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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
NICAELLEN ROBERTA DA SILVA SOUZA
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS EM
CAFÉ TORRADO
DEVELOPMENT OF METHOD FOR EVALUATION OF
PESTICIDES RESIDUES IN ROASTED COFFEE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
NICAELLEN ROBERTA DA SILVA SOUZA
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA
AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS EM
CAFÉ TORRADO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química,
da Universidade Federal de Sergipe, para a
obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene
DEVELOPMENT OF METHOD FOR EVALUATION OF
PESTICIDES RESIDUES IN ROASTED COFFEE
Master Dissertation presented to the
Graduate Program in Chemistry of the
Federal University of Sergipe to obtain
MSc. in Chemistry.
RESUMO
A agricultura é uma das principais atividades econômicas do Brasil, possuindo a cultura
do café como sua principal commodity primária. A fim de atingir altos níveis de
produção e evitar a perda das safras, insumos agrícolas como os agrotóxicos são
utilizados em grandes quantidades. Este tipo de prática e o aumento da preocupação do
público consumidor estão motivando investigações científicas a respeito destes tópicos,
com o intuito de garantir a segurança alimentar dos produtos fornecidos para o
consumo. No entanto, a literatura não relata metodologias para a determinação de
resíduos de agrotóxicos no café torrado, com os métodos de extração e análise
propostos, que segundo dados bibliográficos apresentam resíduos destas substâncias
mesmo após a torrefação. Neste contexto, o presente trabalho buscou desenvolver uma
metodologia analítica para determinar carbofurano, cipermetrina, clorpirifós,
clotianidina, dissulfotom, endosulfan, espirodiclofeno, haloxifope, imidacloprido,
tebuconazol, triadimefom e triadimenol em café torrado empregando método de
extração sólido líquido por sonicação com etapa de clean-up por meio de extração
líquido líquido (LLE) e análise instrumental por cromatografia líquida de ultra eficiência
acoplada a detector por espectrometria de massas (LC-MS/MS). Para tanto, a otimização
das condições cromatográficas e a avaliação do melhor método de clean-up foram
realizadas. Com isso, as condições de melhor resposta quantitativa foi obtida com 0,5 g
de café torrado, 5 mL de solvente de extração por sonicação, 1 mL de água e 1 mL de
diclorometano na etapa de clean-up por LLE. Durante o procedimento de validação no
LC-MS/MS foi observado efeito matriz positivo para todos os analitos com exceção da
cipermetrina na qual houve supressão do sinal pela matriz, ocasionando, com base na
curva preparada no extrato, recuperações entre 74,2% - 102,4%, com desvio padrão
relativo entre 0,6% e 10,2%, nos níveis de concentração avaliados no processo, além
disso, a linearidade obtida foi na faixa de 0,9979 a 0,9998 para os agrotóxicos,
carbofurano, clotianidina dissulfotom, imidacloprido, tebuconazol, triadimefom e
triadimenol, garantindo a eficiência da metodologia.
Palavras-chave: café torrado; Coffea arabica; agrotóxicos; pesticidas; sonicação;
ultrassom; LLE; HPLC/ UV-DAD; UPLC/ UV-DAD; LC-MS/MS.
ABSTRACT
Agriculture is one of the main economic activities of the Brazil, possessing the culture
of coffee as their main primary commodity. In order to achieve high levels of production
and prevent the loss of crops, farm inputs such as pesticides are used in large
quantities. This type of practice and the increased public concern consumer are
motivating scientific research about these topics, with the aim of ensuring food safety of
products supplied for consumption. However, the literature does not report
methodologies for the determination of pesticide residues in roasted coffee, with the
methods of extraction and analysis proposed, which according to bibliographic data
present residues of these substances even after roasting. In this context, the present
study sought to develop an analytical methodology to determine carbofuran,
cypermethrin, chlorpyrifos, clothianidin, disulfoton, endosulfan, spirodiclofen,
haloxyfop, imidacloprid, tebuconazole, triadimenol and triadimefom in roasted coffee
using solid liquid extraction method by sonication with clean-up step through liquid
liquid extraction (LLE) and instrumental analysis for ultra performance liquid
chromatography tandem mass spectrometry detector (LC-MS/MS). For both, the
optimization of chromatographic conditions and assessing the best method of clean-up
was carried out. With that, the conditions for better quantitative response was obtained
with 0.5 g of roasted coffee, 5 mL extraction solvent by sonication, 1 mL of water and 1
mL of dichloromethane in the clean-up by LLE. During the validation procedure in LC-
MS/MS positive matrix effect was observed for all analytes except of cypermethrin in
which there was suppression of the signal by array, causing, prepared in the curve-
based extract, recoveries between 74.2%-102.4% standard relative deviation (SRD)
between 0.6% and 10.2%, in levels concentration assessed in the process, Furthermore,
the linearity obtained was in the range of 0.9979 to 0.9998 for pesticides , carbofuran,
disulfoton, imidacloprid, clothianidin tebuconazole, triadimenol, triadimefom and
ensuring the efficiency of the methodology.
Keywords: Sonication, pesticides, roasted coffee, Coffea arabica, LLE; HPLC/ UV-
DAD; UPLC/ UV-DAD; LC-MS/MS.
Aos meus pais Mª Quitéria e Natalício,
meus tios e minha irmã Natalilian, dedico
este trabalho.
O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas
admiráveis.
(José de Alencar)
AGRADECIMENTOS
A Deus pela força e dom da vida.
A minha família, principalmente meus pais Natalício e Quitéria e minha irmã Natalilian
pelo apoio e paciência.
Ao meu orientador Prof. Dr. Sandro Navickiene pelos anos de orientação, me
concedendo a oportunidade de adquirir conhecimento e experiência nas áreas de
Química Analítica e Cromatografia.
Aos amigos integrantes do LCP (antigos e novos) que também colaboraram com o
desenvolvimento deste trabalho, em especial aos pertencentes ao grupo do Prof. Dr.
