Differential Expression of Cyclin-Dependent Kinase 6 in Cortical Thymocytes and T-Cell Lymphoblastic Leukemia

8/2/2019 Differential Expression of Cyclin-Dependent Kinase 6 in Cortical Thymocytes and T-Cell Lymphoblastic Leukemia.

1/9

American J o ur n al o f P a t h o l o g y , V o l . 1 5 2 , N o. 1 , J a n u a r y 1998C o p y r i g h t American S o c i e t y f o r I n v e s t i g a t i v e P a t h o l o g y

D i f f e r e n t i a l E x p r e s s i o n o f C y c l i n - D e p e n d e n t K i n a s e 6i n C o r t i c a l T h y m o c y t e s a n d T - C e l l L y m p h o b l a s t i cLymphoma/LeukemiaM a r c o C h i l o s i , * C l a u d i o D o g l i o n i , t Z h a n q i n g Y a n , *M a u r i z i o L e s t a n i , * F a b i o M e n e s t r i n a , *C l a u d i o S o r i o , * A l i c e B e n e d e t t i , * F a b r i z i o V i n a n t e , G i o v a n n i P i z z o l o , a n d G i o r g i o I n g h i r a m i *Fr om t h e I s t i t u t o d i Anatomia P a t o l o g i c a an d C a t t e d r a d iE m a t o l o g i a , s U n i v e r s i t a d i V e r o n a , a nd Anatomia P a t o l o g i c aO s p e d a l e C i v i l e d i F e l t r e , t I t a l y ; a nd t h e D i v i s i o n o fH e m a t o p a t h o l o g y / M o l e c u l a r P a t h o l o g y L a b o r a t o r y , * Ne w Y o r kU n i v e r s i t y M e d i c a l C e n t e r , Ne w Y o r k , New Y o r k

C y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e - 6 (CDK6) i s t h e e a r l i e s t i n -d u c i b l e m e mb e r o f t h e CDK f a m i l y i n human T lym-p h o c y t e s , i n v o lv e d i n growth f a c t o r s t i m u l a t i o n andc e l c y c le p r o g r e s s i o n . C D K 6 i s one o f t h e t a r g e t s o fp 16 and p15, CDK i n h i b i t o r s encoded by M TS1 andMTS2, t wo t u mo r suppressor genes t h a t a r e f r e -q u e n t l y d e l e t e d i n T - c e l i l e u k e m i a . In t h i s s t u d y wehave i n v e s t i g a t e d C D K 6 e x p r e s s i o n i n normal andn e o p l a s t i c lymphoid t i s s u e s u s i n g i m m u n o h i s t o -c h e m i s t r y and f l o w cytometry. In normal ( s i x sam-p l e s ) and h y p e r p l a s t i c ( f o u r s a m p l e s ) t h y m u s e s ,strong C D K 6 e x p r e s s i o n was o b s e r v e d i n a d i s c r e t ep r o p o r t i o n o f c o r t i c a l t h y m o c y t e s ( 1 0 to 15%),mainly l o c a t e d i n t h e p e r i p h e r a l ( s u b c a p s u l a r ) zoneo f t h e c o r t e x . A U t e s t e d cases o f T - c e l l l y m p h o b l a s t i clymphoma/leukemia ( T - L B L / A L L ) showed strongC D K 6 e x p r e s s i o n i n t h e m a j o r i t y ( u p to 100%) o fn e o p l a s t i c lymphoid c e l l s . Western b l o t a n a l y s i s con-f i r m e d t h e e x p e c t e d C D K 6 p r o t e i n s i z e ( 4 0 k d ) . A c -c o r d i n g t o Southern b l o t a n a l y s i s , C D K 6 o v e r e x p r e s -s i o n i n n e o p l a s t i c T l y m p h o b l a s t s was no t du e to genea m p l i f i c a t i o n . In a l l o t h e r lymp h o mas i n v e s t i g a t e d( 2 8 p e r i p h e r a l T - c e l l non-Hodgkin's lymp o h o mas ( T -N H L s ) , 7 CD30+ a n a p l a s t i c NHLs, 2 2 h i g h - g r a d e B -NHLs, 1 5 l o w - g r a d e B - N H L s , 2 5 B - c e l l precursorA L L s ) , C D K 6 was n o t e x p r e s s e d or e x p r e s s e d a t lo wl e v e l s , with t h e o n l y e x c e p t i o n o f t h r e e n a s a l a n g i o -c e n t r i c T - N H L s , a l l e x h i b i t i n g C D K 6 i m m u n o r e a c t i v -i t y comparable t o t h a t o b s e r v e d i n T-LBIIALL Thesed a t a p r o v i d e e v i d e n c e t h a t C D K 6 i s a b n o r m a l l y e x-p r e s s e d i n T - L B L / A L L and may be i n v o l v e d i n t h ep a t h o g e n e s i s o f t h i s malignancy. In a d d i t i o n , t h eq u a n t i t a t i v e d i f f e r e n c e o f C D K 6 e x p r e s s i o n betweenn e o p l a s t i c and n o n - n e o p l a s t i c c o r t i c a l t h y m o c y t e scan be p o t e n t i a l l y u s e f u l i n t h e d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s

o f t h y m i c neoplasms on h i s t o l o g i c a l and c y t o l o g i c a ls p e c i m e n s . ( A m J Pathol 1 9 9 8 , 1 5 2 : 2 0 9 - 2 1 7 )

P r og r e s s io n t h r o ug h t h e c e l l c y c l e i n e u k a r y o t i c c e l l s i sm e d i a t e d b y p o s i t i v e r e g u l a t o r s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n , s u c has c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s ( C D K s ) , a n d n e g a t i v e r e g -u l a t o r s , s u c h as t h o s e e n c o d e d b y t h e t u m o r suppressorg e n e s p 5 3 a n d r e t i n o b l a s t o m a ( p R B ) , as w e l l as d i f f e r e n tC D K i n h i b i t o r s , s u c h as p 2 l WAF1 p 2 7 K I P l p 1 6 M T S lp 1 5 M T S 2 , a n d o t h e r s . 1 I n t e n s e i n v e s t i g a t i o n i s c u r r e n t l yd e v o t e d t o u n d e r s t a n d i n g t o w h a t e x t e n t t h e d e r e g u l a t i o no f t h i s array o f m o l e c u l e s i s i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i so f human n e o p l a s i a s , s e a r c h i n g p o s s i b l e m o l e c u l a r t a r -g e t s f o r t h e r a p y o r d i a g n o s t i c a n d p r o g n o s t i c m a r k e r s t ob e a p p l i e d i n c l i n i c a l p r a c t i c e . 1 - 6C D K 4 a n d C D K 6 , w h i c h are t h e m o s t h o m o l o g o u samong t h e v a r i o u s C D K s , a f t e r c o u p l i n g w i t h c y c l i n s o ft h e D f a m i l y , r e g u l a t e t h e c e l l c y c l e e n t r y a n d / o r t r a n s i tt h r o u g h very e a r l y G l p h a s e b y p h o s p h o r y l a t i n gp R B . 1 7 - 1 0 I n T l y m p h o c y t e s , C D K 4 a n d CDK6 are a b l e t oa s s o c i a t e w i t h p r o l i f e r a t i n g c e l l n u c l e a r a n t i g e n a n d t h er e g u l a t o r y s u b u n i t c y c l i n s D2 a n d D3 a f t e r c e l l a c t i v a t i o n ,t h u s f o r m i n g t h e c a t a l y t i c a l l y a c t i v e k i n a s e s necessary f o rc e l l p r o l i f e r a t i o n . 1 1 - 1 3 C D K 6 seems t o p l a y a p a r t i c u l a rr o l e i n human T c e l l a c t i v a t i o n as i t i s t h e e a r l i e s t i n d u c i b l emember o f t h e C D K f a m i l y i n T l y m p h o c y t e s , f i r s t a p p e a r-i n g i n m i d - G 1 , b e f o r e t h e u p - r e g u l a t i o n o f a n y o t h e r C D K ,a n d i n d e p e n d e n t l y o f t h e k e y T c e l l p r o g r e s s i o n f a c t o ri n t e r l e u k i n ( I L ) - 2 . 8 1 3 I n t e r e s t i n g l y , C D K 6 s h o w s a s t r i k i n gd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n among n o r m a l t i s s u e s , b e i n g d e -t e c t e d a t h i g h l e v e l s o n l y i n p r i m a r y c u l t u r e s o f T l y m p h o -c y t e s . 1 4 C D K 6 i s o n e o f t h e t a r g e t s o f p 1 6 M T S 1 a n dp 1 5 M T S 2 , t w o h i g h l y h o m o l o g o u s C D K i n h i b i t o r s t h a t e x e r tt h e i r i n h i b i t o r y f u n c t i o n b y d i r e c t l y b i n d i n g C D K s , t h u ss p e c i f i c a l l y i n t e r f e r i n g w i t h t h e f or ma t io n o f c a t a l y t i c a l l ya c t i v e k i n a s e c o m p l e x e s . 1 5 - 1 7 p 1 6 M T S 1 a n d p 1 5 M T S 2 areencoded b y t w o g e n e s ( M T S 1 a n d M T S 2 ) t h a t are f r e -q u e n t l y d e l e t e d a n d / o r m u t a t e d i n T - c e l l l e u k e m i a s . 1 6 - 2 3MTS1 i n a c t i v a t i o n , o b s e r v e d i n a t l e a s t 80 % o f T - c e l la c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a s ( T - A L L s ) , i s t h e m o s t co n-

