Diagnostic Carmen

7/30/2019 Diagnostic Carmen

1/67

Istoric

Din antichitate pina in sec. 19Antonie Van Loewenhoek 1675 -observarea microscopica a "animalculelor"Louis Pasteur: 1857demonstrarea rolului bacteriilor in fermentatia lactica

Felix Archimde Pouchet 1861sf. Mitului generatiei spontane

- Robert Koch : 1877 izolarea Bacillusanthracis, 1882 izolarea Mycobacteriumtuberculosis- Christian Gram 1884 : coloratia "Gram"- Ptri 1887 : inventarea cutiei "Ptri"- Fannie Eilshemius-Hesse : descoperirea gelozei nutritive

Secolul 20- Fleming, 1926 lizozimul Griffith, 1928 Tranformarea bacteriana

Fleming, 1929 penicilina G

Domagk, 1935 Sulfamidele

Avery, 1944 - ADNsuportul ereditatii

Waksman, 1944 Streptomicina

Lederberg & Tatum 1946 Conjugarea bacteriana

Lwoff, 1950fagii si lizogenia

Zinder & Lederberg, 1952 Transductia baceriana

Watson & Crick structura helicodala a moleculei de ADN

Jacob & Monod 1961 Operonul lactozei

Acidul nalidixic: 1962

MacDade, 1977 Boala legionarilor (Legionellapneumophila)

Anii 80- genetica bacteriana si biotehnologiile


2/67

AntraxBacillus

anthracisKoch 1876

GonoreeNeisseria

gonorrhoeaeNeisser 1879

Febra tifoida SalmonellaTyphi

Eberth 1880

TuberculozaMycobacterium

tuberculosisKoch 1882

Holera Vibriocholerae Koch 1883
http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=178http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=178http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=191http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=191http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://web.grcc.edu/biosci/pictdata/bi127/salmtyph.jpg&imgrefurl=http://web.grcc.edu/biosci/pictdata/127contents.htm&h=240&w=320&sz=14&hl=ro&start=59&tbnid=zX6LO_WmyPd6FM:&tbnh=89&tbnw=118&prev=/images%3Fq%3DSalmonella%2Btyphi%26start%3D40%26gbv%3D2%26ndsp%3D20%26hl%3Dro%26sa%3DNhttp://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=191http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=191http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=191http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=178http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=178http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=178


3/67

Difteria Corynebacterium diphteriae Klebs/Loeffler 1883

Tetanos Clostridium tetani Nicolaier 1885

Diaree Escherichia coli Escherich 1885

Pneumonie Streptococcus pneumoniae Fraenkel 1886
http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=168http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=136http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=145http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/S.pneumoniae1.jpg&imgrefurl=http://www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/S.pneumoniae.html&h=323&w=475&sz=32&hl=ro&start=3&tbnid=MGJUENYImbkqwM:&tbnh=88&tbnw=129&prev=/images%3Fq%3DStreptococcus%2Bpneumoniae%26gbv%3D2%26hl%3Dro%26sa%3DGhttp://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=145http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=136http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=168


4/67

Meningita Neisseria meningitidis Weischselbaum 1887

Febra ondulanta Brucella sp.Bruce1887

Gangrena gazoasa Clostridium perfringens Welch et Nuttal 1892

Pesta (ciuma) Yersinia pestis Yersin/Kitasato1894

Coloratia Wayson-aspect in ac de siguranta
http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=180http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/images/skin/perfringens.jpg&imgrefurl=http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/skin/perfringensgram.html&h=250&w=400&sz=18&hl=ro&start=1&tbnid=qRB3MJOkPmFy5M:&tbnh=78&tbnw=124&prev=/images%3Fq%3DClostridium%2Bperfringens%26gbv%3D2%26hl%3Drohttp://bacterioweb.univ-fcomte.fr/photo2detail.php?id=180


5/67

Botulism Clostridium botulinum Van Ermengem 1896

Dizenteria Shigella dysenteriae Shiga1898

SifilisTreponema pallidum Schaudin/Hoffmann1905

Tusea convulsiva Bordetella pertussis Bordet et Gengou 1906

Meningita Rickettsia rickettsiiRicketts1909

Imunohistochimie


6/67

Diagnosticul bacteriologic

Scopuri- Identificarea agentilor etiologici ai unui proces infectios-Alegerea unei antibioterapii tintite- Controlul eficientei antibioterapiei

- Screening-ul purtatorilor sanatosi- Anticiparea unei infectii (colonizari)

Abordari- Diagnostic direct +++ (direct in produsul patologic)

Ne-orientat- izolarea si cultivarea pe medii nutritive adecvate amicroorganismelor suspectate

Orientat de clinician- cercetarea unui agent infectios specific(tehnici imunologice/genetice)


7/67

Etapele diagnosticului direct

Examenul microscopic (dupa coloratiaGram)

- prelevate normal sterile morfologie bacteriana caracteristica = orientare

rapidaLCR si meningococ

prelevate plurimicrobiene

aprecierea starii de disbioza sau eubioza asociatia fuso-spirochetiana -angina Vincent


8/67

Etapele diagnosticului direct cont.

Examinareapreparatelorlama/lamela

Evidentierea treponemelor lamicroscopul cu fond negru

Coloratia Ziehl-Neelsen Evidentierea micobacteriilor (BK, lepra)


9/67


ImunodiagnosticELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Imuno-fluorescenta directa / indirecta

Immunodifuzie

Rapide, sensibile, rezervate bacteriilor cu cultivare dificila(Chlamydia, Clostridiumdifficile, Mycoplasma)


10/67

Etapele diagnosticului direct cont. Diagnostic molecular

- Hibridizare

- PCR (polymerase chain reaction) Sensibile, foarte specifice, costisitoare, rezervatebacteriilor cu crestere dificila sau lenta (BK, Chlamydia,Bordetella).


11/67

Etapele diagnosticului direct cont.Cultivarea produsului patologic- Izolarea microorganismelor in cultura pura

- Medii lichide (utilizate pentru imbogatirea prelevatului)

- Medii solide (simple,imbogatite, diferentiale)


12/67


Evidentierea caracterelor biochimice

Teste biochimice conventionale

Medii multitest

Sisteme microtest (Api, ApiRapid miniAPI)

Sisteme de identificare automatizate (Vitek,

Phoenix,MasterID, Biolog etc)


13/67

Rectia catalazei Rectia oxidazei

Violet intens, in maximum 7 secunde (oxidazo+)

Incolor sau violet tardiv ( oxidazo-)

Efervescenta Absenta efervescentei

Catalaza+ Catalaza-

Cultura bacteriana H2O2Cultura Banda de hirtie de

Microbiana filtru impregnata cu reativ

Etapele coloratiei Gram

Insamintarea mediilor repartizate in

placi = tehnica epuizarii ansei

Etapele

realizarii

testelor

API

Insamintarea

mediilor repartizate

in tuburi, drepte(tehnica de intepare cu ansa cu

fir drept)

Insamintarea

mediilor repartizate

in tuburi, inclinate(tehnica de insamintare in

striuri in zig-zag)

Citi t t C S


14/67

Citire teste

conventionale

Geloza singe:

-Hemoliza totala (beta)

-Hemoliza partiala (alpha)

--absenta hemolizei

Medii lactozate:

-Mediu MacConkey, EMB:-LF (colonii roz)

-LN (colonii incolore)

--Mediul ADCL:

--LF (colonii galbene)

--LN (colonii incolore)

Mediu Chapman

-crestere bacteriana, mediu roz

(halotoleranta, manito-)

-Crestere bacteriana, mediu

galben (halotoleranta, manito+)

-Absenta cresterii

(halosesnsibilitate)

-Mediu Baird Parker

-- colonii negre, lucioase, cu

halou opac (colonii coagulazo-

pozitive)

--colonii mici, gri sau negre, fara

halou (colonii coagulazo-

negative)

-Mediu Simmons:

-Verde (Citrat negativ)

--Albastru (citrat pozitiv)

Citire Sisteme multitest

Citire teste API

Mediu TSI (triple sugar iron): Mediul MILF (mobilitate, indol, Mediu MIU (mobilitate

Negru= producere de H2S LDC, FAD) Indol, Ureaza)

Fragmentarea coloanei de mediu-

=prodcere de gaz din glucozaGlc-

Lac-

Zah-

Glc+

Lac-

Zah-

Glc+

Laz/Zah+

Vezi mediul

lactozat

Glc+

Lac+

Zah+

+FeCl3

Inel de precipitat :verde= FAD+, incolor=FAD-

Banda rosie=Ind+ Banda incolora=Ind-

Imob. Mob. Imob. Mob.

Ure+ Ure-

+reactiv Kovachs/Ehrlich

Inel rosu= Ind.+

Inel incolor=Ind-

API 20E-James (Kovacs) in Ind

-TDA in TDA

--VP1 si VP2 in VP

--Nit1, Nit2 si Zn in Glc

API 20 NE

-Nit1+Nit2 in NO3(Zn in NO3)

-James (Kovacs) in TRP

API 20 STAPH-NIT 1 +NIT2 in NIT

-Zym A +ZYM B in PAL

-VP1+VP2 in VP

API 20 STREP-VP1 +VP2 in VP

-NIN (10 min) in HIP

--ZYM A+ZYMB in:

-PYRA

-aGAL

-bGUR

-bGAL

-PAL

-LAP

d b h


15/67

REALIZAREA ANTIBIOGRAMEI DIFUZIMETRICE Evidenierea prin teste biochimice a

factorilor de virulen i patogenitate

la bacterii

Insamantare in striuri longitudinale

pe:-Geloza sange (evidentierea hemolizinelor si a factorilor

CAMP-like prin trasarea unui striu de S. aureus

producator de sfingomielinaza perpendicular pe striurile

de cultura la 8 mm distanta).

-Mediu Wagatsuma cu singe de iepure si cristal violet

(evidentierea enterotoxinelor Kanagawa)

-Mediu cu ADN (evid.entierea DN-azelor) +HCl

-Mediu cu TWEEN-80 (evidentierea lipazelor)

-Mediu cu ou (evidentierea lipazelor si lecitinazelor)

-Mediu cu gelatina (evidentierea gelatinazelor)

-Mediu cu cazeina (evidentierea cazeinazelor)-Mediu cu mucina (evidentierea mucinazelor) +Lugol

-Mediu cu amidon (evidentierea amilazelor) +Lugol

-Mediu cu esculina (evidentierea producerii de esculetol-

siderofor)

Testul producerii de slime

-se insaminteaza o ansa plina de cultura in bulion, se

incubeaza 24 h, se golesc tuburile, se coloreaza cu

safranina alcoolica 30 min, se evidentiaza tulpinileproducatoare de slime prin aparitia unui inel rosu pe

eretii tubului .


