Different MS strategy on Different MS strategy on gygyproteomics researchproteomics researchpp

Pengyuan YangPengyuan YangPengyuan YangPengyuan YangFudan UniversityFudan University

20072007年年33月月77日日

OutlineOutline

Proteomics

M t tMass spectrometry

MS based proteomicsMS based proteomics

MS proteome data analysis

2001/2/15 2001/2/16

功能基因组学时代结构基因组学时代 功能基因组学时代结构基因组学时代

序列图 基因图DNA序列图≠基因图

人类基因组中1/3以上人类基因组中1/3以上基因未曾确认基因未曾确认

基因确认的基本层次--基因确认的基本层次蛋白质水平

基 (基因组(genome = gene + chromosome):生物体所拥有的全套染色体上的全部基因生物体所拥有的全套染色体上的全部基因

转录组(t i t t i t + )转录组(transcriptome=transcript + genome):一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套

mRNA

蛋白质组(proteome = protein + genome):一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套

蛋白质蛋白质

Genome and Proteome

中心法则

DNA RNA DNA RNA 蛋白质蛋白质

功能执行体遗传信息载体 功能执行体遗传信息载体

蛋白质组基因组 转录组 蛋白质组基因组 转录组

√ √ ？

基因组学向蛋白质组学“求

Nature 409:747, 15 Feb. 2001

基因组学向蛋白质组学 求助” !Nature 409:747, 15 Feb. 2001

And now for proteome

S i 291 1221 16 F b 2001Science 291:1221, 16 Feb. 2001Proteomics in Genomeland

蛋白质组学是功能基因组学的蛋白质组学是功能基因组学的

重要支柱

基因组与转录组不能取代蛋白质组基因组与转录组不能取代蛋白质组

• 基因和蛋白质并不存在严格的线性关系

• ORF并不预示一定存在相对应的功能性基因

• mRNA水平并非与蛋白质的表达水平对应

• 翻译后修饰及同工蛋白质(Isoforms)等现象在基因水平无从表现

• 蛋白质与蛋白质的相互作用难以在基因水平得以认识

人体人体人体：人体：11个受精卵个受精卵→→10101212细胞，细胞，101033细胞类型细胞类型

其其““时时”” 、、““空空”” 变化在于其间变化在于其间““蛋白蛋白其其 时时 、、 空空 变化在于其间变化在于其间 蛋白蛋白质组质组””的改变，而的改变，而““基因组基因组””不变不变

• 生命体的统一性源于基因组

生命体的复杂性基 白质• 生命体的复杂性基于蛋白质组

重大疾病的研究状况重大疾病的研究状况重大疾病的研究状况重大疾病的研究状况重大疾病发生发展机制重大疾病发生发展机制

重大

蛋白

是全

单一基因单一基因 单一蛋白单一蛋白

大疾病的

其防诊

白质组“

全面认识础??

?

的病理机

诊治的基

“全景式

识病理机

础。

基因群基因群 蛋白质群蛋白质群

?

?机制认识

基础。

式”分析

机制的基?

?识是

析基

转录组转录组 蛋白质组蛋白质组

Science 291:1221, 2001

SpecimenBank

Database PathomeBank

Antibody

Physiome

AntibodyBankScientific objectives:

“Solar System” of Liver Proteome Project

Localization

y j

Map

LinkagegMap

ORFExpression Profile

ModificationProfile

ORFeome

总体思路总体思路

Glycosome

国际蛋白质组学的 大前沿方向国际蛋白质组学的 大前沿方向国际蛋白质组学的三大前沿方向国际蛋白质组学的三大前沿方向

生物体或特定组织生物体或特定组织//细胞的全蛋白质组和蛋白质组连锁群的细胞的全蛋白质组和蛋白质组连锁群的研究研究 ((compositionalcompositional proteomicsproteomics))研究研究 ((compositionalcompositional proteomicsproteomics))

