Research Collection

Doctoral Thesis

Sulla conversione della vitamina K-1 (fillochinone) negliembrioni di pollo e della vitamina K-3 (menadione) nelLumbricus terrestris in vitamina K-2(20)

Author(s): Alvino, Claudio

Publication Date: 1965

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000091248

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ETH Library

Dissertazione No. 3659

PARTE I

Sulla conversione della vitamina K: (fillochinone)

negli embrioni di pollo e della vitamina K3 (menadione)nel Lumbricus terrestris in vitamina K2(2o)

PARTE II

Azione di alcune sideromicine e sideramine

sul metabolismo di alcuni batteri e sulla sintesi

in vitro dell'emina

DISSERTAZIONE

presentata alla Scuola Politecnica Federale di Zurigo

per il conseguimento del titolo di Dottore in Scienze Tecniche

dal Signor

CLAUDIO ALVINO

Dott. in Scienze Biologicheall'Università di Napoli

Cittadino italiano

Relatore: Prof. Dr. C. Martius

Correlatore : Prof. Dr. L. Ettlinger

Juris Druck + Verlag Zurigo

1965

I

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A mia moglie

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Meinem verehrten Lehrer,

Herrn Prof. Dr. C. Martius

bin ich fiir sein Interesse an dieser Arbeit und fiir seine grossziigige Hilfe sowie

fiir das mlr entgegengebrachte Wohlwollen zu grossem Dank verpflichtet.

Al mio Maestro,

Prof. Dr. C. Martius

sento di essere profondamente riconoscente per il prezioso criticismo con il

quale ha seguito questo lavoro. Lo ringrazio inoltre per la benevolenza con la

quale mi ha sempre guidato.

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- 7 -

INDICE

PARTE I

Sulla

cor

di pollo

Sulla

conversione del fillochinone in vitamina K<vgn\ negli embrioni

Introduzione 11

Parte teorica 13

A) Considerazioni generali sul metabolismo della vitamina K 13

1. Conversione del fillochinone nelle uova fecondate di

gallina 14

2. Conversione del fillochinone somministrato per os

alle galline 19

Sulla conversione del menadione in vitamina Kq/<.m nel L. terrestris^2(20)

•

B) Considerazioni generali sul metabolismo della vitamina K

negli anellidi 24

1. Conversione del metilnaftochinone nel L. terrestris 24

Parte sperimentale 27

A) Sintesi dei composti radioattivi 27

B) Derivati 29

C) Materiale da esperimento 29

D) Applicazione dei composti marcati 30

E) Metodi analitici 31

1. Estrazione e separazione controcorrente 31

2. Cromatografia su strato sottile 32

3. Misurazione della radioattività 32

Sommario 33

PARTE E

Azione di alcune sideromicine e sideramine sul metabolismo di alcuni

batteri e sulla sintesi in vitro dell'emina

A) Considerazioni generali su alcuni rappresentanti del

gruppo dei siderocromi 37

1. Azione di alcune sideromicine sul B. subtilis e

sull'E. coli 37

a) Materiali e metodi 38

b) Risultati 40

B) Considerazioni generali sulla biosintesi delle porfirine 46

1. Azione di alcuni siderocromi sulla sintesi in

vitro dell'emina 47

a) Materiali e metodi 47

b) Risultati 48

Sommario 49

Bibliografia 51

- 9 -

PARTE I

SULLA CONVERSIONE DELLA VITAMINA B^ (FILLOCHINONE) IN VITAMINA

K2(20) NEGLI EMBRIONI DI POLLO

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- 11 -

Introduzione

E' ben noto che un considerevole numero di composti esibisce proprietà

antiemorragiche nei tests biologici. Uno di questi è il metilnaftochinone (noto

anche come menadione o vitamina K„). Altri composti affini che possono essere

facilmente trasformati in metilnaftochinone nell'organismo animale - l'aminome-

tilnaftolo o vitamina K, per esempio - rappresentano ulteriori casi. Ih aggiunta

a questi composti relativamente idrofili, esiste anche un gruppo ben definito di

composti lipofili quale la vitamina K. (o fillochinone) e tutta una serie di vita¬

mine K, isolate dai batteri (Ko/ocy Kof45ì ecc*)- <-)ra> prescindendo dalla loro

attività che risulta essere - su base molecolare - praticamente la stessa e dal

loro comportamento per quanto concerne solubilità e altre proprietà fisico-chimi¬

che, è utile citare quanto segue. Per lungo tempo la vitamina K è stata conside¬

rata come direttamente partecipe - nel fegato - alla sintesi dei fattori che rego¬

lano la coagulazione del sangue e in particolare della protrombina e del fattore

VEL Nel corso delle ricerche effettuate da Martius & Nitz-Litzow' '* '

sulla catena respiratoria fosforilativa è emerso che tutte le sostanze che in vivo

agiscono come anti-K (tra queste quel tipico disaccoppiante che è il ben noto

dicumarolo), agiscono anche come antagoniste molto potenti dell'ossidazione fosfori¬

lativa» Tale antagonismo è però annullato mediante aggiunta di vitamina K a

tali anticoagulanti. Ciò porterebbe ad attribuire al fillochinone un'azione catalitica

nella fosforilazione ossidativa. Tali risultati sarebbero del resto confermati dal

fatto che l'alterato rapporto P/O che si riscontra nei mitocondri del fegato

di polli tenuti a dieta priva di vitamina K, può essere normalizzato mediante

aggiunta di vitamina K. o K„* • Inoltre, poiché il menadione^ ' è in grado di

rinormalizzare in vivo tutti i sintomi causati da una carenza di vitamina K, ma

non l'alterato rapporto P/O in vitro, dobbiamo dedurre che il nucleo chinonico,

per essere fisiologicamente attivo, ha bisogno della sua catena laterale lipofila.

Tale catena che l'organismo animale è in grado di sintetizzare è costituita, nel

caso della vitamina Kn/Qny da 4 unità isopreniche (geranilgeraniolo) con 4 doppi

legami (uno per ogni unità isoprenica). Premesso ciò e accertato che l'organismo

animale è in grado di convertire, con il concorso della flora batterica intestinale

Wl'/W^ jj fillochinone (ma anche altre vitamine appartenenti alla serie delle K„)

in vitamina Ko/ony c* siamo chiesti: Pu° quest'ultima vitamina formarsi anche

in assenza della suddetta flora batterica?

- 12 -

La prima parte di queste ricerche svolte utilizzando fillochinone radioattivo

3 1J(H nel gruppo metilico del nucleo chinonico e C nella catena laterale), ha cer¬

cato di dare un'esauriente risposta a tale quesito.

- 13 -

PARTE TEORICA

A) Considerazioni generali sul metabolismo della vitamina K

E' opportuno ricordare che gli uccelli e i mammiferi provvedono in ma¬

niera diversa al loro fabbisogno di vitamina K. I primi, in virtù della partico¬

lare conformazione anatomica dell'intestino crasso, sono prevalentemente assog¬

gettati all'apporto loro proveniente attraverso il nutrimento (nel caso di nutri¬

mento vegetale, al fillochinone). I mammiferi, invece, sono ampiamente agevo¬

lati in questo compito potendo disporre delle vitamine prodotte dalla ricca flora

batterica intestinale. Sulla base dei risultati ottenuti da Bill et er, Bolliger(9)