16/67


17/67


18/67


19/67


20/67


21/67


22/67


23/67

Examinarea prelevatelor din

cavitatea bucalaContext Principalele obiective

Angina acuta Izolare de Streptococcus pyogenes (grup A) si de streptococci -hemolitici

din grupele C si G.

Daca angina este insotita de o iritatie cutanata: Streptococcus pyogenes si

Arcanobacterium haemolyticum (mai ales la adultul tanar).

In cazul anginei recidivante se analizeaza suplimentar: H. influenzae, S.

aureus, Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Angina ulcero-necrotica Se evidentiaza asociatia de fusospirochete caracteristica anginei Vincent

Angina cu membrane false Izolare Corynebacterium diphtheriae

Candidoza orofaringiana Izolare Candida albicans

Bilantul initial al unei boli cu transmitere sexuala Izolare deN. gonorrhoeae

Pneumonie interstitiala Izolare de Chlamydia pneumoniae

Flegmon amigdalian Examen citobacteriologic al produsului obtinut prin punctie cu analize

pentru S. pyrogenes, H. influenzae, S. aureus, anaerobi

(Fusobacterium spp.,B. fragilis, Peptostreptococcus spp.)


24/67

1 Prelevare si transport

inaintea tratamentului local sau general cu antibiotic

prelevarea cu tamponul de pe amigdale (sau amigdala in cazul amigdalitei

unilaterale) si de pe valul palatin si partea posterioara a faringelui. 2 tampoane: etalarea pe lama

insamantare.

Daca insamantarea nu se realizeaza in maxim 2 ore se foloseste un mediu detransport tip Stuart sau Amies.

Aspecte particulare: ulceratie sau exudat -prelevarea se face de la nivelul lor

suspiciune de difterie sunt prelevate si membranele false

Pentru N. gonorrhoeae daca nu se poate realize imediat insamantarea esteindispensabila folosirea unui mediu de transport tip Stuart sau Amies

Pentru Candida recoltarea se efectueaza de la nivelul limbii, palatului si fetei interne aobrajilor.

2 Examen direct

Examenul microscopic dupa coloratia Gram : Semnalizarea prezentei sau absentei leucocitelor, indicatori ai inflamatiei

Evidentierea asociatiei fuso-spirochete caracteristica anginei Vincent

Eventualul sumar al florei (calitativ si cantitativ)

Cultura


25/67

CulturaAngina acuta sau context bine definit

Geloza sange sau geloza sange cu inhibitori incubata in atmosfera cu 10% CO2 sau anaerobioza. Anaerobioza este recomandata pentru omai buna evidentiere a -hemolizei.

Angina cu iritatie cutanata

Evidentierea deArcanobacterium haemolyticum (bacil Gram pozitiv coryneform) se poate realiza pe geloza sange, inse trebuie prelungitaincubarea cu 24-48 ore pentru a se putea evidentia zona de -hemoliza care se formeaza in jurul coloniilor cu un aspect asemanatorstreptococului.

Alte contexte

H. influenzae geloza cu sange tratat termic sau geloza chocolat imbogatita cu polivitamine, incubata in atmosfera cu 10% CO2 cu sau farabacitracina.

S. aureus geloza sange sau geloza simpla.

M. catarrhalis se dezvolta si pe medii uzuale, insa creste mai repede pe geloza chocolat

N. gonorrhoeae geloza chocolat imbogatita cu polivitamine si un inhibitor (tip VCAT) si incubata

atmosfera cu 10% CO2 C. diphtheriae mediu Loeffler sau Tinsdale modificat

C. albicans mediu Sabouraund cu cloramfenicol sau gentamicina incubat la 300C.

A. haemolyticum

M. catarrhalis

M. catarrhalis


26/67

Interpretare antibiograma

In cazul unei angine acute recidivante sau nu, singurul patogen recunoscut esteStreptococcus pyogenes (grup A).

La comunicarea analizei microoganismelor potential patogene se fac evaluarisemicantitative.

Nu se mentioneaza prezenta bacteriilor din flora comensala.

Streptococcus pyogenes indiferent de cantitatea in care se regaseste, se analizeazacel putin pentru penicilina G, eritromicina, lincomicina, tetraciclina.

Streptococii din grupurile C si G, cand sunt izolati in cantitati semnificative

A. haemoliticum

N. gonorrhoeae

In celelalte cazuri realizarea antibiogramei depinde de cantitatea de microorganismeizolata.

In cazul anginei recidivante unde rolul H. influenzae si M. catarrhalis nu este clarstabilit, este necesara pentru aceste doua bacterii detectarea de betalactamze


27/67

EXAMENUL CITOBACTERIOLOGIC AL

URINII (ECBU)

Prelevare si transportcaz general

pacient sondat la domiciliu

imunodeprimati

analiza pentru mycobacteriisugar

circumstante particulare

Urina din primul jet (dupa un eventual masaj prostatic)

suspiciune de infectie uretrala sau prostatica

detectie de Mycoplasma sau Chlamydia trachomatis prin biologie

moleculara.Prelevare prin punctie suprapubiana dupa dezinfectia tegumentului

Prelevare prin cateter uretral permite obtinerea de urina separat din rinichiul

drept sau stang

ureterostomie


28/67

Etiologia ITU

Enterobacterii (mai ales E. coli, Proteus mirabilis) Mai rar Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S.

saprophyticus (la tinere).

+ Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia,Staphylococcus coagulazo-negativ,Corynebacteriumurealyticum (vechiul grup D2), Candida spp (albicanssi glabrata), mai rar: Oligella urethralis, Aerococcusurinae, Lactobacillus spp


29/67

Examen citologic

cantitativ Camera de numarare

stare fiziologica, urina contine sub 10 000 leucocite si 5 000hematii per ml.

Infectiei urinara =proces inflamator: >50 000 leucocite/ml >10 000 hematii/ml

Celule uroepiteliale frecvente

calitativ

Examinarea frotiurilor realizate permite observarea eventualelormicroorganisme prezente si orientarea catre alegerea mediilorde cultura in functie de morfologia si afinitatea lor tinctoriala.

Cultivare


30/67

Cultivare

Insamintare

mediu lactozat

(CLED), geloza

singe, gelozachocolat

Urocultura=examen bacteriologic

cantitativ

diluarea urinii

tehnica ansei calibrate

metoda lamei imersate


31/67

Interpretarea rezultatelor ECU

Bacteurie Piurie Simptome Tratament

Colonizare + - - -

Infectie asimptomatica + + - +*

Infectie simptomatica + + + +

Inflamatie fara infectie - + - Simptome fara infectie - - +

*in unele circumstante

Interpretare bacterio-clinica

Categorii Criterii microbiologice

Infectie urinara acuta fara complicatii la femeie 10 000 L/ml103 UFC/ml uropatogeni recunoscuti

Pielonefrita acuta simpla 10 000 L/ml

104 UFC/ml uropatogeni recunoscuti

ITU cu risc sau complicate 10 000 L/ml

105 UFC/ml uropatogeni recunoscuti

Bacterurie asimptomatica (controlata prin 2 ECU) 10 000 L/ml

105 UFC/ml

Bacteriurie 105 UFC/ml posibila infectie

103 si 104 UFC/ml incertitudine (se repeta)


32/67

Examenul secretiilor si

exudatelor ano-genitaleOBIECTIVE Identificarea microorganismelor patogene

Diagnosticul infectiilor tractului genital si al vaginozelor dezvoltate datorita comensalilor

Diagnosticul infectiilor cu transmitere sexuala

Orientarea antibioterapiei, alegerea antibioticelor, supravegherea tratamentului si

a vindecarii.

Prevenirea bolilor cu transmitere sexuala (BTS)

Microorganisme ale cailor genitale feminine

Microorganisme intotdeauna

patogene

Microorganisme comensale

eventual patogene

Microorganisme fara

patogenitate cunoscuta

Neisseria gonorrhoeae Candida albicans Lactobacillus

Chlamydia trachomatis Gardnerella vaginalis Corynebacterium

Trichomonas vaginalis Mobiluncus spp Neisseria alte decat

gonorrhoeae

Herpes virus Mycoplasma, Ureaplasma Staphylococcus non aureus

Staphylococcus aureus

Streptococcus spp

Bacterii strict anaerobe

Enterobacterii

Papillomavirus

Gardnerella vaginalis

Mobiluncus
http://www.baylorcme.org/vaginosis/presentations/sweet/images/slides/sweet__023.gif


33/67

PRELEVARE SI TRANSPORT Pentru ambele sexe uretrite:

Prelevat endo-uretral cu tamponul

Chlamydia pentru detectarea ei este preferabila o raclare endo-uretrala.

ulceratii ano-genitale: recoltarea serozitatilor se va efectua de la nivelul bazei sau marginii ulceratiei cu un vaccinostil, o chiureta sau un tampon

biopsiile sau punctia ganglionului satelit se poate realiza de preferinta la cabinetul medicului sau spital

Pustule: colectarea continutului cu seringa sau tamponul

Recoltarea primului jet de urina este de interes in cazul uretritelor, in particular pentru a determina Chlamydia prin tehnici de biologiemoleculara.

Prelevate anale (eventual orofaringiene) - util diagnosticului in cazurile de BTS.

Prelevate de tract genital feminin vulvo-vaginite -recoltarea cu tamponul a secretiilor din orificiul vaginal si vestibul vaginal posterior

bartolinitele - aspirarea cu seringa din canal sau prelevarea cu tamponul.

cervicite - recoltare cu tamponul din endocol si se analizeaza intotdeuna la acest nivel gonococul si Chlamydia.

endometrite - prelevat din endocol si eventual aspirarea transcervicala prin cateter .

anexite -lichidul abcesului este prelevat cu seringa si celulele tubo-peritoneale prin periere in cadrul unei interventii chirurgicale.

material intra-uterin

Prelevate de tract genital masculin epididimite si prostatite - tamponarea uretrala, prelevarea spermei sau recoltarea primului jet de urina. prostatite - secretii prostatice dupa eventualul masaj al prostate si/sau primul jet de urina.

orhitese punctioneaza abcesul cu seringa . Agentul responsabil poate fi regasit si in sperma.

In toate cazurile, prelevatele trebuie sa permita examinarea directa si insamantarea (doua tampoane).