重大生命过程或重大疾病的比较蛋白质组或亚蛋白组研究重大生命过程或重大疾病的比较蛋白质组或亚蛋白组研究重大生命过程或重大疾病的比较蛋白质组或亚蛋白组研究重大生命过程或重大疾病的比较蛋白质组或亚蛋白组研究

((comparativecomparative proteomicsproteomics))

高通量高通量、、高效率高效率、、高灵敏度的蛋白质组提取高灵敏度的蛋白质组提取、、分离分离、、鉴定的鉴定的

新技术新技术 蛋白质组的生物信息学体系蛋白质组的生物信息学体系新技术新技术;; 蛋白质组的生物信息学体系蛋白质组的生物信息学体系

化学家拯救了人类基因组测序计划

化学家研究和发展了

化学家拯救了人类基因组测序计划

化学家研究和发展了96道毛细管电泳快速测序

News Focus, SCIENCE 291/5507 1207B 2001

UNSUNG HEROES:NORM DOVICHI & HIDEKI KAMBARACREDIT: MARY LEVIN/UNIVERSITY OF WASHINGTON

SCIENCE 291/5507, 1207B, 2001

An ocean apart, Dovichi at the University of Alberta in Canada and Kambara at the Hitachi Co. in Tokyo independently hit upon a seq encing technolog that greatl ad anced the h man genome projectsequencing technology that greatly advanced the human genome project. The method, used in today's high-speed machines, uses laser beams to scan DNA being pumped through numerous capillary tubes,scan DNA being pumped through numerous capillary tubes, simultaneously identifying the bases by color-coded chemical tags.

2002年的诺贝尔化学奖授予了三位研究人员，其中包括美国科学家芬恩和日本科学家员，其中包括美国科学家芬恩和日本科学家田中耕一，表彰他们在生物质谱领域中里程碑的贡献 以及对蛋白质组学研究的深远影碑的贡献, 以及对蛋白质组学研究的深远影响。

Information Department, The Royal Swedish Academy of Science, Advanced information on the Nobel prize in Chemistry 2002, www.kva.sc, 9 Oct., 2002.

1994年，蛋白质组学第一次被提出，生物质谱被建议用来测定生物大分子结构 鉴定组成以及进行痕量议用来测定生物大分子结构、鉴定组成以及进行痕量分析。因此，生物大分子质谱在1995年后确实越过了化学和物理的边界 融入到生物化学和生物科学领域化学和物理的边界，融入到生物化学和生物科学领域[3]。

1996年生物质谱被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，科学家此时已认识到生物质谱另一个吸引人之处的是可以取代Edman降接测序方法，了解蛋白生成的早期结构城，以及当时显示出来的可以鉴定翻译后修饰的能力。更有甚者生物质谱还可以用来测定非共价健作用比如抗体-抗原结合作用。

2001年以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化已成定局 生物质谱正在发挥着其不可组学的规模化已成定局，生物质谱正在发挥着其不可取代的中坚作用。

