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Molekulare Virologie I
DNA (Virus) Vektoren
Dr. Armin Baiker, Max von Pettenkofer-Institut
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Adminstration2) Replikation3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Gliederung:
Plasmidreplicons:1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren:1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration
Nackte DNA
Replikationsdefiziente Viren
Replikationskompetente Viren
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration – nackte DNA
TransfektionPhysikalische Transfektionsmethoden1) Nadel Injektion in Gewebe / Inhalation 2) Hydrodynamischer Gentransfer3) Mikroinjektion in Nukleus4) „Gene Gun“ Transfer5) ElektroporationChemische Transfektionsmethoden1) Kalziumphosphat Co-Präzipitation2) Kationische Polymere 3) Kationische Lipide („non-bilayer forming“)4) Liposomen („bilayer forming“)
KondensationPositive Ladung(Membranfusion)
Transfektionsmethoden mit „nuclear localization signals“
Geringe Effizienz des Gentransfers
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration – Replikationsdefiziente Viren
Transduktion
Beibehaltung der Mechanismen der Ausgangsviren zur Infektion (Transduktion) von Zielzellen
Zusammenbau in z.T. komplexen Produktionssystemen
Häufig immunogen (humorale und zelluläre Immunantwort)
Nicht-integrierende Vektoren sind nur „transient“
Dadurch: sehr hohe Effizienz des Gentransfers
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Administration – Replikationskompetente Viren
Infektion
Anwendung (Studien) v.a. in der Therapie von Tumoren (onkolytische Viren) und in der DNA Vakzinierung
Basieren auf attenuierten bzw. genetisch modifiziertenreplikationskompetenten Viren
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:2) Replikation
(Indirekte) Replikation nach Integration ins Wirtschromosomstabile Expression eines Transgens
Kein Mechanismus zur Replikation vorhandenVerlust des Vektors während der Zellteilungen !transiente Expression eines Transgens
Mechanismen der episomalen Replikation vorhandenstabile Expression eines Transgens
- Kopienzahl des Vektors ?- Zellzyklus (MCM2-7) abhängige Replikation ?
Achtung: nicht mehr oder selten teilende Zellen !!!
ReplikationExkurs: „MCM2-7 licensing“
ORC1-6 assoziiert mit ORI
Schrittweise„assembly“ derInitiatorproteine:1) Cdc6, Cdt12) MCM 103) MCM 2-7
ORC: Origin recognition complexMCM: Minichromosome maintenance (replikative Helikase)Cdk: Cyclin dependent kinaseCdc: Cell division cycle proteinCdt1: cdc 10 dependent transcript 1RPA: Replication Protein ADpb: DNA Polymerase binding protein
S-Phase assoziierteCdK‘s:
Cdc6 Cdc7 / 45
Eintritt in S-Phase(DNA Replikation)
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:3) Nukleäre Retention (Persistenz)
(Indirekte) Retention nach Integration ins Wirtschromosomstabile Expression eines Transgens
Kein Mechanismus der Retention vorhandenVerlust des Vektors während der Zellteilungen !transiente Expression eines Transgens
Retentionsmechanismen von Episomen vorhandenstabile Expression eines Transgens
1) Kopienzahl-Strategie2) Bindung an Metaphasechromosom („piggy-back“) Strategie3) Centromer-Strategie4) Selektionsdruck-Strategie5) Verschiedene Endreplikationsstrategien linearer Episomen
Achtung: nicht mehr oder selten teilende Zellen !!!
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Adminstration2) Replikation3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Gliederung:
Plasmidreplicons1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationskompetente Viren1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren
Plasmidreplicons:
Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:1) Historisch: Vektoren für die Hefe2) Vektoren für Säugetierzellen
Virale Plasmidreplicons:1) Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon2) Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon3) Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon4) „Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention .
Kopienzahl
Replikation
Ja
STB (CEN) / Kopienzahl
50-100
2µm ORI
Ja
Selektionsdruck .
<10
ORI
Ja
CEN / TEL .
<10
ORI
2 µm - Plasmid ARS Plasmide YAC‘s
Selektionsmarker
ORI
ORID
REP1
IR
IR
FLPREP2
TEL CEN ORI TEL
Spindel (Metaphase)
Spindel (Metaphase)
„rolling circle“Replikations-intermediat
STB
1976 Nach 1976
ORC
ARS
ORI
Replikationder Plasmide !
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:Grundlagenforschung in der Hefe
Isolierung (Klonierung in Plasmide)
Entdeckung von autonom replizierenden Sequenzen (ARS)
Grundlagenforschung im Bereich der molekularen Chromosmenstruktur: ORI‘s, Centromere,Telomere
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:Grundlagenforschung in Säugetierzellen
Eine Übertragung der aus Hefe gewonnenen Erkenntnisse imBereich der Vektorologie auf Säugetierzellen ist sehr langenicht möglich (bis Ende der 1990er Jahre)
(Mögliche) Ursachen:1) Höhere Komplexität von Säugetier ORI‘s2) Technische Schwierigkeiten bei der Transfektion von
Säugetierzellen3) (unbekannte) Epigenetische (Kontroll-) Mechanismen:
- Kopplung von Replikation und Transkription- „Silencing“ durch Methylierung von Promotoren- Mechanismen der Etablierung von Episomen- ???
4) Mechanismen der angeborenen Immunität:- CpG Inseln im Plasmid „backbone“
Der DHFR Locus:
Ursachen:Exkurs: höhere Komplexität von Säugetier-ORI‘s
(ca. 25 kbp)
300 nm chromatin fibernuclear matrix
30 nm chromatin fibernucleosome
MAR
Ursachen:Exkurs: höhere Komplexität von Säugetier-ORI‘sMatrix attachment regions (MAR):
- AT-rich sequences of around 100 bp - 1 kbp- DNA unwinding elements / Base unpairing regions- DNase I hypersensitive sites- Topoisomerase II binding and cleavage sites
In eukaryotischer DNA:- Häufigkeit eines CpG Dinukleotids: 1:60- C sehr häufig methyliert: mCpG- „CpG-reiche“ (ca. 1:16) Regionen häufig assoziiert mit
Promotoren (epigenetische Regulation via „silencing“)
Ursachen:Exkurs: „CpG islands“
Statistische Wahrscheinlichkeit eines CpG Dinukleotids: 1:16
In bakterieller DNA:- Häufigkeit eines CpG Dinukleotids: 1:16- C nicht methyliert: CpG
Mechanismen der angeborenen Immunität können zwischenbakterieller und eukarytischer DNA differenzieren:- Erkannt werden: nicht methylierte CpG Motive- via TLR-9 „signalling“- B-Zellen und Plasmazytoide Dendritische Zellen (pDC‘s)
Ursachen:Exkurs: „CpG islands“
Produktion inflammatorischer Zytokine !
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Kopienzahl
Replikation
Ja
Selektionsdruck
<10
Chromosomaler ORI (!)
selectioncassette
Chromosomaler ORI (!)
Selektionsmarker
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:nicht-viral – Chromosomale ORI Vektoren
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Kopienzahl
Replikation
Ja
CEN / TEL
<10
Chromosomaler ORI
TEL CEN ORI TEL
Spindel (Metaphase)
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:nicht-viral – Künstliche Chromosomen
Zwei Arten der Konstruktion:- „top - down“ (durch Fragmentierung) [0,5 -1 Mbp]- „bottom – up“ (durch „assembly“ in vitro) [~ 10 Mbp]
Schlechte Handhabbarkeit (Mbp !!!)
1997
Instabilität (?)