S u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m A I R C ( M i l a n ) a n d R e g i o n e V e n e t o , I t a l y .A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n O c t o b e r 1 0 , 1 9 9 7 .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o D r . M a r c o C h i l o s i , I s t i t u t o d i A n a t o m i aP a t o l o g i c a U n i v e r s i t A d i V e r o n a , P o l i c l i n i c o B o r g o - R o m a , 3 7 1 3 4 , V e r o n a ,

I t a l y . E - m a i l : m a r c o @ a n p a t . u n i v r . i t .2 0 9


2/9

2 1 0 C h i l o s i e t a lA J P J a n u a r y 1 9 9 8 , V o l . 1 5 2 , N o . 1

s i s t e n t g e ne t i c d e f e c t f o u n d i n t h i s d i s e a s e . 2 4 T a k e n t o -g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e m o l e c u l a r m e c h a -n i s m c e n t e r e d o n t h e i n t e r a c t i o n o f p 1 6 a nd p 1 5 i n h i b i t o r sa n d t h e i r t a r g e t CDK6 p l a y s a f u n d a m e n t a l r o l e i n t h er e g u l a t i o n o f t h e G l c h e c k p o i n t i n T c e l l s a n d t h a t d e r e g -u l a t i o n o f t h i s m o l e c u l a r s y s t e m i s p r i m a r i l y i n v o l v e d i n t h ed e v e l o p m e n t o f T - c e l l l y m p h o b l a s t i c n e o p l a s i a s . T h e a i mo f t h i s s t u d y was t o i n v e s t i g a t e t h e p a t t e r n o f CDK6e x p r e s s i o n i n n o r m a l a n d n e o p l a s t i c m a t u r e a n d i m m a -t u r e T c e l l s , a n a l y z i n g a s e r i e s o f T - c e l l l y m h o b l a s t i cl y m p h o m a s ( T - L B L s ) / A L L s a n d p e r i p h e r a l T - c e l l l y m p h o -mas ( t o g e t h e r w i t h a s e r i e s o f B - c e l l l y m p h o m a s a s c o n -t r o l s ) , u s i n g i m m u n o p h e n o t y p i c a l a n d m o l e c u l a r a n a l y -s e s .

M a t e r i a l s a n d M e t h o d sS a m p l e s C o m p o s i t i o nF o r m a l i n - f i x e d , p a r af fi n - e mb e dd e d s a m p l e s w e r e c o l -l e c t e d f r o m t h e f i l e s o f t h e D e p a r t m e n t s o f P a t h o l o g y o fV e r o n a U n i v e r s i t y a n d Ne w Y o r k U n i v e r s i t y . T h e i n v e s t i -g a t e d t i s s u e s a m p l e s i n c l u d e d f e t a l t h y m u s ( 2 s a m p l e s ) ,i n f a n t i l e t h y m u s ( 4 s a m p l e s ) , T - L B L / A L L ( 1 6 b o n e m a r r o wt r e p h i n e b i o p s i e s , 5 m e d i a s t i n a l m a s s e s , a n d 4 i n v o l v e dl y m p h n o d e s ) , t h y m o m a s a m p l e s w i t h a r i c h l y m p h o i dc o m p o n e n t ( 7 s a m p l e s ) , a n d t h y m i c h y p e r p l a s i a f r o mp a t i e n t s w i t h m y a s t h e n i a g r a v i s ( 4 s a m p l e s ) . C o n t r o l t i s -s u e s i nc l u d e d n or ma l b o n e m a r r o w ( 1 0 s a m p l e s , o b -t a i n e d d u r i n g s t a g i n g p r o c e d u r e s ) a n d r e a c t i v e l y m p hn o d e ( 4 s a m p l e s ) . A s e r i e s o f o t h e r n o n - H o d g k i n ' s l y m -p h o m a s ( N H L s ) w e r e a l s o s t u d i e d , i n c l u d i n g p e r i p h e r a lT - c e l l NH L ( 2 8 c a s e s ) , CD30+ a n a p l a s t i c T / n u l l NH L ( 7c a s e s ) , B - c e l l NH L ( 2 2 h i g h - g r a d e a n d 1 5 l o w - g r a d e ) ,a n d B - c e l l p r e c u r s o r l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a ( B C P - A L L ;2 5 c a s e s ) . A l l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a t d i a g n o s i s b e -f o r e a n y t r e a t m e n t . T - L B L / A L L c a s e s w e r e d i a g n o s e d o nt h e b a s i s o f m o r p h o l o g i c a l a n d i m m u n o p h e n o t y p i c a l f e a -t u r e s ( b l a s t s e x h i b i t i n g n u c l e a r t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e t o g e t h e r w i t h T - c e l l m a r k e r s s u c h a s mem-b r a n e e x p r e s s i o n o f C D 7 , C D 5 , C D 1 , a n d c y t o p l a s m i cC D 3 ) . 2 5 T h e t h y m o m a s i n v e s t i g a t e d w e r e o f t h e c o r t i c a l( 4 s a m p l e s ) o r m i x e d ( 3 s a m p l e s ) t y p e s a c c o r d i n g t or e c e n t c l a s s i f i c a t i o n s 2 6 a n d h a d a l a r g e l y m p h o i d c o m -p o n e n t c h a r a c t e r i z e d b y t h e c o r t i c a l t h y m o c y t e i m m u n o -p h e n o t y p e ( T d T + , C D 1 + , C D 3 + ) . 2 7 - 2 9 P e r i p h e r a l T - c e l lNHLs a n d B - c e l l NHLs w e r e d i a g n o s e d o n t h e b as is o fm o r p h o l o g i c a l a n d i m m u n o p h e n o t y p i c a l f e a t u r e s a c -c o r d i n g t o t h e c r i t e r i a o f t h e K i e l a n d t h e R e v i s e d E u r o -p e a n - A m e r i c a n Lymphoma c l a s s i f i c a t i o n s .S a m p l e I m m u n o s t a i n i n gT h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s f o r CDK6 w a s p e r -f o r m e d o n f o r m a l i n - f i x e d ( < 2 4 h o u r s o f f i x a t i o n ) , p a r a f f i n -embedded m a t e r i a l u s i n g a b i o t i n - s t r e p t a v i d i n i m m u n o -p e r o x i d a s e t e c h n i q u e ( L S A B p e r o x i d a s e , D a k o ,C a r p i n t e r i a , C A ) . B r i e f l y , s e c t i o n s w e r e d e p a r a f f i n i z e d i nx y l e n e , r e h y d r a t e d , w a s h e d i n P B S , i m m e r s e d i n 0 . 0 1m o l / L c i t r a t e b u f f e r , pH 6 , a n d i r r a d i a t e d i n a m i c r o w a v e

