecta entre caída de actividad

y pérdida de la interacción con eIF4G. Con

estos datos hemos propuesto un modelo

(Figura 1) por el que el IRES estaría

conectado directamente con eIF4G, que a

su vez interaccciona con eIF3 y éste con

la subunidad 40S del ribosoma.

JJefe de Línea / Group Leader:

Encarnación Martínez-Salas

Personal científico / Scientific Staff:

Ricardo Ramos Ruiz



Esther Lafuente Duarte

Sonia López de Quinto

(desde enero 2000)


Students:

Sonia López de Quinto

(hasta enero 2000)

Olga Fernández Miragall

Técnicos de laboratorio / Technical

Assistance :

Emilio Cano Cabezas

E.15

116

Iniciación interna de la traducción en mRNAseucarióticos.

Representación esquemática de las interacciones RNA-RNA y RNA-proteína

en el IRES de FMDV. eIF4G, eIF4B, eIF3 y eIF2 corresponden a los factores

de iniciación de la transducción; PTB, polypirimidin binding protein; 40S, la

subunidad pequeña del ribosoma.

Internal initiation of translation in eucarioticmRNAs

Research Summary

A subset of eukaryotic mRNAs which are

translated under acute cellular stress (viral

infections, apoptosis, etc., ) usually contain

long 5´untranslated regions, known as

IRES, involved in directing ribosomal entry

to an internal start codon. The research

interests of our group have been focused

to 1) the study of essential structural

regions in the IRES of foot-and-mouth

disease virus (FMDV) and hepatitis C

(HCV), 2) the identification of RNA-protein

interactions involved in the recruitment

of the translational machinery to the

vicinity of the start codon, 3) to determine

the predictive value of the HCV IRES

sequence as well as the NS5 region with

the response to the combined treatment

of interferon plus ribavirin, and 4) to

identify the parameters affecting start

codon selection in IRES-dependent

translation initiation. The results obtained

have provided new insights into the

biology of IRES elements, including the

identification of key regions that constitute

essential targets for antiviral drugs.

Additionally the understanding of IRES-

mediated translation is crucial to its use

in bicistronic expression vectors.

We have identified long-range RNA

interactions between separated domains

of the IRES in vitro, under conditions

which resemble the viral infection

environment. Complex formation was

dependent upon RNA concentration,

temperature and ionic conditions. The

dynamism observed in these interactions

may be of important biological relevance

to govern translational efficiency during

the changes in ionic conditions observed

along the viral infection cycle.

Recently we have mapped the interaction

site of the eukaryotic initiation factors

eIF4B and eIF4G in the 3´ region of the

FMDV IRES. Interestingly, the eIF4G-

IRES interaction is a key determinant of

IRES activity, as shown by the correlation

between eIF4G interaction and IRES

activity in FMDV IRES mutants. In

agreement with these results we have

proposed a working model to explain

IRES-dependent translation initiation

(Figure 1). In essence, the eIF4G protein

binds directly to the RNA sequence of the

IRES element and to eIF3, which in turn

is linked to the 40S ribosomal subunit.

117


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de Quinto. Enero, 2000. Universidad Autónoma de Madrid.

Schematic representation of RNA-RNA and RNA-protein interactions in the

FMDV IRES. eIF4G, eIF4B, eIF3 and eIF2 depict translation initiation factors;

PTB, the polypirimidin binding protein; 40S, the small ribosomal submit.

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E Regulación de la expresión génica Regulation of gene ... · PDF fileE.12 División Celular Bacteriana y ... Parody, Salvador Iborra, Maxy B. de los ... 246-250 Quijada, L., Soto,