蛋白质组学的回顾蛋白质组学的回顾

蛋白质的分离

1940-1960年代，电泳，诺贝尔奖，色谱，诺贝尔奖

蛋白质组的分离，

1960-1980年代，双相电泳，（蛋白质组先于基因组）

蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定

1940-1960， 测序，诺贝尔奖，

1960-1980，质谱，诺贝尔奖

蛋白质组的鉴定蛋白质组的鉴定

1980-2002，生物质谱，诺贝尔奖

研究技术的发展使蛋白质组学成为可能

1948 年， A. W. K. Tiselius 因研究和发明蛋白质电泳技术而获得诺贝尔化学奖蛋白质电泳技术而获得诺贝尔化学奖

1952年，A. J. P. Martin和R. L. M. Synge 因发明纸色谱和薄层色谱分离蛋白质和因发明纸色谱和薄层色谱分离蛋白质和

氨基酸而获得诺贝尔化学奖

1958 年 F Sanger研究胰岛素结构时因1958 年，F. Sanger研究胰岛素结构时因发明蛋白质测序而获得诺贝尔化学奖

鼠肝蛋白的双向电泳图向 H3 10 NL 二向 12%分离胶一向： pH3-10, NL , 二向：12%分离胶

70-80 年代70-80 年代，生物学家已经可以用二维技可以用二维技术将复杂蛋白质体系分开质体系分开

主要因为发展质谱技术和方法而获诺贝尔奖的主要因为发展质谱技术和方法而获诺贝尔奖的科学家有好几位， 他们是：

J. J. Thompson (物理1906，发明质谱技术并用以研究气体的电导)，

F. W. Aston (化学1922，用质谱仪发现了非放射性元素的同位素)元素的同位素)，

W. Paul (物理1980，发明离子阱质谱原理与技术)，

R. F. Curl, R. E. Smalley and H. W. Kroto (化学1996 用质谱仪观察到激光轰击下产生的C60)1996，用质谱仪观察到激光轰击下产生的C60),

K.Tanaka和J.B. Fenn （化学2002，发明生物大分子质谱技术）。

生物质谱，不同于其他质谱，如无机、有机质谱，顾名思义是研究生物分子的 而生物分子 大多数以其高相对分义是研究生物分子的，而生物分子，大多数以其高相对分子质量而区别于其他分子。就质谱而言，以往的质谱只要求测定几十到2000的相对分子质量，而生物质谱则要求测定上万甚至是上百万的。

质谱的特点可归纳为几个“S”，即灵敏（sensitivity）、快质谱的特点可归纳为几个 ，即灵敏（ y）、快速(speed)、专一(specificity)，充分展示了质谱比其他方法优越。同时，质谱在测定中为生物样品分子提供了准确的化学计量 信息化学计量（stoichiometry）信息。

质谱成为分析生物活性分子的重要手段，是由于它具有以下特点：下特点

（1）高灵敏度，可测10-8以下克分子；

（ 快速 数分钟内即可完成测试（2)快速，数分钟内即可完成测试；

（3)能同时提供样品的精确分子质量和结构信息；

（4)既可用于定性分析，也可用于定量分析；

（5)能有效地与各种色谱联用 如GC/MS HPLC／MS（5)能有效地与各种色谱联用，如GC/MS,HPLC／MS，TLC／MS及CZE／MS等，用于复杂体系分析。

HPLC

Thermal spray

Bed vaporization

solutionsolution

MS

digestion

gel

泰勒锥泰勒锥

质谱

不锈钢毛细管

质谱采样孔分析溶液

电喷雾间隙

电喷雾装置高压装置（3000-5000V)

电喷雾：在不锈钢毛细管和质谱采样孔施加高压， 分析溶液

在电场下气溶化和带上电荷，然后离子化，并以多电荷离子进入质谱。

电喷雾原理示意图电喷雾原理示意图

Fenn, J.B., et al., Proc 36th Annual Conference, Am. Soc. For Mass Spectrom., San Francisco, 5-10 June 1988, p. 733.Mass Spectrom., San Francisco, 5 10 June 1988, p. 733.

通常认为电喷雾可以用两种机制来解释。

(1)小分子离子蒸发机制：在喷针针头与施加电压的电极之(1)小分子离子蒸发机制：在喷针针头与施加电压的电极之间形成了强电场，该电场使液体带电，带电的溶液在电场的作用下向带相反电荷的电极运动，并形成带电的液珠(液(滴)，由于小雾滴的分散，比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面积的场强高达108V/cm2，从而产生液滴的“爆裂” 重复此过程 最终产生分子离子产生液滴的“爆裂”。重复此过程，最终产生分子离子。

