DNA ExtractionDNA ExtractionΓαβρίλης ΗλίαςΓαβρίλης Ηλίας –– ΧημικόςΧημικός

M.Sc. M.Sc. Διδακτική βιολογικών Διδακτική βιολογικών μαθημάτων.μαθημάτων.

M.Sc. M.Sc. Καθηγητών Φυσικών Επιστημών.Καθηγητών Φυσικών Επιστημών.Συνεργάτης του ΕΚΦΕ ΝικαίαςΣυνεργάτης του ΕΚΦΕ Νικαίας

Απαιτούμενα όργανα και Απαιτούμενα όργανα και αντιδραστήρια.αντιδραστήρια.

ΟΡΓΑΝΑΟΡΓΑΝΑ 1 Μικρό ποτήρι ζέσεως 1 Μικρό ποτήρι ζέσεως

των 50 των 50 ml.ml. Ηλεκτρική Ηλεκτρική

οδοντόβουρτσα.οδοντόβουρτσα. Υδατόλουτρο 50Υδατόλουτρο 50 00C.C. 1 μεγάλος δοκιμαστικός 1 μεγάλος δοκιμαστικός

σωλήναςσωλήνας

ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Εμφιαλωμένο νερό Εμφιαλωμένο νερό PH=7,6).PH=7,6). Απορρυπαντικό για το Απορρυπαντικό για το

πλύσιμο των πιάτων πλύσιμο των πιάτων (συμπυκνωμένο).(συμπυκνωμένο).

Πρωτεάση από τα χαπάκια Πρωτεάση από τα χαπάκια για τον εβδομαδιαίο για τον εβδομαδιαίο καθαρισμό των φακών καθαρισμό των φακών επαφής (Περιέχουν επαφής (Περιέχουν σαμντιλυσίνη).σαμντιλυσίνη).

Ταινίες Ταινίες PHPHμερικές.μερικές. Μαγειρικό αλάτι Μαγειρικό αλάτι (NaCl).(NaCl). Κρύα Αιθανόλη (Έχει Κρύα Αιθανόλη (Έχει

τοποθετηθεί στην τοποθετηθεί στην κατάψυξη για 20 κατάψυξη για 20 min).min).

Μεταφέρουμε στο ποτηράκι Μεταφέρουμε στο ποτηράκι 10-20 10-20 ml ml εμφιαλωμένο νερό.εμφιαλωμένο νερό.

Χρησιμοποιούμε Χρησιμοποιούμε την ηλεκτρική την ηλεκτρική οδοντόβουρτσα για οδοντόβουρτσα για να αποσπάσουμε να αποσπάσουμε επιθηλιακά επιθηλιακά κύτταρα από το κύτταρα από το εσωτερικό του εσωτερικό του μάγουλου, τη μάγουλου, τη γλώσσα και τον γλώσσα και τον ουρανίσκο.ουρανίσκο.

Τρόπος παραλαβής των κυττάρων.Τρόπος παραλαβής των κυττάρων.

Τρίβουμε με την Τρίβουμε με την οδοντόβουρτσα το οδοντόβουρτσα το εσωτερικό του εσωτερικό του μάγουλου και τα μάγουλου και τα άλλα σημεία.άλλα σημεία.

Σταματάμε τον Σταματάμε τον κινητήρα και τον κινητήρα και τον βάζουμε να βάζουμε να «στροφάρει» μέσα «στροφάρει» μέσα στο νερό.στο νερό.

Τρόπος παραλαβής των κυττάρων.Τρόπος παραλαβής των κυττάρων.

Η διαδικασία αυτή Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται επαναλαμβάνεται επανειλημένα (15-επανειλημένα (15-20 φορές), μέχρι 20 φορές), μέχρι το νερό να το νερό να θολώσει αρκετά.θολώσει αρκετά.

Τρόπος παραλαβής των κυττάρων.Τρόπος παραλαβής των κυττάρων.