Sandro, Fabricio, Mônica, Ruyanne, Danilo e Édica. Aos amigos do LEMON,
principalmente, Bruno, Tassya, Jany Hellen, que também contribuíram com trocas de
ideias e experiência.
Aos amigos da pós-graduação.
Aos meus amigos da vida, que estão sempre presentes, independente de qualquer coisa.
Aos professores do DQI/UFS pela minha formação acadêmica.
A comissão examinadora por aceitar participar da minha defesa.
A Universidade Federal de Sergipe, ao Departamento de Química e ao Programa de
Pós-Graduação em Química.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
Enfim, gostaria de agradecer a todos que contribuíram de alguma maneira e que não
foram aqui mencionados.
Obrigada a todos!
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Maiores exportadores mundiais de café. Fonte: Maps of World (2011)
[7] .................................................................................................................. 21
Figura 2 - Gráfico da composição do café em diferentes condições. Fonte:
Oestreich-Janzen, 2010 [15]. ....................................................................... 23
Figura 3 - Principais pragas do cafezal (a) broca-do-café, Hypothenemus hampei
e (b) Bicho-mineiro, Leucoptera coffeella. Fonte: Souza et.al, 2011
[23]. .............................................................................................................. 25
Figura 4 - Outras pragas do cafezal: (a) Ácaro vermelho Tetranychus evansi; (b)
Lagarta dos cafezais, Eacles imperialis magnifica. Fonte: Mesquita. ........ 25
Figura 5 - Processo de cavitação. Fonte: SEIDI e YAMINI (2012) [51]. .................... 38
Figura 6 - Mecanismo de extração/lixiviação por sonicação (a) na ausência e (b)
na presença das ondas ultrassônicas. Fonte: CASTRO e CAPOTE
(2007) [50]. .................................................................................................. 40
Figura 7 - Esquema básico de um sistema de cromatografia líquida com detector
espectrofotométrico e espectrometria de massas. Fonte: Baseado em
NAUSHAD e KHAN, 2014; MEYER, 2010 e SNYDER et al., 2010
[54,56,57]. .................................................................................................... 41
Figura 8 - Fluxograma utilizado para preparar as soluções de trabalho dos
agrotóxicos em estudo seguido da elaboração das soluções analisadas
para a obtenção das curvas analíticas. ......................................................... 46
Figura 9 - Café torrado moído e homogeneizado. ......................................................... 50
Figura 10 - Procedimento de extração da amostra de café torrado. .............................. 51
Figura 11 - Cromatograma da análise exploratória dos analitos em estudo no
SISTEMA 1 (HPLC-DAD) .......................................................................... 53
Figura 12 - Espectros de absorção indicando o comprimento de onda de máxima
absorção avaliados no SISTEMA 1. ............................................................ 55
Figura 13 - Cromatogramas dos extratos por sonicação utilizando ACN (preto) e
DCM (vermelho) como solvente extrator. ................................................... 57
Figura 14 - Cromatogramas da Proposta 1 de clean-up, em vermelho o primeira
fração e em preto o interferente retido seguindo as condições da
Tabela 7 no SISTEMA 1. ............................................................................ 58
Figura 15 - Cromatogramas do método da Proposta 2, em vermelho o extrato e
em preto o branco do adsorvente seguindo as condições da Tabela 7
no SISTEMA 1. ........................................................................................... 59
Figura 16 - Sobreposição dos cromatogramas da Proposta 2 com adsorvente C18
em vermelho e com a sílica em preto seguindo as condições da Tabela
7 no SISTEMA 1. ........................................................................................ 59
Figura 17 - Cromatogramas com a comparação dos extratos oriundo da Proposta
2 com o adsorvente C18 por sonicação na cor preta e por agitação na
cor vermelha seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ............. 60
Figura 18 - Cromatogramas da análise do extrato fortificado por sonicação
utilizando a sílica (preto) e da solução conjunta dos agrotóxicos
seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1. ................................... 60
Figura 19 - Cromatogramas da análise da influência do solvente extrator
Diclorometano no método de extração, sendo o volume de 1 mL em
vermelho, 2 mL em preto e 3 mL em azul e a solução de comparação
dos agrotóxicos em verde, utilizando o SISTEMA 1 e condições
descritas na Tabela 7. ................................................................................... 62
Figura 20 - Cromatogramas das análises das amostras contaminadas utilizando a
metodologia de extração da Proposta 3 e o SISTEMA 1 de análise nas
condições da Tabela 7. Em vermelho, preto e azul constam os extratos
com diferentes volumes de Diclorometano e em verde a solução
conjunta dos agrotóxicos. ............................................................................ 62
Figura 21 - Cromatograma da análise exploratória dos agrotóxicos estudados a
partir de uma solução conjunta em 25 ug mL-1
, utilizando a fase
estacionária composta por C18 e um fluxo de 0,6 mL min-1
. ....................... 63
Figura 22 - Espectros de absorção em detector UV/Vis com arranjo de fotodiodos
dos agrotóxicos em estudo. Em vermelho a varredura dada pelo
SISTEMA 2, em preto para o SISTEMA 1. ................................................ 64
Figura 23 - Comparação de diferentes fluxos por meio de solução padrão dos
agrotóxicos em 25 µg mL-1
. O primeiro cromatograma corresponde ao
fluxo de 0,3 mL min-1
, o segundo de 0,6 mL min-1
e o terceiro de 0,7
mL min-1
utilizando gradiente de eluição em análise exploratória na
coluna BEH C18. .......................................................................................... 67
Figura 24 - Esquema da estrutura das fases estacionárias testadas no trabalho.