Transportul prelevatelor Daca prelevarile nu sunt efectuate in laborator, probele trebuiesc transportate rapid prin medii de transport adecvate( gonococ, Chlamydia,

Mycoplasma, virus).

Examenul citobacteriologic direct al prelevatelor in


34/67

Examenul citobacteriologic direct al prelevatelor in

functie de contextul clinic

Ulceratii: Examen extratemporaneu la microscop cu fond negru al serozitatii sancrului permite evidentierea de Treponema pallidum. Se poate folosi

imunofluorescenta directa, impregnarea cu argint sau coloratia Vago.

Coloratia May-Grundwald-Giemsa a frotiurilor realizate din serozitatile unui sancru evidentiaza bacilli care evoca Haemophilus ducreyi, stiind caaceasta bacterie este putin colorabila prin metoda Gram

Posibilitatea existentei unei ulceratii externe de tip herpetic in raport cu o infectie cu Chlamydia (boala Nicolas-Favre) sau Mycoplasma.

In mod exceptional se pot evidential corpii lui Donovan ( Calymmatobacterium granulomatis sau donovani) intr-un granulom inghinal survenit la 2-3 lunidupa un raport contaminant.

Uretrite, cervicite si vaginite: Cel mai frecvent vaginitele sunt determinate de Candida albicans, Trichomonas vaginalis si bacteriile care detemina vaginoza. Sistematic se

investigheaza N. gonorrhoeae si Chlamidia trachomatis in uretrite si cervicite Candida albicans - asimptomatice.

Prin preparat proaspat lama-lamela se poate observa daca exista Trichomonas vaginalis sau Candida albicans (ultima este mai bine evidentiata prindilutia prealabila in potasiu 10% si vizualizare cu contrast de faza).

Coloratiile May-Grundwald-Giemsa si eventual Papanicolaou permit studiul etiologic indispensabil: prezenta polinuclearelor, a celulelor vaginale,clue-cells din vaginoza, Trichomonas vaginalis, si mai rar evidentiaza celule care prezinta incluzii ale infectii cu Chlamydia trachomatis.

Coloratia Gram permite diagnosticul gonoreei, a candidozei determinate de Candida albicans, si mai ales studiul florei bacteriene vaginale si echilibrulsau care poate fi incadrat intr-un scor de la I la IV (scor I flora echilibrata, scor IV flora complet substituita)

In vaginoza bacteriana se observa dezechilibrul florei comensale in favoarea anaerobilor sau Gardnerella vaginalis, scor 3 sau 4

Chlamydia trachomatis poate fi observata prin tehnica imunofluorescentei.

In alte localizari examenul direct determina: Neisseria gonorrhoeae, Candida albicans, Chlamydia trachomatis.

Haemophilus ducreyi

Calymmatobacterium granulomatis sau donovani
http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.merck.com/media/mmpe/thumbnails/tn_s14c194photo07.jpg&imgrefurl=http://www.merck.com/mmpe/sec14/ch194/ch194f.html&h=78&w=149&sz=4&hl=ro&start=19&tbnid=JJnxAkKn2JZOqM:&tbnh=50&tbnw=95&prev=/images%3Fq%3DCalymmatobacterium%2Bgranulomatis%2B%26gbv%3D2%26hl%3Dro%26sa%3DG


35/67

Cultivarea

nu se poate realiza pentru Treponema palidum

pentru Haemophilus ducreyieste foarte dificila (pe geloza cu sange tratat termic sau proaspat).

Prelevatele se insamanteaza cel putin pe:

Geloza cu sange tratat termic cu si fara inhibitori pentru izolarea de Neisseria gonorrhoeae incubat in atmosfera de 10% CO2

Geloza sange pentru determinarea diferitelor bacterii Gram pozitive precum Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus.

Izolarea de Gardnerella vaginalis pe geloza cu sange uman nu are semnificatie decat daca este insotita de o apreciere semicantitativa.Gardnerella - asociere cu Mobiluncus spp

Geloza lactozata este utila pentru izolarea diferitelor bacteria Gram negative, in particular enterobacteriile care nu sunt luate in consideratie incazul uretritelor si vaginitelor.

In cazul unei recomandari explicite:

Culturi celulare pentru a se izola Chlamydia trachomatis.

medii artificiale imbogatite cu ser de vita si extract de levuri pentru Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum.

Geloza sange cultivata in anaerobioza pentru endometritele postpartum sau dezvoltate pe dispozitive intrauterine pentru a determina Prevotella.

Medii speciale pentru micobacterii in cazul endometritelor (rare), epididimitelor cu Mycobacterium tuberculosis.

Biologie moleculara:

Se realizeaza mai ales pentru Chlamydia.

Antibiograma:Se realizeaza in mod sistematic in infectiile endocervicale ale aparatului genital superior pe germenii patogeni izolati, pe tulpinile de gonococcu determinarea producatorilor de betalactamaze.

Nu se realizeaza pe bacteriile care colonizeaza in mod normal aparatul genital in special la femeie exceptie facand streptococul de grup B incursul celui de-al treilea semestru de sarcina pentru a se preveni posibilitatea unei infectii neonatale.


36/67

EXAMENUL BATERIOLOGIC AL SPERMEI

Obiective:

Diagnosticul unei infectii genital la nivel superior (orhi-epididimita, prostatita) pentrudiferentierea germenilor patogeni in cazul unei eventuale contaminari cu microbiotacomensala Controlul calitatii spermei in cazul fecundarii in vitro

Context:

Majoritatea infectiilor genitale survin la adulti tineri care au activitate sexuala si de obiceisunt corelate cu o maladie cu transmitere sexuala.

In cazul unui subiect sondat, care prezinta o anomalie sau o tumoare a tractului genito-urinar, sau un context favorabil (varsta, diabet, imunodepresie), spermocultura poatediagnostica o prostatita sau o epididimita datorata unor germeni oportunisti.

Trebuie avuta in vedere si posibilitatea unei infectii tuberculoase inaintea unei epididimitesubacuta sau cronica, in special la un subiect cu antecedente de tuberculoza saupurtator la nivelul altor situsuri.

Prelevare:

In mod clasic prelevarea se realizeaza dupa o abstinenta de 3 zile, sau dupa o mictiuneurmata de o dezinfectie atenta a glandului cu un antiseptic si clatire cu apa.

Recoltarea se realizeaza intr-un flacon steril cu deschidere mare.

Este preferabila recoltarea intr-un laborator si realizarea extemporanee a examenuluibacteriologic datorita sensibilitatii N. gonorrhoeae la var de temperatura. Daca acestlucru nu este posibil transportul in laborator trebuie sa fie rapid, iar proba mentinuta la370C.


37/67

Examenul bacteriologic al spermei

Examen direct In functie de orientarea clinica si epidemiologica

Examenul citologic pe produsul proaspat

depistarea de levuri sau paraziti (Trichomonas vaginalis, mult mai rar oua de Schistosoma). Coloratia Gram - observarea de N. gonorrhoeae, levuri (Candida albicans), coci Gram pozitivi sau bacilli

Gram negativi

notarea absentei sau prezentei polinuclearelor.

Insamantare pe: Geloza cu sange tratat termic fara inhibitori incubate in mediu imbogatit cu CO2 pentru Neisseria gonorrhoeae.

Geloza sange pentru diferitele bacteria Gram pozitive Staphylococcus aureus, S. epidirmidis, Streptococcus ssp,Enterococcus ssp.

Geloza lactozata pentru bacterii Gram negative, in special Enterobacterii.

Gardnerella vaginalis este rareori izolata in cultura pura pe geloza cu sange uman in prostatitele subacute sicronice.

Caracterul monomorf al culturilor este in favoarea unei infectii la fel ca si prezenta anumitor precumCorynebacterium seminale.

La recomandare speciala:

Culturi celulareChlamydia trachomatis.

Medii sintetice imbogatite cu ser si extract levuric pentru izolarea si numaratoare de Mycoplasma hominis,

Ureaplasma urealyticum. Medii pentru micobaterii petru diagnosticul unei epididimite sau prostatite cu Mycobacterium tuberculosis.

Biologie moleculara

Tehnicile de amplificare genica sunt utilizate in special pentru determinarea de Chlamydia trachomatis mai ales incadrul inseminarilorin vitro. Este necesara folosirea unui martor de amplificare datorita frecventei inhibitorilorprezenti in sperma (5-10%).

Antibiograma

Se realizeaza pentru speciile izolate Se investigheaza producerea de betalactamaze pentru tulpinile de gonococ.


38/67

Coprocultura

Principalele microorganisme care determina diaree

Bacterii Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia,

EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, Vibrio,

Aeromonas, Staphylococcus, Bacillus,

Clostridium

Virusuri Rotavirus, Adenovirus, Astrovirus, Calicivirus,

Coronavirus, virusul Norwalk

Protozoare Entamoeba, Giardia, Isospora,

Cryptosporidium, Balantidium

Helminti Schistosoma, Strongyloides, Ancylostoma,

Necator, Trichuris, Trichinella


39/67

Contexte minimale. Obiective Adult sau copil peste doi ani si context bine definit:

Realizarea unei coproculturi standard cu accent pe Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacterspp.

Copil mai mic de 2 ani: Realizarea unei coproculturi standard cu accent pe E. colienteropatogen stiindu-se ca la aceasta categoriepredomina etiologia virala.

Context epidemic-clinic particular: Notiunea de voiaj recent intr-o tara tropicala

Bolnavi aflati sub tratament cu antibiotic

Toxiinfectie alimentara colectiva Toxiinfectii alimentare cu perioada de incubare scurta (1-4 ore) non-febrile datorita S. aureus si B. cereus.

Toxiinfectii alimentare cu perioada de incubare lunga (12-72 ore) datorita Salmonella spp., Y. enterolitica, C. perfringens si C. botulinum

Pacienti cu HIV (SIDA)

Sindrom hemolitic si uremic

Intoxicatie alimentara Sindrom holeric

Detectarea colonizarii de bacterii mutirezistente

Determinarea starii de purtator la personalul cu risc

Obiective:

determinarea microorganismelor patogene responsabile de diaree.

Coprocultura se realizeaza pe produse lichide, moi, mucilaginoase sau hemoragice si doar la indicatii

foarte precise pentru cele solide. Evidentierea toxinelor produseClostridium difficile, Clostridium perfringeres)

Cercetarea prezentei in scaun a unei bacterii nosocomiale (de ex. Pseudomonas aeruginosa la nou-nascuti)sau rezistente la antibiotice (enterococ rezistent la vancomicina sau enterobacterie producatoare debetalactamaza de spectru larg).