Αυτό γίνεται για να Αυτό γίνεται για να συλλεγούν όσο το συλλεγούν όσο το δυνατόν δυνατόν περισσότερα περισσότερα κύτταρα.κύτταρα.

Προσθήκη απορρυπαντικού.Προσθήκη απορρυπαντικού.

Στο θολό αιώρημα Στο θολό αιώρημα των κυττάρων των κυττάρων προσθέτουμε 5-6 προσθέτουμε 5-6 σταγόνες σταγόνες συμπυκνωμένου συμπυκνωμένου απορρυπαντικού.απορρυπαντικού.

Αναδεύουμε Αναδεύουμε κατόπιν για να κατόπιν για να ομογενοποιηθεί το ομογενοποιηθεί το αιώρημα.αιώρημα.

Ο ρόλος του απορρυπαντικούΟ ρόλος του απορρυπαντικού

Το Το απορρυπαντικό απορρυπαντικό αποδιατάσσει τις αποδιατάσσει τις κυτταρικές και κυτταρικές και τις πυρηνικές τις πυρηνικές μεμβράνες,μεμβράνες, επιτρέποντας στο επιτρέποντας στο DNA DNA

να ελευθερωθεί να ελευθερωθεί στο διάλυμα.στο διάλυμα.

Έλεγχος Έλεγχος PH PH μετά την προσθήκη μετά την προσθήκη του απορρυπαντικού.του απορρυπαντικού.

Το εμφιαλωμένο νερό Το εμφιαλωμένο νερό έχει έχει PH=7,6.PH=7,6.

Μετά την προσθήκη Μετά την προσθήκη του απορρυπαντικού του απορρυπαντικού το ΡΗ θα ανέβει.το ΡΗ θα ανέβει.

Εμείς θέλουμε να Εμείς θέλουμε να πετύχουμε ένα ΡΗ πετύχουμε ένα ΡΗ γύρω στο 8.γύρω στο 8.

Αυτό είναι και το Αυτό είναι και το ρυθμιστικό διάλυμα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων λύσης των κυττάρων που χρησιμοποιούμε.που χρησιμοποιούμε.

Έλεγχος για τη ρύθμιση του ΡΗΈλεγχος για τη ρύθμιση του ΡΗ

Ελέγχουμε αν Ελέγχουμε αν το ΡΗ του το ΡΗ του αιωρήματος αιωρήματος λύσης των λύσης των κυττάρων κυττάρων έχει την έχει την επιθυμητή επιθυμητή τιμή ΡΗ.τιμή ΡΗ.

Προσθήκη πρωτεάσηςΠροσθήκη πρωτεάσης

Χρησιμοποιούμε τις Χρησιμοποιούμε τις ταμπλέτες για τον ταμπλέτες για τον πρωτεϊνικό καθαρισμό πρωτεϊνικό καθαρισμό των φακών επαφής.των φακών επαφής.

Οι ταμπλέτες Οι ταμπλέτες περιέχουν το περιέχουν το πρωτεολυτικό ένζυμο πρωτεολυτικό ένζυμο σαμντιλυσίνη.σαμντιλυσίνη.

Η σαμντιλυσίνη δεν Η σαμντιλυσίνη δεν κάνει διάκριση κάνει διάκριση πλευρικών ομάδων πλευρικών ομάδων στα σημεία κοπής.στα σημεία κοπής.

Αναδεύουμε αργά το διάλυμα για Αναδεύουμε αργά το διάλυμα για 15 15 minmin

Στο διάστημα αυτό Στο διάστημα αυτό επιδιώκουμε: επιδιώκουμε:

Τη λύση των Τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών κυτταρικών μεμβρανών για απελευθέρωση του για απελευθέρωση του DNA.DNA.

