Design, síntese total e superexpressão funcional do

gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma

grande lipase industrial

Amanda F. Sarmento

Nathani C. B. Denardi

Rafael L. Farinha

Disciplina: Engenharia de proteínasProf. Dr. Jesus A. Ferro

Jaboticabal

Setembro de 2013

S. BROCCA, C. SCHMIDT-DANNERT, M. LOTTI, L. ALBERGHINA and R. D. SCHMID, 1998

Design, síntese total e superexpressão funcional do

gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma

grande lipase industrial

Amanda F. Sarmento

Nathani C. B. Denardi

Rafael L. Farinha

Disciplina: Engenharia de proteínasProf. Dr. Jesus A. Ferro

Jaboticabal

Setembro de 2013

S. BROCCA, C. SCHMIDT-DANNERT, M. LOTTI, L. ALBERGHINA and R. D. SCHMID, 1998

IntroduçãoLipases

• As lipases (Triacilglicerol acil-hidrolases EC 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilglicerídeos na interface água/meio orgânico.

• In vitro são enzimas versáteis devido a sua capacidade de catalisar a hidrólise e a síntese de uma grande variedade de ésteres, ou a resolução de misturas racémicas

• De maneira geral, as lipases não requerem cofatores, atuam em ampla faixa de pH, são estáveis à altas temperaturas, que fazem com que sejam altamente aplicáveis em processos industriais (VILLENEUVE et al., 2000; HASAN, SHAH, HAMEED, 2006).

• Muitos processos tecnológicos utilizam catalisadores biológicos nas sequências de conversão química.

• As principais fontes de obtenção de lipases para aplicação industrial têm sido os microorganismos. Tanto micro-organismos eucariotos (leveduras) como procariotos (bactérias), são produtores de lipases e suas propriedades variam de acordo com a procedência.

• O uso de enzimas nas indústrias possibilita o desenvolvimento de processos tecnológicos tão eficientes quanto aos realizados pela natureza (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006) e sem causar riscos ambientais.

Introdução

• Algumas aplicações da lipase:

- Indústrias de detergentes;

- Medicamentos;

- Alimentos (panificação, queijos e chás);

- Têxteis;

- Cosméticos;

- Biodiesel;

- Tratamento de efluentes;

Introdução

Introdução

Candida rugosa

- Trata-se de uma levedura do gênero Candida sp.

- As lipases de Candida rugosa estão entre as lipases comercias mais frequentemente utilizadas na hidrólise e a síntese de uma gama de ésteres de interesse comercial (Kotting & Eibl, 1994;Vulfson, 1994).

- Na maioria das aplicações biocatalíticas preparações de enzima em bruto, obtidas com TCA (Ácido tricloroacético) do sobrenadante da cultura, são aplicadas.

- Uma alta homologia de sequência (entre 60-70%) entre vários genes de lipase que foram clonados a partir de C. rugosa.

- Diferenças na glicolisação destas lipases podem contribuir para esta heterogeneidade.

- Várias isoformas de lipase foram isoladas a partir de preparação de enzimas comerciais , sendo mostrado que o produto do gene lip1 é o constituinte principal.

- Pelo fato das isoformas poderem diferir nos seus desempenhos catalíticos e suas propriedades poderem ainda ser afetadas pelos processos de purificação, pensou-se que a clonagem e expressão do gene lip1 seria a abordagem mais adequada para produção e caracterização de lipase pura de C. rugosa.

Introdução

- C. rugosa dimórfica obedece a uma utilização de códons em que o não-canônico tripleto CUG, um códon universal para leucina, é lido com serina.

- Na maioria das espécies de Candida sp., filogeneticamente relacionados , CUG é extremamente raro, com notável exceção de C. rugosa , onde responde por cerca de 40% do total de códons de serina.

- No gene Lip1, 20 dos seus 47 resíduos de serina, incluindo a Ser209 catalítica, são codificados por tripletos CUG. Como consequência, a expressão heteróloga de Lip1 em Saccharomyces cerevisiae resulta em uma lipase inativa.

Introdução

A troca de vários , ou mesmo a maioria, códons CUG por tripletos universais de serina (UCN, AGY) é necessária para expressão em hospedeiro heterólogo.

• Neste trabalho foram investigadas duas abordagens para a expressão da proteína funcional de Lip1 :

- Mutagênese de um gene Lip1 natural e a sua expressão em S. cerevisiae;

- Síntese química enzimática do mesmo gene.

