06.11.2009

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Fundamentals of Biochemistry

Third Edition

Chapter 25 DNA Replication, Repair, and Recombination

Copyright 2008 by John Wiley & Sons, Inc.

Donald Voet Judith G. Voet Charlotte W. Pratt

Lernziele:

1. Verstehen, dass einige DNA Schden von einem einzigen Enzym repariert werden knnen.

2. Verstehen, dass beschdigte Basen durch 'base excision repair' und 'nukleotid excision repair' entfernt und ersetzt werden knnen.

3. Verstehen, dass Replikationsfehler durch 'mismatch repair' korrigiert werden knnen.

4. Verstehen, dass einige Reparaturmechanismen fehleranfllig sind.

U. Albrecht

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5. DNA Reparatur A. Einige Schden knnen direkt behoben werden

Pyrimidin Dimere

DNA Photolyase

gibt es im Menschen nicht

N5,N10 methenyltetrahydrofolat absrobiert UV und transferiert die Energie auf FADH-, welches ein Elektron zum Pyrimidin Dimer bring und es dabei spaltet.

Damit das Enzym seine Wirkung haben kann muss das Dimer nach aussen flippen, was relativ gut geht da das Dimer konformationsstrungen in der DNA verursacht und die Basen- paarung von Pyrimidin Dimeren nicht sehr stark ist.

U. Albrecht

Figure 25-30

B. Base excision repair (BER) bentigt eine Glycosylase

DNA Glycosylase entfernen die defekten Basen. Spalten glykosidische Bindung der vernderten Base -> deoxyribose bleibt brig. -> apurine oder apyrimidine Stelle = abasische Stelle. = AP sites. knnen auch durch spontane Hydrolyse von glyko- sidischen Bindungen entstehen. Desoxyribose dann durch eine AP Endonuclease auf einer Seite gespalten-> Deoxyribose und benachbarte Reste werden entfernt durch eine Exonuklease. -> die Lcke wird dann aufgefllt und verknpft durch DNA Polymerase und DNA Ligase.

Die Enzyme fr Basen-Excisions-Reparatur enthalten eine glycosylase (erkennt 8-oxoguanin) und eine Uracil-DNA Glycosylase (UDG) welche Uracil Reste entfernt. (Uracil Reste entstehen durch Cytosine Desaminierung) -> Grund warum DNA normalerweise Thymidin Reste und keine Uracil Reste enthlt)

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Figure 25-31

RntgenStruktur eines Komplexes von Uracil-DNA Glycosylase und 10bp DNA mit U-G Basenpaar

Uracil Rest

AP site

Arg 272 des Enzyms interkaliert und fllt Platz aus -> AP sites drfen nicht frei sein da sie cytotoxisch sind.

Wie sieht dieses Enzym Uracil Reste? Scannen der DNA durch binden -> wenn Uracil Rest -> DNA wird einfacher gebogen und Uracil kann einfach aus- geflippt werden.

U. Albrecht

Warum sind AP-sites cytotoxisch?

1) binden irreversibel topoisomerase I 2) die Ribose am AP-site hat keine glykosidische Bindung, d.h. Ring ffnet sich reversibel in seine lineare Form -> freie Aldehydgruppe -> kann sich cross-linken zu anderen zellulren Komponenten. -> AP-sites mssen von UDG enzym bedekt bleiben -> anschliessend wird UDG von AP endonuclease verdrngt aber schtzt die Zelle immer noch vor den cytotoxischen effekten von AP-sites.

U. Albrecht

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Figure 25-32

C. Nucleotide excision reparatur (NER) entfernt ein Segment eines DNA Stranges

Pyrimidin Dimere werden durch nukleotid excision Reparatur (NER) korrigiert.

Helix distortionen bilden die Angerpunkte fr diese Reparatur (nicht spezifische Nukleotiderkennung)

NER ist der Hauptmechanismus gegen 2 wichtige Karzinogene: UV licht und Tabakrauch.

In e. coli ist NER ein ATP abhngiger Prozess in dem UvrA, UvrB und UvrC proteine involviert sind. Dieses System spaltet den beschdigten DNA Strang and der 7 bzw. 3-4 Stelle welche das Dimer flankieren. Ein 11 oder 12nr langes Stck wird entfernt durch binden von UvrD.

