Differents Modes de Chromatographie Liquide

7/25/2019 Differents Modes de Chromatographie Liquide

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MTHODES PHYSIQUES DE SPARATIONET D'ANALYSE ET MTHODES DE

DOSAGE DES BIOMOLCULES

6-LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE / MCANISMES ET MODALITS

6-2-Les diffrents modes de chromatographie liquide

On dispose d'un grand nombre de modes de chromatographie. Certains ont un champ d'application trs large, d'autresau contraire correspondent des applications trs spcialises.On distinguera dans ce qui suit :

1- chromatographie d'adsorption2- chromatographie de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))3- chromatographie d'change d'ions (+ chromatographie ionique)4- chromatographie de paires d'ions5- chromatographie d'exclusion (sparation selon la taille)

6- chromatographie d'affinit7- chromatographie adapte la sparation d'nantiomres

Le choix de tel ou tel mode obit des rgles logiques directement lies la nature des composs sparer :

6-2-1-La chromatographie d'adsorption

C'est la premire chromatographie ralise : sparation des pigments vgtaux par adsorption sur de la craie (Tswett1906).

Dfinition : Ce mode de chromatographie met en jeu un mcanisme d'adsorption du solut sur la phasestationnaire solide et un mcanisme d'lution (dsorption)par la phase mobile liquide ou gazeuse (luant).

Principe :

- L'adsorptionest la fixation plus ou moins nergique d'un gaz, d'un liquide ou d'un solut sur une surface solide; ellemet en jeu des liaisons faible nergie (liaisons hydrogne, interactions lectrostatiques...). Pour tre utilisable desfins sparatives, l'adsorption doit tre rversible.

- L'lutionou dsorptionconsiste extraire le solut adsorb l'aide d'un solvant appel luant.

- Les diffrents soluts sont plus ou moins adsorbs sur la phase stationnaire, et plus ou moins solubles dans la phasemobile; il en rsulte une migration diffrentielle des soluts en fonction de la rsultante entre les deux forces (dertention et d'entranement) et donc une sparation de ces soluts.Le schma ci-aprs rsume les interactions entre le solut, le solide adsorbant et l'luant :

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Adsorbants :- Les adsorbants doivent tre insolubles dans le solvant et chimiquement inertes vis--vis du solvant et dessoluts.

- Leur granulomtrievarie entre 5 et 100 m et leur surface spcifiquede 50 1000 m2/g,- L'activit d'un adsorbant dpend de sa nature et de sa teneur en eau.

N. B.Dans certains cas, on cherche diminuer l'activit adsorbante, et on fait au contraire une dsactivation.

-La capacit d'adsorptionpeut tre :

- faible (carbonate de calcium...)- forte (silice, alumine, charbon ...)

-La polaritpeut tre

- faible (charbon...)- forte(silice SiO2, utilise sous forme hydrate : gel de silice, qui prsente des fonctions "silanol" :Si-OH , alumine Al2O3, n H2O...)

Solvants :On utilise gnralement des mlanges de solvants, de polarit voisine de celle des soluts sparer (ceux-ci doiventtre solubles dans l'luant !). On classe les diffrents solvants selon leur "force luante" qui traduit leur polarit:

Srie luotrope sur alumine de quelques solvants, classs par ordre de polarit croissante :

solvant force luante solvant force luante

Ether de ptrole 0,01 Actone 0,56

Hexane 0,01 Dioxane 0,56

Cyclohexane 0,04 Butanol 0,56

Ttrachlorure de carbone 0,18 Actate d'thyle 0,58

Ether isopropylique 0,28 Actonitrile 0,65

Tolune 0,29 Pyridine 0,71

Benzne 0,32 Dimthylsulfoxyde 0,75

Ether thylique 0,38 Isopropanol 0,82

Chloroforme 0,40 Ethanol 0,88

Chlorure de mthylne 0,42 Mthanol 0,95

Dichlorothane 0,49 Eau > 0,95

Acide actique > 0,95

Selon la nature des composs sparer, on choisit des solvants de force luante ( o) approprie. C'est rarement un

solvant pur, mais en fait un mlange de 2 4 solvants, optimis par tests successifs vis--vis des composs tudis,sans que cela obisse des rgles permettant de prdire les rsultats. Des abaques permettent de calculer la forceluante d'un mlange binaire :

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Dans les mlanges contenant plus de deux solvants, les derniers sont prsents dans de trs faibles proportions (< 2%)et correspondent des solvants de forte polarit (eau, acide) destins amliorer la symtrie des pics. Le choix dusolvant doit obir certaines contraintes :

- miscibilitdes composantes lmentaires- compatibilitavec le systme de dtection ("cut-off" en UV)*

*N.B. Cette contrainte n'existe pas avec la chromatographie sur couche mince, pour laquelle le choix des solvants estdonc plus tendu.

