DIAGNÓSTICO MOLECULAR GENERADO POR LA …20DEL%20... · Extracción de RNA • Gibco Life Technologies (1996) La muestra de tejido se pulveriza con nitrógeno líquido en un mortero

DIAGNÓSTICO MOLECULAR GENERADO POR LA UNAM

MVZ Alicia Sotomayor González

Agente Etiológico •  Orden :Nidovirales ▫  Familia: Arteriviridae

(Jerusalén, agosto de 1996) �  Género: Arterivirus

•  Caracteristicas: ▫  Alta variabilidad genética y

antigénica ▫  Infectar macrófagos-

monocitos induciendo infecciones persistentes ▫  Modular el sistema

inmunológico ▫  Capacidad de producir

viremia prolongada Imagen obtenida de: www.revistas.uchile.cl

Agente Etiológico •  8 marcos de lectura abiertos (ORF “open reading frame”)

codifican la RNA polimerasa viral

codifica para la estructura proteica GP2



reconocer el receptor de células blanco e induce apoptosis

liberación y ensamblaje de nuevas partículas virales

Codifica para la proteína N

Genoma del virus de PRRS

RNA polimerasa Genes estructurales

Agente Etiológico

Codifica para la proteína de la envoltura GP5.

Glicoproteína de 200 aminoácidos.

Es el gen más variable.

Se encarga de reconocer el receptor celular de las células blanco e inducir apoptosis.

ORF 5 Codifica para la proteína

N

Induce una producción elevada de anticuerpos sin actividad protectora evidente

Interactúa con el ARN viral para el conjunto de partículas infecciosas.

Es la más pequeña (20 al 40% de la proteína total que contiene el virión)

ORF 7

Agente Etiológico • Designación de dos serotipos principales

de referencia: ▫  Americano ▫  Europeo

• Entre ellos la variabilidad genética puede llegar a ser muy alta (80%).

• El virus evoluciona por mutaciones al

azar y recombinación antigénica.

Diagnóstico

Diagnóstico:

Detección de anticuerpos contra el virus (serología)

Reacción en cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT PCR)

Aislamiento viral en células MARK 145

RT-PCR Secuenciación

RFLP (polimorfismo de longitud en fragmentos mediante el uso de patrones de corte con enzimas de restricción )

Identificación:

RT-PCR • Técnica rápida • Elevada especificidad y sensibilidad • Útil para la detección del virus

El ARN viral se convierte en ADN complementario por la enzima RT

Es amplificado por la enzima Taq polimerasa

Diagnóstico en el DMZ:C • Laboratorio BSL-3

Procedimiento para el Diagnóstico Molecular del Arterivirus Porcino

Diseño de Oligonucleótidos

•  Oligonucleotidos utilizados: ▫  Sotomayor et al., 2011 (Tesis de licenciatura).

ClonManager Versión 7.0 170 secuencias de linaje

americano 50 secuencias de linaje

europeo.

PRIMER Confirmación de la

alineación.

Basic Local Alignment Sequence Tool (BLAST) del National Center

for Biotechnology Information (NCBI)

Validar su especificidad única hacia secuencias de PRRS, así como la especificidad del linaje origen.

Diseño de Oligonucleótidos •  Basic Local Alignment Sequence Tool (BLAST) del National

Center for Biotechnology Information (NCBI). ▫  Validar su especificidad única hacia secuencias de PRRS,

así como la especificidad del linaje origen.

Procedimiento 1.   Extracción viral ▫  Gibco Life Technologies 1996. ▫  PureLink, RNA/DNA extraction.

2.   RT-PCR. Kit RT-PCR One Step Invitrogen® 3.   Gel de electroforesis horizontal.

Extracción de RNA •  Gibco Life Technologies (1996)

La muestra de tejido se pulveriza con nitrógeno líquido en un mortero

estéril

Se coloca en un tubo eppendorf de 1.5 ml

Se le adicionan 700 µl de Trizol y se mezcla perfectamente hasta

diluir la muestra

Se deja incubar por 10 minutos a 4°C

Se adicionan 200 µl de cloroformo puro

Se agita en vortex durante 15 segundos

Se deja incubar a 4°C durante 10

Se centrifuga a 12,000 rpm durante 15 min a

4°C

El sobrenadante se deposita en otro tubo eppendorf de 1.5 ml

Se le adiciona 1 volumen de isopropanol

(1:1)

Se incuba por 15 min a 4°C

Se centrifuga a 12,000 rpm durante 10 min a

4°C

Se lava la pastilla (RNA) con 200 µl de

etanol al 70%, mediante una centrifugación a

12,000 rpm por 10 min a 4°C.