Fonte: (WATERS) [65] ............................................................................... 68
Figura 25 - Comparação do perfil dos picos nos cromatogramas obtidos da
análise da solução conjunta dos agrotóxicos em 25 µg mL-1
com as
diferentes fases estacionárias, o primeiro cromatograma corresponde à
coluna BEH C18, o segundo corresponde à resposta da coluna CSH
Phenyl-Hexyl e o último gráfico à HSS CN em gradiente de eluição
em análise exploratória com vazão de 0,6 mL min-1
. .................................. 69
Figura 26 - Cromatogramas da solução conjunta dos analitos em 10µg mL-1
comparando diferentes gradientes presentes na Tabela 9 utilizados
para a otimização do programa de eluição dos analitos, utilizando a
coluna CSH Phenyl-Hexyl, vazão de 0,6 mL min-1
e volume de
injeção de 10 µL. ......................................................................................... 70
Figura 27 - Cromatogramas das análises da solução conjunta dos agrotóxicos
com concentração de 10µg mL-1
para a otimização do tempo de
equilíbrio, onde (a) 2,62 minutos, (b) 5,00 minutos, (c) 6,60 minutos e
(d) 10 minutos. ............................................................................................. 73
Figura 28 - Otimização do volume de injeção, teste envolvendo a redução de 10
(preto) para 5 µL (vermelho) com o gradiente do tópico III da seção
4.2.1 e tempo de equilíbrio do tópico IV da seção 4.2.1 utilizando a
solução conjunta dos analitos. ..................................................................... 74
Figura 29 - Otimização do volume de injeção, análises com volumes de 2,5 a 0,5
µL nas condições estabelecidas anteriormente presentes na Tabela 7 e
Tabela 8. ...................................................................................................... 75
Figura 30 - Cromatogramas das fases (a) ACN: H2O e (b) ACN: DCM obtidas
pela metodologia de extração da Proposta 3 da seção 4.1.2.1 seguindo
as condições cromatográficas do SISTEMA 2 presentes na Tabela 7......... 76
Figura 31 - Cromatogramas da extração por sonicação e clean-up por LLE
(Proposta 3), em verde - amostra testemunha, vermelho - fortificado,
marrom - solução de comparação e em preto - solução dos padrões,
obtidos pelas condições otimizadas da Tabela 7 no SISTEMA 2. .............. 76
Figura 32 - Gráfico com valores de recuperação no nível de 2μg mL-1
(n = 2). ............ 77
Figura 33 - Gráfico com os valores de intensidades obtidos pelo teste de
degradação dos agrotóxicos. ........................................................................ 78
Figura 34 - Cromatogramas obtido com a sonicação utilizando acetonitrila e
diclorometano como solventes extratores. Seguindo as condições
cromatográficas da Tabela 7 para o SISTEMA 2, onde o
cromatograma em preto corresponde ao extrato com diclorometano,
em vermelho com Acetonitrila, em verde, o Branco da amostra e em
azul, a Solução Conjunta dos Agrotóxicos em 10µg mL-1
. ......................... 79
Figura 35 - Dados de recuperação utilizando acetonitrila e diclorometano como
solvente extrator na sonicação (n = 2). Intensidade utilizadas foram
obtidas através das condições cromatográficas da Tabela 7 ........................ 79
Figura 36 - Cromatogramas referentes à otimização do solvente de clean-up,
onde (a) Acetato de Etila, (b) Clorofórmio e (c) Diclorometano. No
cromatograma em vermelho a resposta equivalente ao Branco, em
preto ao Fortificado e em azul a Solução de Comparação, todas as
análises de acordo com as condições da Tabela 7. ...................................... 81
Figura 37 - Valores de recuperação obtidos através das análises cromatográficas
(n = 2) segundo a Tabela 7, evidenciando os solventes de clean-up
utilizados na otimização do método. ........................................................... 82
Figura 38 - Dados de recuperação do teste realizado para verificar a influência da
ordem dos solventes utilizados no clean-up, separados com as
condições cromatográficas da Tabela 7. ...................................................... 83
Figura 39 - Fragmentos utilizados para a quantificação e confirmação dos dados
quantitativos das amostras analisadas no SISITEMA 3 segundo as
condições da Tabela 7. ................................................................................. 84
Figura 40 - Cromatograma dos íons de quantificação dos agrotóxicos avaliados
utilizando as condições cromatográficas descritas nas Tabelas 7 e 8. ......... 88
Figura 41 - Cromatograma da análise do extrato fortificado na concentração de
0,1 mg mL-1
com detector espectrofotométrico em 220 nm, seguindo
as condições de análise descritas nas Tabelas 7 e 8..................................... 88
Figura 42 - Representação gráfica dos valores de recuperação dos agrotóxicos
com seus respectivos desvios padrão presentes na Tabela 15 para os
quatro níveis de concentração avaliados...................................................... 96
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição do café arábica torrado. Fonte: [10] ......................................... 21
Tabela 2 - Classificação dos agrotóxicos selecionados para o trabalho quanto ao
grupo químico, ao modo de ação, à classe toxicológica e fórmula
estrutural. Fonte: Agência de Vigilância Sanitária [25]. .............................. 27
Tabela 3 - Limites máximos de resíduos para os agrotóxicos selecionados na
cultura do café. Fonte: [26,25] ..................................................................... 30
Tabela 4 - Modo de aplicação dos agrotóxicos e produtos comerciais utilizados na
cafeicultura. Fonte: [28] ............................................................................... 31
Tabela 5 - Características físico-químicas dos agrotóxicos em estudo. Fonte:
[32,33,34,35]. ................................................................................................ 32
Tabela 6 - Alguns trabalhos com técnicas de extração combinadas e amostras
sólidas. .......................................................................................................... 37
Tabela 7 - Condições de análise nos sistemas cromatográficos utilizados. .................... 48
Tabela 8 - Gradientes de eluição para cada sistema cromatográfico utilizado. .............. 49
Tabela 9 - Composições dos gradientes de eluição dos cromatogramas
apresentados na Figura 26. ........................................................................... 71
Tabela 10 - Parâmetros otimizados no SISTEMA 3 (UPLC-MS/MS) .......................... 87
Tabela 11 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos
agrotóxicos em um intervalo linear de 0,01 a 10 μg mL-1
. Obtidos
através dos valores de intensidade fornecidos pela análise
cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA 2 (n =
3). .................................................................................................................. 89
Tabela 12 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos
agrotóxicos em um intervalo linear de 0,01 a 1,0 mg L-1
. Obtidos
através dos valores de intensidade fornecidos pela análise
cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA 3 (n =
3). .................................................................................................................. 90
Tabela 13 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos
agrotóxicos preparados no extrato da matriz em um intervalo linear de
0,01 a 1,0 mg L-1
. Dados obtidos através dos valores de intensidade
fornecidos pela análise cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela
8 no SISTEMA 3. ......................................................................................... 92
Tabela 14 - Valores das razoes dos coeficientes angulares das curvas analíticas
preparadas no extrato da matriz e no solvente. ............................................. 92
Tabela 15 - Valores de desvio padrão e coeficiente de variação dos agrotóxicos
estudados....................................................................................................... 94
Tabela 16 - Valores do limite de detecção dos agrotóxicos de trabalho. ....................... 97
LISTA DE ABREVIATURAS
ACN - Acetonitrila
AGROFIT - Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários
ANVISA - Agência de Vigilância Sanitária.