Determina portajului cronic

Determinarea etiologiei diareei la pacientii infectati cu HIV bacterii responsabile de diaree acuta banala

virusuri de tip CMV, HSV, HIV

protozoare, precum Entamoeba histolityca, Isospora belli, Giardia intestinalis

Cryptosporidii, Microsporidii


40/67

Examenul microscopic

Orientarea culturilor germeni invazivi - prezenta leucocitelor

(Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacterspp.)

germeni enterotoxigeni leucocite absente (V.cholerae, Aeromonas spp., C. difficile)

Examenul frotiurilor colorate Gram: aprecierea procentajului celor doua tipuri tinctoriale.

Microbiota echilibrata este formata in majoritate debacilli Gram negativi insa sunt prezenti intotdeaunasi bacilli Gram pozitivi. Orice perturbare notabila aacestui elichibru trebuie semnalata.

Cultivarea


41/67

CultivareaAdult sau copil peste 2 ani si context bine definit

Salmonel lasi Shigel la.mediu selectiv de izolare (geloza SS, XLD, DCL, Hektoen)

mediu de imbogatire (3-6h) pentru Salmonella (bullion Mueller-Kauffmann, Selenit)

Campylobacterspp.mediu specific (Karmali, Skirrow sau Buztler).

Culturile sunt incubate minim 48 ore in mediu microaerofil.

Yersinia enterol i t icanu se analizeaza decat la copiii ai caror scaune sunt diareice sau la adulti intr-un context de poliartrita reactionala.mediu de imbogatire (mediu Rapapport), incubare 24-48 ore la +4 0C si repicare pe medii specific pentru Yersenia mediu Wauters (geloza SS imbogatita cu

dezoxicolat) mediu Irgasan-cefsulodin si novobiocin incubate pana la 48 ore la 300C.

Copil sub 2 ani

EPECmedii tip EMB sau Drigalski.

Contexte epidemico-clinice particulare

Notiunea de calatorie recenta in tariletropicale si sindrom holeriform

V. cholerae- imbogatire in apa peptonata alcalina si repicare la fiecare 3 ore pe mediu gelozat specific (de ex. TCBS)

Aeromonasspp pe geloza sange cu adaos de ampicilina

Bolnavi aflati sub tratament cu antibiotic

Clost r id ium di f f i c i le- punerea in evidenta a toxinei B in filtratele de scaun prin determinarea efectului citopatogen pe culture celulare (fibroblaste,cellule Vero, MRC-5, Mac Coy). Citirea se face dupa 24-48 de ore.

metode rapide imunoenzimatice pentru detectia rapida de toxina A sau de toxina A si B cand rezultatele se citesc in maxim 3 ore.

Sindrom hemolitic si uremic Izolarea de E. col iO157 se realizeaza pe geloza MacConkey cu sorbitol, coloniile sorbitol (-) sunt agglutinate pe latex.

Intoxicatie alimentara (de exemplu suspiciune de botulism)

Aceasta patologie nu necesita tehnici de coprocultura ci cercetare si tipizarea toxinei din serul bolnavului si din alimentele suspectate.

Determinarea colonizarii de catre bacteria multirezistente la antibiotic Enterococcul rezistent la vancomicina este izolat pe geloza tip bilaesculina cu 6mg/l de vacncomicina.

Bacteriile producatoare de betalactamaze de spectru larg sunt selectionate pe mediu Drigalski cu 0,5-1 mg/l cefotaxim.

Antibiograma

In toate cazurile este necesara realizarea antibiogramei pentru toate bacteriile izolate din coprocultura.

Antibiograma este imperativ necesara pentruSalmo nella, Shigella, E. co li, V. cholerae.

Examenul citochimic si bacteriologic al lichidului cefalorahidian


42/67

Meningite comunitare: Adulti si copii >5 ani :

S. pneumoniae

N. menigitidis

Listeria monocytogenes

Sugari si copii 0.4 g/l

- hipoglicorahie < 40% fata de glicemie

LCR limfocitar

> 10 elemente/mm3din care 50% limfocite

proteinorahie >0.4 g/l

hipoglicorahie < 40% fata de glicemie =>se suspecteaza etiologie

bacteriana : Listeria, BK insostita de hipoclorurorahie)

daca normoglicorahia este >50% decat glicemia si mai putin de 100

elemente/mm3 => se suspecteaza etiologe virala

LCR panache

> 10 elemente/mm3 ; % polinucleare = % limfociteproteinorahie si glicorahie normala

se poate suspecta: listerioza, meningita purulenta sau o menigita

limfocitara la debut, abces cerebral

LCR hemoragic

Contaminarea LCR cu globule rosii se poate datora unui traumatism

aparut in timpul punctiei lombare sau unei hemoragii subarahnoidiene

(asociata unei pleiocistoze si uneori cu hipoglicorahie).


43/67

Orientarea etiologica rapidaExamenul microscopic al frotiurilor Gram

Prezenta/absenta bacteriilor, unor amibe libere (Naegleria fowleri)

Tipul morfologic, afinitate tinctoriala (coci, bacili, Gram +/-)

Prezenta capsuleilocalizarea intra-/extraleucocitara.

Investigarea prezentei antigenelor solubile in LCRmetoda latex aglutinarii

Meningita comunitara la adult/copilcoci Gram +: S. pneumoniae

bacili G - : H. influenzae

coci G - : N. meningitidis

Meningita la nou-nascuticoci Gram +: S. agalactiae

bacili G - : E. coli K1

Meningita limfocitara la imunodeprimati (SIDA)Cryptococcus neoformans

LCR limfocitar cu hiperproteinorahie, hipoglicorahie si hipoclorurahie

= meningita tuberculoasa.- investigarea BAAR prin examen microscopic

- insamantarea pe mediu de cultura specific M. tuberculosis

- confirmare cu o tehnica de amplificare molecura

LCR hipercelular cu frecvente polinucleare,crestere bacteriana absentaTratament cu antibiotice

Etiologie cu bacterii greu cultivabile (Leptospira, Borelia)

Ant ib iograma direct din LCR


44/67

Cultivarea Sistematica pentru toate tipurile de LCR

Medii imbogatite geloza sange suplimentata cu factori de crestere, incubare la 370C in atmosfera de 5-10% de CO2 geloza sange, incubare la 370C in atmosfera de 5-10% de CO2

mediu pentru anaerobi, incubare la 370C in anaerobioza

bulion cu extract globular (facultativ) permite diluarea antibioticului prezent in LCR

Incubare 18 48h -5 zile la 370C

Circumstante particulare: meningita limfocitara la imunodeprimati (SIDA)

geloza Sabouraud

meningita limfocitara, hipoglicorahie si suspiciune de tuberculoza mediu Lowenstein-Jensen (insamantare in 3 tuburi si imbogatire daca este posibil) sau alt mediu specific

Antibiograma

H. influenzaeinvestigarea beta-lactamazelor

N. meningitidis

investigarea beta-lactamazelor (in cazuri exceptionale)

investigarea sensibilitatii scazute la penicilina G prin masurarea diametrului zonei de inhibitie obtinut in juruldiscului de oxacilina si prin determinarea CMI

gruparea antigenica

trimiterea catre un centru de referinta

S. pneumoniae

detectarea rezistentei la beta-lactamine cu ajutorul discului de oxacilina si determinarea CMI la penicilina G,amoxicilina, cefotaxim si cetriaxona


45/67

Examenul bacteriologic al lichidelor de punctie

(lichide serice, infectate)Supuratie hepatica Enterobacteriaceae

Anaerobi

Streptococcus milleri

S. aureus

Enterococcus sp.

Peritonita primara (primitiva) Streptococcus pneumoniaeEscherichia coli

Peritonita secundara (infectie biliara sau abces) EnterobacteriaceaeStreptococi

Anaerobi

Enterococcus spp.

Supuratie intestinala Yersinia pseudotuberculosisYersinia enterocolitica

Salmonella spp

Streptococcus milleri

Peritonita post-chirurgicala EnterobacteriaceaeEnterococcus spp

Anaerobi

Pleurezie Streptococcus pnemoniaeS. aureus

Haemophilus influenzae

Anaerobi

Osteomielita la copil S. aureus

Osteomielita si spondilodiscita S. aureusEnterobacteriaceae

P. aeruginosa

Artrita profunda S. aureusNeisseria gonorrhoeae

Enterobacteriaceae

Streptococcus spp.

Haemophilus influenzae

Borrelia burgdorferi

P. aeruginosa

Infectii ale protezelor articulare S. aureus

Stafilococi coagulazo-negativiPeptostreptococcus

M d b i l i


46/67

Metode bacteriologiceExamenul directin situatia unei cantitati de lichid este mica (sau in cazul punctiilor chistilor) : se realizeaza coloratie Gram;

in situatia unei cantitati suficiente de lichidse realizeaza o numaratoare si formula elementelor figurative;

coloratie citologica (pentru determinarea celulelor neidentificabile)

coloratie Gram

Cultivarea

centrifugarea lichidelor interne la 1500g 30 min (expunere la oxigen !!!!(efect nefast asupra anaerobilor) si risc mare de contaminare)

insamantare in bulion imbogatit (tip cord - creier)incubare in anaerobioza la 370C (in medie 4 zile, iar pentru lichidele articulare 10 zile) si observare zilnica.

insamantare in bulion pentru anaerobi

pentru izolarea aerobilor:

geloza sange;- mediu selectiv pentru bacterii gram negative;

- geloza chocolat incubare in atmosfera de CO2 la 350C ( in functie de context se foloseste geloza BCYE pentru Legionella; mediu cu Tweenpentru corynebacterii)

In functie de contextul clinic (imunodeprimati, antecedente de tuberculoza), se utilizeaza:mediu Sabouraud pentru levuri, Aspergillus (incubare la 22 -300C)

mediu de cultura pentru Mycobacterium (incubare 8 saptamani)

mediu de cultura pentru Nocardia (10 zile)

Interpretarea culturilorcomparatie intre rezulatele obtinute in cultivare aeobe si cele ale cultivarii anaerobe.

Mediile solide sunt examinate la 24h si la 48h.

Mediile lichide sunt incubate, rezultatul nefiind considerat negativ nici dupa a 10 zi de incubare mai ales in cazul lichidelor de punctie articulara.

Pentru aceste lichide un pozitivarea culturii exprima o infectie, dar lipsa dezvoltarii in cultura nu exclude existenta bacteriei in cantitatireduse/necultivabile in acest situs.

