TESTELE PCR IN TESTELE PCR IN DIAGNOSTICUL DIAGNOSTICUL

BOLILOR LA PASARIBOLILOR LA PASARI

Dr. Virgilia POPADr. Virgilia POPAINSTITUTUL PASTEUR INSTITUTUL PASTEUR

Intalnirea trimestriala a SMVPAAMR Intalnirea trimestriala a SMVPAAMR FMV FMV BUCUREŞTIBUCUREŞTI

Aula Prof. Dr. Aurel PopoviciuAula Prof. Dr. Aurel Popoviciu29 martie 201229 martie 2012

Boli infectioase care pot evolua Boli infectioase care pot evolua in ferma de pasariin ferma de pasari

Boli frecvente la varstele 1 - 4 saptamani > 4 saptamanipuiul de

carneadulte

Anemia infectioasaAspergilozaBoala cronica respiratorieBoala de NewcastleBoala MarekBordeteliozaBronsita infectioasaBursita infectioasaCoccidiozaColibaciloza / colisepticemiaCoriza aviaraEncefalomielitaEnterita hemoragica (curca)

Enterita necroticaHepatita vibrionicaHolera aviaraInfluenta aviaraLaringotraheita infectioasaLeucoza limfoidaOrnitobacteriozaOrnitozaReovirozeRinotraheita aviaraRujetulSalmonelozeSinuzita infectioasaSpirochetoza (Borelioza)StafilocociaTuberculozaVariola aviara

Diagnostic Diagnostic Metode / testeMetode / teste

in vivoin vivo in vitroin vitro

• Clasice (bacteriologice, virusologice, parazitologice etc)Clasice (bacteriologice, virusologice, parazitologice etc)

• Genetice (moleculare)Genetice (moleculare) ““Gold test” (test de referinta)Gold test” (test de referinta)

http://www.karymullis.com/index.shtmlhttp://www.karymullis.com/index.shtml

Dr. Kary MullisDr. Kary Mullis

metodă de sinteză a ADN “in vitro” - sinteza metodă de sinteză a ADN “in vitro” - sinteza acelularaacelulara

amplificare selectivă a ADN, in timpul unor cicluri amplificare selectivă a ADN, in timpul unor cicluri termice repetate, prin intermediul enzimei ADN termice repetate, prin intermediul enzimei ADN polimeraza. polimeraza.

ADN polimeraza sintetizeaza catena ADN polimeraza sintetizeaza catena complementară pornind de la o amorsă (“primer”).complementară pornind de la o amorsă (“primer”).

un ciclu termic: un ciclu termic: denaturarea moleculei / moleculelor de ADN, denaturarea moleculei / moleculelor de ADN, hibridizarea amorselor si hibridizarea amorselor si extinderea / elongarea cópiilor secventei tintaextinderea / elongarea cópiilor secventei tinta

de la o singura / cateva cópii la ordinul miilor sau de la o singura / cateva cópii la ordinul miilor sau milioanelor de cópii.milioanelor de cópii.

-amplificare clasica – amplificare clasica – control post-amplificare control post-amplificare prin gel-electroforeza prin gel-electroforeza (end-point)(end-point) - amplificare in timp real - amplificare in timp real (spectrofotometrica) – (spectrofotometrica) – control in timpul reactiei control in timpul reactiei

PPostulatele lui Kochostulatele lui Koch completate de biologia molecularacompletate de biologia moleculara

1) microorganismul este întâlnit în 1) microorganismul este întâlnit în mod regulat în leziunile boliimod regulat în leziunile bolii..

2) microorganismul poate fi izolat 2) microorganismul poate fi izolat sub forma unei sub forma unei culturi pureculturi pure

3) inocularea acestei culturi 3) inocularea acestei culturi determină leziuni unui animal determină leziuni unui animal experimental şiexperimental şi microorganismul microorganismul poate fi recuperat din leziunile poate fi recuperat din leziunile animaluluianimalului de experienta. de experienta.