(2) 大分子带电残基机制：首先也是电场使溶液带电，结果形成带电雾滴，带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶，溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子化的分子 般来讲 电喷雾方法适合使溶液中形成离子化的分子。一般来讲，电喷雾方法适合使溶液中的分子带电而离子化。离子蒸发机制是主要的电喷雾过程，但对质量数大的分子化合物，带电残基的机制会起相当重但对质量数大的分子化合物，带电残基的机制会起相当重要的作用。

e- Ar+ Cs+ hv cluster

FABFAB

Protein depositionp

基体辅助激光解吸（MALDI）在原理上利用激基体辅助激光解吸（MALDI）在原理上利用激光束照射分散于基质中的样品，由于这些基质能够强烈吸收激光，从而保护了样品分子。够强烈吸收激光，从而保护了样品分子。MALDI中的基体起着如下几种重要作用：从脉冲激光中吸收足够的能量；隔离样品分子；提供冲激光中吸收足够的能量；隔离样品分子；提供光激发的酸或碱基团；以及在离子—分子碰撞中电离样品分子。电离样品分子。

Tanaka K Ido Y et alTanaka, K., Ido, Y., et al

Second Japan-China Joint S i M S t tSymposium on Mass Spectrometry.

Editors Matsuda, H. and Xiao-tian Liang. (Odaka, Japan, 15-18 September 1987)p. 185-188.

German scientist, 1988.

MALDI 技术原理MALDI 技术原理示意图

公认的机理是：激光光束的能量首先被发色团的基体吸收，接着这些基体迅速蒸发为气相，被包含的分析物的分子从而被带入气含的分析物的分子从而被带入气相。而离子化的产生是由于受激的基体分子将质子转移给分析物的基体分子将质子转移给分析物分子。这个过程似乎是在固相中进行的，也可能是由激光诱导的（粒子）在尾焰中的碰撞引起的。MALDI离子源，可以电离分子量为100 1 000 000D 的生物分子并为100-1,000,000Da的生物分子并用于质谱分析，提供了高的灵敏度、高的离子透过率、和强的可度、高的离子透过率、和强的可操作性。

令人鼓舞的是，生物大分子质谱在1995年后确实越过了化学和物理的边界，融入到生物化学和生物科学领域域。

1996年生物质谱被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，科学家此时已认识到生物质谱另一个吸引人之处的是可以取代Edman降接测序方法，了解蛋白生成的早期结构城 以及当时显示出来的可以鉴定翻译成的早期结构城，以及当时显示出来的可以鉴定翻译后修饰的能力。更有甚者生物质谱还可以用来测定非共价健作用比如抗体-抗原结合作用。共价健作用比如抗体 抗原结合作用。

2001年以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化已成定局 生物质谱正在发挥着其不可取学的规模化已成定局，生物质谱正在发挥着其不可取代的中坚作用。

完整的质谱仪是机械、电子、真空、计算机及电子离子

光学等多方面技术的综合。质谱仪的核心是离子源和分析器 其他的部分 般根据离子源和分析器相应地来配析器，其他的部分一般根据离子源和分析器相应地来配备。

分析器类型主要有：磁偏转、四极杆、离子阱、飞行时偏转 杆 离间、离子回旋共振等。不同的分析器与离子源间有多种组合，构成了质谱仪器的家族。

生物质谱分析的基本方法是测定分子量，生物质谱分析的基本方法是测定分子量，其他的分析方法均为测定的衍生方法。

8.0x104

b14,303.24.50x105

a

4.0x104

6.0x104

ensi

ty(c

ps)

5

3.00x105lysozyme

ensi

ty(c

ps)

0.0

2.0x104inte

0.00

1.50x105

inte

12000 13000 14000 15000 16000

mass(Da)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

M/Z

图 5.1 溶菌酶的 ESIMS 谱图 （a）溶菌酶的多电荷谱图， （b）多电荷谱图的重组谱图

对一个多电荷的谱图可以基于如此假设：样品的带电荷数是连续的 样品的带电离子是 等已知的离子 则对任连续的；样品的带电离子是H+、Na+等已知的离子，则对任意的一多电荷谱峰，设该多电荷谱中相邻峰的带电荷数为n和n 1 则可以得到如下方程：和n-1，则可以得到如下方程：