o v e n f o r 5 m i n u t e s a t 7 5 0 W ( t h r e e t i m e s ) a n d 1 0 m i n u t e sa t 6 0 0 W ( o n c e ) . S e c t i o n s w e r e t h e n k e p t f o r 1 5 m in ut e sa t r o o m t e m p e r a t u r e b e f o r e a d d i t i o n a l PBS w a s h i n g a n di m m u n o s t a i n i n g . CDK6 i m m u n o s t a i n i n g was p e r f o r m e du s i n g a n a f f i n i t y - p u r i f i e d r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y r e c -o g n i z i n g CDK6 ( C - 2 1 a n t i b o d y , S a n t a C r u z B i o t e c h n o l -o g y , S a n t a C r u z , C A ) r a i s e d a g a i n s t a p e p t i d e c o r r e -s p o n d i n g t o a m i n o a c id r e s i d ue s 3 0 6 t o 3 2 6 m a p p i n g a tt h e c a r b o x y t e r m i n u s o f C D K 6 .A q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f a n t i g e n e x p r e s s i o n w a sp e r f o r m e d , a s s i g n i n g t o e a c h c a s e a d i f f e r e n t s c o r e ,o b t a i n e d e v a l u a t i n g t h e p e r c e n t a g e o f p o s i t i v e c e l l sc o u n t e d i n d i f f e r e n t h i g h - p o w e r m i c r o s c o p i c f i e l d s . At h o r o u g h a n a l y s i s o f s e r i a l s e c t i o n s w a s u s e d w i t h as e l e c t e d p a n e l o f a n t i b o d i e s r e c o g n i z i n g d i f f e r e n t c e l lt y p e s t o p r e c i s e l y d e f i n e t h e n a t u r e o f C D K 6 - p o s i t i v ec e l l s . A C D K 6 / K i 6 7 c o m b i n a t i o n w a s p e r f o r m e d o n t h y -m i c s a m p l e s t o i n v e s t i g a t e t h e p r o l i f e r a t i v e s t a t u s o fC D K 6 - p o s i t i v e c e l l s , a t t h e s i n g l e - c e l l l e v e l , u s i n g a p r e -v i o u s l y d e s c ri b e d d o u b l e m ar k e r t e c h n i q u e . 3 0F l o w C y t o m e t r i c A n a l y s i sF o r f l o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o n o f n u c l e a r C D K 6 , 1 x 1 0 6c e l l s i n s u s p e n s i o n w e r e f i r s t t r e a t e d w i t h t h e FACS p e r -m e a b i l i z i n g s o l u t i o n ( B e c t o n D i c k i n s o n , S a n J o s e , C A ) ,a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s . A f t e r i n c u -b a t i o n w i t h a r a b b i t a n t i - C D K 6 a n t i b o d y ( S a n t a C r u z ;1 : 1 0 0 ) f o r 3 0 m i n u t e s ( 4 0 C ) a n d w a s h i n g , c e l l s w e r ei n c u b a t e d w i t h f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) - c o n j u -g a t e d ( F ( a b ' ) 2 f r a g m e n t s o f s h e e p a n t i - r a b b i t i m m u n o -g l o b u l i n ( 1 : 3 0 0 ; O r g a n o n T e k n i k a - C a p p e l , M a l v e r n , P A ) .F o r t w o - c o l o r a n a l y s i s , t h e c e l l s w e r e f i r s t s t a i n e d w i t ha n t i - C D K 6 o r h y p e r i m m u n e r a b b i t s e r a a n d t h e n i n c u -b a t e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e l y d i l u t e d p h y c o e r y t h r i n - c o n j u -g a t e d m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( C D 1 9 a n d C D 5 , B e c t o nD i c k i n s o n ) f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 0 C . M u l t i p l e c o m b i n a t i o n so f i s o t y p e - m a t c h e d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w i t h i r r e l e v a n ts p e c i f i c i t y w e r e u s e d a s n e g a t i v e c o n t r o l s . C e l l s s t a i n e dw i t h s i n g l e p o s i t i v e f l u o r e s c e n c e w e r e u s e d a s s i n g l ep o s i t i v e c o n t r o l s t o p e r f o r m a m a n u a l e l e c t r o n i c c o m p e n -s a t i o n . I n m i x e d e x p e r i m e n t s , h i g h l y p u r i f i e d c e l l s f r o m ap a t i e n t w i t h c h r o n i c l y m p h o c y t i c l e u k e m i a ( B - C L L ;C D 1 9 + / C D 5 + , > 9 5 % ) w e r e m i x e d w i t h ALL c e l l s ( C D 4 + /C D 8 + / C D 5 + , > 9 5 % ) i n d i f f e r e n t r a t i o s ( C L L / A L L : 1 0 0 % /0 % , 7 5 % / 2 5 % , 5 0 % / 5 0 % , 2 5 % / 7 5 % , a n d 0 % / 1 0 0 % ) .M i x e d c e l l s w e r e s t a i n e d a s d e s c r i b e d a b o v e . F l o w c y -t o m e t r i c a n a l y s i s was p e r f o r m e d u s i n g t h e F A C S c a n c y -t o m e t e r ( B e c t o n D i c k i n s o n ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . 3W e s t e r n B l o t A n a l y s i sT o c o n f i r m t h e s p e c i f i c i t y o f CDK6 i m m u n o r e a c t i v i t y i no u r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t i s s u e l y s a t e s o b t a i n e d f r o ms i x s a m p l e s o f T - L B L / A L L ( t w o f r o m m e d i a s t i n a l massa n d f o u r f r o m p e r i p h e r a l b l o o d l e u k e m i c s a m p l e s ) w e r es u b j e c t e d t o s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s , f o l l o w e d b yW e s t e r n b l o t t i n g . 3 2 T h e same a n t i b o d y t o CDK6 u s e d f o ri m m u n o h i s t o c h e m i s t r y was u s e d f o r W e s t e r n b l o t t i n g .


3/9

C D K 6 i n N o r m a l a n d N e o p l a s t i c L y m p h o c y t e s 2 1 1AJPJanuary 1 9 9 8 , V o l . 1 5 2 , N o . 1

F i g u r e 1 . I n f a n t t h y m u s . I m m u n o r e a c t i v i t y f o r CDK6 ( A ) i s e v i d e n t i n a p r o p o r t i o n o f c o r t i c a l t h y m o c y t e s ( 1 0 t o 1 5 % ) , w i t h some c l u s t e r i n g i n t h e s u b c a p s u l a rz o n e w h e r e i m m a t u r e t h y m oc y t e s p r e d om i n at e a s s h o w n b y t h e l a c k o f C D8 e x p r e s s i o n ( a r r o w h e a d s i n B ) . L S A B - i m m u n o p e r o x i d a s e on c o n s e c u t i v e p a r a f f i ns e c t i o n s ; m a g n i f i c a t i o n , X 2 5 0 .

S o u t h e r n B l o t A n a l y s i sT e n - m i c r o g r a m a l i q u o t s o f g e n o m i c D NA w e r e d i g e s t e d ,e l e c t r o p h o r e s e d , d e n a t u r e d , a n d t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l -l u l o s e f i l t e r s a c c o r d i n g t o S o u t h e r n . T h e g e n o m i c E c o R l -a n d B g / l l - d i g e s t e d DNAs w e r e h y b r i d i z e d w i t h t h e CDK6c D N A . 8 T h e o r g a n i z a t i o n o f t h e c - m y c ( M C 4 1 3 R C ) 3 3 a n db c / - i m a j o r b r e a k p o i n t ( M T C ) 3 4 l o c i w e r e a l s o i n v e s t i -g a t e d a s c o n t r o l g e n e s . F i l t e r s w e r e s c a n n e d u s i n g I DI m a g e A n a l y s i s s o f t w a r e , K o d a k D i g i t a l S c i e n c e ( E a s t -man K o d a k C o . , R o c h e s t e r , N Y ) , t o e v a l u a t e t h e o p t i c a ld e n s i t y o f e a c h c o r r e s p o n d i n g b a n d . N o r m a l i z a t i o n wasa c h i e v e d b y d i v i d i n g t h e CDK6 v a l u e s ( i n d i v i d u a l b a n d s )b y t h e v a lu e s o b t ai n e d f r o m t h e h y b r i d i z a t i o n o f t h e samef i l t e r s u s i n g c - m y c a n d / o r b c / - l MTC p r o b e s a s c o n t r o l s .

R e s u l t sR e a c t i v e Lymph N o d e sI n a l l s a m p l e s , CDK6 i m m u n o s t a i n i n g was c o n f i n e d t o af e w l a r g e l y m p h o i d c e l l s s c a t t e r e d i n p a r a c o r t i c a l a r e a s .T h e s t a i n i n g a p p e a r e d a s b o t h n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c .On t h e b a s i s o f d o u b l e - m a r k e r a n d s e r i a l s e c t i o n a n a l y s i sw i t h B - a n d T - c e l l m a r k e r s ( C D 3 , C D 8 , a n d C D 2 0 )CDK6+ c e l l s c o u l d b e r e c o g n i z e d a s T c e l l s . A w e a kCDK6 e x p r e s s i o n was o b s e r v e d i n g e r m i n a l c e n t e r c e l l so f l y m p h o i d f o l l i c l e s ( n o t s h o w n ) .