Três genes sintéticos recombinantes (slip1) foram construídos diferindo na sequência líder .

Os genes recombinantes foram expressos em S. cerevisiae e Picha pastoris.

Introdução

Introdução

Picha pastoris

- É uma espécie de levedura metilotrófica.

- Como em S. cerevisiae , a secreção pelas células requer a presença de uma sequência de sinal fundido com a proteína expressa.

- Propriedades físico-químicas e catalíticas da lipase recombinante produzidas por P. pastoris, foram comparadas com as CRLs comercias, revelando que são idênticas.

Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa

Cinco membros, pertencentes à família de multigenes de codificação para as lipases de C. rugosa.

Utilização da sequência Lip1 Melhor caracterizado;

Estrutura cristalográfica resolvida;

Codifica a principal isoforma da lipase;

Lip1 contém sequência genômica com uma única ORF de 1647 pb, o que corresponde a uma proteína de 549 resíduos com uma extensão N-terminal de 15 resíduos hidrofóbicos, que codificam um peptídeo sinal .

A proteína madura Lip1 contém 46 resíduos de Serina, 19 delas codificadas por tripletos CTG.

A primeira tentativa de superar os problemas que ocorrem na expressão heteróloga foi a substituição, por mutagênese sítio-dirigida dos códons CTG por outros códons universais para Serina.

Hierarquia dos resíduos de Ser, funcionalmente e estruturalmente mais importante a ser mutado.

Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa

Mutantes de Serina

Com base no alinhamento com outras Serinas-hidrolases e sobre a estrutura 3D da enzima são selecionadas oito Ser como alvo para mutagênese.

- Quatro genes mutantes, contendo um Nº crescente de resíduos de Ser restaurados.

Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa

Genes mutantes foram clonados no vetor pEMBLyex4, contendo a sequência de indução.

Células de leveduras recombinantes, cultivas sob condições de indução, acumulam intracelularmente produto inativo do gene Lip1 a um nível de 10-20mg/L da cultura.

Embora a análise da glicolisação de proteínas recombinantes tenha fornecido evidências de N-glicolisação, como no caso de Lip1 do tipo selvagem, sua secreção falhou sugerindo dificuldades no nível pós-transcrional.

Construção de um material sintético, com códons optimizados da lipase da C. rugosa

Expressão da lipase recombinante em P. pastoris e S. cerevisiae

nl-slip 1Gene sintético

PCR

pp-slip 1 p-slip 1

PCR

Vetores

pPICZαB pYES2pY-nl-slip1pY-pp-slip1pY-p-slip1

pPIC-nl-slip1pPIC-pp-slip1pPIC-p-slip1

P. pastoris S. cerevisiae

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris

● Pichia Pastoris e Metanol -> Fonte de Carbono

● AOX regula Metanol

● Secreção evidenciada por “anéis” nas placas de tributirina-metanol.

● pPIC-pp-slip1 e pPIC-p-slip1 -> Atividade Overnight

● pPIC-NL-slip1 ->Atividade (48h-72h)

● pPICZ-alfa-B -> Sem atividade

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris

● Seleção dos melhores clones através da formação de anéis.● Cultivo– Metanol 20mL (Fonte de Carbono)– Indução: 48h

● Palmitato de p-nitrofenil -> Sobrenadante (Multiplas Inserções Genômicas)

● Cultivo – BMMY 200 ml (Meio Rico Padrão)– Indução: 5dias

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris

● Atividade da Lipase:

– pPIC-p-slip1– pPIC-pp-slip1

● SDS-PAGE

– Única Banda de 60 Kda– Peso molecular já era esperado para a Lip1– Nenhuma outra proteína foi secretada pela P.Pastoris

85 U/ml

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris

● Outros testes executados– Western-Blott– Sequênciamento Amino-Terminal

• Acúmulo de Lipase recombinante no meio Intracelular -> Seq. Pré-Pro Sinalizadora do Fator Alfa (pPIC-pp-slip1) -> Apenas Expressão

● Não houve acúmulo -> Seq. Sinalizadora Natural -> Apenas Secreção

● Seq. Líder sinaliza a secreção na P.pastoris, evitando o acúmulo.

• Seq. Pré-Sinalizadora do Fator Alfa (pPIC-p-slip1) -> Secreção E expressão

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris

• Clone pPIC-pp-slip1 com o maior nível de secreção de lipase● Fermentação com Biorreator● BMMY● pH 6● 208h

• Para melhorar ainda...● Fermentação Celular de Alta Densidade● 280h

125 U/ml

150 U/ml

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris

• Produtividade de 500-600 U/L por hora.