1) fenotipul sau trăsătur1) fenotipul sau trăsătura a trebuie să trebuie să se asocieze tulpinilor virulente ale se asocieze tulpinilor virulente ale microorganismului şi nu celormicroorganismului şi nu celor avirulenteavirulente..

2) inactivarea specifică a genei 2) inactivarea specifică a genei asociată virulenţei – de exemplu,asociată virulenţei – de exemplu,înlocuirea genei normale (denumită înlocuirea genei normale (denumită tipul sălbatic) cu una modificată sautipul sălbatic) cu una modificată saumutantă ar trebui să conducă la o mutantă ar trebui să conducă la o scădere măsurabilă a scădere măsurabilă a p patogenităţiiatogenităţii..

3)3) înlocuirea genei mutante cu gena înlocuirea genei mutante cu gena tipului sălbatic ar trebui să tipului sălbatic ar trebui să restabilească înrestabilească în întregime întregime patogenitatea microorganismului.patogenitatea microorganismului.

Avantajele testelor PCR Avantajele testelor PCR confirmarea (pana la confirmarea (pana la 48 de ore48 de ore, de regula intre , de regula intre 2.5 si 6.5 ore2.5 si 6.5 ore) a agentului cauzal al ) a agentului cauzal al

bolilor infectioase bolilor infectioase manifeste manifeste latente latente recente recente fara semne clinice.fara semne clinice.

cuantificarea agentului infectios in proba analizata (atunci cand boala este cuantificarea agentului infectios in proba analizata (atunci cand boala este dependenta si de acest parametru);dependenta si de acest parametru);

identificarea animalelor purtatoare;identificarea animalelor purtatoare; diferentierea episoadelor de boala datorate diferentierea episoadelor de boala datorate tulpinilor salbaticetulpinilor salbatice de cele produse de de cele produse de

tulpinile vaccinaletulpinile vaccinale, sau de diverse , sau de diverse patotipuripatotipuri ale unui agent infectios; ale unui agent infectios;

declararea unui efectiv / lot de animale ca fiind indemn / liber de anumiti agenti declararea unui efectiv / lot de animale ca fiind indemn / liber de anumiti agenti infectiosi; infectiosi;

prevenirea asupra raspandirii agentilor infectiosi in populatia de animale;prevenirea asupra raspandirii agentilor infectiosi in populatia de animale; reducerea expunerii umane la anumiti agenti infectiosi zoonotici; reducerea expunerii umane la anumiti agenti infectiosi zoonotici;

controlul puritatii produselor biologice de origine animala / vaccinurilor cu controlul puritatii produselor biologice de origine animala / vaccinurilor cu ingrediente de origine animala;ingrediente de origine animala;

analiza expresiei unor gene in bolile metabolice.analiza expresiei unor gene in bolile metabolice.

Limitele testelor PCR Limitele testelor PCR

rezultate rezultate fals negativefals negative daca daca proba / specimenul de analizat nu sunt reprezentative din punct de proba / specimenul de analizat nu sunt reprezentative din punct de

vedere epidemiologic; vedere epidemiologic; in proba sunt prezenti produsi care inhiba reactia de amplificare; in proba sunt prezenti produsi care inhiba reactia de amplificare; proba contine variante genetice ale unui agent patogen pe care proba contine variante genetice ale unui agent patogen pe care

testul nu le poate recunoaste;testul nu le poate recunoaste;

rezultate rezultate fals pozitivefals pozitive daca daca proba / specimenul de analizat au fost recoltate necorespunzator in proba / specimenul de analizat au fost recoltate necorespunzator in

conditii in care s-a produs o contaminare incrucisata; conditii in care s-a produs o contaminare incrucisata;

incapacitatea testului PCR de a evidentia daca agentul patogen este incapacitatea testului PCR de a evidentia daca agentul patogen este viu sau mort, respectiv capabil de a produce sau nu boala, ceea ce viu sau mort, respectiv capabil de a produce sau nu boala, ceea ce presupune necesitatea executarii si a altor teste, cum sunt cele presupune necesitatea executarii si a altor teste, cum sunt cele clasice, virusologice, bacteriologice etcclasice, virusologice, bacteriologice etc..