Prezenta unei culturi mixte (>3 specii microbiene, nici unul nefiind predominant) impune identificarea tuturor speciilor izolate, realizandu-se ocomparatie si cu simptomatologia pacientului.

Antibiosensibilitatea Se realizeaza determinarea CMI sau CMIs pentru moleculele folosite in mod frecvent in tratament

E l b t i l i l l t l l


47/67

Examenul bacteriologic al prelevatelor oculare

1. Obiective

izolarea si identificarea agentului bacterian/fungic implicat in etiologia infectiei oculare

stabilirea terapiei infectieiprevenirea infectiilor post-operatorii

izolarea agentului etiologic;

localizarea infectiei la nivelul segmentului anterior conjunctivite

- keratite- uveite anterioare/iridociclite

- la nivelul segmentului posterior corioretinite si retinite

- endoftalmite si panoftalmite

- infectii perioculare

contextul epidemiologic etiologia infectiilor oculare pot varia cu:varsta

statusul imuniatar (imunodeficienta)

zona geografica

Potentiali patogeni S. aureus, Streptococcus pneumoniae,

E f l


48/67

Bacterii Gram +

Enterococcus faecalis

Comensali S. epidermidis, Corynebacterium sp.,

Propionibacterium acnes, Streptococcus spp.

Bacterii Gram -

Potentiali patogeni Enterobacterii (Serratia, Klebsiella, Proteus,

Enterobacter), P. aeruginosa, Haemophilus,

Moraxella, Acinetobacter

Comensali Moraxella catarrhalis, Neisseria spp

Localizare Context habitual Context special

Conjunctivita S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, H.influenzae,

N.gonorrhoeae, Moraxella spp, enterobacterii

Adult imunodeprimat: Pseudomonas,

enterobacterii, levuri

Batrani si copii: N.gonorrhoeae, S.aureus,

S.pyogenes, C.trachomatis, P.aeruginosa

Africa si tarile in curs de dezvoltare:

M.tuberculosis, C.diphtheriae, N.gonorrhoeae,Haemophilusaegyptius, C. trachomatis

Celulite profunda S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, P.aeruginosa Copii


49/67

Prelevare - de catre medicul oftalmolog

- inainte de o toaleta facila riguroasa

- la nivelul unghiului intern al ochiului

- cu un tampon steril

Mai rar, in cazul:blefaritelor (se preleva cruste palpebrale, 1-2 gene cu pensa sterila)

orgeletului (se preleva cu un ac de seringa steril pruoiul)

dacriocistitei (se preleva pruoiul de la nivel punctelor lacrimale palpebrale, prin presarea sacilor lacrimali)

ulcerului corneean (se preleva cu ajutorul unui tampon dupa efectuarea unei anestezii locale)

Transportulmediu pentru Chlamidia

mediu Stuart pentru alte specii bacteriene

Examenul directNu se realizeaza in cazul prelevatelor recoltate inainte de interventia chirurgicala oculara.

Pentru alte prelevate se pot realiza :frotiu colorat Gram permite descrierea florei dominante

frotiu colorat Giemsa permite descrierea asptectului citologic (prezenta polinucleare)

pentru evidentierea bacteriei Chlamidia trachomatis prin imunofluorescenta

preparat proaspat pentru evidenterea amibelor libere la pacientii purtatori de lentile de contact

Prelevate pre-operatorii

In acest caz se evidentiaza bacterii patogene in proportie de 25-30% cazuri:bacterii Gram pozitive cele mai frecvente (75-80%): S. aureus, S. pneumoniae, Enterococcus faecalis;bacterii Gram negative: enterobacterii (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus), P.aeruginosa, Haemophilus,Moraxella spp.,Acinetobacter

La purtatorii de lentile de contact predomina bacteriile Gram negative.

Bacteriile florei comensale prezinta o importanta deosebita in cazul pacientilor imunodeprimati, devenind oportuniste : S. epidermidis, Propionibacterium acnes,Streptococcus spp., Moraxella catarrhilis, Neisseria spp.

Antibiograma se realizeaza numei pentru bacteriile cu potential patogen

Alte prelevate


50/67

geloza sange/ sange tratat termic, incubare in atmosfera de CO2, la 350C.

In functie de contextul clinic si epidemiologic se utilizeaza alte medii;culturi de celule pentru izolarea Chlamidia trachomatis

bulion /geloza sange in anaerobioza

mediu Sabouraud pentru levuri si Aspergillus, incubare 22-300C

medii de cultura specifice pentru Mycobacterium si Nocardia (incubare 8 saptamani in atmosfera de CO2 la 350C)

medii de cultura pentru amibe libere

Rezultate estimate:

Conjunctivite: S.aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae, N. gonorrhoeae, enterobacterii, Moraxella spp;Adulti imunodeprimati: Pseudomonas, enterobacterii, levuri

Copii si batrani: N.gonorrhoeae, S.aureus, S.pyogenes, C.trachomatis, P.aeruginosa

Context epidemiologic particular (Africa si tarile in curs de dezvoltare)M.tuberculosis, C.diphtheriae, N.gonorrhoeae, Haemophilusaegyptius

C. trachomatis este responsabila de trahoma (serotip A,B si C) si de conjunctivita cu incluzii (serotip D si K). Diagnosticul se realizeaza prin examen directsau cultivare.

Alte infectii oculare

Celulite profunde : S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, P.aeruginosa; la copii


51/67

. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL UNUI DISPOZITIV

INTRAVASCULAR

(CATETER, CAMERA IMPLANTABILA)

I. Contextraportatea existentei unei stai septice la colonizarea dispozitivelor intravasculare cuunul sau mai multe microorganisme.

II.Obiective

-Utilizarea unei metode sensibile si specifice care sa permita punerea in evidenta acolonizarii unui dispozitiv.

Microorganismele cel mai frecvent intalnite sunt: Staphylococcus epidermidis, (si alti stafilococicoagulazo-negativi), Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter ssp.,Enterocaterii, Enterococcus ssp., bacterii corineforme, Candida sp.

Studiul bacteriilor anaerobe nu este necesar in acest context.

-Diferentierea unei colonizari de contaminarea ce are loc in general la scoatereadispozitivului. metode cantitative sau semicantitative, calitative (simple puneri deculturi in medii lichide).

Excluderea posibilitatii existentei unui alt focar infectios

Luarea unuei decizii:- instaurarea sau nu a antibioterapiei pe cale generala sau locala

- alegerea antibioticului

- indepartarea dispozitivului

M t d b t i l i


52/67

Meteode bacteriologice1. Analiza bacteriologica a dispozitivului in organism

Hemoculturi diferentiate care se aplica in cazul camerelor implantabile si a cateterelor profunde.

a. Hemocultura prin metoda centrifugare-liza (Isolator 10)- prelevati 2 hemoculturi (10 ml de sange fiecare), una de la periferie, de la distanta de material si alta

de-a lungul dispozitivului (dupa aruncarea primilor 20 ml de sange)

- insamantati sedimentul de centrifugare din fiecare tub pe 2-3 placi cu geloza sange

- incubati 72 ore in atmosfera 5% CO2

- exprimati rezultatele in UFC/ml

- rezultatul este semnificativ daca UFC/ml al materialului > 5x UFC/ml din sangele periferic

Metoda liza Isolator 1,5

- aceleasi etape fara centrifugare utilizand tuburi de 1,5 ml

- se utilizeaza in pediatrie

- este mai usor de realizat decat prima metoda pentru camerele implantabile

b. Hemocultura pentru detectarea cresterii in sistem automat

- realizati hemoculturi in flacoane pentru automat din sange periferic si din material

- plasati probele rapid in automat

- se tine cont de o pozitivare mai rapida a hemoculturii prelevate de pe material (semnificativa dacatimpul de pozitivare este inferior hemoculturii periferice)

- aceasta metoda este valabila pentru automatul VITAL (bioMerieux), pentru un timp > 2 ore.


53/67

2. Analiza bacteriologica dupa scoaterea cateterului

- se lucreaza pe 5 cm de la extremitatea distala pentru cateterele lungi, sau pe toata suprafata cateterului pentrucateterele scurte.

a. Metoda semicantitativa Maki

- rulati cateterul pe suprfata unei placi de geloza-sange cu ajutorul unei pense sterile sau a unei pipete Pasteur

- incubati 48 ore la 370C

- cateterul este colonizat daca UFC/ml > 15 (5 dupa unii autori)

Aceasta metoda ia in calcul doar suprafata externa a cateterului, prezinta sensibilitate buna dar specificitatemediocra

b. Metoda cantitativa Cleri

- prindeti cateterul cu o pensa sterila si se desfaceti orificiul in care se pune 1 ml de bulion steril-colectati bulionul si cateterul intr-un tub steril, vortexare 30 secunde

- insamantati 10 l bulion pe geloza sange, incubare 48 ore la 370C

- cateterul este colonizat daca UFC > 1000/ml.

Aceasta metoda ia in calcul fata externa a cateterului si orificiul dispozitivului, se caracterizeaza prin specificitate sisensibilitate buna

c. Metoba cantitativa Cleri modificata de Brun Buisson

- este o metoda simplificata: cateterul e colectat intr-un ml ser fiziologic fara desfacerea orificiului , vortexare 1 minut

- se obtine acelasi prag de pozitivitate

3. Analiza bacteriologica dupa scoaterea unei camere implantationale

- nu exista o metoda standardizata pentru analiza camerelor implantabile, se fac prelevari la indepartarea acestordispozitive:

-indepartati camera

- recoltati serozitati

- analizati cateterul printr-o metoda cantitativa (Cleri sau Brun-Buisson)

- spalati partea inchisa a camerei si analizati produsul de spalare

EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL LICHIDULUI DE


54/67

EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL LICHIDULUI DE

DREN

I. ContextAnaliza bacteriologica a unui lichid de dren se poate practica in scopul supravegerii unui situs, in mod naturalsteril, necesitand un dispozitiv de drenaj.

Practica este curenta dar nevalidata pe plan clinic.

II.Obiective

- prelevatele trebuie sa provina din sisteme de drenaj inchise

- diferentierea colonizarii dispozitivului de contaminarea ce are loc la situsul de insertie sau pe traseul drenului: seconfrunta abundenta si natura florei cu cea de la nivelul situsului.

- daca sunt puse in evidenta bacterii trebuiesc cautate argumente in favoarea unei infectii locale sau a unei stariseptice: se realizeaza sistematic hemoculturi pentru evidentierea bacteriemiei, se exclude posibilitatea altui focarinfectios.