Una vez seca, la pastilla de RNA se resuspende

en 20 µl de H2O DEPC (0.1%).

Beneficios de los Oligonucleótidos Utilizados

•  Rápida identificación de muestras positivas. ▫  Rápida toma de decisiones

•  Cantidad mínima de muestra. (.5 ml)

•  Reproducibilidad Estandarización.

•  Elevada especificidad para una diagnostico preciso del genoma viral.

•  Procesamiento de distintos tipos de muestras: ▫  Órganos y tejidos (pulmón, cornete nasal, linfonodo, cordón

umbilical) ▫  Semen ▫  Suero ▫  Hisopo nasal ▫  Hisopo oral ▫  Fluidos orales

•  Especificidad

5 exL A

5 exA A

5 L A

5 A A

5 esL E

5 exA E

5 L E

5 A E

Identificación de cepas americana y europea sin reacción cruzada.

Mar

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Mol

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Mar

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ORF5

• Diferenciación

VPA ORF 7

VPE ORF 7

Diferente tamaño de amplicon para diferenciar la cepa americana de la europea, con un mismo par de oligonucleótidos.

ORF 7

Diferenciación entre cepa vacunal y cepas de campo

Vacuna

Cepas de campo

Muestras Id Muestra Procedencia

(estado)

Fecha de

Muestreo

1 pulmón y linfonodo Hidalgo 18-Abr-11

2 pulmón y linfonodo Hidalgo 18-Abr-11

3 pulmón Guanajuato 20-Abr-11

4 pulmón Guanajuato 20-Abr-11

5 cornetes nasales Guanajuato 20-Abr-11

6 2 hisopos nasales Sonora 25-Abr-11

7 2 pulmones, 1 linfonodo Puebla 25-Abr-11

8 3 pulmones Veracruz 25-Abr-11


10 2 pulmones, 1 linfonodo Veracruz 25-Abr-11


12 2 pulmones Puebla 25-Abr-11

13 3 pulmones; 1 linfonodo Veracruz 25-Abr-11


15 2 pulmones, 1 linfonodo Veracruz 25-Abr-11


17 1 pulmón Puebla 25-Abr-11

18 1 pulmón Morelos 27-Abr-11



21 1 semen Morelos 27-Abr-11

22 6 pulmones Estado de México 09-Sep-09

23 3 pulmones, 1 tráquea Tamaulipas 23-Sep-09

24 4 pulmones Veracruz Oct-09

25 1 pulmón, 1 tonsila Jalisco 19-Jul-09


27 1 pulmón, 1 tonsila Michoacán 21-Jul-09

28 1 pulmón, 1 tonsila Guanajuato 03-Ago-09

29 80 pulmones Puebla 21-Ene-10

30 60 pulmones Estado de México 21-Ene-10

31 5 pulmones Edo. de México 09-Sep-09

32 3 pulmones Tamaulipas 21-Sep-09

33 3 pulmones Tamaulipas 22-Sep-09

34 5 pulmones Veracruz 22-Sep-09

35 2 pulmones, 2 tráqueas Veracruz 22-Sep-09

36 1 pulmón, 1 tonsila Guanajuato 14-Jul-09




40 13 pulmones Veracruz 04-Nov-09

41 23 pulmones, 23 tráqueas Veracruz 05-Nov-09

42 20 pulmones Veracruz 10-Nov-09

43 5 pulmones, 5 tráquea, 5

tonsilas

Edo. de México 10-Nov-09

44 3 pulmones, 3 tonsilas Oaxaca Dic-09

45 6 pulmones Edo. de México 01-Mar-10

46 63 pulmones Jalisco 14-Ene-10

47 100 pulmones Jalisco 21-Ene-10

48 80 pulmones Veracruz 21-Ene-10

49 80 pulmones Veracruz 21-Ene-10

50 80 pulmones Querétaro 21-Ene-10

51 30 pulmones Edo. de México 21-Ene-10

52 50 pulmones Querétaro 02-Feb-10

53 125 pulmones Guanajuato 02-Feb-10

54 34 pulmones Veracruz 02-Feb-10

55 10 pulmones Michoacán 02-Feb-10

56 1 4 0 p u l m o n e s , 1 4 0

linfonodos

Yucatán 19-Feb-10

57 3 pulmones Hidalgo 01-Jun-10

58 1 semen Edo. de México Jun-10

Muestras 59 1 semen Edo. de México Jun-10

60 aislamiento viral Edo. de México Sep-10