Boala infectioasa Etiologie

Tam

po

an

e

Pro

be

org

an

Alt

e p

rob

e

Anemia infectioasa C(I)AV, Gyrovirus, Circoviridae (ADN mc)Aspergiloza Aspergillus fumigatus, A. sppBoala cronica respiratorie Mycoplasma gallisepticumBoala de Newcastle APMV1 (Avian paramyxovirus 1, ARN)Boala Marek Gallid herpesvirus 2 (ADN)Bordetelioza Bordetella aviumBronsita infectioasa AIBV, Gammacoronavirus, Coronaviridae (ARN)Bursita infectioasa (Boala Gumboro, Nefroza aviara) IBDV, Avibirnavirus, Birnaviridae (ARN dc)

Coccidioza Eimeria spp (A. acervulina, A. brunetti, A. praecox, A. maxima, A. mitis, A. necatrix)

Colibaciloza / colisepticemia Escherichia coli APECCoriza aviara Avibacterium (Haemophilus) paragallinarum,

PasteurellaceaeEncefalomielita (Epidemic tremor) AEV, Tremovirus, Picornaviridae (ARN)Enterita hemoragica (curca) Adenovirus tip IIEnterita necrotica Clostridium perfringens A, CHepatita vibrionica Vibrio-like bacteria / Campylobacter jejuni / C. coli / C.

lariHolera aviara Pasteurella multocidaInfluenta aviara Influenzavirus A, OrthomyxoviridaeLaringotraheita infectioasa Gallid herpesvirus 1 (ADN)Leucoza limfoida Alpharetrovirus (ARN)Ornitobacterioza Ornithobacterium rhinotracheale Ornitoza Chlamydia psittaci Reoviroze / Artrita virala / Sindromul de malabsorbtie / Alte reoviroze

Reovirus (Avian orthoreovirus, ARN dc)

Rinotraheita aviara Avian metapneumovirus, Paramyxoviridae (ARN)Rujetul Eryspelothrix rusiopathiaeSalmoneloze Salmonella spp (S. gallinarum-pullorum, S. enteritidis,

S. typhimurium etc)Sinuzita infectioasa Mycoplasma synoviaeSpirochetoza (Borelioza) Borrelia anserinaStafilococia Staphylococcus aureusTuberculoza Mycobacterium avium, M. genavenseVariola aviara Avipoxvrus (ADN)

Identificarea Identificarea TrichinellaTrichinella spp. spp.

Concluzie Concluzie

medicul veterinar de libera practica medicul veterinar de libera practica imputernicit pentru fiecare unitate imputernicit pentru fiecare unitate avicola va stabili dupa caz, in avicola va stabili dupa caz, in colaborare cu expertii epidemiologi si colaborare cu expertii epidemiologi si de laborator, necesitatea executarii de laborator, necesitatea executarii unor investigatii complexe. unor investigatii complexe.

Concurs: Concurs:

Ce boala a fost reprodusa experimental Ce boala a fost reprodusa experimental si ilustrata in fotografiile de la inceputul si ilustrata in fotografiile de la inceputul prezentarii?prezentarii?

http://farmavet.ro/institutul-pasteur-laborator-http://farmavet.ro/institutul-pasteur-laborator-analize/analize/

diagnostic@pasteur.rodiagnostic@pasteur.ro 0744510070 / 0744510081 / 0212206920 int. 1122. 0744510070 / 0744510081 / 0212206920 int. 1122.

Sarbatori Sarbatori fericite!fericite!