III. Metode bacteriologice

1. Examen direct

- coloratie Gram poate fi realizata pe un frotiu direct, sau pe sediment de centrifugare

2.Cultura- insamantare pe geloza-sange

- incubare 48 ore in aerobioza

3. Antibiograma

- nu este obligatorie


55/67

EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL PRELEVATELOR PERINATALE

I.Context: Evaluarea riscului infectiilor perinataleContaminarea perinatala se poate produce in utero, la nastere sau dupa nastere.

1. In uter

Fatul este contaminat pe cale transplacentara in cursul unei bacteriemii materne.

Patologii fetale sau/si neonatale intotdeauna severe (avort, prematuritate, malformatii, sindrom infectios congenital)

Bacteriile in cauza sunt cele capabile sa infecteza mama si capabile sa colonizeze fatul pe cale transplacentara: Listeria monocytogenes

2. Infectii neonatale

Fatul este contaminat prin lichidul amniotic care a fost el insusi infectat la strabaterea caii genitale sau la nastere, la trecerea prin caile genitale alemamei.

Germenii infectanti sunt deseori ingerati de nou-nascut.

Patologii infectioase neonatale care sunt greu de combatut si sunt dominate de semne respiratorii.Bacteriile care colonizeaza caile genitale ale mamei cel mai adesea fara consecinte patologice pentru mama.

Speciile cu risc infectios crescut pentru nou-nascut: Streptococcus agalactiae (grup B, tip III si I), E. coli(tip capsular K1), H. influenzae (biotip 4), H.haemolyticus.

Alti comensali din vagin pot fi implicati in infectii neonatale: Staphylococcus aureus, Streptococcus spp, Enterococcus spp, enterobacterii, Gardnerellavaginalis, Anaerobies strictes, Mycoplasma, Ureoplasma.

De asemenea, microorganisme responsabile de patologia veneriana la femei (Chlamydia, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum) pot infecta nou-nascutii.

Infectiile virale ale nou-nascutului (Herpes viridae VIH, hepatite) care sunt detectate la nastere nu sunt tratate aici.

3. Infectii post-natale

In 8 ore de la nastere, copilul poate fi contaminat de microorganisme din mediu sau de la mama.Tabloul clinic al acestor infectii tardive sunt adeseadominate de semne de meningita.

4.Criterii decizionale pentru instituirea unui tratament antiinfectios la nou-nascut

Prognosticul infectiei nou-nascutului este direct dependent de rapiditatea administrarii tratamentului.

Decizia tratamentului se face la nastere, uneori chiar inainte, pe baza unor argumente anamnetice, clinice, biologice si bacteriologice.

Fiecare echipa de obstetricieni utilizeaza propriile reguli in absenta unui consens in tratamentul infectiilor.

Criteriile microbiologice si rezultatele examelelor directe a prelevatelor practicate la nastere influenteaza decizia in privinta tratamentului.

II. Obiectivele examenelor bacteriologice:


56/67

g

- stabilirea criteriilor bacteriologice pentru luarea unei decizii in stabilirea tratamentului la nou-nascut

- izolarea, identificarea, si determinarea sensibilitatii la antibiotice a bacteriilor responsabile de infectie in cursul primelor zile de viata

III. Prelevate

1.Prelevate de urgenta- efectuate si transportate la temperatura ambianta intr-o ora (daca e posibil) de la nastere si examinate imediata. aspiratul gastric: cativa ml de lichid gastric sunt aspirati cu ajutorul unei sonde gastrice nr 8 montata pe o seringa de 10 ml.

b. aspirat din orificii si cutanat (1-3 situsuri cutanate si orificii (pliu, narina si conduct auditiv)

2. Prelevate complementare -sunt efecuate in urmatoarele 24 de ore de la nasterea. prelevare de meconiu: In mod normal meconiu este eliminat in 48 de ore, o eliminare precoce poate fi un semn de infectie.

- sunt prelevati cativa ml cu ajutorul unei spatule sterile.

b.prelevare de placenta: un esantion de placenta poate fi prelevat cu ajutorul unui scalpel steril de preferinta dintr-o zona cu aspect macroscopicanormal. Daca aspectul este diferit trebuie conservat esantionul la 40C.

3. Prelevate specifice

hemoculturile, punctiile LCR si prelevatele periferice (ECBU)

B. Prelevate pentru evidentierea portajului matern de microorganisme de risc

1.Examenul bacteriologic al endocolului

Infectia corioamniotica ascendenta incepe printr-o colonizare a endocolului.Examenul prelevatelorde endocol realizate corect (fara contaminare vaginala) poate permite identificarea bacteriei responsabi le de colonizareasi producerea infectiei.

Acest examen poate fi practicat in timpul ultimului consult inainte de data prevazuta pentru nastere.

Tehnica de prelevare este determinanta pentru a evita contaminarea vaginala. Mai inainte trebuie curatat corect exocolul cu AFS, apoi prelevatendocol cu un tampon ce va fi intors de mai multe ori in endocol si scos evitand orice contact cu peretii vaginului.

Trebuie cautati in cultura toti germenii care pot fi responsabili de chorioamniotite bacteriene, cu prioritate bacterii cu risc inalt de infectie pentrunou-nascut.

2. prelevate vaginale, anale

Evidentierea S. agalactiae la nivel vaginal si anal in timpul ultimului consult inaintea datei prevazute pentru

. Existenta unei BTS anterioare la femei face sa creasca riscul infectiilor grave la nou-nascut.

3. Examenul bacteriologic al lichidului amniotic

Acest examen este practic in perioada prenatala in caz de ruptura precoce a apei.

Acest tip de prelevat este tratat ca un prelevat steril.

Enterobacteriile, streptococii, Lysteria, Haemophylus, Gardnerella dar si alti germeni aerobi si anaerobi comensali ai cailor genitale.

Tehnica de prelevare este determinanta pentru evitarea contaminarii lichidului in timpul trecerii prin vagin. Trebuie mai intai curatat corectexocolul apoi prelevat, de la nivelul colului, o cantitate suficienta de lichid amniotic (0,5ml).

Examene microbiologice1. Microorganisme incriminate


57/67

Bacteriile patogene investigate sistematic in toate prelevatele la mama sau la fat

S. agalactiae, E. coli (K1),H. influenzae, L. monocytogenes.

Toate celelalte specii izolate din lichidul gastric sau din alt prelevat recoltat la nastere la copil trebuie considerat ca potential patogen.

Antibiograma obligatorie.

2.Examenul direct

a. Lichdul gastric

Realizati frotiuri Gram. Se examineaza la microscop: polimorfonucleare, bacterii, levuri.

In general, in cazul unei infectii, flora monomorfa.

Prezenta unei flore abundente si variate poate fi rezultatul contaminarii datorita prelevarii tarzii sau conditiilor proaste de transport.

b. Meconium

Meconiu este normal steril. Examinarea se practica ca si in cazul lichidului gastric.

c. Prelevarile cu tampon

Aceste prelevate sunt frecvent contaminate de flora vaginala a mamei si/sau de flora cutanata sau din mediu.

Se examineaza la microscop dupa coloratia Gram: polimorfonucleare, bacterii, levuri. Examenul directal acestor prelevate este mai putininformativ decat cel al lichidului gastric.

d. Alte metode de diagnostic rapidEvidentierea antigenelor bacteriene.

Metodele de amplificare genica sau sonde nucleare nu sunt inca validate.

. Cultura

- un mediu imbogatit (geloza cu sange tratat termic)

- un mediu selectiv pentru streptococi si Listeria (geloza sange si acid nalidixic-colistine sau ANC)

- un mediu selectiv pentru bacili G-

- un mediu solid pentru strict anaerobi din lichidul gastric.

Mediile unt incubate 48 ore la 370C, si, in cazul mediului cu sange, cu 5-10% CO2.

Trebiue evidentiate speciile de risc.

Prezenta speciilor comensale trebuie interpretata cu precautie.Prezenta unei specii ca flora dominanta in 2 prelevate din situsuri diferite este considerata semn de infectie.

Tulpinile de Listeria sunt trimise la centrul de referinta.

Determinarea grupului capsular K1 de E. colise face prin aglutinare pe lama.

Haemophilus trebuie identificat.

Identificarea altor bacterii considerate ca patogene se face pana la stadiul de specie.

4. Antibiograma

Se realizeaza pentru tulpinile patogene.

E. coliK1: fenotip de rezistenta dobindita

S. agalactiae: rezistenta la macrolide, si ciclineH. influenzae: prezenta de beta-lactamaze

Listeria : rezistenta naturala la cefalos orine rezistenta dobandita la macrolide floro uinolone cotrimazol

HEMOCULTURA


58/67

HEMOCULTURAFactor de predictie puncte

Temperatura maxima>38,30

C 3

Maladie rapid fatala 4

Maladie terminala 2

Prezenta frisonului 3

Toxicomanie pe cale venoasa 4

Abdomen chirurgical 3

Factor de comorbiditate majoraa

coma sau moarte cerebrala, perforare digestiva,

multitraumatisme, stop cardiorespirator, insuficienta

hepatica acuta sau cronica

3

scor 6 risc puternic de bacteriemie

scor 2 -risc scazut


59/67

Realizarea unui prelevat de calitatea.Evitati contaminarea

Asepsia pielii se face succesiv cu alcool 70% ,apoi un produs iodat, tinctura de iod sau polividona iodata. 1-2 minute de contact sunt necesare pentru obtinerea efectului aseptic incazul polividonei.

Dezinfectia capului flaconului de hemocultura e realizata cu alcool 70% sau cu produs iodat unde a fost lasat inainte de utilizare.

b. Prelevarea unei cantitati suficiente de sange

20 ml -adult.1-2 ml la copil.

c. Efectuati numarul de prelevari necesare

Cu exceptia infectiilor sistemului vascular, in particular endocarditele bacteriene, in cursul carora bacteriemia este permanenta, in cursul altor situatii clinice,bacteriemia poate fitranzitorie, intermitenta.

2-3 seturi de hemoculturi / 24 ore cu pauza de 30-60 minute intre 2 prelevari.

2. Alegerea conditiilor de cultivare adecvata

a. Aerobioza-anaerobioza

b. Diluarea sangelui

Sangele bolnavului contine numeroase substante cu activitate antibacteriana:complement, lizozim, celule fagocitare si antibiotice . Diluarea 1/10 sangelui in bulion atenueazaefectul acestor substante.

c. Polietanol sulfonat de sodiu (SPS)

Este anticoagulantul general utilizat in bulion pentru hemoculturi la o concentratie de 0,025-0,05%.