61 2 pulmones, 2 tonsilas Estado México Sep-10

62 10 hisopos nasales Estado de México Sep-10

63 15 pulmones Distrito Federal Nov-10

64 1 pulmón, 1 tráquea Guerrero Oct-10

65 15 pulmones Tlaxcala Nov-10

66 10 pulmones Puebla Nov-10

67 20 sueros Sonora Oct-10

68 3 pulmones Guerrero Nov-10

69 3 pulmones Hidalgo, 27-Ene-11

70 3 cordones umbilicales Morelos 27-Ene-11

71 1 pulmón Estado México 07-Oct-10






77 1 hisopo nasal Sonora 31-May-11





82 1 pulmón Sonora 31-May-11

83 1 pulmón Sonora 31-May-11

84 1 hisopo nasal Estado de México 01-Jun-11



87 1 pulmón Estado de México 01-Jun-11

88 1 pulmón Veracruz 01-Jun-11

89 1 pulmón Veracruz 01-Jun-11

90 1 lechón Veracruz 01-Jun-11

91 1 lechón Veracruz 01-Jun-11

92 1 lechón Hidalgo 02-Jun-11

93 pulmón DF 19-Ene-11

94 pulmón Tlaxcala 19-Ene-11

95 pulmón Puebla 19-Ene-11

96 4 pulmones Guanajuato 17-Jun-11

97 4 pulmones Guanajuato 17-Jun-11

98 hisopos nasales Hidalgo 17-Jun-11






104 pulmón Hidalgo 17-Jun-11

105 pulmón Hidalgo 17-Jun-11

106 1 pulmon Sonora 22-Jun-11

107 1 pulmón Sonora 22-Jun-11

108 hisopos nasales Sonora 22-Jun-11



111 pulmón Jalisco 01-Jul-11

112 pulmón Jalisco 01-Jul-11

113 4 pulmones Jalisco 01-Jul-11

114 2 pulmones Jalisco 01-Jul-11

Distribución de las Variantes Encontradas

Resultados

•  Árbol filogenético derivado de ORF 5.

•  Estudio realizado en España para evaluar la influencia del tiempo en la heterogenicidad genética del virus.

Prieto, 2009

Secuenciación •  La secuenciación del virus de PRRS es cada vez más

utilizada como una herramienta para mejorar la comprensión del virus que está circulando activamente dentro de una piara, sistema de producción o región geográfica.

•  Puede ayudar a los médicos veterinarios y a los productores porcinos a comprender el origen, la evolución y el movimiento del virus PRRS en, dentro y entre piaras.

•  El aumento de análisis de secuenciación genética que se realizan es debido al número de proyectos de control de área regionales.

Rodger Main, 2012.

Filogenia esquemática de los subtipos americano y europeo del virus de PRRS

•  Una línea de tiempo se muestra en el centro de la figura. •  El lado izquierdo muestra el tiempo de divergencia del subtipo (1) estimada por Hanada et

al. (2005) utilizando el pariente más cercano, el LDEV, para deducir la secuencia de nucleótidos del ancestro.

•  En el lado de la derecha se muestran las estimaciones del tiempo de divergencia de los subtipos (1) y de linajes dentro de subtipos (MRCAs locales) (2 y 3).

Forsberg, 2005

Conclusiones

• Oligonucleótidos específicos. ▫  Permiten identificar cepas de campo y vacunales

(americana o europea).

�  Cambios genéticos-cambios antigénicos.

�  Formación de variantes endémicas.

Secuenciación

Gracias [email protected]

Colaboradores: Dr. J. Iván Sánchez Betancourt Dra. María Elena Trujillo Ortega M. En C. Carmen Mercado García MVZ Paulina Avalos Guzmán

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DIAGNÓSTICO MOLECULAR GENERADO POR LA …20DEL%20... · Extracción de RNA • Gibco Life Technologies (1996) La muestra de tejido se pulveriza con nitrógeno líquido en un mortero