Diagnosi

Terapia

Prevenzione

carrier screening, which involves identifying unaffected individuals who

carry one copy of a gene for a disease

preimplantation genetic diagnosis

prenatal diagnostic testing

newborn screening

presymptomatic testing for predicting adult-onset disorders such as

Huntington's disease

presymptomatic testing for estimating the risk of developing adult-onset

cancers and Alzheimer's disease

confirmational diagnosis of a symptomatic individual

forensic/identity testing

Identificare nuovi farmaci per la cure di specifiche malattie

Farmacogenomica

Terapia Genica

Terapia

Identificazione di mutazioni di

tumor suppressor genes

che predispongono all’insorgenza di

neoplasie

Prevenzione

Metodologie citogenetiche

Metodologie molecolari

In base al potere di risoluzione della

tecnica

• Formulare la domanda

• Utilizzare la metodica appropriata

Analisi Southern (DNA)

Analisi Northern (RNA)

Analisi Western (Proteine)

PCR (DNA)

RT-PCR (RNA)

Microarray (DNA – RNA – Proteine)

Metodologie molecolari

Estrazione DNA

• Cellule (sangue periferico – colture

cellulari)

• Tessuti (biopsie – prelievi autoptici)

• Una cellula umana diploide contiene circa 3,3x2 pg di DNA.

• 1 mL di sangue periferico umano contiene ÷6-7 x 106 globuli bianchi.

• Massimo recupero teorico di DNA: 40-50 g/mL di sangue.

• Quantità di DNA impiegata per il Southern blot: 5-10 g.

• Quantità di DNA impiegata per la PCR: 0.1 g.

Lisi della membrana plasmatica - della membrana nucleare

Purificazione della cromatina -denaturazione delle proteine

Estrazione DNA

Degradazione meccanicaUsare pipette e puntali a punta larga

Degradazione chimicaLavorare in ghiaccio

Usare i guanti

Estrazione DNA

Ottenere del DNA non degradato - di alto peso molecolare

Ottenere del DNA “puro” non contaminato da proteine o da RNA

Estrazione DNA

Controllo:

Elettroforesi in gel d’agarosio

Con marcatore di peso molecolare

Estrazione DNA

Controllo:

Lettura allo spettrofotometro

260 OD – quantificazione

Rapporto 260/280 – purezza

Rapporto ottimale

1,5 – 1,7

Estrazione DNA

Precipitazione e Risospensone

Precipitazione con 2.5 volumi di etanolo 75%

Risospensione in H2O o TE (Tris EDTA)

Estrazione RNA

• Cellule (sangue periferico – colture

cellulari)

• Tessuti (biopsie – prelievi autoptici)

Estrazione RNA

• RNA TOTALE

• mRNA

• microRNA

RNA meno stabile del DNA

Ribonucleasi più resistenti

Estrazione RNA

Evitare la degradazione chimica

Ottenere del RNA “puro” non contaminato da DNA

Estrazione RNA

Elettroforesi di RNA totale

Controllo:

Lettura allo spettrofotometro

260 OD – quantificazione

Rapporto 260/280 – purezza

Rapporto ottimale

1,8 – 2.0

Estrazione RNA

Precipitazione e Risospensone

Precipitazione con 1 volume di isopropanolo

Risospensione in H2O

Sonde Molecolari

Sequenze nucleotidiche marcate a

singolo filamento in grado di

riconoscere sequenze

complementari

• Denaturazione di una molecola di acido

nucleico a doppia elica

• Rinaturazione o ibridazione di

polinucleotidi a filamento singolo in una

molecola a doppia elica

Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolarePiccin Nuova Libraria S.p.A.

Marcatura

• Radioisotopi (32P, 3H, 35S)

• Fluorescenti (biotina-avidina)

• Chemiluminescenti (fosfatasi alcanica)

• Notevole quantità di DNA - RNA – Proteine (numero elevato di cellule da analizzare)

• Uso di sostanze radioattive

• Tempo impiegato

Limiti

Questa tecnica, utilizzando i principi della

duplicazione del DNA,

permette di ottenere in poco tempo

notevoli quantità di materiale specifico

ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il

premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction

PCR schema

• DNA bersaglio

• Primers

• Enzima

• Nucleotidi trifosfati

• Ioni Mg++

CampioneDNA bersaglio

Oligonucleotidi sintetici complementari

a sequenze fiancheggianti il tratto di

DNA da studiare 20 – 25 bpPrimers

Nucleotidi trifosfati

DNA polimerasiEnzima

Denaturazione del DNA (94°C)

Ibridazione dei primers al bersaglio(40°C – 60°C)

Sintesi del DNA(72°C)

Termociclatori

• Si può evitare l’uso di tecniche più

laboriose. Velocità di esecuzione

• Si possono analizzare campioni di

poche cellule (anche 1 cellula). Elevata

sensibilità

Vantaggi

Biopsie

Analisi prenatale e Analisi preimpianto

Tracce di infezioni virali

Malattia mimima residua

Medicina forense