& Martius, appare altamente probabile che la produzione endogena di vita¬

mine K da parte dei batteri intestinali, non avvenga al solo fine di rendere più

o meno indipendente l'organismo nel quale essi operano, ma anche nel loro stes¬

so interesse. Infatti il menadione, originatosi dalla demolizione (operata dai bat¬

teri) della catena laterale di qualsivoglia derivato del 2-metilnaftochinone, serve

anche per sintetizzare le loro vitamine K. Tali vitamine - sempre del tipo delle

K - sarebbero per essi cellularmente specifiche. E' altamente probabile che

questa eliminazione della catena laterale (nei colombi essa è rintracciabile sotto

forma di un estere dell'acido fitanico), possa essere effettuata da tutta una serie

di batteri e non soltanto da quelli K-eterotrofi. Tra questi ultimi è opportuno

menzionare il Fusiformis nigrescens, perché rappresenta il primo microorgani¬

smo noto che necessita vitamina K quale fattore di crescita. Anche per gli orga¬

nismi superiori, il metilnaftochinone rappresenterebbe una "provitamina" essen¬

ziale. Se esso sia poi contenuto nel nutrimento sotto forma di fillochinone,

non ha importanza alcuna. Saranno infatti i batteri intestinali che provvede¬

ranno ad eliminare la catena laterale in posizione 3, trasformandolo di nuovo

in vitamina K„. Tuttavia ciò non esculde che l'eliminazione della catena laterale

possa avvenire ad opera di batteri diversi da quelli che presiedono alla sua sin¬

tesi. Comunque abbia luogo la formazione in metilnaftochinone, solo come tale

esso sarà "accettato" dall'organismo animale che lo trasporterà poi, mediante

il torrente circolatorio, verso particolari strutture cellulari. A livello di queste

ultime avverrà poi la trasformazione in vitamina Ko/20ì* *->ra> essendo stato

- 14 -

confermato più volte* ' che il metilnaftochinone viene convertito nell'organismo

animale essenzialmente in vitamina Kn/ony * lecito supporre che quest'ultima

vitamina rappresenti per esso il derivato più idoneo a soddisfare le sue esigenze

fisiologiche. Molto più difficile si presenta il tentativo di far luce sul destino,

nonché sulla funzione esercitata dalle vitamine K. e K„ che non subiscono l'eli¬

minazione della catena laterale. Appare però probabile che esse vengano rias¬

sorbite come tali e poi convogliate nel fegato. Se poi in quest'organo di accumu¬

lo della vitamina K possa aver luogo, in particolari circostanze, anche l'elimina¬

zione della loro catena laterale, ciò resta da stabilirsi. Un tentativo a tal riguar¬

do consisterebbe nell1 effettuare una serie di ricerche su organismi assolutamente

incontaminati da batteri. Tali ricerche, pur richiedendo un'attrezzatura che non

era a nostra disposizione, sono state ciononostante effettuate ricorrendo all'uso di

uova fecondate di gallina perché, tra i materiali presi in considerazione, ci of¬

frivano maggiore sicurezza di sterilità. Facendo uso dei dovuti accorgimenti atti

ad evitare qualsiasi apporto esterno di fattori contaminanti che potessero compro¬

metterne la sterilità, abbiamo iniettato a queste uova una piccola quantità di fil¬

lochinone altamente marcato e analizzato poi i suoi prodotti di trasfor¬

mazione negli embrioni in via di sviluppo .Alla luce dei risultati ottenuti pos¬

siamo affermare che il fillochinone si trasforma, in questi organismi inconta¬

minati da batteri, in vitamina K2(20). Tale risultato, per quanto sorprendente, ci

lascerebbe supporre che anche negli organismi adulti, tale processo potrebbe

essere cellularmente possibile. Tuttavia, bisogna anche tenere nel debito conto

le diversità esistenti tra embrioni e organismi adulti.

1. Conversione del fillochinone doppiamente marcato nelle uova fecondate di

gallina

L'effettuazione di queste ricerche non ha comportato particolari difficoltà.

La sospensione di una piccola quantità di fillochinone altamente marcato (C3

nella catena laterale, H nel nucleo chinonico), è stata iniettata nell'albume di

uova fecondate di gallina (particolari a pag. 33). Le uova, lasciate a tempera¬

tura ambiente per 24 ore, sono state normalmente incubate e i pulcini, a svilup¬

po ultimato, uccisi prima che sgusciassero per conservare ulteriormente le con¬

dizioni di sterilità. I tessuti da analizzare (sangue, muscoli, fegato, cuore e

intestino) sono stati rapidamente congelati in azoto liquido e quindi liofilizzati

- 15 -

sotto ghiaccio secco. Allo scopo di ottenere una prima informazione sulla natura

dei prodotti di trasformazione presenti nei singoli organi, questi ultimi sono sta¬

ti sottoposti ad un'estrazione con etere etilico esente da perossidi; l'etere eva¬

porato gli estratti lipidici ottenuti sono stati sottoposti a una separazione

controcorrente usando un apparecchio di Craig a 35 elementi (Soc. Biihler,

Tiibingen) e quale sistema solvente: eptano-metilglicole.

La fig. 1 raccoglie i risultati ottenuti dal fegato di un tale pulcino.

flO.

Fig. 1 Curva di ripartizione di un estratto lipidico del fegato di un pulcinosgusciato da un uovo nel quale, prima dell'incubazione, era stato inietta¬to fillochinone doppiamente marcato (H^nel nucleo, C" nella catena la¬

terale). A destra: attività del C" *—«—«[corrispondente a 0,3 ug di

vitamina Kj/g di organo secco ]; •—•—• attività del tritio L corrispon¬dente alla somma di vitamina Ki (spalla in corrispondenza della frazione

24) e di vitamina K2(20) (= °»58 Pg/s <& organo secco)] .A sinistra:

curve di ripartizione del tritio*—«—«e del C*4 o—o—odopo acetilazìoneriduttiva delle frazioni 16-22 della prima ripartizione. curva di

ripartizione dell'autentico diacetato della diidrovitamina K,2(20)*

- 16 -

Dall'andamento delle curve rappresentative della radioattività del tritio e

14del C

, appare evidente che solo una piccola quantità di fillochinone non tras¬

formato è presente nel fegato (massimo e rispettivamente spalla in corrisponden¬

za delle frazioni 23-24). La restante parte, dopo perdita della catena latera¬

le e successivo passaggio a metilnaftochinone, ha dato luogo alla formazione di

tmp/n>ma

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Fig. 2 a - d Curve di ripartizione degli estratti lipidici ottenuti da organi di¬

versi di un pulcino sgusciato da un uovo che ha ricevuto fillochi¬

none doppiamente marcato (cfr. fig. 1) a) intestino; b) muscoli

pettorali; e) cuore; d) sangue; attività del tritio;attività del Cl4.

- 17 -

vitamina K2/2Q\ (massimo in corrispondenza delle frazioni 19/20). Cosa sia av¬

venuto del materiale che costituiva la catena laterale è difficile da dire. Infat¬

ua)ti essa non si distacca nell'identico modo riscontrato nel caso dei colombi ' ',

Nella fig. 2a-d, sono raccolti i risultati ottenuti dall'analisi degli estratti lipidi¬

ci di altri organi. Appare evidente che sia il muscolo cardiaco che i muscoli

pettorali, sono praticamente privi di vitamina IC. Un quadro quasi analogo ci

è offerto dall'intestino. Del tutto diverso appare invece il rapporto K./K„,?0> nel

sangue, dove esso e fortemente spostato in favore del fillochinone. A tal punto

è opportuno tenere presente che anche nel fegato (cfr. fig. 1) è stato riscontra¬

ta la presenza di fillochinone non trasformato in vitamina Ko/ony Come interpre¬

tare quindi tale particolare comportamento del fegato, quando sappiamo che i

suoi omogenati sono perfettamente in grado di trasformare in vitro il metilnafto¬

chinone in vitamina Kg,,,,,* ? In primo luogo potremmo supporre che il fillochi¬

none affluito al fegato venga eliminato, in parte, direttamente attraverso la bile

mentre la restante parte che non ha subito trasformazione alcuna, verrebbe

accumulata in attesa di essere nuovamente immessa nel torrente circolatorio.