Auffllen mit Pol I und DNA ligase.

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Cockayne Syndrome (CS): 3 genes defective as in XP but also 2 additional genes CSA and CSB

transcription arrest at nucleotide

dimer -> RNA Pol stops

CSA and CSB remove RNA Pol

and give way for DNA repair.

In cockayne syndrome DNA

cannot be reapired -> cells

undergo apoptosis.

-> death of transcriptionally

active cells -> developmental

symptoms of Cockayne syndrome

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Xeroderma Pigmentosum (XP)

im Menschen entfernen 16 proteine etwa 30 nt

lange Stcke.

Wenn defekt -> XP

Haut UV sensitiv -> Hautkrebs, Augenschden

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Figure 25-33

D. Mismatch Reparatur korrigiert Replikationsfehler

Mismatch -> spezieller Reparatur Mechanismus = Mismatch Repair (MMR)

entstehen durch slipping der DNA Polymerase

Defekt in MMR -> hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome (Lynch Syndrome)

In E. coli -> MMR via MutS, MutL and MutH Erkennen des neuen Stranges anhand von nicht Methylierung

In Menschen -> neuer Stragn nicht ber Methylierungsmuster erkannt wahrscheinlich via nicht geschlossene Nicks.

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Figure 25-34

E. Einige DNA Reparaturmechanismen fhren Fehler ein

UV-induzierte Thymin dimere knnen von DNA polymerase berbrckt werden. Es werden automatisch 2 A eingefgt. Dieses Enzym hat allerdings keine proofreading aktivitt und macht etwa alle 30 nt einen Fehler. Solche Polymerasen sind relativ hufig da sie die fr die normale DNA Replikationmaschinerie unzugnglichen DNA Abschnitte replizieren knnen. Mutation in DNA polymerase kann zu XP fhren.

Doppelstrangbrche knnen ber Endverbindungen repariert werden

Ionisiereden Strahlung und freie Radikale -> Doppelstrangbrche (DSB).

2 Mglichkeiten fr Reparatur:

-Reparatur ber Rekombination (siehe spter) -nichthomologes End-joining (NHEJ)

Bei NHEJ -> Protein Ku bindet DNA nicht sequenz- spezifisch -> hlt enden zusammen -> trimming -> generiert Mutationen aber ein nicht reparierter DSB wre schlimmer.

In E. Coli SOS response system als letzte Antwort auf Mutationen -> meiste Zellen sterben, aber ein kleiner Prozentsatz berlebt.

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Figure 25-35

6. Rekombination

Gene sind nicht unvernderlich.

Wenn sich homologe Chromosomen neben- eineander ausrichten knne die Einzelstrnge ausgetauscht werden in einem sogenannten crossing-over. Fremde DNA kann sich auch auf diese Weise in DNA Strang reinrekombinieren. DNA Stcke knnen sich in DNA Strang bewegen = Transposons.

In Figur ist ein Crossing-over gezeigt. Die Nichtschwesterchormatide knnen dort wo sie sich berkreuzen rekombinineren.

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Figure 25-36

Homologe Rekombination braucht mehrere Protein Komplexe

Homologe Rekombination and Orten wo hohe Sequenzhomologie zwischen den DNA Strngen herrscht.

Site-specific Rekombination and 2 kurzen, spezifischen Sequenzen.

Holliday Modell der homologen Rekombination

Branch migration U. Albrecht

Figure 25-37

Rntgenstruktur einer Holiday-Junction

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Figure 25-38

RecA veranlasst Rekombination in E. coli

RecA Protein polymerisiert auf ssDNA oder dsDNA. Bildet ein Polymer -> rechtshndige Helix mit ca 6.2 RecA monomeren pro Umdrehung. Pro monomer ca 3 Nukleotide -> 18 Nukleotide pro RecA polymer turn.

