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Du Phénotype au Génotype. Amplification de l’ADNc de la GFP. La Reverse Transcription. Il s’agit de synthétiser le brin d’ADN complémentaire à partir d’une séquence amorce correspondante à la GFP. ARNm total. + amorce. + enzyme: reverse transcriptase. + tampon. - PowerPoint PPT Presentation
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Du Phénotype au Génotype
Amplification de l’ADNc de la GFP
La Reverse TranscriptionIl s’agit de synthétiser le brin d’ADN complémentaire à partir d’une séquence amorce correspondante à la GFP.
ARNm total
+ amorce
+ enzyme: reverse transcriptase
+ tampon
Solution d’ADNc préparée par RT-PCR
PolyChain Reaction
La PCR permet de fabriquer le second brin de l’ADNc par complémentarité. Cependant l’utilisation d’un double brin étant insuffisante, il faut donc le répliquer en grande quantité. Ce processus se déroule en 3 étapes:
-La dénaturation de l’ADNc à 95°
-L’hybridation à 54°
-L’élongation à 72°
Marqueur Contrôle (+) Contrôle (-) PCR (des 4 groupes)
Purification du produit PCR
Le but de cette étape est de séparer l’ADN de sa solution. Il existe 2 techniques: La purification sur gel et le "gene clean"
Marqueur GFP après purification sur gel
L’électrophorèseRésultats : On a obtenu une séquence d’ADN spécifique au caractère fluorescent sous rayons UV.
Marqueur Plasmide non digéré
Plasmide digéré GFP digéréAprès GeneClean
Enzymes utilisés:-Hind III-Bam H1
Plasmide
Plasmide
GFP
Digestion Ligation
Marqueur GFP après purification sur gel
Marqueur Contrôle (+) Contrôle (-)