CBN - Carbofurano
CIP - Cipermetrina
CLF - Clorpirifós
CTD - Clotianidina
DCM - Diclorometano
DDD - Diclorodifenildicloroetano
DIS – Dissulfotom
END - Endosulfan
EPA - Agência de Proteção Ambiental
ESI - Electrospray Ionization (Ionização por Eletronebulização)
ESP - Espirodiclofeno
GC-MS - Gas Chromatography Mass Spectrometry (Cromatografia Gasosa/
Espectrometria de Massas)
GC-MS (NCI-SIM) - Gas Chromatography-Negative Chemical Ionization Mass
Spectrometry In Selective Ion Monitoring Mode (Cromatografia Gasosa/ Espectrometria
de Massas com Ionização Química Negativa no Modo De Monitoramento de Íon
Seletivo)
GPC - Gel Permeation Chromatography (Cromatografia com Permeação em Gel)
HLX - Haloxifope
HPLC - High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência)
HPLC-UV/Vis - High Performance Liquid Chromatography coupled with detector
UV/Vis (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector no
Ultravioleta/Visível)
ICC - International Coffee Corporation (Coorporação Internacional do Café)
IL-UMAE - Ionic Liquids Based Simultaneous Ultrasonic and Microwave Assisted
Extraction (Extração Assistida por Ultrassom e Microondas Simultaneamente com
Líquidos Iônicos)
IMD - Imidacloprido
LC-MS/MS - Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (Cromatografia
Líquida acoplada à Espectrometria de Massas/Massas)
LLE - Liquid- Liquid Extraction (Extração Líquido-Líquido)
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MMA - Ministério do Meio Ambiente.
MSPD - Matrix Solid Phase Dispersion (Dispersão de Matriz em Fase Sólida)
PLE - Pressurized Liquid Extraction (Extração com Líquido Pressurizado)
QuEChERS - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe
SE – Solid Extraction (Extração de Matriz Sólida)
SPE - Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida)
TBC - Tebuconazol
TDF - Triadimefom
TDN - Triadimenol
TQD - Triple Quadrupole Detector (Detector Triplo Quadrupolo)
UMAE - Ultrasonic and Microwave Assisted Extraction (Extração Assistida por
Microondas e Ultrassom)
UPLC - Ultra Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Ultra
Eficiência)
USASFE - Ultrasound assisted supercritical fluid extraction (Extração com fluido
supercrítico assistida por ultrassom)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 20
1.1 CAFÉ (COFFEA ARABICA E COFFEA CANEPHORA) ................................................. 20
1.2 AGROTÓXICOS NA CAFEICULTURA .......................................................... 24
1.2.1 Agrotóxicos Envolvidos neste Trabalho ..................................................... 30
1.3 MÉTODO DE EXTRAÇÃO ............................................................................... 35
1.3.1 Método de Extração Sólido Líquido por Sonicação ................................... 38
1.4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ........................................................................ 40
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 44
2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................... 44
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................. 44
3. METODOLOGIA ................................................................................................. 45
3.1 REAGENTES ..................................................................................................... 45
3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ................................................................... 45
3.3 PADRÕES DOS AGROTÓXICOS E SOLUÇÕES ............................................. 45
3.4 SELEÇÃO DOS AGROTÓXICOS EM ESTUDO ............................................. 47
3.5 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS DE ANÁLISE ..................................... 47
3.6 OBTENÇÃO E ACONDICIONAMENTO DA AMOSTRA DE CAFÉ
TORRADO ......................................................................................................... 50
3.7 METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO .................................................................. 50
3.7.1 Fortificação das Amostras Para a Extração .............................................. 50
3.7.2 Procedimento de Clean-up ......................................................................... 50
3.8 LIMPEZA DOS MATERIAIS ............................................................................ 51
3.9 DESCARTE DE RESÍDUOS DOS REAGENTES ............................................ 52
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 53
4.1 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 1 (HPLC-DAD) ........................................... 53
4.1.1 Otimização das Condições de Análise ....................................................... 53
4.1.1.1 Seleção dos comprimentos de onda de máxima absorção .................. 54
4.1.2 Otimização do método de extração ............................................................ 57
4.1.2.1 Procedimento de seleção do método de clean-up ............................... 58
4.2 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 2 (UPLC-DAD) ........................................... 63
4.2.1 Parâmetros Avaliados no Sistema UPLC-DAD (SISTEMA 2) ................... 67
4.2.2 Avaliação da Metodologia no SISTEMA 2 (UPLC-DAD) ......................... 75
4.2.3 Otimização da Metodologia de Extração no SISTEMA 2 .......................... 77
4.3 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 3 (LC-MS/MS) ............................................. 83
4.4 VALIDAÇÃO ..................................................................................................... 89
4.4.1 Linearidade e Sensibilidade ....................................................................... 89
4.4.2 Efeito matriz ............................................................................................... 91
4.4.3 Precisão ...................................................................................................... 93
4.4.4 Exatidão ...................................................................................................... 95
4.4.5 Limite de Detecção e Quantificação .......................................................... 97
5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 99
6. PERSPECTIVAS DO TRABALHO ................................................................... 99
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 100
20
1. INTRODUÇÃO
O Brasil atualmente se destaca como maior produtor e exportador de café [1].
