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Doctoral Thesis

Thymopoietin oligopeptides: thymotrinan, thymocartin, andthymopentin - intestinal stabilities, permeabilities, and in vivoevaluation of thymocartin containing dosage forms

Author(s): Heizmann, Joachim August

Publication Date: 2002

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-004447149

Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted

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DISS.ETHNO. 14669

ThymopoietinOligopeptides: Thymotrinan,Thymocartin,and Thymopentin- Intestinal Stabilities, Permeabilities,and

In Vivo Evaluationof ThymocartinContaining DosageForms

A dissertation

submittedto the

Swiss FederalInstitute of TechnologyZürich

for the degreeofDoctorof NaturalSciences

Presentedby

JoachimAugustHeizmannPharmacist

born on January 30&, 1968Citizen of Germany

Acceptedon the recommendationof

Prof. Dr. H.P. Merkle, examiner

Prof. Dr. P. Langguth, co-examiner

2002

Abstract

The three Oligopeptides TP3 (thymotrinan; Arg-Lys-Asp), TP4 (thymocartin;Arg-Lys-Asp-Val), and TP5 (thymopentin; Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) are biologicallyactive fragments of the 49 amino acid polypetidethymopoietin (TP). TP3 and TP4 were

undergoing developmentas immunoregulatorytherapeutic agents in humans, whereas a

parenteral dosage form of thymopentin is on the market. A recent study revealed that

orally given TP4 affects TNF-oc plasma levels in rats during septicemia. Other

investigations showed immunoregulating effects of TP peptides after oral gavage in

mice. These immunoregulating properties of peptides are remarkable because the

bioavailabilitiesof many orally applied peptides are rather low due to their enzymaticdegradationand due to their poor permeation properties. In the presentwork, therefore,

the intestinal stabilities and permeabilities of the three peptides were investigated in

order to obtain detailed informationfor the subsequentlyperformeddevelopmentof oral

dosage forms and for their in vivo evaluation in rats.

Colon targeting as means for oral peptide delivery. Chapter I of this thesis

first provides a survey of different strategies to target the colon as release site for oral

dosage forms. Several case histories of colon delivery of therapeutic peptides such as

insulin and calcitonin are presented in the second part of this review. Five different

approaches of colon targeting are presented. The most marketedcolon-targeted dosageforms are based on pH dependent polymers which are designed to be dissolved in the

colon. However, the variabilityof the luminal pH in the small intestine might triggerdrug release before the dosage form enters the colon. The enzymatic and the time-

controlled release of drugs represent more sophisticated approaches which are

influencing the developmentof colonic drug delivery Systems more and more. Even

more recent approaches are based on pressure- or bioadhesion-controlledrelease, but

they need to be further evaluatedin human trials. Colonic delivery of costly peptides is

critical since the colonic permeability of peptides is generally very low. Chemical

peptide modifications, absorption enhancers, and protease inhibitors are promisingpossibilities to increase the colonic permeability, but they must still be shown to be safe

for human use. Furthermore, the animal modeis used in colonic absorptionexperimentsare questionable due to differences in physiology and function between laboratoryanimals and humans. Moreover, high Standard deviations are noticed in colonic

absorption pointing to the difficulties in managing the intersubject absorptionvariabilities.

Intestinal stabilities of the three thymopoietin peptides. In Chapter II the

intestinal stabilities and degradationsof TP3, TP4, and TP5 are investigated. In the

presence of brush border membranevesicles, crude pancreas extract, and evertedringsfrom duodenum, jejunum, ileum, and colon, all peptides were shown to be degradedboth by pancreatic enzymes and brush border aminopeptidases.Degradation clearances

(Cldeg) of TP3, TP4, and TP5 were calculated for a quantitative comparisonof peptidestability. In the presence of crude pancreas extract, there was a rapid degradationof TP5