Ciò potrebbe giustificare l'alto tenore di fillochinone riscontrato nel sangue. Di¬

versamente potremmo assumere che nel fegato qualche altro composto, la cui

composizione si avvicini molto a quella della vitamina K2/2f)\, Quale ad esempio

lo stesso fillochinone, agisca direttamente e con gli stessi effetti della vitamina

K„/?nv, purché presente in una concentrazione sufficientemente elevata. In tale

ultima alternativa quindi, ci sarebbe nel fegato un' azione diretta del

fillochinone (o composti affini) prima ancora che si sia verificata la sua

trasformazione in vitamina Ko/90V Purtroppo, una verifica sperimentale di ques¬

ta ultima ipotesi non è facile in quanto la trasformazione del fillochinone in

quest'organo, anche se non paragonabile a quella riscontrata negli altri organi,

ha luogo assai rapidamente. In ogni caso ciò potrebbe anche rispondere a una pro¬

prietà fisiologica poiché negli stessi estratti lipidici dell'intestino e del sangue

(v. fig. 3a-b), allorché è stato iniettato metilnaftochinone in sostituzione del

fillochinone, gli embrioni sono stati perfettamente in grado di trasformarlo total¬

mente in vitamina K9(20V O"68** risultati ci confermerebbero ancora una volta

come il metilnaftochinone (ma anche gli altri composti appartenenti alla serie

delle K„), rappresenti il precursore per eccellenza della vitamina K2/2oy Ciò

non esclude tuttavia che l'organismo animale, come del resto già abbiamo riferi¬

to accetti, in particolari circostanze, anche altri composti che si avvicinino

- 18 -

Impt7600

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5700-

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IO 20 25 30 3i

Fig. 3a-b Curve di ripartizione degli estratti lipidici dell'intestino e del

sangue di un pulcino sgusciato da un uovo nel quale era stato

iniettato diidromenadione diacetato marcato (H^ nel gruppo metili¬

co), a) intestino; b) sangue; attività del tritio.

strutturalmente alla Kg/ony Nella figura 4 sono riportate le curve di riparti¬

zione di un estratto muscolare di pulcino, (cfr. fig. 2b) ottenute prima e dopo

avere effettuata la caratterizzazione del prodotto di conversione del fillochinone.

Come risulta in figura 4, nei muscoli pettorali non si rscontra l'attività del

14C orginariamente presente nella catena laterale del fillochinone. La curva di

ripartizione corrispondente all'attività del tritio ottenuta dopo acetilazione

riduttiva, coincide esattamente con quella dell'autentico diacetato della diidrovi-

tamina IC^n) misurata otticamente; ciò sta ad indicarci che anche nel muscolo

la catena laterale fitilica è stata sostituita da quella del geranilgeraniolo.

D.O.

- 19 -

1.

Imp/fnm /\,1.0. -1250 /\ 1 K

/ A 2(20)

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IO 15 20 25 30 Si-

Fig. 4 Curve di ripartizione dell'estratto lipidico della muscolatura di un pul¬cino sgusciato da un uovo dopo applicazione di vitamina Ki marcata (nelnucleo e nella catena laterale). A destra: •—•—•attività del tritio incor¬

porata nella vitamina K2(20) in cui è stato totalmente trasformato il fil¬

lochinone. A sinistra: curve di ripartizione della vitamina K2(20) dopoacetilazione riduttiva e dell'autentico diacetato della diidrovitamina K2(20)misurata otticamente

.

2. Conversione del fillochinone doppiamente marcato somministrato per os

alle galline

Fermo restando che, come del resto dimostrato dai tests batteriologici, il

contenuto intestinale dei pulcini appena sgusciati è risultato perfettamente sterile,

i risultati inaspettatamente ottenuti, ma peraltro confermati attraverso numerosi

esperimenti, ci hanno indotto ad effetuare ulteriori indagini allo scopo di chiarire

quale ruolo possa esercitare questo insolito meccanismo di conversione del fillo¬

chinone riscontrato negli embrioni di pulcino. Nel tentativo di risolvere questo

quesito, abbiamo somministrato per os a galline in periodo di attività ovariale,3

fillochinone doppiamente marcato (H nel gruppo metilico del nucleo chinonico,

C nella catena laterale fitilica), e ricercato quindi l'ammontare di eventuali

- 20 -

prodotti di trasformazione di detta vitamina sia nel tessuto ovariale che nelle

uova in differenti stadi di sviluppo. Dopo un periodo di 10 giorni, durante il

quale le galline avevano ricevuto in totale mg 2,25 di fillochinone marcato, è

stata effettuata l'analisi dei prodotti radioattivi presenti negli estratti lipidici

ottenuti nel modo già precedentemente descritto. Tale analisi ci ha offerto il

DA.

1.0.

-frp/m/'ii

5000

8 ...iOOO

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.1000 /

m. -*B-V-<

Fig. 5 Curve di ripartizione dell'estratto lipidico del tessuto ovariale di una

gallina alla quale era stato somministrato per os fillochinone doppiamen¬te marcato. A destra: prodotto di conversione del fillochinone (= vit.

K2(20) )• A sinistra: curve di ripartizione della vit. K2(20) dopo acetila-

zione riduttiva *—*—k e dell'autentico diacetato della diidrovitamina

K2(20V >attica residua della catena laterale (C14)

seguente quadro: nel tessuto ovariale (fig. 5), è stata riscontrata la presenza

della sola vitamina Kg,^ (non è più presente l'attività del C ) ; nell'insieme

delle più piccole uova analizzate (ca. 7 mm 0 ), sono stati rinvenuti circa 0,40

ug di K2,20> assieme a 0,28 ug di vitamina K, ; in un uovo di 14 mm 0 circa

2,16 ug di ~K-2(20) assieme a 0, 42 ug di K^ ; in un altro di 19 mm 0 0,64 ug di

K2(20) e 2'02 ?& di Kl (cfr* fig> 6)-

- 21 -

Imp/m'm

7500

5000_

2500_

0 5 10 15 20 25 30 3i 0 5 10 15 20 25 X 34

Imp/min

10500.

7000

3500_

Fig. 6

X 34-

Curve di ripartizione degli estratti lipidici di uova di gallina in differentistadi di sviluppo alla quale è stato somministrato per os fillochinone dop¬piamente marcato durante un periodo di 10 giorni, a) uovo di 7 mm 0 ;b) uovo di 10 mm 0; e) uovo di 14 mm 0; d) uovo di 19 mm 0 ;attività del tritio; attività del C*4.

(5)Le precedenti ricerche di Billeter & Martius

,hanno messo in evi¬

denza come la vitamina Kg,, che si riscontra nell'organismo animale adulto,

si origina unicamente (o almeno prevalentemente) ' dal metilnaftochinone liberatosi

1) I metodi di indagine usati, non consentono ancora di sciogliere la riserva

legata all'aspetto quantitativo della trasformazione.

- 22 -

a opera dei batteri intestinali. Premesso ciò, è lecito supporre che la vitamina

K2(20ì riscontrata nel tessuto ovariale, e quasi sicuramente anche quella riscon¬

trata nelle uova ancora in fase di sviluppo, provenga dalla fonte poc'anzi citata.

In realtà non dobbiamo restare sorpresi da una tale duplice modalità di conversio¬

ne della vitamina K- da parte dell'organismo degli uccelli. Essa ci appare senza

altro conforme sia alle loro caratteristiche anatomiche, sia alla povertà della

loro flora batterica intestinale. Per contro, l'embrione ha tutto il tempo per effet¬

tuare, poco a poco, i più disparati processi di demolizione e di trasformazione

servendosi della sua riserva "artificiale" di vitamina K.. La domanda, se anche

nell'organismo dei mammiferi una tale demolizione del fillochinone (ma anche

degli altri composti appartenenti alla serie delle K2) possa aver luogo, rimane

da essere chiarita. L'insieme delle ricerche fin qui effettuate, non esclude che

un tale processo potrebbe essere, anche nell'organismo dei mammiferi, cellular¬

mente possibile.

- 23 -

SULLA CONVERSIONE DEL MENADIONE IN VITAMINA Kg,^ NEL L. TERRESTRIS

- 24 -

B) Considerazioni generali sul metabolismo della vitamina K negli anellidi

Le precedenti indagini hanno dimostrato che negli embrioni di pollo ha luo¬

go, anche senza il concorso della flora batterica intestinale, la conversione di

alcune vitamine K in vitamina K„,of),. Tale risultato, del tutto sorprendente, ci

ha spinti ad effettuare una serie di ricerche su invertebrati, le cui esigenze

fisiologiche si discostano nettamente da quelle dei vertebrati fin qui studiati.

E' noto infatti da lungo tempo che il sangue dei vertebrati superiori presenta

caratteristiche differenze fisiologiche rispetto a quello degli invertebrati inferiori.

Infatti, mentre nei primi è stata accertata la presenza di fattori che regolano

la coagulazione del sangue, nei secondi non è stato ancora possibile rintracciarli.