⎧ += /)'( nnmmM

⎩⎨⎧

−−+=+=

)1/(]')1([/)(

2

1

nmnmMnnmmM

式中：M1，M2为所测定的质荷比；m为蛋白质的分子质量；m’为带电荷离子的分子质量 联立该方程组即可得到蛋白m 为带电荷离子的分子质量。 联立该方程组即可得到蛋白质的分子质量。从多个多电荷峰可以获得一系列的分子质量的计算值。将该计算值平均后，即可获得蛋白质的分子质量。

除测定蛋白质和肽的准确分子量外，生物质谱仪可根据肽段的碎片离子之间的质量差进行氨仪可根据肽段的碎片离子之间的质量差进行氨基酸序列的推测。生物质谱产生碎片离子的模式常采用CID、CAD、PSD等模式。这些方法式常采用CID、CAD、PSD等模式。这些方法为生物大分子的鉴定及结构测定提供了重要信息。息。

CID是一种最为简单的模式。离子经过电喷雾源在进入质量检测前，施加一定的电压，离子的运动速度将大大质量检测前，施加 定的电压，离子的运动速度将大大提高， 当离子与中性分子撞击时，将发生如下的离子反应：

式中：A+为中性分子离子（母离子）；N为中性分子如( ) +++++ ++→→+ DCBANA *

式中：A 为中性分子离子（母离子）；N为中性分子如Ar、N2等中性分子；(A+)*为激发态离子（即含有过多能量的分子离子）；B+ 、C+、D+即为分子离子产生的碎片的分子离子 ； 即为分子离子产 的碎片离子。

CID模式较为简单且易于操作，但该种模式产生的碎片CID模式较为简单且易于操作，但该种模式产生的碎片离子较为复杂，尤其是在LC-MS中，由于溶剂的干扰及样品分离的不彻底，CID谱图常是多个分子离子的碎片谱图，这对CID谱图的解析带来一定的难度。

CAD模式同CID的原理是一样的，主要不同的是CAD采 谱来实 离 产 碎 离采用串级质谱来实现分子离子产生的碎片离子的过程。

第一个四级杆质谱仪作为一个质量分析器，可选择单一的母离子通过第一级质谱而进入第二级质谱仪。第二级质谱仪作为一个碰撞反应池，其内充有一定的惰性或中性气体如A N 当单个的母离子飞入第二级性或中性气体如Ar、 N2，当单个的母离子飞入第二级质谱时，将产生离子反应。碎片离子再经过第三级质谱仪得以检测。谱仪得以检测。

CAD模式所得谱图较为简单，相对CID谱图的解析CAD谱图易于分析。

由于蛋白质基本结构是由肽键构成的。肽键断裂的方式有如下几种

所产生的碎片离子分别定义为：a, b, c, x, y,所产生的碎片离子分别定义为：a, b, c, x, y, z 六种类型。电荷带于N端的有a、b、c类型的离子；电荷带于C端的有x、y、z类型的的离子；电荷带于C端的有x、y、z类型的离子。根据键能的大小，主要以b、y型离子为主。同时，在肽段的断裂中，除了主子为主。同时，在肽段的断裂中，除了主链的断裂外，肽段中氨基酸侧链也会产生断裂。因此带来了谱图的复杂性断裂。因此带来了谱图的复杂性

Hi h th h t t i tfHigh throughput proteomics patform

22--DEDE电泳胶上蛋白质点鉴定的通量和准确度；电泳胶上蛋白质点鉴定的通量和准确度；22 DEDE电泳胶上蛋白质点鉴定的通量和准确度；电泳胶上蛋白质点鉴定的通量和准确度；