– Lipase Nativa na C.rugosa

– Ácido Oleico X Metanol (Fonte de Carbono_

– Produção de 250 U/L por hora.

– P.pastoris com lip1 tem o dobro da produtividade

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae

● Transformantes obtidos por vetores:– pY-nl-slip1– pY-pp-lip1– pY-p-slip1

● Atividade lipásica– Placas de Tributirina-Galactose– Indução: 24h– 30ºC

● Transformante obtido por vetor:– Pyes2 -> Não teve atividade

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae

● Os melhores clones foram cultivados:

– Erlenmeyes 2-L

– 200mL meio de Glicose Mínimo

– Até atingir Densidade Óptica 600

– 5 dias de indução -> Meio mínimo Galactose

Atividade dos sobrenadantes: 5-7U/mL

(vetores pY-pp-slip1, pY-p-slip1, pY-nl-slip1)

– 12-17x menos efetivo que na P.pastoris em cultivo de pequena escala

Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae

● Para o gene natural e modificado -> Completa falha em relação a lipase

– Sem Acúmulo

– Sem Secreção

Caracterização da Lipase Recombinante● Elétroforese de poliacrilamida do plasmídio pPIC-p-slip1 da P.pastoris -> Única banda

de 60 kDA.

– Lip1 Nativa e suas Isoformas

● A sequencia de aminoacidos da Lip1 contem três sítios potenciais de N-glicosilação nas posições 291, 314 e 351

● Após a Deglicosilação:

– Perda de 3kDa -> 5% do peso eram carboídratos

– Nas Lipases não recombinantes, o peso é de cerca de 3,6-8% de carboídratos

● Realizada antes e depois da Desnaturação

– Peso molecular igual

Caracterização da Lipase Recombinante

● C.rugosa comercial – Lip1 ativa em 30-40ºC– pH 7 (Efetividade reduzida em 60% se elevado a pH

8)– Dois pI pouco diferentes (3,9 e 4)

Caracterização da Lipase Recombinante

● Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa

– Triglicerideos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl

– Atividade Lipolítica Alta● Tricaproina (C8)● Tricaprina (C10)

– Atividade Lipolítica Baixa● Trioleina (C18)

– Atividade HIDROlítica Alta● Mantega de Cacau(C16-18)

Caracterização da Lipase Recombinante

● Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa– Ésteres Metílicos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl

(C6-C22)

– Após a atividade da lipase, os acidos graxos foram quantificados por Cromatografia em Gás

– Atividade Lipolítica Alta● C8 - C10

– Atividade Lipolítica NULA● C18 – C22

Caracterização da Lipase Recombinante

● Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa– Ésteres Metílicos com variação em tamanho de cadeias de grupos

acyl(C6-C22)

– Após a atividade da lipase, os acidos graxos foram quantificados por Cromatografia em Gás

– Atividade Lipolítica Alta● C8 - C10

– Atividade Lipolítica NULA● C18 – C22

Caracterização da Lipase Recombinante

● Propriedades físíco-quimicas e catalíticas da Lip1 e CRL coincidem

● Lip1 em P.pastoris -> Mais funcionalmente Ativa

Protocolo Experimental

Cepas, plasmídeos e meios

● E. coli: DH5a

● Plasmídeos: pUC19 e PCYTEXP1

● PEMBLyex4

● pYES (Invitrogen)

● pPICZαB (Invitrogen)

hospedeiropara amplificação

do plasmídeo

P. pastorisGS115(Invitrogen)

S. cerevisiae INVSC2 (Invitrogen)S. cerevisae X4004.3A

Expressão da lipase recombinante

clonagem

expressão

Cepas, plasmídeos e meios

● P. pastoris cultivada em frasco de agitação a 30ºC

Meio rico padrão

● S. cerevisiae cultivada a 30ºC

0,67% (w/v) do meio mínimo: Base Nitrogenada de levedura(YNB)

+ aminoácido apropriado de 50mg/mL e 2% glicose ou 2%

galactose como fonte de carbono

cultivada a 37ºCMeio LB (Luria-Bertani)

100ug/mL de ampicilina ou25 ug/mL de zeocina

seleçãodos clones

transformados

1% de glicerol (BMGY) ou0,5 de metanol (BMMY)