RecA vermittelt DNA Strangaustausch zwischen ssDNA und dsDNA

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Figure 25-39

Modell von RecA vermittelter Rekombination

Initittionskomplex dsDNA bindet-> 3 Strang Komplex ATP vermittelter Strangaustausch

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Figure 25-40

Modell fr RecA vermittelten Strangaustausch

U. Albrecht

Figure 25-41

RecBCD initiiert Rekombination durch Generieren von Einzelstrang-DNA

RecBCD Protein hat Helicase und Nuklease Aktivitt. Bindet an freies Duplex Ende (kommt normalerweis in E. Coli nicht vor, nur wenn Rekombination)

Exonuklease Aktivitt -> mehr am 3' -> krzere Segmente -> bis zur Chi sequenz -> 5' schnittrate wird erhht

-> 3' bleibt als ssDNA an welche RecA bindet -> Einzelstrang wird stabilisiert und kann fr Rekombination eingesetzt werden.

Chi Sequenzen -> erhhte Rekombinationsrate.

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Figure 25-42

RuvABC vermittelt Branch Migration und Auflsen der Holliday junction

Rntegnestruktur eines RivA-Holliday junction Komplexes

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Figure 25-43a

RuvAB Holliday-junction Komplex

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Figure 25-43b

RuvB

RuvB

RuvA

Auflsen des Komplexes ber Nuklease RuvC

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Figure 25-44

B. DNA kann durch Rekombination repariert werden

In haploiden Organismen wie Bakterien ist homologe Re- kombination selten (in transformationen). In mehrzelligen Organismen Gene shuffling nur whrend Meiose.

Warum haben dann Organismen ausgeklgelte Systeme fr homologe Rekombination?

Defekte Replikationsgabeln mindestens 1 mal pro Bakterien- generation. 10 x per eukaryontischem Zellzyklus.

-> solche DNA Schden ber homologe Replikation repariert. d.h. homologe Rekombination ist primr da um Fehler zu korrigieren. RuvA und RuvB sind teil der SOS response in Bakterien.

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Figure 25-45

Reparatur durch Rekombination rekonstituiert Doppelstrangbrche

DSBs knnen durch nonhomologes end-joining (NHEJ) repariert werden was aber zu Mutationen fhrt.

Homologes end-joining fhrt keine Mutationen ein setzt aber voraus, dass ein homologer DNA Strang vorhanden ist.

Der Prozess findet ber Holliday junctions statt.

Reparatur durch Rekombination scheint wichtig zu sein im Menschen. Defekte in BRCA1 und BRCA2 welche beide mit Rad51 interagieren sind korrelieren mit erhhtem Krebsrisiko (breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, pancreatic cancer).

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Figure 25-46

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C. Transposition rearragiert Segmente von DNA

Barbara McClintock beobachtete, dass die unterschieliche Farb- pigmentierung im Mais durch bewegliche genetische Elemente im Maisgenom entstehen. War gegen die Theorie dass Gene in einer fixierten Reihenfolge sind -> 20 Jahre unbeachtet bis auch in E. coli mobile genetische Elemente gefunden wurden.

Transposons bewegen Gene zwischen beliebigen Stellen im Genom in Prokaryonten wie in Eukaryonten. beeinflussen phenotypische Expression und evolutionre Entwicklung brauchen keine Homologie zwischen Donor und Akzeptor Stelle in der DNA.

1. Simple Transposons insertion elements max. 2000 bp codiert fr Transposase. Zielsequenz repetiert -> Einbau geschieht an berhngenden Ende der Ziel DNA

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Figure 25-47

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Modell fr Transposon Insertion

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2. Komplexere Transposons haben auch Gene die keine Rolle in der Transposition haben

Tn3 Transposon ist 4957 bp lang mit 38 nt repeats

Rekombination geschiet an AT reichen Stellen beim Internal resolution site.

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Figure 25-48

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3. Zusammengesetzte Transposons

knnen in der zentralen Region eine beliebige Sequenz haben und transponieren.

Figure 25-49

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Der Transpositionsmechanismus involviert Replikation

konnte isoliert werden

Der Rekombinationsprozess wird durch eine transposon codierte Resolvase katalysiert (nicht RecA).

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Figure 25-50

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Transposition ist verantwortlich fr genetische Rearrangements

Transposons frdern Inversionen, Deletionen und Rearrangements der DNA des Wirtes.

Tranposons sind die genetischen Werkzeuge der Natur. -> z.B. neue Proteine zusammensetzen aus transonierten Elementen, Transfer von genetischer Information zwischen nicht verwandten Spezies.

kann weiter transponieren