Esta commodity é considerada um dos mais valiosos produtos primários no comércio
mundial além de gerar milhares de empregos em toda a sua linha de produção [2]. Para
tanto, os agrotóxicos são utilizadas rotineiramente com intuito de evitar perdas na
produção, que representam em torno de 50% do total [1-5].
O emprego destes insumos agrícolas nas plantações gera uma preocupação mais
intensa do público consumidor, incentivando investigações científicas que envolvam
estes produtos a fim de garantir a segurança alimentar, no caso, do café fornecido [3].
Desta forma, este trabalho visa desenvolver uma metodologia simples e eficiente que
objetiva avaliar os resíduos de agrotóxicos presentes no café torrado.
1.1 CAFÉ (Coffea arabica e Coffea canephora)
Existem mais de 100 espécies diferentes de plantas de café no mundo, agrupadas
em um gênero botânico denominado Coffea, sendo as mais conhecidas Coffea arabica
(café arábica) e Coffea canephora (café robusta ou conilon). Estas, apesar da
diversidade do gênero, detém a relevância econômica no mercado mundial de cafés
[4,5]. Sua descoberta na Etiópia entre os anos 600-800 acarretou diversos eventos que
marcaram a evolução do café como um produto de alto valor econômico. Isto provocou
a disseminação do café pelo mundo, no entanto, a indústria do café no Brasil começou
somente em 1727 [5,6].
Apesar da inserção tardia desta commodity no mercado do Brasil, atualmente
este se destaca como maior produtor e exportador global de café (Figura 1) [1]. O café é
considerado um dos mais valiosos produtos primários no comércio mundial, tendo uma
importância que não pode ser subestimada, principalmente em países em
desenvolvimento, nos quais toda a sua linha de produção gera emprego para milhões de
pessoas em todo o mundo [2].
21
Figura 1 - Maiores exportadores mundiais de café. Fonte: Maps of World (2011) [7]
No que se refere à composição química do café, a cafeína pode ser destacada
como a substância mais conhecida, porém não majoritária. Vários compostos conferem
ao café sabor e aroma peculiares, como fatores genéticos e ambientais, além de
condições de manejo na produção e processamento pós-colheita [8,9]. O grão do café
verde possui de modo geral, minerais, aminoácidos, lipídios, açúcares, polissacarídeos,
vitamina do complexo B e em maior quantidade os ácidos clorogênicos [8]. No entanto,
o consumo do café é realizado após o processo de torrefação dos grãos verdes, o que
produz a maioria das mudanças notáveis na sua composição, conferindo ao café seus
componentes aromáticos através das substâncias formadas pelo processo por meio de
reações de polimerização oxidativa ou degradação de compostos fenólicos (Tabela 1)
[6,10].
Tabela 1 - Composição do café arábica torrado. Fonte: [10]
Componentes Total (%) Solubilidade em
Água (%)
Proteínas Aminoácidos 9 1,5
Carboidratos
Polissacarídeos: - -
Insolúveis em água 24 -
Solúveis em água 6 6
22
(continuação da Tabela 1)
Sacarose 0,2 0,2
Glicose, frutose, arabinose 0,1 0,1
Lipídios
Triglicerídeos 9,5 -
Terpenos: livres, ésteres,
glicosídeos 2 traços
Ácidos
Voláteis
Ácido fórmico 0,1 0,1
Ácido acético 0,2 0,2
Ácidos Não-
Voláteis
Ácidos lático, pirúvico,
oxálico, tartárico, cítrico 0,4 0,4
Alcaloides
Ácidos clorogênicos 3,8 3,8
Cafeína 1,2 1,2
Trigonelina 0,4 0,4
Cinza Minerais 4 3,5
Água - 2,5 2,5
Parcialmente
conhecido
Compostos voláteis do
aroma 0,1 0,1
Compostos “browning”,
fenóis, entre outros 35 7,5
Total 100 27,5
Este processo de torrefação ocorre quando os grãos são “torrados” a altas
temperaturas entre 180-240 ºC, durante um período de sete a quinze minutos conforme a
torra que queira obter, até atingir sabor, aroma e cor desejáveis. Após as reações
desencadeadas pelo calor fornecido, os componentes descritos na Figura 2 são gerados e
variam de acordo com a espécie e processo [11,12]. Outro ponto a ser observado na
torrefação é a permanência dos agrotóxicos utilizados no plantio para a produção do
café após este processo [3,13]. A aplicação constante destes produtos químicos está
ligada a uma tentativa de redução de perdas das safras em decorrência das pragas que
atacam os cafezais como broca-do-café, ácaro vermelho, bicho-mineiro e a lagarta dos
23
cafezais [14]. Com isso, testes realizados por Rice e Ward, 1996 [13] em amostras de
café brasileiro detectaram nível original do agrotóxico DDD
(Diclorodifenildicloroetano) nos grão após a torrefação, apesar desta reduzir estes
níveis, o mesmo foi observado por Yang et al, 2010 para 69 agrotóxicos [3].
Figura 2 - Gráfico da composição do café em diferentes condições. Fonte: Oestreich-
Janzen, 2010 [15].
0
20
40
60
80
100
Outros Compostos
Cinzas
Melanoidinas
Ácidos Orgânico
Aminoácidos
Lipídios
Ácidos Clorogênicos
Carboidratos
Trigonelina
Cafeína
24
1.2 AGROTÓXICOS NA CAFEICULTURA
O Brasil tem como uma das principais atividades econômicas, a agricultura,
responsável pela geração de empregos e fator importante para o desenvolvimento da
economia. Desta forma, a cultura do café, principal commodity primário do país, utiliza
insumos agrícolas, entre eles, os agrotóxicos, a fim de atingir os níveis esperados de
produção [1,2,16,17].