Favorizeaza cresterea majoritatii bacteriilor, pentru ca inhiba activitatea bactericida a serului, inhiba fagocitoza, inactiveaza complementul, neutralizeaza lizozimul si antibioticele

familiei aminosidelor.Totusi, SPS poate avea efect inhibitor asupra unor specii de Neisseria, Peptostreptococcus anaerobius, sau de Streptobacillus moniliformis.

E de preferat utilizat in concentratia 0,025%. Aditia de gelatina la o concentratie de 1,2% poate neutraliza efectul inhibitor al SPS.

d.Neutralizarea antibioticelor

Rasini absorbante de cationi sau carbon activ au efect neutralizant fata de antibiotice.O masura de precautie consta in realizarea prelevarilor la distanta fata de administrareaantibioticelor.

3. Detectarea precoce a cresterii bacteriene

a. Durata de incubare a flacoanelor de hemocultura

Incubare de 7 zile la 350C este suficienta. La automate, incubarea e validata pentru 5 zile.

Peste aceasta perioada, bacteriile detectate sunt in general contaminanti care au fost in prelevat in cantitate scazuta.

Un timp de incubare mai lung poate fi necesar pentru microorganisme particulare:ciuperci, bacterii de grup HACEK, Brucella sau Legionella si in plus pentru pacientii suspectati deendocardite si la care prelevatele au fost realizate atunci cand bolnavul era sub tratament cu antibiotice.

4. Examenul macroscopic al probei= valoare orientativa

Semne observate Bacteria in cauza

Turbiditate Bacili G- aerobi, stafilococi, Bacteroides,

Hemoliza Streptococi, stafilococi, Listeria,Clostridium, Bacillus

Producere de gaz Bacili G-aerobi anaerobi

coagulare S.aureus

Ameliorarea precocitatii si sensibilitatii detectiei


60/67

Ameliorarea precocitatii si sensibilitatii detectiei

cresterii bacteriene

- agitarea flacoanelor aerobe in timpul primelor 24 ore de incubare accelereaza cresterea bacteriana, dar e dificil de pus in practica, in absenta unuidispozitiv automat

- aerarea flacoanelor aerobe cu un dispozitiv adaptat favorizeaza cresterea Pseudomonas

- detectarea precocitatii cresterii realizand o examinare directa la microscop in bulionul de cultura cu acridin orange este o tehnica putin utilizata- repicarea sistematica precoce (intre 6 si 24 ore) a flaconului de anaerobioza pe gelaza chocolat incubata in aerobioza la 350C e uneori recomandata darputin utilizata

-sistemele difazice permit cresterea precoce a coloniilor pe mediul gelozat.Important pentru speciile bacteriene cu crestere delicata.

-sistemul Signal utilizeaza un flacon la care este adaptat un dispozitiv ce permite semnalizarea cresterii bacteriene

b3. Centrifugare-liza: sistemul Isolator

Acest sistem permite recoltarea a 8-10 ml de sange si concentrarea microorganismelor inainte de insamantarea pe mediul gelozat adaptat cresteriimicroorganismelor respective.

Solutia prezenta in tub contine saponina pentru lezarea leucocitelor si eritrocitelor, polipropilenglicol pentru a evita formarea de spuma datorita saponinei siSPS ca anticoagulant.

Dupa centrifugare tuburilor in rotor la unghi fix de 350 -30 minute la 3000g, supernatantul este eliminat si concentratul este omogenizat la vortex.

Se insamanteaza pe diferite medii gelozate.

Isolator 1,5 este acelasi sistem, fara etapa de centrifugare. Se practica in tuburi de 1,5 ml, in pediatrie.

Sistemul Isolator este foarte performant pentru izolarea microorganismelor urmatoare:micobacterii, levuri cu crestere dificila, ciuperci filamentoase, bacteriiexigente. Permite cuantificarea bacteriemiei, ceea ce este util pentru punerea in evidenta a unei infectii pe cateter.

Prezinta si cateva inconveniente:riscul manipularii obliga manipulatorul la lucru in hota, necesita timp mult din partea manipulatorului.

b4. Metode de detectie automatizata

- detectie automata a hemoculturilor pozitive

- detectia flacoanelor pozitive pre-incubate

- prelucrare statistica si protectia manipulatorului

Principiul de detectie estec masurarea directa sau indirecta a cantitatii de CO2 produsa in flacon.

Bio Argos-se masoara spectofotometric producerea de CO2

BacT/Alert

Principiul consta in incorporarea in fiecare flacon a unui detectot colorimetric sensor de CO2 de culoare verde. Sensorul este separat de bulion printr-omembrana semipermeabila care nu lasa sa treaca CO2. Producerea de CO2 antreneaza o descrestere a pH-ului si sensorul devine galben. Virajul culoriieste interpretat prin reflectometrie, fiecare citire compara variatia de culoare cu precedenta, fiecare flacon are propria sa celula de citire .

Bactec 9240

Acelasi principiu, coloratia fluorescenta, masurata de o fotodioda.

Vital

In flacoane sunt molecule fluorescente in stare nativa care emit fluorescenta in prezenta fenomenelor biologice determinate de cresterea bacteriana.Aceasta molecula nu este sensibila doar la CO2, cresterea este detectata datorita variatiei de pH si modificarii potentialulu i oxido-reducator. Fiecare flaconare propria celula de citire, echipat cu o dioda de excitare ce emite o lumina verde. Lumina rosie emisa de filtre e transmisa de o fibra optica spre unnumarator de fotoni.

Cazuri particulare


61/67

Cazuri particularea. Micobacterii

Mycobacterium avium-intracelulare (complexul Mac)pacienti SIDA.

mai rar: M. kansasii, sau M. tuberculosis

b. Alte microorganisme:

b.1. Bacterii cu crestere lenta si dificilaBrucella- unele tulpini sunt exigente pentru CO2. Sangele este inoculat in flacon difazic tip Castaneda, incubat 6 saptamani la370C.Se fac subculturi pe geloza tripticar soya cu 5% ser de bou sau pe agar Brucella incubat in atmosfera de 5%CO2.

Campylobacter- cultura la 370C in microaerofilie in atmosfera de 5%CO2 pe mediu Skirrow, Butzler sau Karmali incubate 72 ore.

Legionella Cultura pe mediul BCYE incubate la 370C cu 5%CO2, observate timp de 10 zile.

Mycoplasme Ureaplasma- cultura in bulion PPLO sau geloza A3 incubata in microaerofilie la 370C si observate 3 zile.

Leptospira- recoltat sange pe tub de heparina si insamantat pe mediu Tween-Albumine sau EMJH incubat la 300C la intuneric.Observarea culturii la microscop cu fond intunecat, in timp de 2 luni saptamanal .

Grup HACEK- Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomicetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens,si Kingella kingae sunt specii responsabile de endocardite bacteriene care se dezvolta lent. Ele pot necesita o incubare in flacoanemai putin de 14 zile, mai mult decat durata normala de incubare a flacoanelor in automate.

Streptococi deficienti (Abiotrophia) unele tulpini de streptococi de grup viridans necesita piridoxal pentru crestere. Acestetulpini pot fi responsabile de bacteriemii sau endocardite. Cresc in bulion , nu cresc pe mediu gelozat. Nevoia de piridoxal estepusa in evidenta prin crestere pe geloza cu sange completata cu 0,001% piridoxal, sau printr-un test de satelitism in jurul unui striude S. aureus.

Bartonel la (Rochal imaea)- Aceste bacterii retrase din ordinul Rickettsiales sunt responsabile de bacteriemii, angiomatose,pelioze bacilare la pacientii cu HIV. Cultivarea lor pe mediu acelular este lenta si delicata. Sedimentul dintr-u tub Isolator esteinsamantat pe geloza cu sange de iepure sau oaie incubat in atmosfera de 5% CO2 6 saptamani. Se poate face PCR.

b.2. Endocardite cu hemoculturi negative

Daca hemoculturile sunt negative la 3 zile de la incubare este recomandat examen serologic Pentru diagnosticul a infectiei cu Chlamydia psittaci, C. pneumoniae, C trachomatis, Brucella, Legionella Bartonella Mycoplasma

pneumoniae CandidaAspergillussau Coxiella burnetti.

Prelungirea timpilor de incubare, sau repicarea flacoanelor

S. aureus, E.coli, Enterobacteriile, P. Aeruginosa si Candida albicans - in 90% cazuri

Bacillus, Corynebacterium si Propionibacterium - 5% din cazuri. S

Streptococilor de grup viridans, Enterococcus si SCN

BrucellaAbiotrophia
http://staff.vbi.vt.edu/pathport/pathinfo_images/Brucella_abortus/Brucella_melitensis_colonies.JPGhttp://medecinepharmacie.univ-fcomte.fr/bacterio_web/img/phototheque/Examens%20microscopiques/CGP/Abiotrophia_defectiva_hemoc.jpg


62/67

Analiza bacteriologica a valvelor cardiace

a. Prelevatele

In pre-operator nu trebiue efectuata nici o tamponare antiseptica ale valvelor cardiace.

Valva va fi recoltata intr-un vas steril care nu contine nici un lichid si va fi transmisa laboratorului de bacteriologie.

b. Analiza la Laboratorul de Bacteriologie

- Ajunsa in laborator valva este depusa intr-un mojar steril, pe un camp steril sau intr-un vas Petri steril.

Operatorul poarta masca si lucreaza in hota.

Trebuie observate diferitele tipuri de leziuni ca perforatii, calcifieri sau vegetatii. Se face descrierea, desenul,eventual fotografierea valvei.

- Un fragment al valvei ajunge la anatomopatolog si alta la bacteriolog.

- Pe fragementul destinat anatomopatologului este recomandat realizarea a 3 amprente pe lama. Lamele sunt uscate si fixate cu etanol. Se poateefectua coloratie Gram, Zeihl-Neelsen, Giemsa sau acridin-orange. Aceste coloratii permit punerea in evidenta a majoritatii bacteriilor si amicrobacteriilor. O lama colorata cu acridin-orange poate fi secundar colorata cu o alta coloratie (Gram, Giemsa). Tesutul destinatanatomopatologului poate fi plasat intr-un fixator (formol diluat 1/10).

- Fragmentul destinat bacteriologului este dilacerat intr-un mojar cu ajutorul unui pistil sau a unui Potter in prezenta de 1ml bulion creier-cord.