(Cldeg 17.9 ml/min) in comparison with TP3 and TP4 (Cldeg 0.95 and 0.56 ml/min,

respectively, at 0.2 mM peptide concentration) caused by the cleavage of the C-terminal

tyrosine by carboxypeptidase A, whereas TP3 and TP4 underwent hydrolysis byaminopeptidase N. In the presence of brush border membrane vesicles, the degradationclearances were 3.9, 3.1, and 2.4 ml/min at 0.2 mM concentrations of TP4, TP5, and

TP3, respectively. The clearance of all peptides was lowered with increasing peptideconcentrations, indicating saturable degradation processes. The degradation of the

thymopoietin Oligopeptides in the presence of brush border membrane enzymes was

exclusively catalyzedby aminopeptidase N. The degradationof all peptides was highlydependent on the intestinal segment, with the lowest degradation clearance observed in

the colon.

Intestinal permeabilitiesof TP3, TP4, and TP5. In Chapter III the intestinal

permeabilities of the three thymopoietin fragmentsare assessedto evaluate the peptides'potential for peroral drug delivery. The permeation studies through both Caco-2

monolayers and porcine intestinal tissues were performed in Ussing-type diffusion

Chambers. Additionally, the metabolic degradationof the peptides was investigated with

porcine intestinal tissue in a reflection kinetics set-up. The permeabilitycoefficients

ranged from 0.16*10"7 cm/s to 2.02* 10"7 cm/s and rose with increasing peptideconcentrations. The effective permeabilities in the absorptive direction were higherthanin the secretory direction. However, the permeabilities in the secretory direction were

close to that in absorptive direction, when the aminopeptidase inhibitor puromycin was

present in the compartment facing the apical membrane. Influences of the di- and

tripeptide carrier and of P-glycoproteinon the permeation could be excluded. An

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analysis of degradationproducts in the presence of Caco-2 monolayers revealedthat at

the apical membrane TP3, TP4, and TP5 were degraded by sequential cleavage of the

N-terminal amino acids. In the permeation studies with porcine intestinal tissue, no

permeated TP3, TP4, and TP5 could be foundin the receiver compartment. Similarly to

the Caco-2 experiments,the degradationproducts resulted from the metabolic cleavageof the N-terminal amino acids, in case of TP5 there was an additional cleavage of the C-

terminal tyrosine. The results suggest that the enzymatic degradation of the three

studied peptides has a marked impact on the permeabilities of TP3, TP4, and TP5.

Furthermore, the observed low permeabilities of the three studied peptides lead to the

conclusionthat reasonable bioavailabilitiesafter peroral application of the peptides are

not expected without the addition of enzyme inhibitors and/orpermeation enhancers.

Developmentand in vivo testing of oral dosage forms. Based on the results of

the stability and permeability studies, enteric-coated TP4 containing pellets were

developed and tested in rats which is describedin Chapter rV. The aim of this proof-of-concept study was to show enteric availability of TP4 in different intestinal segments.

Microcrystalline cellulose spheres were loaded with an aqueous-ethanolicSolution of

TP4 by solution-adsorption. The obtained pellets were enteric-coated with PMMA

(polymethylmethacrylate,Eudragit®)by a Wurster-type fluid-bed process to protect the

peptide against gastric juice and the enzymes of the upper gastrointestinaltract. The

pharmaceuticalproperties of the batcheswere examined by content uniformitytests anddissolution experiments.The release of TP4 was marginal in acidic medium, but at pH6.0, 93.7% ± 3.4% of the peptidewas released from the pellets coatedwith Eudragit®L100-55 withinone hour. At pH 6.8, 87.9% ± 2.8% of the peptide was released from the

pellets coated with Eudragit®S 100 withinone hour. In vivo tests in rats were conducted

with TP4 by dosing the pellets into the stomachof the rats four days and one day beforea septic shock was induced by intravenousinjection of endotoxin (lipopolysaccharide,LPS) which raised the TNF-a level. Plasma concentrationsof TNF-a were determined

with commercially available ELISA kits. The obtained results show that the different

TP4 dosage forms have no significantimpact on the endotoxin-inducedrelease of TNF-

a indicating that enteric-coated formulationsdid not overcome the barriers for peroraldelivery of TP4.