Model für die Untersuchung der Chromosomenstruktur
Transkriptions-Komplex
SAF-A
MARs
mRNA
pEPI
Chromosom
Plasmidreplicons / künstliche Chromosomen:nicht-viral – pEPI-Vektoren
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Kopienzahl
Replikation
Ja
SAF-A Bindung an MARs
~10
Transkription in MARs
Kein definierter ORI:ORC und MCM‘s können an verschiedenenStellen des Plasmid „backbones“ assemblieren
Etablierte pEPI Episomen sind (auch ohne Selektionsdruck) mitotisch stabil
1999
Geeignet zur Herstellung transgener Tiere etc.(Schwein, Zebrafisch)
piggy back
Plasmidreplicons:
Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:1) Historisch: Vektoren für die Hefe2) Vektoren für Säugetierzellen
Virale Plasmidreplicons:1) Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon2) Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon3) Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon4) „Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA
Virale Plasmidreplicons:Das Simian Virus 40 (SV40)
Familie: Polyomaviren40 nm großes, ikosaedrisches KapsidNicht umhülltZirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (5300 bp)MCM 2-7 unabhängige Replikation(T-Antigen ist replikative Helikase)
5300 bp
Virale Plasmidreplicons:Exkurs: Polyomaviren und die Kernpore
Passives Diffusionslimit:10 nm
Importin (NLS) „mediated“:40 nm
Durchmesser: 40 nm
Polyomaviren „passen“ durch die Kernpore
Model für die Untersuchung:- der eukaryontischen DNA Replikation- der Chromatinstruktur (Nukleosomen)- der Genregulation („cis acting“ Enhancer)- des alternativen „splicing“
ab 1976
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Kopienzahl
DNA Replikation
Nein
Kopienzahl
100-1000
SV40 ORI + T-Antigen
Virale Plasmidreplicons:Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon
Anwendung in der Biotechnologie:- Plasmidvektoren mit SV40 ORI und Promoter in cis- Zellinien mit T-Antigen (293T, COS etc.) in trans
Immortalisierung (Transformation) von primären Zellen via T-Antigen („libraries“ !)
Das T-Antigen:- Bindung an SV40 ORI- MCM 2-7 unabhängige, replikative Helikase- Virales Onkoprotein (Inaktivierung von p53 und pRB)- Immunogene Eigenschaften
Virale Plasmidreplicons:Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon
heute
Virale Plasmidreplicons:Papillomaviren (HPV / BPV)
Familie: Papillomaviren55 nm großes, ikosaedrisches KapsidNicht umhülltZirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (7900 bp)MCM 2-7 unabhängige Replikation(E1 ist replikative Helikase)
Virale Plasmidreplicons:Exkurs: Papillomaviren und die Kernpore
Passives Diffusionslimit:10 nm
Importin (NLS) „mediated“:40 nm
Durchmesser: 55 nm ?
Genauer Mechanismus unbekannt
Chromosom
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention .
Kopienzahl
DNA Replikation
Nein
(E1 +) E2 - Chromsom(Kopienzahl)
~ 50 - 150
BPV ORI + E1 + E2
E2
piggy back
Virale Plasmidreplicons:Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon
E1
1980
Anwendung in der Biotechnologie:als BPV 69T Fragment(Depletion von L1 und L2)
Immortalisierung (Transformation)von primären Zellen:E6: p53-DegradationE7: Inaktivierung von pRB
„Warzenbildung“ in vitro
Replikation:E1 ist die replikative Helikase (MCM 2-7 unabhängig)
Retention:E2 (E1) Bindung an Chromosom („piggy back“)
heute (selten)
Virale Plasmidreplicons:Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon
Virale Plasmidreplicons:Das Epstein-Barr Virus (EBV)
ori P ori lyt ori lyt
172 kbp
IR: inverted repeatTR: terminal repeatU: unique regionori P: latenter (Plasmid) Oriori lyt: lytischer ORI
Familie: Herpesviren160 nm großes, umhülltes VirusIkosaedrisches KapsidDoppelsträngiges DNA Genom (172 kbp):- Linear im Virion- Zirkular nach Rezirkularisierung im ZellkernMCM 2-7 abhängige latente Replikation (ori P) MCM 2-7 unabhängige lytische Replikation (ori lyt)
Passives Diffusionslimit:10 nm
Importin (NLS) „mediated“:40 nm
Durchmesser: <160 nm
Andocken des viralen Kapsids und Injektion der DNA
Virale Plasmidreplicons:Exkurs: Herpesviren und die Kernpore
Virale Plasmidreplicons:Exkurs: Komplexe Replikation von Herpesviren
A: Eintritt in Zelle (Fusion / Endocytose)
B: Freisetzung des Kapsids
C: Transport zu Kernporen
D: Einschleussen des linearen Genoms in NukleusRezirkularisierung:- Kaskadenartige Genexpression (IE, E, L)
- Latente Replikation via ori P
- Lytische Replikation via ori lyt:Bildung von Konkatemeren (RCA)
E: Verpackung der Genome in Kapside
F: „Budding an innerer Kernmembran“ (Envelopment)
G: De-Envelopment am ER ins Zytoplasma
H: Re-Envelopment am TGN
I: Freisetzung an Zelloberfläche
AB
CD
EF
G
H
I
Virale Plasmidreplicons:Das Epstein-Barr Virus (EBV) – lytische Replikation
rolling circleAmplifikation (RCA)
MCM 2-7 unabhängig
ori lyt
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention .
Kopienzahl
DNA Replikation
EBNA
FR 24 x
DS 4 x
ORC / MCM 2-7
Chromosom
Ja
OriP (FR) + EBNA1 - Chromosom .
~10
OriP (DS) + EBNA1
EBNA
piggy back
Virale Plasmidreplicons:Das EBV („low copy number“) Plasmidreplicon
EBNA1
EBNA1
ORC / MCM2-7 – RekrutierungReplikation
FR
DS
Nukleäre Retention
1985 Latenz-ORI: ori P
FR: family of repeats (24 x)DS:dyad symmetry element (4 x)
40 89 325 386 450 609 641
Gly
-Arg
UR
1
Gly
-Arg
UR
2
NLS
LR1 LR2Gly-Ala DBD
Chromatin Bindung ori P Bindung
EBNA1
TetR::HMGA1a
HMGA1a::EBNA1
AT-
hook
acid
ic
HMGA1a
linke
r
386 450 609
NLS
DBD
ori P Bindung
641
AT-
hook
AT-
hook
TetR TetR
HMGA1aTetR
linke
r AT-
hook
acid
ic
AT-
hook
AT-
hook
Virale Plasmidreplicons:„Substituted“ EBV Plasmidreplicons
HMGA1: high mobility group AT hook 1TetR:Tetracyclin Repressor
(Chromatin Bindung)
(Chromatin Bindung)(Tet Operator Bindung)
Das EBV Plasmidreplicon ist substituierbar:hier gezeigt: Substitutionen von EBNA1
FR
ORC-Bindung
Chromosomaler ORI
EBNA1
Replikation
FR
4 x TetO
Doxycyclin
EBNA1
TetR::HMGA1a
Replikation
FR
DS
Nukleäre Retention
HMGA1a::EBNA1
Replikation
HMGA1a::EBNA1
Virale Plasmidreplicons:„Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Nukleäre Retention Nukleäre Retention