SDSSDS--PAGEPAGE分离分离，，胶内酶切和液相色谱串联质谱胶内酶切和液相色谱串联质谱

鉴定的技术策略；鉴定的技术策略；

蛋白质全酶切蛋白质全酶切，，离线或在线离线或在线多维色谱多维色谱分离肽段分离肽段蛋白质全酶切蛋白质全酶切，，离线或在线离线或在线多维色谱多维色谱分离肽段分离肽段

混合物混合物，，

液相色谱液相色谱--串联质谱联用鉴定蛋白质的技术平串联质谱联用鉴定蛋白质的技术平

台与技术策略台与技术策略台与技术策略台与技术策略，，

技术路线技术路线技术路线技术路线技术路线技术路线 分离方法分离方法 质谱类型质谱类型 单单 位位

SCX_Digestion_SCXLC_RPLCSCX_Digestion_SCXLC_RPLC ESI_ITMSESI_ITMS 生科院生科院

SAX_Digestion_SCXLC_RPLCSAX_Digestion_SCXLC_RPLC ESI_ITMSESI_ITMS 华大华大

2D2D--LCLCSEC_Digestion_SCXLC_RPLCSEC_Digestion_SCXLC_RPLC ESI_ITMSESI_ITMS 军科院军科院

SEC_Digestion_SCXLC_RPLCSEC_Digestion_SCXLC_RPLC ESI_QSTARESI_QSTAR 复旦复旦

Digestion_SCXLC_RPLCDigestion_SCXLC_RPLC ESI_ITMSESI_ITMS 军科院，生科院军科院，生科院华大华大

SEC_Digestion_SCXLC_RPLCSEC_Digestion_SCXLC_RPLC MALDI_TOFTOFMALDI_TOFTOF 复旦复旦gg

22--D GelD Gel 2DE_Digestion2DE_Digestion MALDI_TOFTOFMALDI_TOFTOF 军科院，复旦军科院，复旦生科院，华大生科院，华大

SDSSDS--PAGEPAGESAX_SDS_Digestion_RPLCSAX_SDS_Digestion_RPLC ESI_ITMSESI_ITMS 华大华大

SDS_Digestion_RPLCSDS_Digestion_RPLC ESI_ITMSESI_ITMS 军科院军科院

原则:每条技术路线必须有两个以上实验室采用;每个实验室采用的技术路线必须重复1次

1

2DE-RPLC-QtofMarco RPLC-LCQ对

0.8

0.92DE-Ultraflex

SEC-SCXLC-RPLC-QSTAR SDS-RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-RPLC-LTQ实验

0.72DE-ABI4700

SCXLC-RPLC-LTQ

验结果

0.5

0.6E

ffect

ive

Rat

e2DE-Autoflex

SCXLC-RPLC-LCQ

果的分

有效

0 3

0.4

E分析

检出率0.2

0.3

0

0.1

检处率

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

Detectable Rate

0.9

1

2DE-RPLC-QtofMicro

2DE Ultrafle

0.8

2DE-Ultraflex

0 6

0.7 2DE-ABI4700

0.5

0.6

peci

ficity

0.4

Sp

SDS-RPLC-LCQ

SEC-SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-Autoflex

0.2

0.3 RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-RPLC-LTQ

SDS RPLC LCQ

0.1

Q

SCXLC-RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-LTQ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

Sensitivity

0.9

1

2DE-RPLC-QtofMicro

2DE UltrafleThe specificities of tofMicro,

0.8

2DE-Ultraflex Ultraflex and ABI4700 data are fairly high.