Applications :

La chromatographie d'adsorption est utilise pour sparer des molcules organiques de masse molaire 100 1000 g/mol et de polarit moyenne;

-les molcules apolaires sont pas ou peu retenues, et sont lues les premires (= elles migrent au fronten CCM).-Les molcules trop polaires risquent d'tre adsorbes de faon irrversible, et ne sont donc pas lues(= elles resteraient sur la ligne de dpt en CCM).

Exemples :

- lipides : strols et strodes, carotnodes, phospholipides...- pigments, mdicaments...- oses et oligosides, acides amins et oligopeptides

L'utilisation de ce mode de chromatographie est assez large, en raison de sa facilit d'emploi et du fait que latransposition depuis la chromatographie sur couche mince est trs aise.

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6-2-2-La chromatographie de partage

La chromatographie de partage (ou chromatographie liquide-liquide) met en jeu un mcanisme de partition entresolvantsque constituent respectivement par la phase stationnaire et la phase mobile. La phase stationnaire peut treconstitue par un film liquide (non miscible avec la phase mobile bien sr) imprgnsur un support rigide (silice) oufix par liaison covalente (phases greffes). C'est ce second type qui est utilis actuellement. Le greffage est ralispar tablissement de ponts siloxane (Si-O-Si) :

->Si-OH + X-Si(CH3)2-R --> ->Si-O-Si(CH3)2-R + HX

Selon la nature des radicaux R, on distinguera :

- les phases greffes polaires (-diol, -cyanopropyl, aminopropyl,)- les phases greffes apolaires (-alkyl, -phnyl, )

Les premires sont utilises avec des solvants peu polaires (cf adsorption) et permettent de raliser de lachromatograhie enphase normaleoudirecte.Les secondes s'emploient avec des solvants polaires et l'on a alors de la chromatographie enphase inverse ourverse.En premire approximation, l'ordre d'lution des composs est invers entre les deux modes, les composs polairestant lus en premier dans les systmes en phase rverse.

LES PHASES GREFFEES POLAIRESElles s'utilisent comme les colonnes de silice prcdentes. La prsence de fonctions particulires sur le greffage (-CN,-NH2,) peut apporter une slectivit intressante. De plus, il est possible de travailler avec un gradientde forceluante, donc d'analyser en une seule fois des mlanges contenant des composs de polarits trs diffrentes. Il n'y a

pas de phnomnes d'adsorption irrversible et on peut rincer les colonnes avec des solvants trs luants comme dumthanol pur.

LES PHASES GREFFEES APOLAIRESCe sont les supports les plus couramment utiliss, principalement avec un greffage alkyl (octadcylsilane ou -ODS ou-C18). Dans ces systmes, le solvant le plus polaire (l'eau) est le moins luant et la force luante de la phase mobileest augmente par ajout d'un solvant organique (mthanol, actonitrile).La phase stationnaire (type de greffage, taux de greffage, porosit) et la phase mobile (type de solvant organique,pH, temprature,) concourent toutes deux la slectivit de l'ensemble et les possibilits sont innombrables, ce quexplique la popularit de ce mode chromatographique.Le contrle de pH permet de faire varier volont le k' des composs ionisables. Il convient dans le cas de greffagesur silice de rester dans des limites compatibles avec la non-dissolution de la colonne ( 2 < pH < 8 ). Il existe parailleurs des phases greffes sur des rsines polymrises qui n'ont pas cet inconvnient et permettent de travaillerdans une gamme de pH bien plus large (1-13).

Certains greffages comme le greffage -CN ont des proprits hybrides qui permettent de les utiliser aussi bien en

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phase directe qu'en phase inverse.

6-2-3-La chromatographie d'change d'ions

Dfinitions :Dans la chromatographie d'change d'ions, la phase stationnaire comporte des groupements ioniss (+ou -) fixes; des ions mobiles de charge oppose assurent l'lectroneutralit. Les ions retenus au voisinage des chargesfixes sont changeables avec les ions prsents dans la phase mobile.