- Se recomanda o coloratie Gram, insamantarea mediilor de cultura definite si congelarea la 80 de grade a restului.

- Insamantarea si durata de incubare a urmatoarelor medii:

- mediul Geloza-chocolat suplimentat Isovitalex. Se incubeaza sub 5 % CO2 10 zile. Pentru a rezista mai mult la desicare e utilizat camediu in panta intr-un tub. Imbogatirea in CO2 poate fi realizata cu ajutorul unui sistem Gaspak.

Incubarea poate fi realizata la 370C dar o a 2 a placa identica cu mediu cu geloza sange trebuie sa fie insamantata sub5% CO2, timp de 45 de zileintre 28-320C pentru a favoriza cresterea Bartonella.

- 2 medii gelozate cu 5 % sange incubate una sub O2 alta sub CO2 timp de 10 zile permite o mai buna crestere a streptococilor fatade mediile gelozate chocolat. Aportul de CO2 favorizeaza cresterea Streptococcus mutans, S. anginosus si S. constellatus.

- mediu geloza Columbia ce contine 5 % sange cultivat sub H2 timp de 10 zile pentru cresterea unor streptococi si bacterii anaerobe.

- mediul geloza BCYE suplimentat cu 10 % ser fetal bovin incubat intr-un recipient sub CO2 la 35-370 C timp de 10 zile (serul fetal

bovin favorizeaza cresterea Legionella micdadeisi L. bosemanii)- mediul Lowenstein si Middlebrook conservat 6 saptamani la 35-370 C pentru cultivarea microbacteriilor.

- un mediu lichid usor reducator imbogatit si usor gelozat favorizeaza multiplicarea in vitro a bacteriilor care la iesirea din organism aunevoie de o atmosfera redusa in oxigen si de un suport pentru multiplicare. Este propus unul din urmatoarele medii:- mediul cord-creier, gelozat1% si imbogatit 1-3% Isovitalex.

- bulion glucozat tamponat aditionat cu ficat si imbogatit 1-3% Isovitalex..

- mediu Schaedler semigelozat imbogatit cu 1-3% Isovitalex.

Aceste medii lichide sunt incubate o luna la 35-370C.

D t t d dit l i l l t i


63/67

Daca este prezenta o endocardita la nivelul protezei

- vegetatie prezenta= analiza bacteriologica descrisa anterior;

- vegetatie absenta= analiza tesutului patologic prelevat de la nivelul de desprindere al protezei. prelucrat ca si o vegetatie.

Se utilizeaza bulion glucozat si se realizeaza o coloratie Gram.

La 48 de la incubare se face o coloratie Gram si se insamanteaza pe diferite medii ca si pentru o valva nativa.

Restul fragmentelor se congeleaza la -81oC.

c.Studiul anatomopatologic al valvelor cardiace

Dupa ce analiza bacteriologica a fost efectuata tesuturile valvulare sunt fixate in formol si trimise Laboratorului de Anatomie Patologica.Pe foaia de insotire bacteriologul trebuie sa noteze aspectul leziunii, cine a prelevat proba.

c.1.Analiza macroscopica a prelevatelor

valva nativa: se noteaza dimensiunea si compozitia prelevatului (tesut valvulat, aderente), se descrie prezenta eventualelor vegetatii, ulceratii, perforatii,trombusuri

bioproteza de valva: se noteaza aspectul perforatiilor, eventuala existenta a aderentei tesutului fibros la nivelul protezei; acestea sunt prelevate pentruhistologie.

proteze mecanice: se noteaza mai ales prezenta trombilor, eventuala existenta a aderentei tesutului fibros la nivelul protezei; acestea sunt prelevatepentru histologie.

Pentru toate aceste tipuri de prelevate ar fi utila o fotografie macroscopica.

c.2.Analiza histologica

Se face pe prelevat la nivelul leziunii constatate (vegetatie, perforatie, tromb) sau incluzand in totalitate prelevatul daca este de dimensiune mica. Se fixeazain formol diluat 10x. Coloratia utilizata Hematoxilina-Eosina-Safranina (HES).

In cazul infiltratiei inflamatorii se fac coloratii suplimentare, coloratia Gram, coloratia Grocott si /sau PAS, coloratia Giemsa pentru Bartonella , coloratiaMachiavello pentru Chlanydia si Rickettsii. Pe blocurile incluse in parafina se poate face in laboratoarele specializate si studii de IF sau hibridizarea-in-situ.

c.3.Rezultatele studiului histopatologic

Endocardita este definita de infiltratia inflamatorie la nivelul valvei. Trebuie precizate intensitatea infiltratului si compozitia sa in polimorfonucleare,macrofage, limfocite.

Din formula inflamatorie se poate deduce notiunea evolutiva inflamatorie a leziunii:prezenta polimorfonuclearelor corespunde leziunilor active;

absenta polimorfonuclearelor cu prezenta macrofagelor si a fibrozei corespunde leziunilor cicatrizate.

Totusi nu exista o stricta corelatie anatomo-bacteriologica: prezenta catorva polimorfonucleare nu este intotdeauna sinonima cu persistenta bacteriilor siabsenta polimorfonuclearelor nu elimina persistenta bacteriilor intracelulare in macrofage.

Anumite lezuni pot contribui la diagnostic: focare de necroza valvulara, tromboza inflamatorie.

Caracterizarea histopatologica a bacteriilor prin utilizarea coloratiilor speciale: deseori bacteriile piogene abundente sunt vizibile sub forma de colonii mici, lacoloratia HES. In alte situatii agentii patogeni nu se pun pun in evidenta decat prin coloratii speciale. Anumite bacterii nu sunt detectate (bacteriileintracelulare), acest fapt trebuie notat caci el orienteaza catre anumite tipuri de bacterii.

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA


64/67

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA

BACTERIILOR ANAEROBE

Prelevate cu risc hemocultura lichid de punctie (pleurala, pericardica, articulara)

abces pulmonar: in masura in care prelevatul a fost realizat corect, fara contaminare buco-dentara

osteite

peritonite

abcese craniene

abcese abdominale si ginecologice

Semne evocatoare miros urat al probei

prezenta de gaz in leziune

supuratie (abces submaxilar sau cervical, pleurezii purulente, peritonite, abcese ale sferei genitale)

microbiota abundenta si polimorfa, asocieri de bacili si coci G- si G+

1. Infectii cu Clostr id iumsecretoare de toxine.

a. toxi-infectii:C tetani, C perfringens, C difficile).

b. intoxicatii (Clostridum botulinum)

2.Infectii mixte: se dezvolta in vecinatatea mucoaselor. Strict anaerobii sunt asociati cu alte bacterii,putand da complicatii, infectii la distanta.


65/67

MicrobiotavaginalaLactobacillus +++

Prevotella bivia

Prevotella pigmentees

Prevotella disiens

Peptostrptococcus ssp.

Microbiotabucala

Prevotella pigmentes

Porphyromonas sspPrevotella grup oral

Fusobacterium

nucleatum


Eubacterium spp

Actinomyces spp.

Piele

Propionibacterium acnes

+++


Microbiota intestinala

Bacterioides grup fragilis +++

Bilophila wadworthia


Clostridium spp

Bifidobacterium spp

Eubacterium spp

Anaerobi din

microbiota

normala


66/67

Supuratii

abdominale

Puroi

ginecologic

Pneumonie

ab ingestis

Abcese

pulmonare

Pleureziipurulrnte

Cap

si

gat

Tesuturi

moi

Bacterioides fragilis +++ (+) / + (+) +

Bacterioides grup fragilis ++ (+) (+) + (+) +

Prevotella bivia / +++ / 0 0

Prevotella oralis / + +++ +++ ++ +

Porphyromonas spp / + (+) (+) + ++

Fusobacterium nucleatum / + ++ +++ ++ /

Fusobacterium

necrophorum

/ / / / ++ /

Peptostreptococcus spp + ++ ++ ++ ++ ++

Actinomyces spp / ++ + ++ ++ (+)

Clostridium perfringens ++ / + / 0 +

Diagnosticul de laborator


67/67

Diagnosticul de laboratorMedii de cultura

pentru bacili G-: mediu Schaedlercu sange si cu vancomicina (7,5 mg/l) si neomicina (75mg/l) ( Bacterioides grup fragilis, Prevotella, Fusobacterium.

pentru bacteriile G+ si Porphyromonas.- geloza Columbia cu sange si feniletilalcool (4,2g/100ml)

pentru Clostr idium: TSN, geloza cu galbenus de ou si neomicina, Columbia cu sange, cicloserina, si cefoxitina pentru C difficile.

bulion anaerob repicat dupa 48-72 de ore pe geloza selectiva.

Incubare in conditii de anaerobioza

Identificarea prezumtiva-determinarea genului bacterian al majoritatii anaerobilor (suficient!!!!).

- studiul mobilitatii intre lama si lamela in contrast de faza

- coloratia Gram

- testul oxidazei si catalazei

- cresterea in prezenta de antibiotice (kanamicina, colistin, vancomicina) si inhibitori (bila, verde briliant)

- studiul fermentatiei zaharurilor: producere de indol, gelatinaza, cu ajutorul minigaleriilor-studiul caracteristicilor enzimatice cu ajutorul galeriilor de identificare rapida

Bacteriile cel mai frecvent izolate prin aceste metode simple sunt: Bacterioides fragilis, Bacterioides ureolyticus, Prevotella melanimogenica, Prevotellabivia, Fusobacterium nucleatum, F. Necrophorum, Porphyromonas gingivalis, Bilophila wadsworthia, Clostridium perfringens, C difficile,Propionibacterium acnes, Actinomyces meyeei.

Identificare definitiva

cromatografie in faza gazoasa, biologie moleculara

Sensibilitatea la antibiotice

Bacterioides grup fragilismultirezistente, secretoare de -lactamaze, altele sunt rezistente la metronidazol.

Bacterioides grup fragililis Amoxiclina, amoxicilina+acid clavulanic, cefoxitin,

cefotaxim, imipenem, clindamicina, metronidazol

Alti bacili Gram- (Prevotella, Fusobacterium) Amoxiclina, amoxicilina+acid clavulanic,

metronidazol

Coci Gram+ si bacili Gram+ nesporulati

(Propionibacterium, Actinomyces)

Penicilina, metronidazol, vancomicina, ofloxacin

(pentru Propionibacterium)

Clostridium Ampicilina, amoxicilina+acid clavulanic,

Documents

Diagnostic Carmen