0 6

0.7 2DE-ABI4700

0.5

0.6

peci

ficity

0.4

Sp

SDS-RPLC-LCQ

SEC-SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-Autoflex

0.2

0.3 RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-RPLC-LTQ

SDS RPLC LCQ

0.1

Q

SCXLC-RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-LTQ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

Sensitivity

0.9

1

2DE-RPLC-QtofMicro

2DE Ultrafle

0.8

2DE-Ultraflex

0 6

0.7 2DE-ABI4700 The sensitivity of some LCQ lines are fairy high, even surpass LTQ. The

causations may be ESI

0.5

0.6

peci

ficity

causations may be ESI nozzle (nano vs. micro) and

differences of MS parameters

0.4

Sp

SDS-RPLC-LCQ

SEC-SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-Autoflex

0.2

0.3 RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-QSTAR

2DE-RPLC-LTQ

SDS RPLC LCQ

0.1

Q

SCXLC-RPLC-LCQ

SCXLC-RPLC-LTQ

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

Sensitivity

技术路线的优化（通量）技术路线的优化（通量）

2DE2DE--MS/MSMS/MS--MSMS达到和超过了达到和超过了10001000蛋白质蛋白质点点//天的鉴定通量（包括肽指纹图谱和串天的鉴定通量（包括肽指纹图谱和串级质谱图）级质谱图）级质谱图）级质谱图）

ShutgunShutgun可实现可实现10001000个蛋白质个蛋白质//天的鉴定天的鉴定通量通量通量通量

SDSSDS--PAGEPAGE--LCLC--MS/MSMS/MS鉴定通量为鉴定通量为500500--10001000个蛋白质个蛋白质//天天

中国人健康肝脏中国人健康肝脏2DE2DE蛋白质表达谱蛋白质表达谱中国人健康肝脏中国人健康肝脏2DE2DE蛋白质表达谱蛋白质表达谱4.5 9pH

100kD

MW

8kD

5481个蛋白质点

Comparative proteome analysis between p p yLCI D20 and LCI D35

pH4 7 pH4 7

Fig. 1. Two-dimensional gel electrophoresis separation of 1mg liver cancer tissue proteins of model LCI-D20 (A) and LCI-D35 (B) The circled protein spots(70) were identify byof model LCI-D20 (A) and LCI-D35 (B). The circled protein spots(70) were identify by MALDI-TOF-MS. The green circled protein spots(32) were identified also and others with red circles were not.

Proteome analysis of HCC cultured cell lines with different metastatic potential

Hep 3B MHCC97L MHCC97H

different metastatic potential

S100A4

3B L H3B L H

S100A6

Annexin 1Differential displayed protein：104

As shown in Figs. 1a and 1b, the 2DLC-ESI route provided the largest data contribution to the identified proteins (1391 uniquelylargest data contribution to the identified proteins (1391 uniquely identified proteins), especially in the range of SCIN of 0.001-0.1 as reported . p

The 3DLC-ESI route contributed 916 uniquely identified proteins, and gave the highest identifications at the extremely lowand gave the highest identifications at the extremely low abundance grade (SCIN of 0.001-0.01) because of its additional dimension of chromatography for proteins prefractionation .

The 2DE-MALDI route was also fairly complementary to the two LC routes above, and contributed 379 uniquely identified , q yproteins which were not detected by other routes.

As the indicator of the complementarity of four technical routesAs the indicator of the complementarity of four technical routes, 1112 proteins were identified from the integrated strategy, in which the proteins were recognized by two or more different technical routes but each route with only one peptide dedication.