N o r m a l B o n e M a r r o wE x t r e m e l y f e w s c a t t e r e d l a r g e b l a s t s w e r e o b s e r v e ds h o w i n g s t r o n g CDK6 i m m u n o s t a i n i n g , a g a i n c h a r a c t e r -i z e d b y n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n .N o r m a l I n f a n t a n d F e t a l T h y m u s e sA d i s c r e t e n u m b e r o f C D K 6 - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s w e r eo b s e r v e d i n t h e t h y m i c c o r t e x , m a i n l y l o c a l i z e d i n t h eo u t e r ( s u b c a p s u l a r ) z o n e ( F i g u r e 1 A ) . C D K 6 - i m m u n o r e -a c t i v e c e l l s w e r e m a i n l y l a r g e l y m p h o i d b l a s t s , c h a r a c -t e r i z e d o n s e r i a l s e c t i o n a n d d o u b l e - m a r k e r a n a l y s i s b yt h e T d T + , CD8- i m m u n o p h e n o t y p e ( F i g u r e 1 B ) . A q u a n -t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f CDK6+ c o r t i c a l t h y m o c y t e s p e r -f o r m e d o n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r e p a r a t i o n s a n d b yf l o w c y t o m e t r y r e v e a l e d f i g u r e s v a r y i n g b e t w e e n 1 0 a n d15 % ( T a b l e 1 ) . T h e s e f i g u r e s c l e a r l y c o n t r a s t e d w i t h t h ev e r y h i g h p r o p o r t i o n o f t h y m o c y t e s e x p r e s s i n g t h e p r o l i f -e r a t i o n - r e l a t e d a n t i g e n K i 6 7 . 2 9 Low p r o p o r t i o n s o fCDK6+ t h y m o c y t e s , s i m i l a r t o t h o s e o b s e r v e d i n n o r m a lc o r t e x , w e r e o b s e r v e d i n t h y m i c s a m p l e s f r o m m y a s -t h e n i c p a t i e n t s w i t h f o l l i c u l a r t h y m i c h y p e r p l a s i a .Thymoma S a m p l e sT h e p r o p o r t i o n o f CDK6+ t h y m o c y t e s ( r e c o g n i z e d b yC D 1 , C D 8 , a n d / o r t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e


4/9


T a b l e 1 . E x p r e s s i o n o f C D K 6 R e v e a l e d b y I m m u n o h i s t o c h e m i c a l A n a l y s i s i n N o r m a l a n d P a t h o l o g i c a l S a m p l e s o f Lymph N o d e ,Bone M a r r o w , a n d T h y m u sS a m p l e N u m b e r o f s a m p l e s CDK6 r e a c t i n g c e l l s %

R e a c t i v e l y m p h n o d e 4 T c e l l s i n PCA


5/9

C D K 6 i n N o r m a l a n d N e o p l a s t i c L y m p h o c y t e s 2 1 3A J P J a n u a r y 1 9 9 8 , V o l . 1 5 2 , N o . 1

F i g u r e 3 . M e d i a s t i n a l T - l y m p h o b l a s t i c l y m p h o m a . M o s t c e l l s show s t r o n g CDK6 e x p r e s s i o n ( A ) , w i t h n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c l o c a t i o n a t h i g h e r m a g n i f i c a t i o n( B ) . L S A B - i m m u n o p e r o x i d a s e ; m a g n i f i c a t i o n , X 1 0 0 ( A ) a n d X 2 5 0 ( B ) .

F i g u r e 4 . T - A L L . M o s t b l a s t i c c e l l s i n f i l t r a t i n g t h e b o n e marrow ( A ) a n d p e r i p h e r a l b l o o d ( B ) e x p r e s s h i g h l e v e l s o f C D K 6 . L S A B - i m m u n o p e r o x i d a s e ;m a g n i f i c a t i o n , X 1 0 0 ( A ) a n d X4 0 0 ( B ) .I

0

l l . 4 1


6/9

2 1 4 C h i l o s i e t a lA/PJanuary 1 9 9 8 , V o l . 1 5 2 , N o . 1

T a b l e 2 . E x pr e s s i on o f C D K 6 i n T - C e l l Lymphomas a n d B - C e l l LymphomasCDK6 I m m u n o r e a c t i v i t y

Number o f c a s e sT - c e l l l y m p h o m a sT - L B L / A L LNH L T p e r i p h e r a l ( t o t a l )I m m u n o b l a s t i c / l a r g e c e l lM y c o s i s f u n g o i d e s / S e z a r yN a s a l a n g i o c e n t r i c T - c e l l I .T - C L L ( C D 4 + )A I L DU n s p e c i f i e dNH L T / n u l l CD30+B - c e l l l y m p h o m a sBCP ALLNH L B h i g h - g r a d eD i f f u s e l a r g e c e l lB u r k i t t ' sR i c h t e rNH L B l o w - g r a d eF o l l i c u l a rB - C L LH a i r y c e l l l e u k e m i aM a n t l e c e l l l y m p h o m aL y m p h o p l a s m a c y t o i d

2 52 86732197

2 5300300002 52 21 92

11 555221

00000000000

++

01100000

2200000000

+

0523000004

000000

00

Q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f n u c l e a r CDK6 e x p r e s s i o n : - , 0 t o 1 0 % ; + , 1 0 t o 3 0 % ; ++, 3 0 t o 5 0 % ; + + + , 5 0 t o 100% p o s i t i v e .

F l o w C y t o m e t r yF l o w c y t o m e t r i c a n a l y s i s a n d d i l u t i o n e x p e r i m e n t s p e r -f o r m e d o n p e r m e a b i l i z e d s a m p l e s o f T - A L L a n d B - C L Lc o n f i r m e d t h e h i g h e x p r e s s i o n o f CDK6 i n n e o p l a s t i ct h y m o c y t e s ( F i g u r e s 5 a n d 6 ) when c o m p a r e d w i t h n o r -m a l c o n t r o l s .

W e s t e r n B l o t t i n g P r e p a r a t i o n sF i g u r e 7 s h o w s d i s c r e t e b a n d s i n a l l T - L B L / A L L s a m p l e s ,c o r r e s p o n d i n g t o t h e e x p e c t e d CDK6 p r o t e i n s i z e ( 4 0k d ) . No r e a c t i v i t y wa s d e t e c t e d u n d e r t h e same e x p e r i -m e n t a l c o n d i t i o n s u s i n g a n i s o t y p e - m a t c h e d a n t i b o d y( n o t s h o w n ) .CDK6 S o u t h e r n B l o t A n a l y s i sT h e p r e c i s e m e c h a n i s m s l e a d i n g t o t h e o v e r e x p r e s s i o n /d e r e g u l a t i o n o f C D K 6 i n T b l a s t s i s u n c l e a r . T o g a i n somei n s i g h t i n t h i s p r o c e s s , we e v a l u a t e d t h e p o s s i b l e p r e s -ence o f CDK6 g e n e a m p l i f i c a t i o n . T o w a r d t h i s e n d , s e v e n

1 !esUS9_

c a s e s o f T -A L L , e x p r e s s i n g h i g h l e v e l s o f CDK6 p r o t e i n ,d e m o n s t r a t e d e i t h e r b y f l o w c y t o m e t r y a n d / o r i m m u n o -h i s t o c h e m i s t r y , w e r e e v a l u a t e d b y S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s .A s t h e c o n t r o l g r o u p , B C P - A L L c a s e s w e r e u s e d . CDK6g e n e a m p l i f i c a t i o n was a s s e s s e d b y c o m p a ri n g CDK6n u m e r i c a l v a l u e s w i t h t h o s e o b t a i n e d a f t e r c - m y c o r b c 1 - 1 ,a f t e r I D - I m a g e A n a l y s i s s o f t w a r e a n a l y s i s ( n u m b e r s a r ee x p r e s s e d a s t h e r a t i o o f E c o R I - d i g e s t e d DNAs a f t e rh y b r i d i z a t i o n w i t h P L S T I R E ( C D K 6 ) / M C 4 1 3 R C ( c - m y c ) ;mean S D : 1 . 3 1 0 . 1 1 2 / 1 . 2 7 7 0 . 1 0 8 o r C D K 6 / b c I - 1 /MB R ( d a t a n o t s h o w n ) v a l u e s ( F i g u r e 8 , A a n d B ) ) . U s i n gt h i s a p p r o a c h , we o b s e r v e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s

I I

FL1-H>It-

B 7~~~

F L I - H \ C D K 6 F I T C --->

F i g u r e 5 . I n t r a c e l l u l a r CDK6 e x p r e s s i o n i n n o r m a l t h y m o c y t e s a n d n e o p l a s t i cT - A L L c e l l s b y f l o w c y t o m e t r y . N o r m a l t h y m o c y t e s ( A ) a n d n e o p l a s t i c T - A L Lc e l l s ( B ) were i n c u ba t ed w i th a p p r o p r i a t e amounts o f h y p e r i m m u n e r a b b i t( N C ) a n d a n t i - C D K 6 r a b b i t a n t i s e r a ( r i g h t h i s t o g r a m ) f o l l o w e d b y f l l o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) - c o n j u g a t e d g o a t a n t i - r a b b i t a n t i b o d y a s d e s c r i b e d i nM a t e r i a l s a n d M e t h o d s ( s e e a b o v e ) a n d i n a l y z e d U s i n g F A C S c a n .