Das EBV Plasmidreplicon ist substituierbar:hier u.a. gezeigt: Substitutionen des ori P (FR bzw. DS)
Trennung von Replikation und nukleärer Retentionpraktische Anwendung z.B. als „ori fishing“ Vektoren
FR: family of repeats (24 x)DS:dyad symmetry element (4 x)
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Adminstration2) Replikation3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Gliederung:
Plasmidreplicons1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationskompetente Viren1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren
Replikationsdefiziente Viren:Das Adenovirus (Ad)
E: earlyL: lateITR: inverted terminal repeatsPsi: Verpackungssignal
Familie: Adenoviren60-90 nm großes, nicht umhülltes VirusIkosaedrisches Kapsidca. 51 bekannte, humanpathogene Ad SerotypenLineares, doppelsträngiges DNA Genom (30-36 kbp):MCM 2-7 unabhängige lytische ReplikationReplikation startet an den „Enden“Rezeptoren: CAR, Integrine
36 kbp
Durchmesser: 60-90 nm
Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Adenovirus und die Kernpore
Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Adenovirale (End-)replikation
G
G
TP dCMP
TP CTPC
G
G
TP C
TPC
5‘
3‘
5‘3‘
3‘
3‘
5‘
3‘
5‘ E2A
G
G TPC 5‘3‘
3‘TP dCMP
5‘
5‘
TP C5‘
G 3‘
+
Lineares Ad Genom mit55 kDa TP an 5‘ Enden
G/C Paarung zwischen80 kDa TP-dCMP unddem G des 3‘ Endesdes Ad Genoms
dCMP bildet freie 3‘ OH-Gruppe als Primer fürdie Replikation
Der nicht-replizierte, einzelsträngige, E2A gebundene DNA-Strang dient als Matrize…
E2A
Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Adenovirale (End-)replikation
G 3‘
TPC 5‘
TPdCMP 5‘3‘
G
G TPC 5‘3‘
3‘TP dCMP
5‘
…für die weitere Replikation unter Ausbildung einer „Pfannenstielstruktur“via ITR‘s (internal terminal repeats)
E2A
ITR‘s
Replikationsdefiziente Viren:Das Adenovirus (Ad) – weitere Informationen
Das „splicing“ wurde an Adenoviren entdeckt
1977: Erstbeschreibung der (Ad transformierten)293 Zellen (Graham et al.)
Transformation durch die E1 Proteine:- E1A Inhibition von pRB- E1B Inhibition von p53
In Kombination führen beide Proteine zur Transformationvon Zellen in vitro
Daher: in allen replikationsdefizienten Adenoviren ist das Gen für E1 deletiert
E1 E3L1 L5L4L3 E4L2E2
L5L4L3 E4L2E2Transgen
Transgen
Wildtyp Ad
AV – 1.gen.
AV – 2.gen.
AV – 3.gen.*
ITR ITR
ITR
ITR
ITR
ITRL1 E3
L5L4L3 E4L2E2Transgen L1
ITR
ITR
Replikationsdefiziente Viren:Adenovirale Vektoren (schematisch)
Δ E1Klonierungskapazität: 5.2 kbp
Δ E1 Δ E3 (oder E2 oder E4)+Klonierungskapazität: bis 13 kbp
Klonierungskapazität: 36 kbpΔ E1-E4 und L1-L5
(*auch bezeichnet als „gene-deleted“ oder „gutless“ AV)Komplexität des
Produktionssystems
Genom: 30-36 kbp
transgeneproduction release of
DNA intonucleus
cellularentry
endosomalrelease
Transduktion mit AV‘s
L5L4L3 E4L2E2transgene AV – 1.gen.
tg
E1
mRNAtranscription
Produktion von „1. Generation“ adenoviralen Vektoren (AV‘s)
ITR ITR
E3E4AAA
AAA
AAA
AAA
viral DNA replication=
productionof viralproteins
encapsidationof AV-DNA
AV release
L1 E3
tg
tg
assembly
nuclearporecomplex
E1
E2
L4
L3L2
L1 AAA
AAA
AAAAAA
Δ E1
Replikationsdefiziente Viren:Adenovirale Vektoren (AV) – Zusammenfassung
Administration (Transduktion) als replikationsdefiziente VirenDadurch: sehr effizienter Gentransfer auch in nicht-teilendeZellen !