Attraverso i lavori di Martius & Esser1 'condotti su animali vertebrati è

emerso che la sintesi di questi fattori, richiede la partecipazione di vitamine

del gruppo K. Ora, l'assenza di tali fattori riscontrata nel sangue degli inverte¬

brati dovrebbe, di conseguenza, far escludere non solo la possibilità di rinvenire

queste vitamine in tali organismi, ma anche quella di una probabile trasforma¬

zione da parte loro del metilnaftochinone (o del fillochinone), in un prodotto ana¬

logo alla vitamina K0/?n> o a qualcuna delle altre vitamine appartenenti alla serie

delle K„. A tale scopo, abbiamo scelto quale punto di applicazione il sacco celo-

3matico dell'anellide L. Terrestris e iniettato metilnaftochinone marcato (H nel

gruppo metilico del nucleo chinonico). Successivamente abbiamo ricercato gli

eventuali prodotti di trasformazione sia nella muscolatura, sia nell'intestino.

1. Conversione del metilnaftochinone marcato nel Lumbricus terrestris

L'effettuazione di queste ricerche ha comportato qualche difficoltà sia per¬

ché la cavità celomatica, a causa delle contrazioni dell'anellide, non sempre è

stata facilmente raggiunta, sia perché, a causa delle stesse contrazioni, solo una

piccola parte della vitamina iniettata poteva essere riassorbita. Ciononostante, è

stato ugualmente possibile studiare l'effetto delle piccole quantità di menadione

assorbito grazie alla sua elevata attività specifica. Dopo applicazione della vita¬

mina attiva, gli anellidi sono stati tenuti per tre giorni in un recipiente colmo

di terra (prima di tale periodo non si riscontra alcuna conversione apprezzabile).

Allo scadere dei tre giorni, gli anellidi sono stati sezionati al fine di separare

- 25 -

L.2000 I kafloj

0 5 W 15 20 2S 30 X

Fig. 7 Curve di ripartizione degli estratti lipidici della muscolatura e, rispetti¬vamente, dell'intestino di un anellide nel cui sacco celomatico è stato

iniettato menadione marcato (H^ nel gruppo metilico). A destra: curva

di ripartizione del solo intestino ; al centro: curva di ripartizio¬ne della sola muscolatura .

la muscolatura dall'intestino. H materiale cosi- ottenuto è stato, secondo la

procedura già descritta, subito congelato, liofilizzato, estratto con etere e sotto¬

posto ad analisi mediante separazione controcorrente degli estratti lipidici nel

solito apparecchio di Craig. La fig. 7 raccoglie i risultati ottenuti da tali analisi.

Essi rispecchiano il comportamento del menadione in ciascuno dei suddetti tessu¬

ti. La muscolatura, come indica la curva rappresentativa dell'attività del tritio,

contiene praticamente solo vitamine K2/2Q. (massimo in corrispondenza della

frazione 19), e tracce di un prodotto di trasformazione più lipofilo (spalla in

corrispondenza delle frazioni 29/30).

Viceversa, l'estratto lipidico dell'intestino contiene solo il prodotto più lipo¬

filo il cui massimo è ancora localizzato in corrispondenza delle frazioni 29/30.

Per caratterizzare il prodotto di trasformazione che nella muscolatura presenta

il suo massimo in corrispondenza della frazione 19, sono state raccolte le fra¬

zioni ottenute dalla distribuzione controcorrente dell' estratto lipidico da 14 a

- 26 -

r

Imp/mh1,04- 1250

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3

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ù 5 10 IS 20 25 30 3i. 5 IO 1S 20 25 30 X

Fig. 8 Curve di ripartizione dell'estratto lipidico della sola muscolatura di un

anellide (cfr. fig. 7). A destra: prima dell'effettuazione dell'acetilazione

riduttiva; a sinistra: attività del tritio dopo acetilazione riduttiva

in parallelo con la curva di ripartizione dell'autentico diacetato della

diidrovitamina K^T?n, n—x—x.

22 e, dopo effettuata l'acetilazione riduttiva, di nuovo sottoposte a tale tipo di

separazione. La fig. 8 raccoglie le curve ottenute prima e dopo aver effettuata

l'acetilazione. Purtroppo dal suddetto diacetato non è stato ottenuto il solo mas¬

simo corrispondente alla vitamina K2(20)

e localizzato in corrispondenza della

frazione 10, ma ancora un altro in corrispondenza della frazione 23. E' proba¬

bile che il secondo massimo corrisponda ad un artefatto. Per contro, il massi¬

mo corrispondente alla frazione 10 indica, con alta probabilità, la presenza di

vitamina K„,2Qv. Sembra pertanto acquisito che almeno in questi invertebrati,

abbia luogo la conversione del menadione in vitamina K2,20>. Resta tuttavia, per

il momento, ancora da chiarire quale ruolo fisiologico debba essere attribuito a

tale inattesa attitudine da parte degli anellidi.

- 27 -

PARTE SPERIMENTALE

A) Sintesi dei composti radioattivi

14 31. Vitamina K.. con C nella catena laterale fitilica e H nel gruppo metilico

del nucleo naftochinonico

La sintesi del fillochinone marcato con tritio nel gruppo metilico del nu¬

cleo chinonico (attività: 1,10- 10 Imp/min/pg) e con C in posizione 1', 2'

della catena laterale fitilica (attività: 1,81 • 10 Imp/min/ug), è stata effettuata(1)

secondo il metodo precedentemente descritto da Billeterx '.

32. Menadione marcato con H nel gruppo metilico del nucleo chinonico

Il menadione marcato con tritio nel gruppo metilico del nucleo chinonico

rità:3•10Imp/min/ug)

è

tesi del fillochinone (v. fig. 17)

(attività:3•10Imp/min/ug)

è stato isolato quale prodotto intermedio della sin-

- 28 -

CH3

1. Zn, AC2O, Piridina

2. Br-succinimide

OAc

^

OAc

1 31. H2 + H2, Pd, trietilamina

2. LiAlH4

| 3. Ag20

-, H

C-H'

Il '

H H2'Pd

O

( H-Menadione)1. BF3-Eterato2. Ag20

Li, NHg liq.

14 14HC =CX*H

H2, Pd-Pb-Cat.

Chinolina

(Fillochinone)

Fig. 9 Rappresentazione schematica della sintesi del menadione e, rispettiva¬mente, del fillochinone radioattivi.

- 29 -

B) Derivati

1. Diacetati

I diacetati delle vitamine K ridotte sono stati ottenuti mediante breve riscal¬

damento della sostanza in anidride acetica con zinco in polvere. Successivamen¬

te la sostanza in esame è stata trattata con poca piridina e di nuovo riscaldata

per 15' circa su bagnomaria bollente. Dopo raffreddamento è stata ripresa con

cicloesano e lavata quindi con acqua finché il pH è risultato neutro. Ai composti

radioattivi, di solito presenti in quantità minime, è stata aggiunta della vitamina

inattiva (1 mg ca.). Per la determinazione quantitativa dei diacetati si è

ricorso allo spettro di assorbimento (massimo a 230 mu). D. derivato del fil¬

lochinone rimane oleoso a temperatura ambiente mentre, da quello della

vitamina Kn/Zr,\ e stato possibile ottenere, sebbene con difficoltà, un diacetato

cristallino (da metanolo) che fonde a 33 C.

2. Riduzione con LiAIH,

I prodotti ottenuti dopo acetilazione riduttiva sono stati trattati con una solu¬

zione eterea di LiAlH. e una volta riossidati a chinoni mediante aggiunta di Ag.O,

sottoposti ancora una volta a una separazione controcorrente nell'apparecchio di

Craig allo scopo di riottenere le originarie curve di distribuzione.

C) Materiale da esperimento

1. Uova fecondate di gallina

Galline bianche di razza Leghorn e relative uova fecondate, ci sono state

fornite dalla pollicultura Duttlinger (Neftenbach/Zurigo).

- 30 -

2. Anatre

Sono state utilizzate anatre di circa un anno.