F i g u r e 6 . S p e c i f i c i n t r a c e l l u l a r e x p r e s s i o n o f CDK6 i n T - A L L c e l l s b y f l o wc y t o m e t r y . T h e CDK6 g e n e e x p r e s s i o n was i n v e s t i g a t e d ( b l a s t s were > 9 5 % )a f t e r s t a i n i n g w i t h a n t i - C D 5 ( A ) a n d a n t i - C D K 6 ( B ) a n t i b o d i e s . To c o n f i r mt h e s p e c i f i c i t y o f t h e CDK6 b i n d i n g , T - A L L c e l l s ( 5 0 % ) were m i x e d w i t hm o n o c l o n a l B c e l l s o b t a i n e d f r o m a p a t i e n t w it h c h ro ni c l y m p h o c y t i c l e u -k e m i a ( 5 0 % ) a n d t h e n i nc u ba t ed w i t h a n t i - C D K 6 ( C ) a n d a n t i - C D 1 9 ( D )a n t i b o d i e s . T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t f l o w c y t o m e t r y c a n s p e c i f i c a l l yi d e n t i f y i n t r a c e l l u l a r CDK6 a n t i g e n s i n T - A L L c e l l s .

01 93402197

2 01 91 6211 555221

F L - . .j 1OX 6 t 2 1 X lF L I - H \ C D K 6 fI C -"

-a > eX Z-i

L O


7/9

CDK6 i n N o r m a l a n d N e o p l a s t i c L y m p h o c y t e s 2 1 5AJPJanuaty 1 9 9 8 , V o l . 1 5 2 , N o . 1

1 2 3 4 6 6 s u b c a p s u l a r r e g i o n w h e r e i m m a t u r e p r o t h y m o c y t e s a r ef r e q u e n t . 3 6 T h i s p e c u l i a r l o c a l i z a t i o n s u g g e s t s t h a t CDK6c a n p l a y a m a j o r r o l e i n t h e c o n t r o l o f t h e c e l l c y c l e d u r i n gt h e e a r l y p h a s e s o f T c e l l o n t o g e n y .T h e d e m o n s t r a t i o n o f CDK6 o v e r e x p r e s s i o n i n T - L B L /ALL c a n b e a n i n t e r e s t i n g f i n d i n g f o r d i f f e r e n t r e a s o n s .F i r s t , s e v e r a l s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h e c e n t r a l r o l e o f Gld y s r e g u l a t i o n i n l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a b y d e m o n s t r a t -i n g t h e f r e q u e n t l o s s o f f u n c t i o n o f p 1 5 a n d p 1 6 C D K 6i n h i b i t o r s , d u e t o d e l e t i o n s o f M T S 1 a n d MTS2g e n e s . 1 8 - 2 4 I n T - L B L / A L L o n c o g e n e s i s , i t c a n b e h y p o t h -e s i z e d t h a t t h e a c q u i r e d l o s s o f t h e s e p o t e n t CD K i n h i b -i t o r s c a n t r i g g e r t h e e m e r g e n c e a n d p e r p e t u a t i o n o f amnlinnnntnnrr I ni i n t i n r , f r n r t h i n mnlinnnnt t r q n f c f r r m q _H C U I y I I t a l I L b U U I I x ; aL;UUU I I I luUI L f ; l a l i l y l l a l i I L LI a l i I;u l a t -7 . W e s t e r n b l o t t i n g p r e p a r a t i o n s s h o w i n g d i s c r e t e b a n d s i n a l l T - c e l l t i o n o f T l y m p h o b l a s t s . I n t h i s c o n t e x t , the overexpressionb l a s t i c l e u k e m i a / l y m p h o m a s a m p l e s ( l a n e s 1 t o 6 ) , c o r r e s p o n d i n g t o o f C D K 6 could be d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e l a c k o f f u n c t i o n a l) e c t e d C D K 6 p r o t e i n s i z e ( 4 0 k d ) . i n h i b i t o r s , p r o v i d i n g t h e abnormal s i g n a l s necessary f o rn e o p l a s t i c p r o l i f e r a t i o n a n d b l o c k o f c e l l d i f f e r e n t i a t i o ng T - A L L s a n d / o r w i t h B C P - A L L a s t h e c o n t r o l g r o u p . ( a s r e c e n t l y s h o w n f o r CDK4 i n e r y t h r o l e u k e m i a c e l l s ) . 3 7

t h e s e r e s u l t s t e n d t o e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t I n f a c t , G l c e l l c y c l e d e r e g u l a t i o n c a n b e a c h i e v e d n o to v e r e x p r e s s i o n / d e r e g u l a t i o n i n T - A L L i s d u e t o o n l y b y M T S 1 g e n e l o s s b u t a l s o b y C D K 6 a m p l i f i c a t i o n ,g e n e a m p l i f i c a t i o n . a s r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d i n human g l i o m a s , a n o t h e r m a -l i g n a n c y c h a r a c t e r i z e d b y f r e q u e n t M T S 1 g e n e d e l e t i o na n d CDK4 g e n e a m p l i f i c a t i o n . 3 8 3 9 A s i m i l a r r o l e o f CDK6u s s i o n g e n e a m p l i f i c a t i o n a s a m e c h a n i s m a c c o u n t i n g f o r t h eo b s e r v e d CDK6 o v e r e x p r e s s i o n / d e r e g u l a t i o n i n l e u k e m i cs h a r a c t u d y z w e d e m s t r a t g e x p r e t t l s e s i o f T-LBL/Aint T b l a s t s was r u l e d o u t b y o u r S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s .h a r a c t e r i z e d b y s t r o n g e x p r e s s i o n o f CDK6 i n t h e A c c o r d i n g t o o u r s t u d y , CDK6 o v e r e x p r e s s i o n s e e m sm a j o r i t y o f n e o p l a s t i c c e l l s ( u p t o 1 0 0 % ) , a t v a r i - Acodn t o o u ' t d , C veepeso emm a j m o r i t y o f h e re o p l a s t i c c e l l s y u p h t o m 100% a t e v a n m a i n l y r e s t r i c t e d t o l y m p h o b l a s t i c T - c e l l n e o p l a s m s , a sw i t h p r e s m o s o t h e r i ny p e s o f p l y m p h o m a s i n v e m s t i g t , m o s t p e r i p h e r a l T - c e l l a n d B - c e l l l y m p h o m a s o f o u r s e r i e sn x p r a t e d n C D K 6 n o h i n t o n e o p l i c a l T n a l y m p h o b l a s t , f were c h a r a c t e r i z e d b y e i t h e r l o w e x p r e s s i o n o r c o m p l e t en s t r a t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s l a c k o f n u c l e a r i m m u n o r e a c t i v i t y f o r C D K 6 . T h e o n l y t u -e t r y i n o u r s t u d y a n d b y i m m u n o c h e m i c a l a n a l y s i s m o r e x h i b i t i n g CDK6 e x p r e s s i o n c o m p a r a b l e t o t h a t o b -1 1 l y s a t e s o f human l e u k e m i a s b y W o l o w i e c e t a l , 3 5 s e r v e d i n T - L B L / A L L was n a s a l a n g i o c e n t r i c l y m p h o m ab e c o n s i d e r e d a s a b n o r m a l o v e r e x p r e s s i o n a se considered a s abnormal o v e r e x P ression a s ( a l l t h r e e c a s e s o f o u r s e r i e s w e r e s t r o n g l y r e a c t i v e f o r: + t h y m o c y t e s r e p r e s e n t e d l e s s t h a n 15 % i n a l l c o n - C D K 6 ) , a n e o p l a s m c h a r a c t e r i z e d b y p e c u l i a r i m m u n o -i y m i c s a m p l e s ( i n c l u d i n g f e t a l , i n f a n t , a n d h y p e r - p h e n o t y p i c a n d c l i n i c a l f e a t u r e s .c t h y m u s e s ) . S i m i l a r l y , t h e n o n - n e o p l a s t i c l y m p h o i d A more p r e c i s e u n d e r s t a n d i n g o f c e l l c y c l e d y s r e g u -o n e n t o f t h y m o m a s , w h i c h i s k n o w n t o e x h i b i t c o r - l a t i o n t a k i n g p l a c e i n T - c e l l m a l i g n a n c y c o u l d p r o v i d ei m m u n o p h e n o t y p i c f e a t u r e s , 2 5 - 2 8 s h o w e d f i g u r e s new t a r g e t s f o r d r u g d e s i g n . I n f a c t , a t v a r i a n c e w i t h o t h e re x c e e d i n g 3 0 % CDK6' l y m p h o i d c e l l s . I n n o r m a l members o f t h e C D K f a m i l y , t h e e x p r e s s i o n o f CDK6 i sc s a m p l e s , CDK6+ c e l l s w e r e m a i n l y l o c a t e d w i t h i n n o t u n d e r g l u c o c o r t i c o i d r e g u l a t i o n 4 0 ; t h u s , compoundse r i p h e r a l a r e a s o f t h e c o r t e x , c o r r e s p o n d i n g t o t h e s p e c i f i c a l l y i n h i b i t i n g CDK6 c o u l d b e s e a rc h e d a n d r a -t i o n a l l y t e s t e d f o r d e v e l o p i n g a l t e r n a t i v e p r o t o c o l s f o r