E. coli

indução

PUC19pCYTEXP1

pPICZαB

Cepas, plasmídeos e meios

● Para manter as culturas de leveduras foi usado o meio YEPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 2% de dextrose)

● Para selecionar os transformantes de P. pastoris foram utilizadas placas contendo zeocina (100mg/mL) e meio YEPS (YEP + 2% de sorbitol)

Design do gene, síntese do cassete e montagem do códon do gene otimizado

● Gene foi dividido em 4 fragmentos de ca. 400pb cada clonados separadamente

● 4 subcontruções resultantes:

● Após remoção de mutações indesejáveis

Cassete I

Cassete II

Cassete III

Cassete IV

4 oligonucleotídeos

6 oligonucleotídeos

Cada cassete foi sintetizado em uma etapa

Vetor de clonagem pUC19

pUC-I pUC-II

pUC-III pUC-IV

digerido com Smal

corte abrupto

clonados em pUC19

Design do gene sintético

Cassete I Cassetes II a IV

4 oligonucleotídeos 6 oligonucleotídeo

gene Lip1

Construção dos vetores de expressão Lip1● Gene sintético Lip1 (slip) foi subclonado

● passo intermediário para a fusão:

● Fragmento BamHI de pUC(I-IV) estava ligado em um vetor linear de BamHI → pCYTEXPI, originando pCY-slip1

vetor pCYTEXP1

sequência líderdo fatorα deS. cerevisiaegene

BamHIvetor

pCYTEXPIpCY-slip1

Construção de vetores de expressão de Lip1

Sequência que codifica a lipaseSequência do fator alfa

presente no vetor de expressãode P. pastoris (pPICZαB)

primer complementara sequência pPICZαB

PCR

O produto obtido da PCR foi clonado em SphI/blunt linearizado com pCYTEXPI, resultando em pCY-prepo-fator-α

O fragmento BglI de pCY-slip1, contendo toda a forma madura do gene sintético da lipase, foi inserido no plasmídeo digerido (pCyprepo-fator-α), restaurando assim o gene de resistência a ampicilina

O plasmídeo obtido (pCYpp-slip1), contendo o gene sintético da lipase madura, fundiu a sequência líder prepo-fator-α, foi digerido (BamHI/bluntHindIII), e o fragmento resultante foi ligado dentro de pPICZαB linearizado com XbaI/blunt-HindIII, gerando pPIC-pp-slip1.

pCY-pp-fator-α

Sequência que codifica a lipaseSequência que codifica a lipase

contém os fragmentos: SphI, BglI + gene sintétido da lipase

Sequência líderprepo-fator--α

fragmento resultante ligado em pPICZαB

contém os fragmentos: SphI, BglI + gene sintétido da lipase

pPIC-pp-slip1

linearizado com XbaI/blunt-HindIII

Construção de vetores de expressão de Lip1

● Como vetor de expressão em células de S. cerevisiae, foi usado um vetor contendo um promotor forte de indução da galactose (GALI-GALIO).

● pPIC-nl-slip1 foi digerido com BamHI e ligado a pYES2 com a mesma enzima, e desfosforilado, originando PY-nl-slip1.

● PY-nl-slip1 foi utilizado para clonagem no vetor pYES2 do gene sintético da lipase, procedido pelas sequências prepo-sinal fator alfa e pre-sinal.

● Os fragmentos HindIII-BsteII contendo os genes recombinantes foram isolados a partir de pPIC-pp-slip1 e pPIC-p-slip1, e inseridos em pYES2, digerido com a mesma enzima. Os plasmídeos obtidos foram chamados de pY-pp-slip1 e pY-p-slip1, respectivamente.

Expressão de Lip1 em:

P. pastoris

S. cerevisiae

Expressão de Lip1 em P. pastoris● Cepa: GS115

● Transformadas com o vetor pPIC-pp-slip1 por eletroporação

● Transformantes → plaqueamento em meio seletivo sólido (YEPD) contendo zeocina

● Clones produtores de lipase → halo claro

● Todos os transformantes obtidos com pPIC-pp-slip1 exibiram atividade lipásica após incubação 'overnight'

verificação da atividade da lipase

transferência das colônias para placas de tributirina-metanol

● incubadas a 30ºC● 48h● 0,1mL de metanol → adicionado a cada 24h em cada tampa

detecção de microorg.lipolíticos

células de Pichia transformadas com pPICαB nunca formaram halos

Expressão de Lip1 em S. cerevisiae● Células de S. cerevisiae Invsc2

● Transformadas com pY-nl-slip1, pY-pp-slip1 e pYpreLIP por eletroporação

● Transformantes foram plaqueados em meio mínimo sólido contendo tributirina e galactose