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In summary, the present work embraces both biopharmaceuticalcharacterizations of the three TP peptides and the technological developmentof dosageforms with subsequent in vivo testing. TP3, TP4, and TP5 show susceptibilities in the

presence of intestinal enzymes and low permeabilities which might result in poor

bioavailabilities after peroral administration. Moreover, varioustechniques of stabilitytesting and permeation modeis are presentedin this thesis which can be used to explainand to predict the interactions between absorption processes and concomitant

metabolismin human intestinal tissue. The resulting knowledge is of great importancefor the further developmentof effective and safe oral dosage forms.

ZusammenfassungDie drei Oligopeptide TP3 (Thymotrinan; Arg-Lys-Asp), TP4 (Thymocartin;

Arg-Lys-Asp-Val) und TP5 (Thymopentin; Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) sind biologischaktive Fragmente des aus 49 Aminosäuren bestehenden PolypeptidsThympoietin(TP).TP3 und TP4 wurden als Immunregulantien für die Anwendung am Menschen

entwickelt, während sich eine parenterale Arzneiformdes Thymopentin auf dem Markt

befindet. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass oral verabreichtes TP4 die TNF-oc-

Plasmaspiegel von Ratten beeinflusst, in denen eine Sepsis durch Injektion von

Endotoxin induziert wurde. Andere Untersuchungen zeigten immunregulierendeWirkungen von TP-Peptiden nach oraler Gabe an Mäusen. Diese immunregulierendenEigenschaften der Peptide sind bemerkenswert, da nach oraler Anwendung die

Bioverfügbarkeitvieler Peptide aufgrund ihrer enzymatischen Degradierung und wegen

ihrer massigen Permeationseigenschaften eher gering ist. Daher wurde in der

vorliegenden Arbeit die intestinale Stabilität und Permeabilität der drei Peptideuntersucht, um detaillierte Informationen für die anschliessend durchgeführteEntwicklungvon oralen Anwendungsformen und deren In-vivo-Evaluationan Ratten zu

erhalten.

Colon-Targeting als Möglichkeit der oralen Arzneistoffabgabe von

Peptiden. Kapitel I dieser Dissertation gibt zuerst eine Übersicht über verschiedene

Strategien, das Kolon als Freisetzungsort für orale Arzneiformenanzusteuern. EinigeFallbeispiele für die Arzneistoffabgabevon therapeutischenPeptiden im Dickdarm wie

z.B. Insulin und Calcitonin werden im zweiten Teil der Übersicht vorgestellt. Fünf

verschiedene Ansätze für das Colon-Targeting werden vorgestellt. Die meisten

vermarkteten Arzneiformen, die das Kolon als Freisetzungsort ansteuern, basieren auf

pH-abhängigenPolymeren, die sich erst im Kolon auflösen sollen. Die Schwankungendes luminalen pH im Dünndarm lösen jedoch die Arzneistoffabgabebereits aus, bevor

die Arzneiform ins Kolon gelangt. Die enzymatisch-kontrollierte und die

zeitkontrollierteFreisetzungvon Arzneistoffenstellen ausgeklügeltere Ansätze dar, die

die Entwicklung von Systemen mit Arzneistoffabgäbe im Kolon mehr und mehr

beeinflussen. Noch neuere Ansätze basieren auf druckkontrollierter oder

bioadhäsionskontrollierter Freisetzung, aber sie müssen in Versuchen am Mensch

weiter evaluiert werden. Die Arzneistoffabgabevon teuren Peptiden im Dickdarm ist

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kritisch, da die Permeabilität von Peptidenim Kolon generell sehr gering ist. Chemische

Peptidmodifikationen, absorptionsverbesserndeAgenden und Proteasehemmer sind

vielversprechendeMöglichkeiten, die Permeabilität im Kolon zu erhöhen, aber ihre

Sicherheit für die Anwendung am Menschenmussnoch gezeigt werden. Ferner sind die

Tiermodelle, die in den Absorptionsexperimenten im Kolon benutzt wurden, aufgrundder physiologischen und funktionalen Unterschiede zwischen Labortieren und

Menschen fragwürdig. Ausserdem werden hohe Standardabweichungen in der

Absorption im Kolon beobachtet, was auf die Schwierigkeiten hinweist, die

Absorptionsvariabilität zwischen Versuchstierenbzw. Versuchspersonen in den Griff zu

bekommen.