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 l y m p h o b l a s t i c T - L B L / A L L c a s e s r e f r a c t o r y t o c o n v e n -t i o n a l t h e r a p y . 4 1 - 4F i n a l l y , t h e d i f f e r e n t i m m u n o p h e n o t y p i c l e v e l o f CDK6e x p r e s s i o n b e t w e e n n e o p l a s t i c a n d n o n - n e o p l a s t i c c o r -t i c a l t h y m o c y t e s c o u l d r e p r e s e n t a u s e f u l d i a g n o s t i cm a r k e r i n t h e d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s o f m e d i a s t i n a lm a s s e s . I n f a c t , i n d i f f e r e n t t y p e s o f t h y m i c l e s i o n s , i n -c l u d i n g t h y m i c h y p e r p l a s i a , t h y m o m a w i t h r i c h l y m p h o i d

o r w r r o r o r-.-o ,roT C 2 1 /Al -. lerr4 r s r % r v - % k r { r % f ohc o m p o n e n i , a n a - L b L / A L L , a l a r g e n u m o e r o T i y m p n o -b l a s t s a r e u s u a l l y f o u n d a t h i s t o l o g i c a l a n d c y t o l o g i c a la n a l y s i s , w h i c h e x h i b i t a c o m m o n i m m a t u r e p h e n o t y p e( T d T + , C D 3 + , C D 1 i + , e t c ) . 2 7 - 2 9 C o n s e q u e n t l y , t h e d i f f e r -- -4i ' - -_ l_ _- aL _- _ - _L - - _ _ _U - ___1 & --S -_-__8 . CDK6 n o r m a l g e n e c o n f i g u r a t i o n i n T - A L L a n d B -A L L b y S o u t h e r n e n t i a t i o n o e t w e e n t n e s e esions m a y o e c i i i c u i t o r i m p o s -i a l y s i s . G e n o m i c D N A s o f s e v e n T - A L L ( l a n e s 1 t o 7 ) a n d t h r e e s i b l e , e s p e c i a l l y i n f i n e - n e e d l e a s p i r a t i o n p r e p a r a t i o n s . 4 5I I ( l a n e s 8 t o 1 0 ) w e r e d i g e s t e d w i t h E c o R I r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e , G e n e r e a r r a n g e m e n t a n a l y s i s can be a v a l ua b l e d i a g n o s -p h o r e s e d , t r a n s f e r r e d , a n d h y b r i d i z e d w i t h 3 2 P - r a d i o l a b e l e d CDK6 itR E ; A ) a n d c - m y c ( M C 4 1 3 R C ; B ) c D N A p r o b e s . S a m p l e s a r e i n d i c a t e d t i C t o o l I n t h e s e cases by p r o v i n g t h e c l o n a l i t y I n T - L B L ,n u m b e r s . p r o v i d i n g t h a t s u f f i c i e n t n u m b e r s o f f r e s h c e l l s a r e a v a i l -

6 35 2

3 53 2

CDK.

F i g u r el y m p h ct h e e x p

amonT h u s ,CDKECDKE

D i s cI n t h i sa r e cl a r g ea n c eT h e Edemoc y t o r ro n c ec a nC D K Et r o l t l -p l a s t i icompt i c a ln e v e rt h y m it h e p

A

B

F i g u r e ,b l o t a nB C P - A Le l e c t r o i( P L S T I Ia s c a s e

A k k m v i Owowmw


8/9


a b l e , b u t t h i s i s n o t a l w a y s t h e c a s e . A s s h o w n i n o u rs t u d y , t h e a n a l y s i s o f CDK6 c a n b e p e r f o r m e d o n r o u t i n ep a r a f f i n - e m b e d d e d m a t e r i a l o r c y t o l o g i c a l s m e a r s a n da l s o b y f l o w c y t o m e t r y , t h u s p r o v i d i n g a s i m p l e a n d r e l i -a b l e a d d i t i o n a l t o o l t o d i s t i n g u i s h n e o p l a s t i c f r o m n o n -n e o p l a s t i c c o r t i c a l t h y m o c y t e p o p u l a t i o n s .

R e f e r e n c e s1 . S h e r r C J : G l p h a s e p r o g r e s s i o n : c y c l i n g o n c u e . C e l l 1 9 9 4 , 7 9 : 5 5 1 -5 5 52 . S t r a u s s M , L u k a s J , B a r t e k J : U n r e s t r i c t e d c e l l c y c l i n g a n d c a n c e r .