La sparation est base sur cette proprit d'change d'ions et ne peut donc s'appliquer qu' des soluts ionisables.

Les changeurs d'ions :

Nature :La phase stationnaire est constitue d'un support insoluble dans l'eau, sur lequel sont greffs desgroupements fonctionnels ionisables.

-Les supportspeuvent tre :

minraux : silice organiques : rsine polystyrnique, cellulose, dextrane

-Les groupements fonctionnelssont fixs par des liaisons covalentes sur la matrice; ils sont de deux types :

les changeurs de cations portent des groupements chargs (-) les changeurs d'anions portent des groupements chargs (+)

Exemples :

ECHANGEURS DE CATIONS ECHANGEURS D'ANIONS

FORTS

FAIBLES

Les changeurs forts sont ioniss quel que soit le pH, alors que les carboxylates ne le sont qu' pH > 3 et les aminestertiaires ne sont protones qu' pH acide. On utilise les changeurs d'anions forts pour sparer des acides faibles (exacides carboxyliques) et les changeurs faibles pour sparer des acides forts (ex esters phosphate). Le mme type deraisonnement s'applique aux changeurs de cations.La nature de l'ion changeable est variable : par exemple une rsine cationique peut tre utilise sous forme acide

(lie H+) ou sous forme sodique (lie Na+); il faut donc conditionnerla rsine sous la forme ionique adquateavant son utilisation, et la rgnreraprs usage.

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Caractristiques :-Porosit :le support est un polymre plus ou moins rticul ; la porosit dpend du taux de pontage : un polymretrs rticul a des pores de petite taille et convient pour des petites molcules.-Granulomtrie : le support est commercialis sous forme de grains de diamtre variant de 30 800 m(chromatographie basse pression) Celui des colonnes HPLC a une granulomtrie de 5-10 m (supports totalementporeux) ou lgrement suprieure (supports pelliculaires, en couche de 1 m sur des billes de verre). Les changessont d'autant plus rapides et efficaces que les grains sont petits.-Capacit de rtention :c'est la quantit maximale d'ions que peut fixer l'changeur d'ions, exprime en mEq/g depoids sec ou en mEq/ml de poids humide. Elle dpend de la densit du support en groupements fonctionnels et il fauten tenir compte pour ne pas trop charger une colonne.

L'affinit d'un changeur pour un ion donndpend de plusieurs facteurs:

de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-mme dpend :

L'affinit d'un changeur pour un ion donndpend de plusieurs facteurs:

de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-mme dpend :

- de leur nature (pKa)

- du pH de la solution

de la densit de charge de l'ion considr, qui dpend:

- de la charge de cet ion c'est--dire :- de la nature de l'ion (pKa, pHi)

- du pH de la solution

- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fix qu'il est charg, ou/et qu'il est petit)

dela concentration des ions de l'accessibilit des groupements fonctionnels( cf : porosit et granulomtrie)

Raction d'change d'ions :

Le systme peut s'crire : (r = fix sur la rsine; s = en solution)

La constante de slectivit est donne par la relation :

et

si > 1 la rsine a une affinit prfrentielle pour le solut A

si < 1 la rsine a une affinit prfrentielle pour le solut B

Les luantssont des solutions aqueuses qui contiennent des ions changeables avec les soluts fixs sur l'changeur :-solutions contenant un ion de densit de charge plus leve et (ou) de concentration plus leve.-solutions d'un pH tel qu'il modifie la charge des ions fixs et (ou) des groupements fonctionnels et provoque leurlibration dans l'luat.On peut luer avec une solution de composition constante (conditions isocratiques) ou avec un gradient de pH et (ou)de force ionique, pour dcrocher successivement les diffrents ions fixs sur l'changeur.

Applications :La chromatographie d'change d'ions est utilise pour sparer des molcules ionisables, quelle quesoit leur taille : ions minraux, acides amins, peptides, protines, nuclotides, acides nucliques, glucides ioniss etlipides ioniss.