Com isso, visando um maior controle e regulamentação do uso destes, os órgãos
públicos elaboram normas legais que os definem e relatam as diretrizes e exigências
para registro dos agrotóxicos. Sendo assim, a Lei nº 7802/89, regulamentada pelo
Decreto nº 4074/02 do MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento)
apresenta a seguinte definição para estes insumos agrícolas: agrotóxicos são produtos e
agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de
produção, armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, pastagens, proteção
de florestas nativas ou implantadas e de outros ecossistemas, bem como de ambientes
urbanos, hídricos e industriais. [18]. Contudo, estas legislações e suas exigências não
impediram que o Brasil se tornasse o maior consumidor destes produtos no mundo
[19,20].
Várias pragas assolam a cultura do café, a principal é o Bicho-mineiro na
cafeicultura brasileira, seguido da Broca-do-café (Figura 3), porém existem outras
pragas que atingem as plantações de café (Figura 4). O Bicho-mineiro é considerado
praga-chave da cafeicultura na maioria das regiões produtoras. As larvas deste inseto se
alimentam do parênquima foliar, causando necrose e redução da área fotossintética,
provocando a queda das folhas e o decréscimo da produção dos frutos [21,22]. O
controle químico desta praga é realizado por meio de inseticidas, principalmente
organofosforados, carbamatos e diversos piretróides [14,21].
25
Figura 3 - Principais pragas do cafezal (a) broca-do-café, Hypothenemus hampei e (b)
Bicho-mineiro, Leucoptera coffeella. Fonte: Souza et.al, 2011 [23].
Outra praga que agride intensivamente os cafezais, a Broca-do-café
Hypothenemus hampei, é um inseto que ataca os frutos do cafeeiro e é originário do
Continente Africano, sendo visto pela primeira vez no Brasil em 1913, na região de
Campinas dispersando-se pelos cafezais brasileiros [23]. Apesar do longo tempo desde
sua constatação ainda não foi erradicada das lavouras e o controle mais eficiente desta
infestação ocorre principalmente por meio do inseticida endosulfan [14,23]. No geral, a
principal forma de combate e prevenção destas pragas nas plantações de café é por meio
de agrotóxicos, o mesmo é válido para o Ácaro-vermelho, utilizando acaricidas e para a
Lagarta dos cafezais inseticidas seletivos [14,22].
No intuito de evitar grandes perdas, os cafeicultores aplicam estes agrotóxicos
em toda a lavoura, tanto em decorrência de seu baixo custo como por sua rápida ação ou
ainda pela evolução da resistência das pragas a estes produtos. Isto corrobora o
surgimento de efeitos adversos como a destruição de organismos benéficos (vespas
a b
a b
Figura 4 - Outras pragas do cafezal: (a) Ácaro vermelho Tetranychus evansi; (b)
Lagarta dos cafezais, Eacles imperialis magnifica. Fonte: Mesquita
26
predadoras, vespinhas parasitóides e bicho-lixeiro) além da contaminação do meio
ambiente provocada pelo aumento da quantidade de resíduos poluentes [14,21,22].
Devido ao protecionismo nos mercados externos cada vez mais se estabelecem
requisitos técnicos no que diz respeito a aplicação, exportação e importação dos
agrotóxicos sobretudo quando relacionados a produtos agrícolas mais competitivos,
tornando essas substâncias as mais sujeitas a rígidas legislações no mundo [24]. Estas
legislações visam garantir a segurança do consumidor bem como regulamentar o
comércio externo, funcionando como o mais importante parâmetro para a saúde pública
e para o comércio internacional, por meio do estabelecimento e regulamentação dos
limites máximos de resíduos (LMRs), algumas destas legislações estão descritas na
Tabela 3.
Estes LMRs podem ser definidos como a quantidade máxima de resíduo de
agrotóxico, ou afim, oficialmente aceita no alimento, em decorrência da aplicação
adequada numa fase específica, desde sua produção até o consumo, expressa em
miligramas do agrotóxico afim ou de seus resíduos por quilo do alimento analisado (mg
kg-1
). Na qual, resíduo pode ser definido como substância ou mistura de substâncias
remanescentes ou existentes em alimentos ou no meio ambiente, decorrente do uso ou
da presença de defensivos e afins, inclusive quaisquer derivados específicos, tais como
produtos de conversão e de degradação, metabólitos, produtos de reação e impurezas,
consideradas toxicológica e ambientalmente importantes [24].
27
Tabela 2 - Classificação dos agrotóxicos selecionados para o trabalho quanto ao grupo químico, ao modo de ação, à classe toxicológica e
fórmula estrutural. Fonte: Agência de Vigilância Sanitária [25].
Agrotóxico Fórmula Estrutural Grupo Químico Modo de
Ação
Classe
Toxicológica *
Carbofurano
(CBN)
Metilcarbamato de
Benzofuranila
Acaricida
Cupinicida
Inseticida
Nematicida
I
Cipermetrina
(CIP) O
O CN
O
Cl
Cl
Piretroide Formicida
Inseticida II
Clorpirifós
(CLF) O
ClCl
Cl
PH3CH2CO S
OCH2CH3
Organofosforado
Acaricida
Formicida
Inseticida
II
Clotianidina
(CTD) S
N
ClNH
N
NH
O2N
Neonicotinoide Inseticida III
O
O
NH
O
28
(continuação da Tabela 2)
Dissulfotom
(DIS) P
OCH2CH3S
OCH2CH3S
S
Organofosforado
Acaricida
Fungicida
Inseticida
I
Endosulfan
(END) Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
O
O
SO
Organoclorado Acaricida
Inseticida I
Espirodiclofeno
(ESP)
O
O
Cl
Cl
O
O
Cetoenol Acaricida III
Haloxifope
(HLX)
NF
F
F O
O
Cl
H OH
O
Ácido
Ariloxifenoxipropiônico Herbicida -
29
(continuação da Tabela 2)
Imidacloprido
(IMD)
N
Cl
N
NH
N NO2
Neonicotinoide Inseticida III
Tebuconazol
(TBC)
Cl
OH
N
N
N
Triazol Fungicida IV
Triadimefom
(TDF)
Cl
O
O
N N
N
Triazol Fungicida III
Triadimenol
(TDN)
Cl
O
OH
N N
N
Triazol Fungicida II
* Classificação Toxicológica: I – Extremamente Tóxico; II – Altamente Tóxico; III – Medianamente Tóxico; IV – Pouco Tóxico.