N a t u r e Me d 1 9 9 5 , 1 : 1 2 4 5 - 1 2 4 63 . H i r a m a T , K o e f f l e r H P : R o l e o f t h e c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r si n t h e d e v e l o p m e n t o f c a n c e r . B l o o d 1 9 9 5 , 8 6 : 8 4 1 - 8 5 44 . G u a n K - L , J e n k i n s C W , L i Y , N i c h o l s M A , Wu X , O ' K e e f e C L , M a t e r aA G , X i o n g Y : G r o w t h s u p p r e s s i o n b y p 1 8 , a p 1 6 I N K 4 / M T S 1 - a n dp 1 4 I N K 4 B / M T S 2 _ r e l a t e d CDK6 i n h i b i t o r , c o r r e l a t e s w i t h w i l d - t y p e pRBf u n c t i o n . G e n e s D e v 1 9 9 4 , 8 : 2 9 3 9 - 2 9 5 25 . K a r p J E , B r o d e r S : M o l e c u l a r f o u n d a t i o n s o f c a n c e r : new t a r g e t s f o ri n t e r v e n t i o n . N a t u r e Me d 1 9 9 5 , 1 : 3 0 9 - 3 2 06 . C o r d o n - C a r d o C : M u t a t i o n o f c e l l c y c l e r e g u l a t o r s : b i o l o g i c a l a n dc l i n i c a l i m p l i c a t i o n s f o r human n e o p l a s i a . A m J P a t h o l 1 9 9 5 , 1 4 7 : 5 4 5 -5 6 07 . M a t s u s h i m e H , Q ue ll e D E , S h u r t l e f f S A , S h i b u y a M , S h e r r C J , K a t oJ - Y : D - t y p e c y c l i n- d e p e nd e n t k i n a s e a c t i v i t y i n m a m m a l i a n c e l l s . M o lC e l l B i o l 1 9 9 4 , 1 4 : 2 0 6 6 - 2 0 7 68 . M e y e r s o n M , H a r l o w E : I d e n t i f i c a t i o n o f G l k i n a s e a c t i v i t y f o r c d k 6 , an o v e l c y c l i n D p a r t n e r . M o l C e l l B i o l 1 9 9 4 , 1 4 : 2 0 7 7 - 2 0 8 69 . B a t e s S , B o n e t t a L , M a c A l l a n D , P a r r y D , H o l d e r A , D i c k s o n C , P e t e r sG : CDK6 ( P L S T I R E ) a n d CDK4 ( P S K - J 3 ) a r e a d i s t i n c t s u b s e t o f t h ec y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s t h a t a s s o c i a t e w i t h c y c l i n D l . O n c o g e n e1 9 9 4 , 9 : 7 1 - 7 91 0 . Kwon T K , B u c h h o l z M A , G a b r i e l s o n E W , N o r d i n A A : A n o v e l c y t o -p l a s m i c s u b s t r a t e f o r c d k 4 a n d c d k 6 i n n o r m a l a n d m a l i g n a n t e p i -t h e l i a l d e r i v e d c e l l s . O n c o g e n e 1 9 9 5 , 1 1 : 2 0 7 7 - 2 0 8 31 1 . S z e p e s i A , G e l f a n d E W , L u c a s J J : A s s o c i a t i o n o f p r o l i f e r a t i n g c e l ln u c l e a r a n t i g e n w i t h c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s a n d c y c l i n s i n n o r m a la n d t r a n s f o r m e d h u m a n T l y m p h o c y t e s . B l o o d 1 9 9 4 , 8 4 : 3 4 1 3 - 3 4 2 11 2 . M o d i a n o J F , D o m e n i c o J , S z e p e s i A , L u c a s J J , G e l f a n d E W : D i f f e r -e n t i a l r e q u i r e m e n t s f o r i n t e r l e u k i n - 2 d i s t i n g u i s h t h e e x p r e s s i o n a n da c t i v i t y o f t h e c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s C d k 4 a n d C d k 2 i n h u m a n Tc e l l s . J B i o l Chem 1 9 9 4 , 5 2 : 3 2 9 7 2 - 3 2 9 7 81 3 . L u c a s J J , S z e p e s i A , M o d i a n o J F , D o m e n i c o J , G e l f a n d E W :R e g u l a t i o n o f s y n t h e s i s a n d a c t i v i t y o f t h e P L S T I R E p r o t e i n ( c y c l i n -d e p e n d e n t k i n a s e 6 ( C D K 6 ) , a m a j o r c y c l i n D - a s s o c i a t e d C D K4h o m o l o g u e i n n o r m a l human T l y m p h o c y t e s . J I m m u n o l 1 9 9 5 ,1 5 4 : 6 2 7 5 - 6 2 8 41 4 . Ta m S W , T h e o d o r a s A M , S h a y J W , D r a e t t a G F , P a g a n o M : D i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n a n d r e g u l a t i o n o f c y c l i n D l p r o t e i n i n n o r m a l a n d t u m o rhuman c e l l s : a s s o c i a t i o n w i t h C d k 4 i s r e q u i r e d f o r c y c l i n D l f u n c t i o ni n G l p r o g r e s s i o n . O n c o g e n e 1 9 9 4 , 9 : 2 6 6 3 - 2 6 7 41 5 . S e r r a n o M , H a n n o n G J , B e a c h D : A ne w r e g u l a t o r y m o t i f i n c e l l - c y c l ec o n t r o l c a u s i n g s p e c i f i c i n h i b i t i o n o f c y c l i n D / C D K 4 . N a t u r e 1 9 9 3 ,3 6 6 : 7 0 4 - 7 0 71 6 . H a n n o n G J , B e a c h D : p 1 5 I N K 4 B i s a p o t e n t i a l e f f e c t o r o f T G F - , 3 -i n d u c e d c e l l c y c l e a r r e s t . N a t u r e 1 9 9 4 , 3 7 1 : 2 5 7 - 2 6 11 7 . H a l l M , B a t e s S , P e t e r s G : E v i d e n c e f o r d i f f e r e n t m o d e s o f a c t i o n o fc y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s : p 1 5 a n d p 1 6 b i n d t o k i n a s e s , p 2 1a n d p 2 7 b i n d t o c y c l i n s . O n c o g e n e 1 9 9 5 , 1 1 : 1 5 8 1 - 1 5 8 81 8 . H e b e r t J , C a y u e l a J M , B e r k e l e y J , S i g a u x F : C a n d i d a t e t u m o r -s u p p r e s s o r g e n e s M T S 1 ( p 1 6 I N K 4 ) a n d MTS2 ( p 1 5 I N K 4 B ) d i s p l a yf r e q u e n t h o m o z y g o u s d e l e t i o n s i n p r i m a r y c e l l s f r o m T - b u t n o tf r o m B - c e l l l i n e a g e a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a s . B l o o d 1 9 9 5 ,8 4 : 4 0 3 8 - 4 0 4 41 9 . O h n i s h i H , K a w a m u r a M , I d a K , S h e n g X M , Hanada R , N o b o r i T ,Y a m a m o r i S , H a y a s h i Y : H o m o z y g o u s d e l e t i o n s o f p 1 6 / M T S 1 g e n ea r e f r e q u e n t b u t m u t a t i o n s a r e i n f r e q u e n t i n c h i l d h o o d T - c e l l a c u t el y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a . B l o o d 1 9 9 5 , 8 6 : 1 2 6 9 - 1 2 7 52 0 . H a t t a Y , H i r a m a T , M i l l e r C W , Yamada Y , T o m o n a g a M , K o e f f l e r H P :