6-2-4-La chromatographie de paires d'ions

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On appellepaire d'ionsune entit forme par l'association de deux ions de charge oppose. La paire d'ions a doncune charge nette nulle et peut dans ce cas prsenter des proprits hydrophobes qui permettent de l'analyser parsur une colonne de chromatographie en phase inverse.Pour arriver cette utilisation, on emploie des phases mobiles qui contiennent un dtergent anionique oucationique. Ces dtergents sont des molcules ionises qui comportent par ailleurs des chanes carboneshydrophobes (ex ttrabutylammonium, laurylsulfonate,) et forment avec les composs sparer des paires d'ionshydrophobes.On peut dans ce mode chromatographique jouer sur un trs grand nombre de paramtres :

- nature et concentration du dtergent- pH et force ionique du tampon- temprature

- modifiant organique (alcool, actonitrile,)

De tels systmes s'avrent plus performants (N) que les systmes d'change d'ions et ont des capacits plus grandes (= ils permettent d'injecter de plus grandes quantits d'chantillon sur une colonne de mme dimension).

6-2-5-La chromatographie d'exclusion

La chromatographie d'exclusion est aussi appele FILTRATION SUR GELou TAMISAGE MOLECULAIRE. Cettetechnique est apparue en 1959 avec un produit nouveau : le Sephadex.Le Sephadex est un gel de dextrane(polymre de glucose a-1-6 produit par Leuconostoc mesenterodes), auquel onfait subir une rticulation. Il se prsente sous forme de billes poreuses, dont la porosit dpend du degr derticulation. Ces billes sont trs hydrophiles et gonflent dans l'eau. Il en existe diffrents types en fonction de la tailledes billes et de leur porosit.

Principe de la chromatographie d'exclusion :

1 : Dpt d'un mlange de deux molcules (des grosses et des petites) sur unecolonne remplie d'un gel de Sephadex.2 :Les petites molcules peuvent pntrer dans les billes de Sephadex car leurdiamtre est infrieur celui des pores du gel. Les grosses molcules ne lepeuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont donc excluesdu gel (d'ole nom de chromatographie d'exclusion).3 :Les grosses molcules ont donc un trajet plus court parcourir pour arriver enbas de la colonne; elles sont donc lues les premires.4 :Les petites molcules sont lues ensuite car elles ont une plus grande distance parcourir pour arriver en bas de la colonne.

D'une faon plus gnrale :

-Les molcules de taille suprieure celle des pores des billes de Sephadex sont totalement exclues du gel etne se rpartissent que dans le volume extrieur aux billes, c'est--dire dans la phase mobile (luant). Elles sortent lespremires, un volume d'lution Vo appel volume mort de la colonne.-Les molcules de taille infrieure celle des pores des billesde Sephadex peuvent pntrer librement dans lesbilles et se rpartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide l'intrieur des billes ou phasestationnaire + volume de liquide l'extrieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernires, unvolume d'lution Vt ou volume total des liquides de la colonne.-Les molcules de taille intermdiairepntrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme;elles pntrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont lues dans l'ordre des masses molairesdcroissantes.

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1: Les molcules de masse molairefaible sortent toutes Vt.

3: Les molcules de masse molaireleve sortent toutes Vo.

2: Les molcules de masse molaireintermdiaire sortent des Ve

intermdiaires et sont effectivementspares.

Applications de la chromatographie d'exclusion :

-Cette technique est trs utilise pour la sparation ou l'limination de sels ou de petites molcules dans les solutionsprotiques : DESSALAGE, ECHANGE de TAMPONS...

-Cette technique est galement applique au FRACTIONNEMENT de MELANGES de MACROMOLECULES et laDETERMINATION (approximative) de la MASSE MOLAIRE des protines.Dans ce dernier cas, il faut d'abordtalonner la colonne avec des protines de masse molaire connue, tracer la courbe Ve= f(logM), puis effectuer une

dtermination graphique.

Ce qui prcde concernant le Sephadex est en fait trs gnral et s'applique de nombreux supports, en particulierdes supports base de silice ou de polymres organiques rigides, qui permettent l'utilisation de ces supports en HPLC(ce n'est pas le cas du Sephadex). Ces colonnes, le plus souvent de taille rduite par rapport aux prcdentes, maisgalement plus rsolutives et donnant des sparations plus rapides (car autorisant l'emploi de dbits linairesbeaucoup plus levs) sont utilises des fins analytiques :

- avec des phase mobiles aqueuses pour les macromolcules biologiques (essentiellement protines) et avec desphases stationnaires conues pour minimiser les phnomnes d'adsorption et de dnaturation.- avec des phases mobiles organiques pour l'analyse des polymres en chimie organique (ex polystyrnes).

6-2-6-La chromatographie d'affinit

Ce mode de chromatographie connat depuis 1970 un dveloppement sans prcdent et est appel prendre uneplace encore plus grande avec l'essor des biotechnologies.