D) Applicazione ed estrazione dei composti marcati

1. Preparazione e applicazione nell'uovo della sospensione vitaminica

I composti marcati sono stati portati in soluzione mediante aggiunta di un

tensioattivo (Cremophor El-BASF), alcool e acqua distillata sterile. Per la loro

applicazione nell'uovo è stato praticato nel guscio un foro di 1 mm circa di dia¬

metro, previo lavaggio con alcool della zona interessata. Usando quindi una co¬

mune siringa (sterilizzatal ) sono stati aspirati ca. 1,5 mi di albume e, successi¬

vamente, è stata iniettata molto lentamente la sospensione (sterile) delle vitami¬

ne attive per mezzo di una siringa per turbercoline (v. fig. 17) nell'albume dello

uovo a una profondità aggirantesi tra i 5 e i 10 mm. Le uova cosi trattate sono

state incubate, previa otturazione dei fori con cementite, in una piccola incuba¬

trice che peraltro è in commercio.

Fig. 10 Punto di applicazione dei composti marcati

- 31 -

2. Applicazione per os della sospensione vitaminica

Secondo il procedimento precedentemente descritto, i composti marcati sono

stati portati in soluzione (unica eccezione: metilglicole invece di etanolo) e som¬

ministrati, goccia a goccia, per os alle galline.

3. Applicazione della sospensione vitaminica nel L. terrestris

I composti marcati portati in soluzione sono stati iniettati, mediante una

siringa per tubercoline, nel sacco celomatico di questo anellide.

E) Metodi analitici

1. Estrazione e separazione controcorrente

Gli organi ottenuti dagli animali uccisi sono stati trattati nell'identico modo

già descritto da Bill et er*'»*'. Gli estratti lipidici ottenuti mediante estrazio¬

ne con etere, sono stati sottoposti a una separazione controcorrente nell'apparec¬

chio di Craig (sistema solvente: eptano/metilglicole). Le misurazioni della ra-

14dioattivita del tritio e del C nelle singole frazioni, sono state effettuate median¬

te un "Packard Liquid Scintillation-Spectrometer".

Tabella 1 Comportamento di alcuni composti sottoposti a una separazione contro¬

corrente nell'apparecchio di Craig. Sistema solvente: eptano-metilgli-cole. Massimo spostamento delle frazioni:

Sostanza F max.

Menadione 7

Fillochinone 24 - 25

Vitamina K2(2Q)Fillochinone diacetato

19 - 20

15

Vitamina K2/20\ diacetato

Fitolo

10

16

2,5-difeniloxazolo (PPO) 6 - 7

- 32 -

2. Cromatografia su strato sottile

La cromatografia su strato sottile secondo Stahl1,

si è rivelata un otti¬

mo metodo d'analisi per un'ulteriore conferma della natura dei composti previa¬

mente isolati mediante separazione controcorrente (v. Tab. 1). In partico¬

lare essa si è resa utile per la separazione delle vitamine K2 aventi catene la¬

terali insature di differente lunghezza. Nella maggior parte dei casi, per meglio

evidenziare la fluorescenza dei composti insaturi, al gel di silicio è stata aggiun¬

ta della fluoresceina. A causa della irriproducibilità dei valori del Rf, sono state

aggiunte sostanze di riferimento per evidenziare meglio la separazione. Per le

misurazioni della radioattività incorporata nelle macchie, è stata seguita la se¬

guente procedura: la porzione di gel di silicio su cui era localizzata la macchia,

è stata cautamente asportata, versata in flacconcini per la conta, eluita quindi

con una soluzione di PPO in toluolo puro e la radioattività misurata allo spettro¬

metro Packard.

3. Misurazione della radioattività

Tutte le misurazioni della radioattività presente nelle sìngole frazioni otte¬

nute con l'apparecchio di Craig, sono state effettuate mediante l'uso di un Tri-

Carb Liquid Scintillation Spectrometer della Packard Instrument Co. La Grange-

Illinois, dopo che il residuo dell'evaporazione di ogni singola frazione contenuta

in appositi flaconcini era stato ripreso con 5 mi di una soluzione al 3 % di 2, 5-

difeniloxazolo (PPO) in toluolo puro. Tutte le sostanze che assorbivano nell'am¬

bito delle onde lunghe dell'ultravioletto o nell'ambito delle onde corte del visibile,

provocavano una diminuzione degli impulsi registrati dallo spettrometro (in inglese:

"quenching effect"). Questa interferenza, allorché si è reso necessario, è stata

eliminata mediante aggiunta di uno standard interno. Infatti l'effetto "quenching"

à uguale al rapporto tra la radioattività ulteriore che si riscontra dopo aver

aggiunto al campione in esame una determinata quantità di standard radioattivo

e la quantità di standard radioattivo aggiunta.

- 33 -

SOMMARIO

Nel presente lavoro è stato studiato il comportamento della vitamina K.

(o fillochinone) in organismi incontaminati da batteri. Alla luce dei risultati otte¬

nuti, è emerso che il fillochinone, allorché iniettato nell'albume delle uova fecon¬

date di gallina, è trasformato, dall'embrione in via di sviluppo, in vitamina

K.,„nv. Ne deriva pertanto che la trasformazione della vitamina K. in vitamina

K„/9f.v ha luogo, nei suddetti organismi, anche senza il concorso della flora bat¬

terica intestinale. Se tale tipo di trasformazione possa avere luogo anche nello

organismo dei mammiferi, non può essere per ora escluso. Nel corso di ulte¬

riori indagini, è emerso che nella stessa vitamina K2/2Q> viene trasformato il

menadione allorché iniettato nel sacco celomatico dell'anellide L. terrestris. Su

quest'altra inattesa trasformazione manca ogni spiegazione che possa chiarire il

ruolo fisiologico esercitato dalla vitamina Kg/ooì m *a^ organismi- Tali risulta¬

ti confermerebbero, ancora una volta, che il ruolo svolto dalle vitamine K e

di ben più complessa natura che non una semplice e diretta partecipazione alla

sintesi dei fattori che regolano la coagulazione del sangue.

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- 35 -

PARTE II

AZIONE DI ALCUNE SIDEROMICINE E SIDERAMINE SUL METABOLISMO DI

ALCUNI BATTERI E SULLA SINTESI IN VITRO DELL'EMINA

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- 37 -

A) Considerazioni generali su alcuni rappresentanti del gruppo dei siderocromi

(12)Come e stato precedentemente riportato da altri autori

,tutte le sostan¬

ze naturali che contengono o che possono legarsi al ferro e il cui assorbimento

massimo è localizzato tra 420 e 440 mu, sono da considerarsi dei siderocromi.

Sotto tale gruppo, sebbene con proprietà fra loro antagoniste, vengono classificate

sia le sideramine che le sideromicine. Le prime, infatti, rappresentano dei fattori di

crescita per numerosi microorganismi e si rinvengono, anche se non sempre in

rilevanti quantità, in molti rappresentanti della famiglia delle actinomicetaceae.

Di esse se ne conoscono diverse specie denominate A, B, C, D., D„, E,

F e G. Caratteristica comune della loro molecola è la presenza in essa di un

complesso del ferro con l'acido trudrossamico. Le sideromicine, viceversa, pur

contenendo ferro nella loro molecola e quantunque siano state isolate dagli actino-

miceti, sono da considerarsi come sostanze a carattere antibiotico (fernmicma

A,, A„, B; gnsema, albomicina). Pertanto esercitano uno spiccato antagonismo»

(13)

verso le sideramine. In più, è stata notatav'

in alcuni batteri (B.

subtilis, B. megatenum, S. aureus ecc.), l'attitudine a trasformare le sideromi¬

cine aggiunte ai loro terreni culturali in sideramine ovverosia, a trasformare un

antimetabohta in un metabolita.

Nel corso degli esperimenti che saranno appresso descritti, abbiamo studia¬

to l'azione delle seguenti sideramine e sideromicine su alcuni ceppi batterici.

Ferrioxamma B e desfernoxamma B dal gruppo delle sideramine (= fattori di

crescita); fernmicma A e albomicma dal gruppo delle sideromicine (= antibiotici)

e infine, dai siderocromi ad azione biologica non ancora nota, la ferricrisina.