Intestinale Stabilität der drei Thymopoietinpeptide.In Kapitel II werden die

intestinale Stabilität und Degradation von TP3, TP4 und TP5 genauer beleuchtet. In

Anwesenheitvon Bürstensaummembranvesikeln,Pankreasrohextraktund umgedrehten

Darmwandringen aus Duodenum,Jejunum, Ileum und Kolon wurden alle drei Peptidesowohl durch Pankreasenzyme als auch durch Aminopeptidasen des Bürstensaums

degradiert. Es wurden die Degradierungsclearances (Cldeg) für TP3, TP4 und TP5

berechnet, um die Peptidstabilitäten quantitativ miteinander zu vergleichen. In

Anwesenheit von Pankreasrohextraktwurde eine rasche Degradierungvon TP5 (Cldeg17.9 ml/min) im Vergleich zu TP3 und TP4 (Cldeg 0.95 bzw. 0.56 ml/min bei einer

Peptidkonzentration von 0.2 mM) beobachtet, was durch die Abspaltung des C-

terminalen Tyrosins durch Carboxypeptidase A verursacht wurde, wogegen sich TP3

und TP4 der Hydrolyse durch AminopeptidaseN unterzogen. In Anwesenheit von

Bürstensaummembranvesikelnwaren die Degradierungsclearances 3.9, 3.1 und 2.4

ml/min bei 0.2 mM Konzentrationen von TP4, TP5 bzw. TP3. Die Clearances aller

Peptide sanken mit steigender Peptidkonzentration, was auf sättigbareDegradierungsprozesse hindeutet. Die Degradierung der Thymopoietinoligopeptide in

Anwesenheit von Bürstensaummembranenzymen wurde ausschliesslich durch

AminopeptidaseN katalysiert. Die Degradierung aller Peptide war stark abhängig von

dem jeweiligen intestinalen Segment, wobei die niedrigste Degradierungsclearance imKolon beobachtet wurde.

Intestinale Permeabilität von TP3, TP4 und TP5. In Kapitel IE wird die

intestinalePermeabilität der drei Thymopoietinfragmente untersucht, um das Potential

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der Peptide hinsichtlich einer peroralen Arzneistoffabgabe zu evaluieren. Die

Permeationsstudien wurden sowohl mit Caco-2-Monolayerals auch mit intestinalem

Gewebe vom Schwein in Ussing-Diffusionskammern durchgeführt. Zusätzlich wurde

die metabolische Degradierung der Peptide mit intestinalem Gewebe vom Schwein in

einem Reflektionskinetikaufbauuntersucht. Die Permeabilitätskoeffizienten lagen imBereich von 0.16-10"7 cm/s bis 2.02-10"7 cm/s und stiegen mit grösser werdender

Peptidkonzentration. Die effektiven Permeabilitäten waren in der absorptivenRichtunghöher als in der sekretorischen Richtung. Jedoch lagen die Permeabilitäten der

sekretorischen Richtung nahe an denen der absorptiven Richtung, wenn der

Aminopeptidasenhemmer Puromycin im Kompartiment, das der apikalen Membran

zugewandt war, vorlag. Einflüsse des Di-/Tripeptidtransporters und des P-

Glykoproteins auf die Permeation konnten ausgeschlossen werden. Eine Analyse der

Abbauproduktein Anwesenheitder Caco-2-Monolayerzeigten, dass TP3, TP4 und TP5

an der apikalenMembrandurch sequentielle Abspaltung der N-terminalen Aminosäuren

abgebaut werden. In den Permeationsstudien mit intestinalem Gewebe vom Schwein

konnte kein permeiertes TP3, TP4 und TP5 im Empfängerkompartiment gefundenwerden. Ähnlich wie bei den Caco-2-Experimenten resultiertendie Abbauprodukteausder metabolischen Abspaltung der N-terminalen Aminosäuren,im Fall von TP5 gab es

noch zusätzlich eine Abspaltung des C-terminalen Tyrosins. Die Ergebnisse geben zu

erkennen, dass die enzymatische Degradierung der drei untersuchten Peptide einen

deutlichen Einfluss auf die Permeabilitätenvon TP3, TP4 und TP5 hat. Ausserdem

legen die beobachteten geringen Permeabilitäten der drei untersuchten Peptide den