H o m o z y g o u s d e l e t i o n s o f t h e p 1 5 ( M T S 2 ) a nd p 1 6 ( C D K N 2 / M T S 1 )g e n e s i n a d u l t T - c e l l l e u k e m i a . B l o o d 1 9 9 5 , 8 5 : 2 6 9 9 - 2 7 0 42 1 . O k u d a T , S h u r t l e f f S A , V a l e n t i n e M B , R a i m o n d i S C , H e a d D R , Behm F ,C u r c i o - B r i n t A M , L i u Q , P u i C - H , S h e r r C J , B e a c h D , L o o k A T , D o w n i n gJ R : F r e q u e n t d e l e t i o n o f p 1 6 I N K 4 a / M T S 1 a n d p 1 4 I N K 4 b / M T S 2 i n p e d i a t r i ca c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a . B l o o d 1 9 9 5 , 8 5 : 2 3 2 1 - 2 3 3 02 2 . Q u e s n e l B , P r e u d h o m m e C , P h i l i p p e N , V a n r u m b e k e M , D e r v i t e I , L a iJ L , B a u t e r s F , W a t t e l E , F e n a u x P : p 1 6 g e n e h o m o z y g o u s d e l e t i o n s i na c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a . B l o o d 1 9 9 5 , 8 5 : 6 5 7 - 6 6 32 3 . T a k e u c h i S , B a r t r a m C R , S e r i u T , M i l l e r C W , T o b l e r A , J a n s s e n J W G ,R e i t e r A , L u dw i g W - D , Z i m m e r m a n n M , S c h wa ll e r J , L e e E , M i y o s h i I ,K o e f f l e r H P : A n a l y s i s o f a f a m i l y o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s :p 1 5 / M T S 2 / I N K 4 B , p 1 6 / M T S 1 / I N K 4 A , a nd p 1 8 g e n e s i n a c u t e l y m p h o -b l a s t i c l e u k e m i a o f c h i l d h o o d . B l o o d 1 9 9 5 , 8 6 : 7 5 5 - 7 6 02 4 . C a y u e l a J - M , M a d a n i A , S a n h e s L , S t e r n M - H , S i g a u x F : M u l t i p l et u m o r - s u p p r e s s o r g e n e 1 i n a c t i v a t i o n i s t h e m o s t f r e q u e n t g e n e t i ca l t e r a t i o n i n T - c e l l a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a . B l o o d 1 9 9 6 , 8 7 :2 1 8 0 - 2 1 8 62 5 . C h i l o s i M , P i z z o l o G : R e v i e w o f t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e :b i o l o g i c a l a s p e c t s , m e t h o d s o f d e t e c t i o n , a n d s e l e c t e d d i a g n o s t i ca p p l i c a t i o n s . A p p l I m m u n o h i s t o c h e m 1 9 9 5 , 3 : 2 0 9 - 2 2 12 6 . M a r i n o M , M u l l e r - H e r m e l i n k H K : Thymoma a n d t h y m i c c a r c i n o m a :r e l a t i o n o f t h y m o m a c e l l s t o t h e c o r t i c a l a n d m e d u l l a r y d i f f e r e n t i a t i o no f t h y m u s . V i rc h o ws A rc h A P a t h o l A n a t 1 9 8 5 , 4 0 7 : 1 1 9 - 1 4 92 7 . C h i l o s i M , l a n n u c c i A M , P i z z o l o G , M e n e s t r i n a F , F i o r e - D o n a t i L ,J a n o s s y G : I m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h y m o m a : e v i d e n c ef o r m e d u l l a r y o r i g i n o f e p i t h e l i a l c e l l s . A m J S u r g P a t h o l 1 9 8 4 ,8 : 3 0 9 - 3 1 82 8 . C h i l o s i M , l a n n u c c i A , F i o r e - D o n a t i L , T r i d e n t e G , P a m p a n i n M ,P i z z o l o G , R i t t e r M , B o f i l l M , J a n o s s y G : M y a s t h e n i a g r a v i s : i m m u -n o h i s t o l o g i c a l h e t e r o g e n e i t y i n m i c r o e n v i r o n m e n t a l o r g a n i z a t i o n o fh y p e r p l a s t i c a n d n e o p l a s t i c t h y m u s e s s u g g e s t i n g d i f f e r e n t m e c h -a n i s m s o f t o l e r a n c e b r e a k d o w n . J N e u r o i m m u n o l 1 9 8 6 , 1 1 : 1 9 1 -2 0 42 9 . C h i l o s i M , l a n n u c c i A , M e n e s t r i n a F , L e s t a n i M , S c a r p a A , F i o r e -D o n a t i L , T r i d e n t e G , D i P a s q u a l e B , P i z z o l o G , P a l e s t r o G , J a n o s s yG : I m m u no h i s t o c h e m i c al e v i d e n c e o f a c t i v e t h y m o c y t e p r o l i f e r a t i o n i nt h y m o m a : i t s p o s s i b l e r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f a u t o i m m u n e d i s -e a s e . A m J P a t h o l 1 9 6 7 , 1 2 8 : 4 6 4 - 4 7 03 0 . C h i l o s i M , D o g l i o n i C , M e n e s t r i n a F , M o n t a g n a L , R i g o A , L e s t a n i M ,B a r b a r e s c h i M , S c a r p a A , M a r i u z z i G M , P i z z o l o G : A b n o r m a l e x p r e s -s i o n o f t h e p 5 3 - b i n d i n g p r o t e i n mdm2 i n H o d g k i n ' s d i s e a s e . B l o o d1 9 9 4 , 8 4 : 4 2 9 5 - 4 3 0 03 1 . I n g h i r a m i G , F o i t l D R , S a b i c h i A , Z h u B Y , K n o w l e s D M : A u t o a n t i b o d y -a s s o c i a t e d c r o s s - r e a c t i v e i d i o t y p e - b e a r i n g h u m a n B l y m p h o c y t e s :d i s t r i b u t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n , i n c l u d i n g I g VH g e n e a n d CD5a n t i g e n e x p r e s s i o n . B l o o d 1 9 9 1 , 7 8 : 1 5 0 3 - 1 5 1 53 2 . G e r s h o n i J M , P a l a d e G E : P r o t e i n b l o t t i n g : p r i n c i p l e s a n d a p p l i c a -t i o n s . A n a l B i o c h e m 1 9 8 3 , 1 3 1 : 1 - 1 53 3 . P e l i c c i P G , K no wl e s D M , M a g r a t h I , D a l l a - F a v e r a R : C h r o m o s o m a lb r e a k p o i n t s a n d s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s o f t h e c - m y c l o c u s d i f f e r i ne n d e m i c a n d s p o r a d i c f o r m s o f B u r k i t t l y m p h o m a . P r o c N a t l A c a d S c iUS A 1 9 8 6 , 8 3 : 2 9 8 4 - 2 9 8 83 4 . T s u j i m o t o Y , J a f f e E , C o s s m a n J , G o r h a m J , N o w e l l P C , C r o c e C M :C l u s t e r i n g o f b r e a k p o i n t s o n c h r o m o s o m e 1 1 i n h u m a n B - c e l l n e o -p l a s m s w i t h t h e t ( 1 ; 1 4 ) c h r o m o s o m e t r a n s l o c a t i o n . N a t u r e 1 9 8 5 ,9 5 : 3 1 5 : 3 4 0 - 3 4 33 5 . W o l o w i e c D , M e k k i Y , F f r e n c h P , M a n e l A M , B e r t r a n d Y , R i m o k h R ,P h i l i p p e N , B r y o n P A , F fr en c h M : D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f c e l l p r o -l i f e r a t i o n r e g u l a t o r y p r o t e i n s i n B - a n d T - l i n e a g e a c u t e l y m p h o b l a s t i cl e uk a em i as . B r J H a e m a t o l 1 9 9 6 , 5 1 8 - 5 2 33 6 . J a n o s s y G , B o f i l l M , T r e j d o s i e w i c z L K , W i l l c o x H N A , C h i l o s i M : C e l -l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n o f l y m p h o i d s u b p o p u l a t i o n s a n d t h e i r m i c r o e n v i -r o n m e n t s i n t h e human t h y m u s . T h e Human T h y m u s : H i s t o p a t h o l o g ya n d P a t h o l o g y . E d i t e d b y M u l l e r - H e r m e l i n k H K . B e r l i n , S p r i n g e r - V e r -l a g , 1 9 8 6 , p p 8 9 - 1 2 53 7 . K i y o k a w a H , R i c h o n V M , R i f k i n d R A , M a r k s P A : S u p p r e s s i o n o f c y c l i n -d e p e n d e n t k i n a s e 4 d u r i n g i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n o f e r y t h r o l e u k e m i ac e l l s . M o l C e l l B i o l 1 9 9 4 , 1 4 : 7 1 9 5 - 7 2 0 33 8 . S c h m i d t E E , I c h i m u r a K , R e i f e n b e r g e r G , C o l l i n s V P : CDKN2 ( p 1 6 /M T S 1 ) g e n e d e l e t i o n o r CDK4 a m p l i f i c a t i o n o c c u r s i n t h e m a j o r i t y o fg l i o b l a s t o m a s . C a n c e r R e s 1 9 9 4 , 5 4 : 6 3 2 1 - 6 3 2 43 9 . S o n o d a Y , Y o s h i m o t o T , S e k i y a T : H o m o z y g o u s d e l e t i o n o f t h e M T S 1 /


9/9

CDK6 i n N o r m a l a n d N e o p l a s t i c L y m p h o c y t e s 2 1 7AJPJanuary 1 9 9 8 , V o l . 1 5 2 , N o . 1

p 1 6 a n d M T S 2 / p 1 5 g e ne s a n d a m p l i f i c a t i o n o f t h e CDK4 g e n e i ng l i o m a . O n c o g e n e 1 9 9 5 , 1 1 : 2 1 4 5 - 2 1 4 94 0 . R h e e K , R e i s m a n D , B r e s n a h n W , T h o m p s o n E A : G l u c o c o r t i c o i dr e g u l a t i o n o f G l c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e g e n e s i n l y m p h o i d c e l l s .C e l l G r o w t h D i f f e r 1 9 9 5 , 6 : 6 9 1 - 6 9 84 1 . Abe J , Z h ou W , T a k u w a N , T a g u c h i J , K u r o k a w a K , Kumada M ,T a k u w a Y : A f u m a g i l l i n d e r i v a t i v e a n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r , A G M - 1 4 7 0 ,i n h i b i t s a c t i v a t i o n o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s a n d p h o s p h o r y l a t i o no f r e t i n o b l a s t o m a g e n e p r o d u c t b u t n o t p r o t e i n t y r o s y l p h o s p h o r y l a -t i o n o r p r o t o o n c o g e n e e x p r e s s i o n i n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . C a n -c e r R e s 1 9 9 4 , 5 4 : 3 4 0 7 - 3 4 1 24 2 . M a r k s P A , R i c h o n V M , K i y o k a w a H , R i f k i n d R A : I nd uc i ng d i f f e r e n t i a -t i o n o f t r a n s f o r m e d c e l l s w i t h h y b r i d p o l a r c o m p o u n d s : a c e l l c y c l e -d e p e n d e n t p r o c e s s . P r o c N a t l A c a d S c i USA 1 9 9 4 , 9 1 : 1 0 2 5 1 - 1 0 2 5 4

4 3 . V e s e l y J , H a v i l c e k L , S t r a n d M , B l o w J J , D o n e l l a - D e a n a A , P i n n a L ,L e t h a m D S , K a t o J - Y , D e t i v a u d L , L e c l e r c S , M e i j e r L : I n h i b i t i o n o fc y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s b y p u r i n e a n a l o g u e s . E u r J B i o c h e m 1 9 9 4 ,2 2 4 : 7 7 1 - 7 8 64 4 . A k a g i T , Ono H , S h i m o t o h n o K : T y r o s i n e k i n a s e i n h i b i t o r h e r b i m y c i n Ar e d u c e s t h e s t a b i l i t y o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e C d k 6 p r o t e i n i nT - c e l l s . O n c o g e n e 1 9 9 6 , 1 3 : 3 9 9 - 4 0 5

4 5 . F r i e d m a n H D , H u t c h i s o n R E , Kohman L J , P o w e r s C N : Thymomam i m i c k i n g l y m p h o b l a s t i c l y m p h o m a : a p i t f a l l i n f i n e - n e e d l e a s p i r a t i o nb i o p s y i n t e r p r e t a t i o n . D i a g n C y t o p a t h o l 1 9 9 6 , 1 4 : 1 6 5 - 1 7 14 6 . S c a r p a A , C h i l o s i M , C a p e l l i P , B o n e t t i F , M e n e s t r i n a F , Z a m b o n i G ,P i z z o l o G , P a l e s t r o G , F i o r e - D o n a t i L , T r i d e n t e G : E x p r e s s i o n a n dg e n e r e a r r a n g e m e n t o f t h e T - c e l l r e c e p t o r i n h u m a n t h y m o m a s . V i r -c h o w s A r c h B C e l l P a t h o l 1 9 9 0 , 5 8 : 2 3 5 - 2 3 9

Documents

Differential Expression of Cyclin-Dependent Kinase 6 in Cortical Thymocytes and T-Cell Lymphoblastic Leukemia