1. Azione di alcune sideromicine sul B. subtilis e suil'E. coli

Come abbiamo precedentemente riportato, le sideromicine possono essere

trasformate da diversi microorganismi in sideramine. Sulla base delle ricerche

effettuate da Bachmann & Zahner, sembrerebbe verosimile che la forma¬

zione delle sideramine abbia luogo da una diretta trasformazione delle sideromi¬

cine (secondo gli stessi AA. sarebbe da escludersi un'azione mducente da parte

di quest'ultime). Inoltre, sempre secondo essi, dalla natura del terreno culturale

usato, dipenderebbe la resistenza riscontrata nel B. subtilis verso la fernmicma

- 38 -

A: resistenza non genotipica che scompare usando terreni culturali di diversa

natura. Premesso ciò, ci siamo chiesti se l'azione svolta dalle sideromicine si

estrinsecasse solo sulla crescita batterica e con quale durata. A tale scopo,

abbiamo ricercato l'effetto dell'inibizione prodotta mediante aggiunta di ferrimi-

cina A (o di albomicina) sulla crescita nonché sulla sintesi nucleica e proteica delle

culture di B. subtilis e, rispettivamente, E. coli.

a) Materiali e metodi

Le curve che rappresentano l'andamento della crescita, della sintesi nuclei¬

ca e proteica delle diverse culture batteriche, sono state ottenute aggiungendo ai

terreni culturali soluzioni di sideromicine diversamente concentrate.

a) crescita batterica: determinazione turbidimetrica

b) sintesi nucleica: determinazione dell'acido RN

secondo Schneider e dell'acido(17)

DN secondo Ceriotti 'o lo stesso

cu *

(18)

Schneider '.

e) sintesi proteica: determinazione secondo Folin-Ciocalteau.

Batteri: Bacillus subtilis (ceppo E. T. H. 2016) e relativa sospensione di

spore; Escherichia coli (ceppo E.T.H. 2018); Bacillus megaterium (ceppo E.T. H.

2053), gentilmente fornitici dal Dott. Zahner dell'Istituto di Botanica Speciale

dell'E.T.H.

Terreni culturali sintetici: v. tabella 2.

Misurazioni: le determinazioni turbidimetriche sono state effettuate median¬

te l'uso di un colorimetro Eppendorf a 546 mu azzerando su un terreno culturale

non inoculato; la determinazione degli acidi nucleici mediante l'uso di uno spettro¬

fotometro Zeiss a 490 mu per l'acido RN e a 660 mu e, rispettivamente, 595 mu

per il DNA; la determinazione della sintesi proteica mediante l'uso dello stesso

spettrofotometro a 750 mu.

Antibiotici: i preparati usati nel corso di queste ricerche, ci sono stati

gentilmente forniti dall'industria farmaceutica Ciba di Basilea (ferrimicina A,

ferrioxamìna B) e dal Dott. Zahner dell'Istituto di Botanica Speciale del Politec¬

nico Federale di Zurigo (desferrioxamina B, albomicina, ferricrisina).

- 39 -

Reattivi: Sono stati usati solo quelli della Merck S.A. Darmstadt (Germa¬

nia).

Rappresentazione delle ricerche: quale indice dell'effetto esercitato dalle

sostanze in esame sulle culture batteriche, è stato scelto quello riferentesi al

ritardo in esse provocato nel raggiungere una crescita relativa del 50 % rispet¬

to al controllo. I prelievi per la determinazione della sintesi nucleica e

proteica nonché per il controllo della crescita, sono stati effettuati nel seguente

modo: durante la fase log di crescita delle culture batteriche, sono stati preleva¬

ti 5 mi di terreno culturale e le cellule, in esso sospese, centrifugate, lavate

con NaCl (soluzione fisiologica) e risospese in un nuovo terreno culturale (T =

28° C). Dopo 5 minuti circa, sono stati effettuati sterilmente prelievi da ciascu¬

na cultura batterica in esame nonché dalle culture di controllo, per effettuare la

determinazione della crescita batterica (t = O) e della sintesi nucleica e proteica.

Determinazioni turbidimetriche della crescita batterica: le determinazioni

turbidimetriche sono state effettuate ogni volta su 5 mi di sospensione batterica

in parallelo, come già riferito, con un terreno culturale non inoculato a 546 mu.

I controlli, a intervallo di un'ora, sono stati effettuati contemporaneamente a

quelli necessari per la determinazione della sintesi nucleica e proteica.

Determinazione delle proteine: per la determinazione delle proteine sono

stati prelevati, di volta in volta, 10 mi di sospensione batterica e centrifugati;

il sedimento è stato lavato una volta con soluzione isotonica di NaCl e quindi,

dopo ulteriore centrifugazione, una volta ancora con TCA 15 %. I sedimenti cosi

trattati, sono stati ripresi con 2 mi di NaOH 2N e posti in un bagnomaria bollen¬

te. Dopo 20' circa, gli idrolizzati proteici sono stati diluiti al volume finale di

4 mi con acqua distillata. Per ogni singolo dosaggio (di regola sono state effettua¬

te prove in doppio) è stata prelevata un'aliquota (0,4 mi) che è stata analizzata(15)

secondo il metodo di Folin-Ciocalteau v '.

Determinazione degli acidi nucleici: la stessa quantità di sospensione prele¬

vata per la determinazione delle proteine, è stata anche prelevata per la determi¬

nazione degli acidi nucleici. I sedimenti ottenuti dopo centrifugazione sono stati

lavati con una soluzione isotonica di NaCl e, successivamente, con tampone di fos¬

fati a pH = 7 e quindi di nuovo centrifugati. I sedimenti sono stati ripresi con

5 mi di TCA 15 % e lasciati idrolizzare per 20' su bagnomaria bollente. Dopo

raffreddamento, le soluzioni sono state portate al volume finale di 10 mi, filtrate

e analizzate in parallelo con uno standard di RNA e, rispettivamente, DNA (con-

- 40 -

centrazione: 2 e, rispettivamente 15 y/ml). Normalmente sono state effettuate

prove in doppio senza peraltro riscontrare alcuna interferenza da parte di cia¬

scun acido durante la determinazione del secondo in presenza del primo. Le ana-

i SOI

(17)lisi sono state effettuate secondo i metodi di Schneider* " 'ediCeriot-

ti

b) Risultati

Nella fig. 11 sono riportate le regressioni della crescita batterica ottenute

in una serie di ricerche condotte sul Bacillus subtilis.

16 18 h 20

Fig. 11 Inibizione della crescita di una cultura di B. subtilis che ha ricevuto

quantità diverse de ferrimicina A ( v- /mi)

Da essa risulta che le culture di B. subtilis, senza aggiunta di ferrimicina

A, raggiungono una crescita del 50 % circa dopo 8 ore. Viceversa, nelle culture

dove è stata aggiunta ferrimicina in concentrazioni di 10",

3 • 10 e 5 • 10~3

)f /mi è stato riscontrato un ritardo nella crescita oscillante tra i 15' e le due

ore. In base a tali risultati appare evidente che solo le concentrazioni finali non

-3inferiori a 10 y/ml, sono in grado di provocare un'inibizione della crescita.

Inoltre, non è stata riscontrata nessuna variazione nell'effetto inibente aggiungen-

- 41 -

do la ferrimicina alcune ore dopo l'inizio della crescita batterica. Nella fig. 12,

sono riportate le regressioni riscontrate nella sintesi proteica sotto l'influsso

della ferrimicina A. Come facilmente si può notare, la sintesi proteica nelle

culture che non contengono ferrimicina, raggiunge un valore pari al 43 % circa

dopo quasi 4 ore laddove, nelle culture dove è stata aggiunta ferrimicina nella

-3concentrazione di 3 " 10 t/mh essa subisce un ritardo di 120' circa.

.2i

.le

.os

0 2 i S S IO h 12

Fig. 12 Effetto della ferrimicina A sulla sintesi proteica dinna cultura di B.

subtilis.