7000integrative sum

11125600

7000

ns

gsumunique2 / 3-route overlap

56764200

5600pr

otei

n 2 / 3 route overlap4-route overlap

1391916

5676

2800

4200

ber o

f p

1875 1778574 588379 58

1400Num

b

914 914 914 914

574 588

0

2DLC-ESI

3DLC-ESI

2DE-MALDI

1DE-LC-ESI

Sum

Technical routeTechnical route

6500

60285883

59745577ers

597455775749

534350325500

num

be

45894500tein

n

3612

500

Pro

36123500

0 2 4 6 8 10

Number of experiment

1600

1400

1600

ults

1000

1200

ied resu

600

800

identifi

400

600

mber of

0

200

Num

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Peptide number

Nor Rev

12000

10000s

8000

peptides

4000

6000

mber of p

2000

4000

Num

0

100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100

ppm

Ori error Rec errorOri_error Rec_error

假阳性率

Table res01. The proteins by HPPP Poisson model

Confidence level 0.99 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.60

Proteins found by 3138 3274 3342 3405 3446 3477 3516 3579Proteins found by

HPP model

3138 3274 3342 3405 3446 3477 3516 3579

Overlaps with HLP

core dataset

3056 3180 3240 3299 3329 3357 3389 3477

假阳性率假阳性率

问题问题

MALDI 真空， 效率高， 单电荷, 串联图质量不好

ESI 大气压 效率低 双电荷 串联图质量好ESI 大气压， 效率低， 双电荷, 串联图质量好

MASCOT, 过钱蛋白少， 假阴性率高， 整体效率低， 没有利用高分辨率优点

SEQUEST 过钱蛋白多 假阳性率高 整体效率SEQUEST，过钱蛋白多， 假阳性率高， 整体效率高， 避免涉及分辨率的问题（但也没有利用FT-MS的优势）的优势）

质谱仪器的灵敏度仍然偏低， 有待于提高

分析速度仍然太慢， 有待于改进分析速度仍然太慢， 有待于改进

HLT ∩ IPI_3.0711097 protein-coding

HGEP, 27524 protein-coding 11097 protein coding

genesgenes38594 genes

HLT ∩ HLP4503 protein-coding

genesgenes

HLT 11104

HLP, 5816 protein-coding

genesHLT, 11104 protein-coding

gene 11205 genes

genes6788 proteins

11205 genes

IPI_3.0720070 protein coding20070 protein-coding

genes50207 proteins

高丰度蛋白去除新方法

色谱质谱仪器技术

低丰度蛋白富集新方法

数据检索

除新方法 仪器技术集新方法

生物样品预处理

蛋白质

分离富集

蛋白质

酶解

质谱

鉴定

数据检索

定量分析

微酶反应器 质谱新多维色谱 微酶反应器新技术

质谱新技术

多维色谱新技术

微/纳酶反应器对蛋白的酶解鉴定新技术

a微型酶反应器

b

Anal. Chem. 2006Chem. A – Eur. J. 2006Anal. Chem. 2006 L b hi 2006

三维有序的纳米孔穴阵列三维有序的纳米孔穴阵列酶解反应器酶解反应器 Lab chip 2006

J Proteome Res. 2004Anal. Chem. 2004,

酶解反应器酶解反应器

Results of the database searching from the nano-LC-MS/MS analysis ofg ypeptides digested in solution and through monolithic microreactor

Sequence PositionPeptide mass [M+H]+

[Da]Charg

eOn-column digestion

In-solution digestion

T1 K.TGPNLHGLFGR.K 28-38 1169.32 2 √ √

T2 R.KTGQAPGFTYTDANK.N 39-53 1599.73 2 √

T3 K TGQAPGFTYTDANK N 40 53 1471 55 2 √ √T3 K.TGQAPGFTYTDANK.N 40-53 1471.55 2 √ √

T4 K.TGQAPGFTYTDANKNK.G 40-55 1713.83 2 √ √

T5 K.GITWKEETLMEYLENPKK.Y 56-73 2210.54 3 √

T6 K.EETLMEYLENPK.K 61-72 1496.67 2 √

T7 K.EETLMEYLENPKK.Y 61-73 1624.84 2 √ √

K KYIPGTK M √T8 K.KYIPGTK.M 73-79 806.97 2 √

T9 K.MIFAGIK.K 80-86 780.01 1 √

T1 K MIFAGIKK KT10

K.MIFAGIKK.K 80-87 908.19 2 √

T11

R.EDLIAYLK.K 92-99 965.13 1 √ √

Digestion time 27 s 12 hSequence coverage 58.65% 59.62%

Proteomics 6, 412-419, 2006

Thank youThank you