Schluss nahe, dass passableBioverfügbarkeitennach peroraler Anwendung der Peptidenicht ohne den Zusatz von Enzymhemmern und/oder permeationsverbesserndenAgendenerwartet werden.

Entwicklung und In-vivo-Evaluation von oralen Arzneiformen. Basierend

auf den Resultatender Stabilitäts- und Permeabilitätsstudien, wurden magensaftresistentüberzogene TP4-Pellets entwickelt und an der Ratte getestet, was in Kapitel IV

beschrieben wird. Ziel dieser konzeptionsnachweisenden Studie war es, die intestinale

Verfügbarkeit von TP4 in verschiedenen Darmsegmenten zu zeigen. Mkrokristalline

Cellulosepellets wurden mit einer wässrig-alkoholischen TP4-Lösung mittels

Lösungsadsorption beladen. Die erhaltenen Pellets wurden dann in der Wirbelschicht

mit PMMA (Polymethylmethacrylat,Eudragit®) magensaftresistent überzogen, um das

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Peptidgegen den Magensaftund gegendie Enzyme des oberen Dünndarmszu schützen.

Die pharmazeutischen Eigenschaften der hergestellten Chargen wurden hinsichtlich

Gleichförmigkeitdes Gehalts und hinsichtlich der Dissolutiongeprüft. Die Freisetzungvon TP4 in saurem Mediumwar marginal, bei pH 6.0 aber wurden 93.7% ± 3.4% des

Peptids aus den mit Eudragit®L 100-55 überzogenenPellets innerhalb einer Stunde

freigesetzt. Bei pH 6.8 wurden 87.9% ± 2.8% des Peptids aus den mit Eudragit®Süberzogenen Pellets innerhalb einer Stunde freigesetzt. Die In-vivo-Tests mit TP4

wurden an der Rattedurchgeführt, indem die Pellets in den Magender Ratte verabreicht

wurden. Dies erfolgte vier Tage und einen Tag bevor der septische Schock durch

intravenöse Injektion von Endotoxin (Lipopolysaccharid,LPS) herbeigeführt wurde,

was die TNF-a-Spiegelansteigen liess. Die TNF-cc-Plasmakonzentrationen wurden mit

einem handelsüblichen ELISA-Nachweis bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen,dass die verschiedenen TP4-Arzneiformenkeinen signifikanten Einfluss auf die mit

EndotoxinherbeigeführteFreisetzungvon TNF-a haben, was darauf hindeutet, dass die

magensaftresistent überzogenen Formulierungen die Barrieren der peroralen TP4-

Arzneistoffabgabenicht überwindenkonnte.

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit sowohl

biopharmazeutische Charakterisierungen der drei TP-Peptide als auch die

technologische Entwicklung von Arzneiformen mit deren anschliessenderIn-vivo-

Evaluation umfasst. TP3, TP4 und TP5 zeigen Anfälligkeiten gegenüber intestinalen

Enzymen und geringe Permeabilitäten, die in dürftigen Bioverfügbarkeiten nach

peroraler Verabreichung resultieren dürften. Ausserdem werden in dieser Dissertation

verschiedene Methoden der Stabilitätsprüfung und Permeationsmodelle vorgestellt, die

zur Erklärung und zur Voraussage der Wechselwirkungen zwischen

Absorptionsvorgängen und dabei auftretendem Metabolismus in menschlichem

Darmgewebe genutztwerden können. Das sich darausergebende Wissen ist von grosser

Bedeutung für die weitere Entwicklung von wirksamen und sicheren oralen

Arzneiformen.