Ciò dimostra, e i risultati ottenuti dall'analisi degli acidi nucleici ne danno

conferma, che la ferrimicina, anche a una concentrazione relativamente bassa,

è perfettamente in grado di rallentare i processi metabolici di tali cellule batte¬

riche. Resta comunque da precisare che l'effetto esercitato dalla ferrimicina

sulla sintesi proteica, ma anche su quella nucleica, si rende manifesto solo dopo

2 ore circa dall'aggiunta dell'antibiotico. Infatti, prima di tale periodo non è sta¬

to possibile riscontrare inibizione alcuna. Viceversa, le sospensioni di spore del¬

lo stesso B. subtilis, dimostrano di essere sensibili all'effetto della ferrimicina

sin dall'inizio. Come precedentemente riportato, anche per gli acidi nucleici e

possibile notare un'azione inibente della ferrimicina solo dopo 2 ore circa dalla

sua aggiunta. Nella fig. 13 sono rappresentate le regressioni subite dalla sintesi

nucleica nelle culture che hanno ricevuto ferrimicina. In un altro gruppo di ri¬

cerche condotte sul B. megaterium, è stato notato che l'aggiunta di ferrimicina

- 42 -

Fig. 13 Effetto della ferrimicina A sulla sintesi nucleica di una cultura di B.

subtilis. 1: inibizione della sintesi dell'acido RN; 2: inibizione dellasintesi dell'acido DN; concentrazione della ferrimicina; 10"^ jj- /mi.

alle sue culture non provoca effetto alcuno. Lo stesso risultato hanno dato gli

esperimenti condotti usando concentrazioni più elevate di ferrimicina. Ciò potreb¬

be essere dovuto al fatto che la fase log di crescita del B. megaterium è note-(13)

volmente più lunga e ciò potrebbe dar luogo a una trasformazionev ' della ferri¬

micina in ferrioxamìna il cui effelto è stato già precedentemente descritto. Lo

stesso risultato negativo è stato ottenuto con le culture di E. coli. In quest'ulti¬

mo caso però, ciò non può essere attribuito al tempo di crescita di tali culture,

perché resta lo stesso di quello riscontrato nelle culture del B. subtilis. Più

probabile invece, è l'ipotesi di una naturale resistenza dell'E. coli verso la fer¬

rimicina. Ciò sarebbe anche confermato dalle ricerche diBachmann & Zah-(13)

nerv ', Per un'ulteriore conferma di tale ipotesi, abbiamo effettuato sull'E.

coli una serie di esperimenti usando, questa volta, albomicina. Quest'ultima è

(19 20 21)anch'essa un antibiotico contenente ferro, isolata da Gause et airi. ' ' nel

(12)

1951 e classificata da Bickel et airi; ' nel sottogruppo delle sideromicine. Le

- 43 -

figure 14, 15 e 16 raccolgono i risultati ottenuti dalle culture di E. coli alle

quali è stata aggiunta dell'albomicina. Quantunque la concentrazione dell'albo-

micina usata (0,1 y/ml) sia stata relativamente maggiore, l'effetto dovuto ad

essa è stato a sua volta proporzionalmente più elevato. Le determinazioni effet¬

tuate sulle culture di E. coli rimangono le stesse di quelle effettuate sul B. sub¬

tilis. Unica variante: la scelta di un appropriato terreno culturale sintetico, la

cui composizione è riportata nella tabella 2.

60 _

'A

70.

80.

90.

100 I | 1 i i i

4- 6 S 10 12 li- f> 16

Fig. 14 Influsso dell'albomicina sulla crescita di una cultura di E. coli. (Tem¬

po dopo aggiunta dell'antibiotico).

controllo

- 44 -

Fig. 15 Influsso dell'albomicina sulla sintesi proteica (a) di una cultura di E.coli, (tempo dall'aggiunta dell'antibiotico: 0,1 'jf/ml)

£(\m660mfi).125 l .5

.100...A

.075. ..3

~>ff/V/4(controllo)

Fig. 16 Inibizione della sintesi degli acidi nucleici dopo aggiunta di albomicina

(0,1 y/ml) a una cultura di E. coli. 1 = RNA; 2 = DNA.

- 45 -

Tabella 2 Composizione dei terreni culturali impiegati per i diversi ceppi bat¬

terici

1. Terreno culturale sintetico per il B. subtlis e sua sospensione di spore:

K2HP04 0,7%; KH2P04 0,1%; Na-citrato •

3H20 0,05%; MgS04• 7H2 0,01%;

(NH.)2S04 0,1%; Glucosio;0,2%; acqua dist. q.b.a mi 95; pH = 7,2 (otte¬

nuto mediante aggiunta KOH al 20%); sterilizzazione: 20 min. a 120 C.

2. Terreno culturale sintetico per L'È. coli:

NaCl 0,5%; I^HPO,^ 0,2%; MgS04- 7H20 0,1%; CaCl2•

2H20 0,27%;

MnSO. • H90 0,0006 %; tartrato di ammonio 0,4%; ferricitrato 0,03%; glu-

cosio 0,8 %; acqua dist. q.b. a mi 95; pH =7,2 (ottenuto mediante ag¬

giunta di KOH IN); sterilizzazione: 20 min. a 120 C.

3. Terreno culturale per il B. megaterium:

Ox Lab Lemco 1,0%; peptone 1,0%; NaCl 0,5%; agar 1,5%; acqua distilla¬

ta: q.b. a mi 100; pH = 7,2 (ottenuto mediante aggiunta di KOH IN); steri¬

lizzazione: 20 min. a 120 C.

I risultati fin qui ottenuti, sebbene non esattamente conformi a quelli otte-

(13)nuti daBachmann & Zahner

,hanno tuttavia confermato l'attitudine da

parte di alcuni batteri a convertire, seppure lentamente, le sideromicine in side¬

ramine. Alla presenza di quest'ultime è infatti probabilmente dovuta la rimozione

dell'effetto inibente provocato dall'aggiunta di ferrimicina alle culture di B. subti¬

lis. (Effetto riscontrabile dopo circa 12 ore dall'aggiunta dell'antibiotico). Allo

scopo di studiare più da vicino il meccanismo d'azione delle sideramine, ma

anche quello delle sideromicine (probabili donatrici di ferro), abbiamo condotto

una serie di ricerche sulla sintesi in vitro dell'emina.

*) Nei primi due terreni culturali, il glucosio è stato sterilizzato separatamen¬te in 5 mi di acqua dist. e quindi aggiunto asetticamente.

- 46 -

B) Considerazioni generali sulla biosintesi delle porfirine

Da lungo tempo era noto che la maggior parte degli animali, piante e micro¬

organismi sintetizzassero le proprie porfirine dai costituenti della loro dieta.

Ma dati più precisi sui processi metabolici occorrenti in questa biosintesi, non

poterono essere ottenuti fin quando la tecnica isotopica non venne applicata a

questo problema. Particolarmente importanti sono state, a tal riguardo, le ricer-

15che di Shemin & Rittenberg (1) i quali, somministrando N -glicina a sog¬

getti umani e a ratti, trovarono che l'isotopo veniva incorporato in alte percen¬

tuali nell'anello pirrolico dell'emina. Il ruolo della glicina, quale specifico pre¬

cursore dell'azoto dell'emina, fu stabilito in base al comportamento di altri com¬

posti contenenti azoto e, come la glicina, ugualmente marcati (per es. acido glu-

tamico, prolina, leucina etc). L'incorporazione di questi ultimi composti risul¬

tò essere nettamente inferiore rispetto a quella riscontrata nel caso della glicina.

Un altra componente importante di questa biosintesi è l'acido succinico che rea¬

gendo con la glicina, dà luogo alla formazione di acido & -aminolevulinico duran¬

te la sintesi delle porfirine. In generale, valga il seguente schema:

glicina + succhialo » acido 6 -aminolevulinico • porfobilinogeno '*

uroporfirina IH • coproporfirina HI * protoporfirina K

I enz., 2 Fé

T

emo

A tal punto è utile ricordare che diversi ricercatori * '' 'sono propensi a con¬

siderare l'incorporazione del ferro nelle porfirine, come la risultante di un pro-(24)

cesso enzimatico. Alcuni di essi* ' hanno identificato tale enzima, ma la sua

isolazione in forma pura non è stata ancora effettuata.