30
Tabela 3 - Limites máximos de resíduos para os agrotóxicos selecionados na cultura do
café. Fonte: [26,25]
* Fórum internacional de normatização do comércio de alimentos estabelecido pela
Organização das Nações Unidas (ONU) [18].
** Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs).
1.2.1 Agrotóxicos Envolvidos neste Trabalho
Os agrotóxicos selecionados para este trabalho visaram abranger duas formas
mais comuns de modalidade de emprego destes na cafeicultura, a foliar e a no solo,
podendo variar em relação à praga a ser combatida bem como sua forma de atuação
(Tabela 4). Em seus respectivos produtos comerciais os agrotóxicos/ ingredientes ativos
possuem outros compostos responsáveis por facilitar seu manuseio e aplicação [27,28].
Além destas características estes defensivos agrícolas têm propriedades físico-químicas
(Tabela 5) que possibilitam conhecer teoricamente seu comportamento frente a alguns
parâmetros que podem ser utilizados no método de extração a ser desenvolvido.
Agrotóxico
Codex
Alimentarius *
(mg kg-1
)
Convenção
de Estocolmo**
(mg kg-1
)
ANVISA
(mg kg-1
)
Carbofurano 1,00 0,100 0,1
Cipermetrina 0,05 - 0,05
Clorpirifós 0,05 0,050 0,05
Clotianidina 0,05 - -
Dissulfotom 0,20 0,100 0,1
Endosulfan 0,20 0,050 0,05
Espirodiclofeno 0,03 0,050 0,03
Haloxifope 0,02 - -
Imidacloprido 1,00 0,070 0,05
Tebuconazol 0,10 0,200 0,2
Triadimefom 0,50 0,100 0,1
Triadimenol 0,50 0,500 0,5
31
Tabela 4 - Modo de aplicação dos agrotóxicos e produtos comerciais utilizados na
cafeicultura. Fonte: [28]
Aplicação Classe do
Agrotóxico Agrotóxico Produto Comercial
Solo
Fungicida Dissulfotom
Triadimenol Baron
®1, Baysiston GR
®1
Inseticida Carbofurano
Imidacloprido
Diafuran 50®1
, Furadan®1
Imaxi 700 WG®
1,2
, Premier®1,2,3
Foliar
Acaricida Espirodiclofeno Envidor®4
Fungicida Tebuconazol
Triadimefom
Tebuconazole Nortox®1,5
Bayletom BR®5
Inseticida
Clorpirifós
Cipermetrina
Endosulfan
Klorpan 480 EC ®2,3
Perito®2
, Cipertrin®2,3
Endosulfan AG®, Thiodan
®2,3
1Sistêmico;
2 Não sistêmico de contato;
3 Não sistêmico de ingestão;
4 Não sistêmico;
5 Loco-sistêmico.
Quanto à forma de atuação os agrotóxicos podem ser dispostos em quatro
grupos: sistêmicos, não sistêmicos, mesostêmicos e loco-sistêmicos. Os sistêmicos são
aqueles que se fixam e penetram na superfície da planta, dispersando-se através dela, ou
seja, estas substâncias são absorvidas pelas raízes e translocadas pelo sistema condutor
da planta via xilema e floema. Os classificados como não sistêmicos também
denominados de tópicos ou imóveis agem diretamente nos organismos nocivos, não são
nem absorvidos nem translocados, possuindo ação de contato (via dérmica), de
penetração, de ingestão (via oral) e fumigante (via respiratória). Os mesostêmicos
caracterizam principalmente o grupo dos fungicidas estrobulinas, apresentando
afinidade com a superfície foliar sendo absorvida pela camada de cera formando um
depósito na superfície da área susceptível, sendo penetrante com ação de profundidade
ou movimento translaminar. Por fim, os loco-sistêmicos, de profundidade ou
translaminares podem ser translocados para qualquer parte da planta, independente de
sua parte ou de sua espécie botânica [29,30,31].
32
Tabela 5 - Características físico-químicas dos agrotóxicos em estudo. Fonte: [32-35].
Agrotóxico Ponto de Ebulição (ºC) Log kow Solubilidade (g L-1
) Densidade (g cm-3
)
Carbofurano 153 2,32
Água, 0,351
Diclorometano>200
Isopropanol, 20-50
1,18
Cipermetrina 200 6,94
Acetona, 620
Diclorometano, 550
Ciclohexano, 515
Clorofórmio
1,28
Clorpirifós 160 4,96
Acetona 650
Clorofórmio, 630
Solventes Orgânicos
1,40
Clotianidina 176,8 5 Água, 0,327 1,61
Dissulfotom 62 - - 1,14
33
(continuação da Tabela 5)
Endosulfan 106 3,83 (alfa)
3,62 (beta)
Acetato de Etila, 200
Diclorometano, 200
Etanol, 65
Hexano, 24
1,74
Espirodiclofeno - 5,1
Acetona, Diclorometano,
Acetonitrila, Acetato de
Etila>250
1,29
Haloxifope 55-58
4,33
3,52
4,00*
Diclorometano, Acetona,
Etanol, Acetonitrila 1,30-1,37
Imidacloprido 144 0,57 Água, 0,61 1,5
Tebuconazol 102,4 3,7
Água, 0,032
Diclorometano, 200
Isopropanol, 100-200
-
Triadimefom 78 e 82 ** 3,11 Água, 0,064 1,28
34
(continuação da Tabela 5)
Diclorometano, Acetona,
Acetonitrila >200
Triadimenol 133 e 135 *** 3,08 e 3,28
Diclorometano >250
Acetona, 190
Acetato de Etila, 150
Isopropanol, 140
1,23 e 1,30
*Haloxifope-etotil, haloxifope-metil e haloxifope-R-metil; **Depende da estrutura do cristal; *** Depende do Diasteroisômero; kow – coeficiente de partição octanol-água.