Le principe consiste utiliser une phase stationnaire constitue d'un support (silice, polymre) sur lequel on a greffune molcule organique particulire qui prsente une affinit slective pour certains constituants d'un mlange dont oncherche les isoler. Ceux-ci vont tre slectivement adsorbs ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que lesautres composants sont trs rapidement lus. Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'uncomptiteur) permet ensuite d'luer les substances intressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre1000.

La chromatographie d'affinit s'utilise avec des colonnes basse pression ou des supports haute performance(HPLAC). Nous allons illustrer cette technique avec quelques exemples trs classiques ou moins courants.

Techniques en basse pression :

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- isolement des ARNm polyA+sur colonne d'oligodT- ou polyU- sepharose partir d'un extrait d'ARN total (les ARNmreprsentent 1% du total)- purification de rcepteurs hormonaux avec des colonnes sur lesquelles on a fix des molcules d'hormones- un degr de spcificit trs infrieur, les colonnes sur lesquelles sont greffes des ions boronate ont une affinitpour les diols cis et permettent de fixer entre autres les sucres.

Techniques en haute pression ( titre d'exemple)On donnera ici comme exemple le choix offert par un fabricant(Pierce Eurochemie) :

Type de phase stationnaire Type d'application

Protine A (de Staphylococcus aureus) Immunoglobulines

Bleu Cibacron Enzymes (ex. dshydrognases)

Boronates (affinit pour diols 1,2 ou1,3)

Nuclosides, nuclotides, ARNt,Glycoprotines, sucres

Concanavaline A (lectine) Glycoprotines, sucres

Trsyle activ (pour faire sa colonne) Sert fixer amines primaires et thiols

6-2-7-Techniques pour la sparation d'nantiomres

La sparation d'isomres optiques est un problme qui se pose souvent en biologie, o beaucoup de molculespossdent un (ou plusieurs) carbone(s) asymtrique(s) : exemple des acides amins, des hydrocarbures insaturs,...La synthse chimique, pour sa part, conduit souvent des mlanges d'isomres qu'il faut ensuite de sparer afind'isoler le compos biologiquement actif (exemple des phromones). Or ces substances ont des proprits chimiquessouvent trs voisines et ne sont que mal spares par les techniques de chromatographie liquide conventionnelles. Ona recours alors des mthodes plus sophistiques qui font souvent appel l'utilisation de substances optiquementactives, soit dans la constitution de la phase stationnaire, soit mises en solution dans la phase mobile. Nous nousbornerons ici donner quelques exemples, les possibilits tant en fait trs nombreuses.

Sparation des aminoacides D et L

Le mode de chromatographie utilis est celui dit de "l'change de ligandes". On met profit l'existence d'uneformation de complexes entre les mtaux de transition (Cu, Zn, Cd, Ni) et les aminoacides.

- dans le mode statique, la phase stationnaire est greffe avec de la L-Proline par l'intermdiaire d'unbras et forme un complexe avec des ions Cu++. Cette structure qui comporte deux carbones

asymtriques est hautement stroslective et interagit de faon trs diffrente avec les aminoacidesdes sries D et L, qui sont donc retenus de faon trs distincte.

- dans le mode dynamique, la phase stationnaire est un changeur de cations et contient des ions Cu++

ainsi que de la L- ou D-proline. Les complexes forms sont retenus diffremment des formes noncomplexes, et ceci a pour consquence de sparer les formes D et L des aminoacides injects sur la

colonne.

Sparation d'isomres en utilisant des complexes d'inclusion

Cette mthode utilise des cyclodextrines(polyosides cycliques forms de 6, 7 ou 8 units glucose) formant unestructure torique au sein de laquelle certaines molcules peuvent s'inclure de faon rversible et d'une faon quidpend fortement de leur structure spatiale.

- dans le mode statique, la mthode utilise des phases greffes avec des cyclodextrines

- dans le mode dynamique, on dissout une cyclodextrine dans le solvant.

Dans un certain nombre de cas, cette mthode s'avre trs efficace pour sparer des isomres.Ce mode de chromatographie est encore peu utilis, mais il est en fait assez rcent (surtout l'usage descyclodextrines) et son utilisation devrait se dvelopper assez rapidement.

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Ren Lafont

Dernires modifications : 28 juin 2005

Tous droits rservs - Biologie et Multimdia - Universit Pierre et Marie Curie - UFR de Biologie

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