1) D. Shemin & J. Rittenberg : J.B.C. 16G, (1946)

- 47 -

1, Azione di alcuni siderocromi sulla sintesi in vitro dell'emina

Tenendo presente quanto poc'anzi riportato, e ricollegandoci a un'ipotesi(14)

formulata da Zahner e coli. x

,non sarebbe da escludere una diretta parte¬

cipazione delle sideramine a livello dell'enzima che presiede appunto all'incor¬

porazione del ferro. A tale livello, il ferro delle sideramine verrebbe ridotto

e lo ione ferroso trasportato su di una porfirina ancora esente da ferro quale

potrebbe essere una coproporfirina o la protoporfirina DC. La sideramina, ormai

priva di ferro, verrebbe rilasciata dall'enzima in attesa di legarsi nuovamente

al ferro. Quest'ultimo potrebbe essere presente sia come ione libero, sia come

facente parte di un complesso la cui costante di stabilità risulti essere inferiore

a quella della sideramina. La ferroporfirina verrebbe ulteriormente trasferita,

per esempio, ad un apoenzima. Allo scopo di accertare una tale possibilità da

parte di qualche siderocromo, abbiamo effettuato una serie di esperimenti sulla

sintesi in vitro dell'emina.

a) Materiali e metodi

1) Eritrociti (intatti) di anatra preparati secondo il metodo descritto da S h e -

.

(25,26,27)minv » ' '.

2) Acido succinico marcato con tritio (attività specifica: 1,76 • 10 Imp/min/ug)

3) Glicina (Hoffmann-La Roche)(23)(30)

4) Isolazione dell'emina mediante precipitazione con SnCl,A

.

(28)

5) Preparazione della protoporfirina secondo il metodo di Fischer et.alii.v

'.

6) Siderocromi: ferrioxamina B, desferrioxamina B, ferrimicina A, ferrieri-

sina.

7) Incubazione: 9 ore a 37 C. agitando.

8) Purificazione dell'emina e delle protoporfirine, mediante cromatografia su

(29)strato sottile secondo Stahlv '. Sistema solvente: cloroformio: acido ace¬

tico: acido formico (11:9:2).

- 48 -

b) Risultati

Dopo aver saggiata l'attività dei diversi siderocromi sopra elencati, è emer-

so che solo la ferricrisina, a una concentrazione pari alla 10 M, ha dato luo¬

go ad un lieve incremento della sintesi dell'emina (v. fig. 17). A cosa sia dovu¬

to questo particolare comportamento della ferricrisina, è difficile dirlo poiché

essa appartiene al gruppo dei siderocromi ad azione biologica poco nota. Resta

tuttavia da accertare, usando substrati più adatti, se anche le sideramine posso¬

no dar luogo a tale incremento. Infine, esperimenti condotti mediante aggiunta di

desferrioxamina B, hanno dimostrato che tale composto è in grado di legarsi al

ferro anche quando quest'ultimo si trova legato in composti la cui costante di

stabilità è relativamente alta (v. fig. 17).

I

Imp/min /

.500 / 10~lMoL

0 123 4.S678hg

Fig. 17 Effetto della ferricrisina e, rispettivamente, della desferrioxamina

x—*—* sulla sintesi in vitro dell'emina.

- 49 -

SOMMARIO

Nel corso di alcune indagini effettuate allo scopo di saggiare l'attività di

alcuni siderocromi su alcuni microorganismi (B. subtilis, E. coli) nonché sulla

sintesi in vitro dell'emina, è emerso quanto segue: la ferrimicina A e l'albo-

micina, già ad una concentrazione aggirantesi tra 0, 001 e 0,1 */ml sono in

grado di esercitare un rilevante effetto inibente sia sulla crescita che sulla sin¬

tesi nucleica e proteica dei microorganismi citati. Tuttavia, quest'azione iniben¬

te decresce col passare del tempo e ciò, molto probabilmente, è dovuto alla

conversione delle sideromicine in sideramine (= fattori di crescita). L'ipotesi^ '

di una partecipazione delle sideramine alla sintesi dell'emina, non ha dato i ri¬

sultati attesi. Tale sintesi, tuttavia, è stata leggermente favorita dall'aggiunta

di ferricrisina il cui meccanismo d'azione non è stato ancora perfettamente chia¬

rito (uno dei siderocromi ad azione biologica poco nota).

- 50 -

Ai colleglli tutti per la loro collaborazione e ospitalità, al Sig. H. Fried¬

rich per aver provveduto al materiale da esperimento e alla Sig. na L. Keel

per la sua preziosa assistenza nella parte tecnica, vadano i miei ringraziamenti.

- 51 -

BIBLIOGRAFIA

1) C. Martius & D. Nitz-Litzow: Biochim. et Biophys. Acta 1^, 134

(1953)

2) C. Martius & D. Nitz-Litzow: Biochim.et.Biophys. Acta 13, 152

(1954)

3) C. Martius & D. Nitz-Litzow: Biochem. Z. 327, 1 (1958)

4) C. Martius & D. Nitz - Litzow: Biochim.et Biophys.Acta 13, 289

(1954)

5) M.Billeter & C. Martius: Biochem. Z. _333, 430(1960)

6) C. Martius & H. O. Esser: Biochem. Z. 3_31, 1 (1958)

7) M.Billeter: Dissertatione E.T.H. Nr. 3176 (1961)

8) C. Martius: Angewandte Chemie 17/18, 597 (1961)

9) M.Billeter, W.Bollinger & C. Martius : Biochem. Z. 340, 290

(1964)

10) C. Martius : Schweiz.med.Wschr. 93, 1264(1963)

11) C. Alvino & C. Martius: Biochem. Z. 340, 316(1964)

12) H.Bickel, E.Gaumann, W. Keller-Schierlein, V.Prelog,

E.Vischer, H.Wettstein & H. Zahner : Experientia 16, 129(1960)

13) E.Bachmann & H.zahner: Archiv fiir Mikrobiologie 361, 326 (1961)

14) H.Zahner: Path. Mikrobiol. 25_, 708 (1962)

15) S.P.Colowick & N.O.Kaplan: Methode in Enzymology m, 448

(1957)

16) W.C. Schneider: Methods in Enzymology m, 680 (1957)

17) G.Ceriotti: J.Biol.Chem. 198, 297 (1952)

18) W. C. Schneider: J.Biol.Chem. 161, 293(1945)

19) J. Turkowa, O.Mikes & F.Sorm: Coli.d.Trav.Chim.Tchèques

(Prag) 27, 591 (1962)

20) G.F.Gause & M. G. Brazhnicova: Nov.Med.(Mosca) 23, 3(1951)

21) G.F.Gause: Brit.med.Journal Nr. 2_, 1177(1955)

22) R. F. Labbe: Biochim.et Biophys. Acta 31, 589 (1959)

23) G.Nishida & R. F.Labbe: Biochim. et Biophys. Acta 31, 519(1959)

24) H.Oyama, Y.Sugita, Y.Yoneyama & H. Yoshika: Biochim.

et Biophys. Acta 47, 413 (1961)

25) J.Wittenberg & D. Shemin: J.Biol.Chem. 178, 47 (1949)

- 52 -

26) D. Shemin & S. Kumin: J.Biol.Chem. 198, 827 (1952)

27) D. Shemin & S.C.Russel: J.Biol.Chem. 215, 613 (1955)

28) H.Fischer & B.Putzer: Z.Physiol.Ch. 1EÌ4, 39(1926)

29) E.Stahl: Chemiker Z. 82, 323 (1958)

30) G.Nishida & R. F.Labbe: Biochim. et Biophys. Acta 26, 437(1957)

CURRICULUM VITAE

Nato a Napoli il 26 aprile 1934, iniziai e completai la mia educazione sco¬

lastica in detta città. Conseguita la maturità scientifica presso il Liceo statale

V. Cuoco, mi iscrissi alla facoltà di Scienze biologiche ottenendo il diploma di

laurea. Durante il periodo universitario, lavorai come tecnico presso una nota

industria chimica. Nell'autunno del 1961 iniziai, presso il Politecnico Federale

di Zurigo (E.T.H.), il presente lavoro di dottorato sotto la guida del Prof. Dr.

C. Martius.

Zurigo, febbraio 1965 Claudio Alvino