Την υδρόλυση των Την υδρόλυση των πρωτεϊνών (ιστόνες πρωτεϊνών (ιστόνες κλπ) που πακετάρουν το κλπ) που πακετάρουν το DNA.DNA.

Την αδρανοποίηση Την αδρανοποίηση νουκλεασών που νουκλεασών που ελευθερώνονται με τη ελευθερώνονται με τη λύση των κυττάρων. λύση των κυττάρων.

Τοποθετούμε το ποτηράκι στο Τοποθετούμε το ποτηράκι στο υδατόλουτρο 50 υδατόλουτρο 50 00C C για 15 για 15 min.min.

Η τοποθέτηση στο Η τοποθέτηση στο υδατόλουτρο υδατόλουτρο γίνεται για να γίνεται για να υποβοηθηθεί και να υποβοηθηθεί και να επιταχυνθεί η επιταχυνθεί η διαδικασία λύσης διαδικασία λύσης και και απελευθέρωσης απελευθέρωσης του του DNA.DNA.

Αναδεύουμε αργά με τη γυάλινη ράβδο όσο Αναδεύουμε αργά με τη γυάλινη ράβδο όσο το ποτηράκι βρίσκεται στο υδατόλουτροτο ποτηράκι βρίσκεται στο υδατόλουτρο

Προς το τέλος της διαδικασίας Προς το τέλος της διαδικασίας προσθέτουμε το προσθέτουμε το NaCl.NaCl.

Το διάλυμα του Το διάλυμα του NaCl NaCl πρέπει να πρέπει να είναι αρκετά πυκνόείναι αρκετά πυκνό

Γιατί προστίθεται Γιατί προστίθεται 5M NaCl;5M NaCl;((Πρακτικά εμείς προσθέτουμε 5-6 μικρές «σπαθίδες»με το κουταλάκι των Πρακτικά εμείς προσθέτουμε 5-6 μικρές «σπαθίδες»με το κουταλάκι των

αντιδραστηρίωναντιδραστηρίων

Τα ιόντα Τα ιόντα NaNa++ του του NaCl NaCl συνδέονται με τις συνδέονται με τις φωσφορικές ομάδες των φωσφορικές ομάδες των μορίων του μορίων του DNA, DNA, εξουδετερώνοντας το εξουδετερώνοντας το ηλεκτρικό φορτίο των ηλεκτρικό φορτίο των μορίων του μορίων του DNA. DNA.

Η προσθήκη του Η προσθήκη του NaCl NaCl επιτρέπει στα μόρια τουεπιτρέπει στα μόρια του DNA DNA να πλησιάσουν αντί να πλησιάσουν αντί να απομακρύνονται, να απομακρύνονται, διευκολύνοντας με αυτό διευκολύνοντας με αυτό τον τρόπο την τον τρόπο την καταβύθιση καταβύθιση του του DNA DNA στο διάλυμα μετά την στο διάλυμα μετά την προσθήκη της αλκοόληςπροσθήκη της αλκοόλης..

Ψύχουμε το διάλυμα βυθίζοντας σε νερό ώστε να Ψύχουμε το διάλυμα βυθίζοντας σε νερό ώστε να επανέλθει σε θερμοκρασία περιβάλλοντοςεπανέλθει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος

Στη διάρκεια αυτή Στη διάρκεια αυτή και μέχρι να ψυχθεί και μέχρι να ψυχθεί το διάλυμα το διάλυμα αναδεύουμε αναδεύουμε διαρκώς για 10 διαρκώς για 10 min.min.

Μεταφέρουμε το διάλυμα στον Μεταφέρουμε το διάλυμα στον μεγάλο δοκιμαστικό σωλήνα.μεγάλο δοκιμαστικό σωλήνα.