selecionados com base na capacidade de crescimento na ausência de leucina

selecionados pela produção e secreção de lipase

halos transparentes na placa contendo tributirina

Fermentações

● Realizada em um biorreator 1-L a 30ºC em meio padrão rico BMMY

● Fermentação com alta densidade de células

● Biorreatores: inoculados com 50mL da cultura de balão crescida 'overnight', com uma DO600=2-3 no meio BMGY mantida em pH constante

● Monitoramento: atividade lipolítica dos sobrenadantes, peso úmido das células

adição de HCl 2M,NaOH 2M

pH 6,0

pH 7,0

adição de metanolapós a cultura alcançar

75mg/mL de peso úmido

adição de 5mL de metanoldiariamente

Caracterização físico-química e catalítica● Realizada diretamente com o sobrenadante da cultura, sem qualquer tipo de purificação

Atividade da lipasemedido rotineiramente com tributirina como substrato

em um ensaio de pH-stat a 30ºC e pH 7,2

utilizou-se como substrato:● 20mM de triglicérides● 5% (w/v) de manteiga de cacau emulsificado em água destilada contendo goma arábica (20mg/mL) e usada como uma solução de substrato no ensaio de pH-stat a 30ºC e pH 7,2

sobrenadante da cultura de pequena escala:ensaio com espectrotofômetro usando

p-nitrofenil palmitato como substrato a 30ºC

Atividade da lipase

Especificidade do substrato

Atividade da lipaseAtividade da lipase

Caracterização físico-química e catalítica● Emulsão triesterarina obtida pela adição de 5% de acetona (v/v)

● Retirou-se 2mL da mistura de reação, parando a reação lipolítica pela adição de 0,1mL de ácido ortofosfórico

● Foi extraído 3 vezes ácidos graxos livres com dietileter-n-hexano (1:1) e 50uL do extrato de ácidos graxos, que secou-se sob nitrogênio.

nessas condições as lipases retêm 47% de sua plena atividade em tributirina

Especificidade do substrato

Substrato: esteres metílicos de ácido graxoPreparou-se: 110mM da mistura dos esteres metílicos

de ácido graxo e 5mM Tris-tampão com pH 7,5

10mM de cada éster

Lipólise pH-stat a 30ºC e pH 7,2,até a titulação de 6,6mM de ácidos graxos livres

Características físico-química e catalítica

● Os 3 ácidos graxos livres foram derivados para os silil éteres pela adição de 50uL de MSHFBA(N-metil-N-trimetil-hepta-fluorbutirâmido) e incubação a temperatura ambiente por 15 min

● Determinou-se pela cromatografia gasosa após uma nova adição de 50uL de etanol e 200uL de n-hexano (cromatografia gasosa: Fison 800), temperatura de 40ºC por 2 min, 4ºC por 1 min, 250ºC por 15 min, injetor a 350ºC, detector de ionização de chama a 360ºC a 75kPa

Caracterização físico-química e catalítica

Efeito do pH

Efeito da temperatura

Determinado a 30ºC e pH 7,2

Determinado em diversas temperaturas

Atividade da enzima●Após a incubação das alíquotas da solução de lipase por :

●20h a 30ºC em 0,1M de tampão de fosfato em diferentes pHs●30 min em 25 mM tampão Tris em pH 7,5 a diferentes temp

Métodos analíticos

Análise da sequênciaN-terminal

sequenciador de fase gasosa 470A (Applied Biosystems)

Sobrenadante quecontinha a lipase

SDS-PAGE

Após 'blotting' em uma membrana PVDF, a banda da lipase foi cortada

e utilizada para determinação da sequência N-terminal

ImmunoblotUtilizando anticorpos policlonais

específicospara a lipase homóloga

de Geotrichum candidum

Métodos analíticos

relizada com endo-B-N-acetilglicosamindase H por 12h a 37ºC em um tampão de acetato de potássio de 50mM com pH 5,5 contendo 0,5mM de PMSF

a proteína foi primeiramente incubada a 95ºC por 3 min com 0,1% (m/v) de SDS, e a reação foi realizada por 24h

Deglicosilação das amostras

Deglicosilação das amostrasdesnaturadas

enzima

inibidor de proteases

Obrigado!