Keine Möglichkeit der ReplikationDadurch: nur transiente Expression eines Transgens
Mechansimen der nukleären Retention sind nicht vorhanden(bzw. ungeklärt)Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens
AV sind immunogen (z.B. neutralisierende AK !)Dadurch: wiederholte Behandlungen sind nicht effizient
Erfolgreicher Gentherapie-Vektor:Häufiger Einsatz in klinischen Studien
Replikationsdefiziente Viren:Das Adeno assoziierte Virus (AAV)
ITR: inverted terminal repeatrep: Replikationsproteinecap: Kapsid Proteine
Hammerkopfstruktur
Familie: Parvoviren20 nm großes, nicht umhülltes VirusKönnen Menschen infizieren; keine Pathogenität !Lineares, einzelsträngiges (-) DNA Genom (4.7 kbp)Benötigen Helferviren (Adenoviren, Herpesviren) für eine produktive Virusvermehrung (Faktoren z.B. Ad E1A)Ohne Helferviren: site specific integration in Chromsom 19(ITR und rep benötigt)Rezeptoren: Heparansulfat, Integrine, FGFR
Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: Parvoviren und die Kernpore
Passives Diffusionslimit:10 nm
Importin (NLS) „mediated“:40 nm
Durchmesser: 20 nm
Parvoviren „passen“ durch die Kernpore
Replikationsdefiziente Viren:Exkurs: AAV (End-)replikation
Neusynthetisierte DNAtrs: terminal resolution siteRep: ReplikationsproteinITR: inverted terminal repeatsITR‘s
Produktive Replikationbedingt Anwesenheit eines Helfervirus !
rep cap
ITR ITR
ITRITR
transgene
Wildtyp AAV
AAV Vektor
Replikationsdefiziente Viren:AAV Vektoren (schematisch)
Klonierungskapazität: 4.8 kbp
Genom: 4.7 kbp
Für die Produktion von AAV Vektoren:(1) Bereitstellung von rep und cap(2) Bereitstellung von Helferviren (Koinfektion)
rep cap
ITR ITR
ITRITRtransgene
tg
repcap
1
2
tg
repcap
mRNA
transcriptionE2 E4
E3
AAAAAA
AAA
rep cap AAA
viral DNA replication
tg
productionof viralproteins
tgtg
tg
tg
tg
tg
tg
encapsidationof DNA
AAVV and helper-AD release
helper-AD cellularentry
tg
nuclearentry of AAVV
tg
tg
transgeneproduction
E1
E1 AAA
tg
assembly
wild-type AAV
AAVV
release of DNA intonucleus
Transduktion mit AAV Vektoren
Produktion von AAV Vektoren
Replikationsdefiziente Viren:AAV Vektoren – Zusammenfassung
Administration (Transduktion) als replikationsdefiziente VirenDadurch: sehr effizienter Gentransfer auch in nicht-teilendeZellen !
Keine Möglichkeit der ReplikationDadurch: nur transiente Expression eines Transgens
Mechansimen der nukleären Retention sind nicht vorhanden(bzw. ungeklärt)Dadurch: nur transiente Expression eines Transgens
AAV Vektoren sind wenig immunogen
Erfolgreicher Gentherapie-Vektor:Häufiger Einsatz in klinischen StudienAktuell: Einsatz als DNA Vakzinierungs Vektor gegen HIV
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Adminstration2) Replikation3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Gliederung:
Plasmidreplicons1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationskompetente Viren1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren
Familie: PoxvirenZweitgrößtes bekanntes Virus (300 x 200 x 100 nm) Lineares, doppelsträngiges DNA Genom (190.000 kbp)Kovalente Bindung der beiden DNA Stränge an den Enden ! Replikation im Zytoplasma !Vacciniavirus: Impfstoff gegen Pocken (Jenner – Ende 18. Jhd.)
Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Viren
Familie: Mimiviren Ikosaedrisches KapsidZirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (1.200.000 kbp)Durchmesser: 400 nm (80 nm Fibrillen)> 1200 ORFs (u.a. Translationsfaktoren, tRNAs, Topoisomerasen)Isoliert aus AmöbenAssoziiert mit Pneumonien (?)
Exkurs: Das Mimivirus
2003
Mycoplasmen: ca. 800 kb !
Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Viren – Replikation im Zytoplasma !
Durch zytoplasmatische Replikation können auch sichnicht-teilende Zellen infiziert werden
Kovalente Bindungder linearen DNA Enden
Replikationskompetente Viren:1) Vaccinia Viren - Zusammenfassung
Administration (Infektion) als replikationskompetente Viren
Durch zytoplasmatische Replikation können auch sichnicht-teilende Zellen infiziert werden
Vaccinia Viren (Stamm MVA „modified Vaccinia Ankara“)kommen häufig zum Einsatz als Vakzinierungsvektorenz.B. rekombinantes MVA-basiertes HIV Vakzin
Weiterhin: dienen als Impfstoff gegen Pocken !
In der Biotechnologie: MVA-Vektoren zur Überexpression der T7 RNA PolymeraseDadurch: Überexpressionssystem von Genen, die hinter T7 Promotoren geschaltet sind (in fast allen kommerziellen Vektoren präsent als Ansatzstelle für Sequenzierprimer)
Replikationskompetente Viren:2) Onkolytische Viren - Geschichte
Aus einer klinischen Beobachtung wird eine Therapieform !
Replikationskompetente Viren:2) Onkolytische Viren – Aktuell: ONYX - 015
ONYX-015 (CI-1042 bzw. H101):
Modifiziertes Adenovirus
Repliziert in und tötet selektiv Zellen mit p53 Mutationen
Mutationen in p53 sind die häufigste genetische Abnormalität von Krebszellen
Onyx-015 trägt eine loss of function Mutation im E1B Lokus
E1B bindet und inaktiviert das Tumor Suppressor Protein p53
Da Wildtyp Ad p53 inaktivieren müssen, um zu replizieren, lässt ONYX-015 (welches dies nicht mehr kann) gesunde Zellen unbeeinflusst
November 2005:Shanghai Sunway Biotech Co. Ltd. announced today that the Chinese State Food and Drug Administration (SFDA) has approved H101 to be used in combination with chemotherapy as a treatment for patients with late stage refractory Nasopharyngeal cancer, a type of head and neck cancer prevalent in China. This marks the first oncolytic viral therapy approved by any regulatory agency in the world.
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:1) Adminstration2) Replikation3) Nukleäre Retention (Persistenz)
Gliederung:
Plasmidreplicons1) nicht-viral2) viralReplikationsdefiziente Viren1) Adenovirale (Ad-) Vektoren2) Adeno-assoziiertes Virus (AAV-) Vektoren
Überblick über aktuelle Gentherapiestudien
Replikationskompetente Viren1) Vaccinia Virus Vektoren2) Onkolytische Viren
Überblick über aktuelle Gentherapie Studien: Verwendete Vektoren - Stand: 2008
1309Total
0.912Multi-Country
0.11Africa1.519Australia
2.8
1.2
0.6
37
16
8
Japan
China
Asia *
27.3
11.5
5.7
3.2
1.5
1.5
1.1
358
150
74
42
20
19
15
UK
Germany
Switzerland
France
Belgium
Italy
Europe *
67.4
66
882
864USA
America%Number
Gene Therapy ClinicalTrials
CountryContinent
Überblick über aktuelle Gentherapie Studien: Differenziert nach Kontinent / Land - Stand: 2008
Molekulare Virologie I„DNA (Virus-) Vektoren“
Vielen Dank für ihreAufmerksamkeit !
Dr. Armin Baiker, Max von [email protected]