Προσθέτουμε διπλάσια ποσότητα Προσθέτουμε διπλάσια ποσότητα κρύας αιθανόληςκρύας αιθανόλης

Η προσθήκη της Η προσθήκη της αιθανόλης γίνεται αιθανόλης γίνεται από τα τοιχώματα από τα τοιχώματα του δοκιμαστικού του δοκιμαστικού σωλήνα, υπό κλιση σωλήνα, υπό κλιση ώστε να μη ώστε να μη διαταραχτεί η διαταραχτεί η πυκνότερη κάτω πυκνότερη κάτω στοιβάδα.στοιβάδα.

Ο ρόλος της αιθανόλης.Ο ρόλος της αιθανόλης. Το Το DNA DNA δεν μπορεί να δεν μπορεί να

διαλυθεί σε αλκοόλη.διαλυθεί σε αλκοόλη. Όταν η αλκοόλη είναι Όταν η αλκοόλη είναι

κρύα έχουμε ακόμη κρύα έχουμε ακόμη μικρότερη μικρότερη διαλυτότητα. διαλυτότητα.

Η προσθήκη κρύας Η προσθήκη κρύας αλκοόλης δημιουργεί αλκοόλης δημιουργεί συσσωματώματα συσσωματώματα DNA DNA με αποτέλεσμα με αποτέλεσμα να καταβυθίζονται να καταβυθίζονται στο διάλυμαστο διάλυμα

Βυθίζουμε τη ράβδο και αναδεύουμε ελαφρά στη Βυθίζουμε τη ράβδο και αναδεύουμε ελαφρά στη μεσεπιφάνεια των 2 στοιβάδων χωρίς να τις μεσεπιφάνεια των 2 στοιβάδων χωρίς να τις

διαταράξουμεδιαταράξουμε

Μετά από 15Μετά από 15-20-20 min min εμφανίζεται ένα πρώτο «θόλωμα» στο εμφανίζεται ένα πρώτο «θόλωμα» στο

κάτω μεσαίο τμήμα της αλκοολικής στοιβάδας.κάτω μεσαίο τμήμα της αλκοολικής στοιβάδας. Η διαδικασία Η διαδικασία

εμφάνισης του εμφάνισης του θολώματος θολώματος επιταχύνεται αν επιταχύνεται αν γέρνουμε προς τα γέρνουμε προς τα πλάγια και πλάγια και επαναφέρουμε τον επαναφέρουμε τον σωλήνα, ώστε οι σωλήνα, ώστε οι στοιβάδες να στοιβάδες να κάνουν επαφή αλλά κάνουν επαφή αλλά να μην να μην διαταράσσονται.διαταράσσονται.

Μετά από μισή ώρα εμφανίζονται στη θολή Μετά από μισή ώρα εμφανίζονται στη θολή

στοιβάδα οι πρώτες λευκές ίνες.στοιβάδα οι πρώτες λευκές ίνες.

Όσο περνά η ώρα οι ίνες γίνονται Όσο περνά η ώρα οι ίνες γίνονται πιο ευδιάκριτες.πιο ευδιάκριτες.

Φωτογραφίες των ινών με Φωτογραφίες των ινών με διάφορους φωτισμούς.διάφορους φωτισμούς.

Κοντινή φωτογραφίαΚοντινή φωτογραφία

Η αλκοολική Η αλκοολική στοιβάδα στοιβάδα τραβηγμένη από τραβηγμένη από κοντά.κοντά.

Στο φως του εργαστηρίου.Στο φως του εργαστηρίου.

……και στο σκοτάδι με φακό.και στο σκοτάδι με φακό.

Οι ίνες αιωρούνται όταν τις Οι ίνες αιωρούνται όταν τις τινάζουμε με ένα καλαμάκι.τινάζουμε με ένα καλαμάκι.

Μεγέθυνση των αιωρούμενων ινών.Μεγέθυνση των αιωρούμενων ινών.

ΓΑΒΡΙΛΗΣ ΗΛΙΑΣΓΑΒΡΙΛΗΣ ΗΛΙΑΣ

ΤΕΛΟΣΤΕΛΟΣ