35
1.3 MÉTODO DE EXTRAÇÃO
A determinação de resíduos de agrotóxicos envolve etapas como amostragem,
preparo da amostra, extração dos analitos, clean-up (remoção dos interferentes) e pré-
concentração para a posterior análise instrumental. Na maioria dos casos, alimentos e
amostras ambientais não podem ser analisados diretamente, o que exige a execução
destas etapas que caracterizam a metodologia de extração, permitindo desta forma a
identificação e detecção dos baixos níveis dos agrotóxicos nestas matrizes complexas
[3,32].
Diversos métodos de extração e quantificação estão sendo utilizados para
determinar resíduos de agrotóxicos em alimentos. Visando sempre métodos com
características como baixo custo, facilidade e aplicabilidade a diferentes matrizes
[33,34]. Além disso, são necessários alguns cuidados durante a execução do método
selecionado, pois a determinação de resíduos de agrotóxicos é complexa e com várias
etapas que podem afetar o resultado final, podendo ser citados como alguns destes
cuidados:
I. A amostra tem que ser homogênea e representativa, isto é, ter uma composição
química que se assemelhe ao máximo com a composição média da totalidade do
objeto de estudo.
II. O isolamento e/ou enriquecimento de analitos alvos tem que ser realizado de
forma a obter a transferência de analitos a partir da matriz primária com remoção
simultânea dos interferentes e aumento da concentração dos analitos a níveis
acima do limite de determinação da técnica analítica aplicada.
III. Emprego adequado de um método de limpeza, em decorrência da evolução dos
métodos empregados na determinação de multi-resíduos de agrotóxicos, com
isso diferentes classes e propriedades físico-químicas, o que torna a etapa de
clean-up quase sempre necessária.
Desta forma, para garantir uma eficiente determinação de multi-resíduos de
agrotóxicos em alimentos, diferentes técnicas de limpeza são aplicadas. Estas técnicas
em alguns trabalhos realizados nos últimos anos foram utilizadas de forma combinada,
como nos trabalhos de MUKHERJEE, 2009 [35] (extração líquido-líquido e extração
em fase sólida (em inglês, SPE, Solid Phase Extraction)), de HERCEGOVÁ el al, 2005
[36] (extração sólido líquido por sonicação e SPE) e de BLASCO et al., 2005 [37]
(extração com líquido pressurizado (em inglês, PLE, Pressurized Liqui Extraction) e
36
dispersão de matriz em fase sólida (em inglês, MSPD, Matrix Solid Dispersive
Extraction)). Assim, o desenvolvimento de novas metodologias utilizando diversas
técnicas de extração para a redução de interferentes vem se tornando uma prática
comum [38-42]. Esta ideia foi utilizada no presente trabalho buscando aliar o método de
extração por sonicação com a extração líquido-líquido como clean-up.
Utilizando os grãos de café como matriz poucos trabalhos desenvolveram
metodologias para a determinação de resíduos de agrotóxicos. No geral, a aplicação de
métodos de extração nos grãos de café visa substâncias como cafeína, trigonelina e
ácido nicotínico, que são as responsáveis pelas principais características desta
commodity como sabor, aroma e cor.
Desta forma, um dos trabalhos que desenvolveu uma metodologia para a
determinação de 69 agrotóxicos de diferentes grupos químicos em café foi realizado por
YANG et al., 2010 [3]. Neste trabalho os autores utilizaram extração líquido líquido
para obter uma fração representativa da amostra, aplicando a este extrato uma etapa de
clean-up por cromatografia com permeação em gel separando a fração entre 4-15
minutos, realizando outro clean-up por meio da técnica SPE com cartuchos Envi-Carb®
acoplado aos cartuchos de NH2-LC. Por fim, a análise instrumental foi realizada
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Outro trabalho que
desenvolveu uma metodologia para a análise de multi-resíduos de agrotóxicos em 15
amostras de cafés brasileiros foi realizado por DIAS et al., 2013 [38] aplicando
QuEChERS para a extração e análise em LC-MS/MS.
Contrastando com outras publicações da literatura que utilizam o café, não
necessariamente torrado, foi notada a presença de trabalhos com diversas técnicas de
extração como, MSPD, sonicação, QuEChERS, entre outras, alguns com etapa de clean-
up, como pode ser visto na Tabela 6. Destacando SALINAS-VARGAS e CAÑIZARES-
MACÍAS, 2014 [39] que tiveram como objetivo a elaboração de uma metodologia
aplicando a técnica de extração sólido líquido por sonicação para obter um extrato que
foi submetido a um clean-up com um sistema de SPE on-line visando a determinação da
cafeína, a qual foi uma das referências do presente estudo em decorrência da técnica de
extração ser rápida e eficiente na preparação da amostra [40].
Em suma, nenhum trabalho agregando a utilização da matriz café torrado, o
método de extração por sonicação e clean-up com LLE para a determinação de multi-
resíduos de agrotóxicos com análise instrumental por cromatografia líquida/
espectrometria de massas foi encontrado. A Tabela 6 mostra trabalhos com café e
37
matrizes semelhantes, reunindo algumas técnicas que podem ser utilizadas para o
desenvolvimento da metodologia de extração e análise instrumental deste trabalho.
Tabela 6 - Alguns trabalhos com técnicas de extração combinadas e amostras sólidas.
REFERÊNCIA MATRIZ ANALITO
MÉTODO
DE
EXTRAÇÃO
CLEAN-UP ANÁLISE
INSTRUMENTAL
ALVES e
BRAGAGNOLO,
2002 [41]
Chás Teobromina,
Teofilina, Cafeína
LLE
SE
-
Espectrofotômetro
HPLC-UV/Vis
ALVES et al., 2006
[42] Café torrado
Ácido nicotínico,
trigonelina, ácido
clorogênico e
cafeína
SE - HPLC-UV/Vis
DIAS et al., 2013
[38] Café arábica
Multi-resíduos de
agrotóxicos
QuEChERS - LC-MS/MS
PIZZUTTI et al.,
2012 [2]
Grãos de café
verdes 51 Agrotóxicos SE-agitação QuEChERS GC–MS (NCI-SIM)
SALINA-VARGAS
E CAÑIZARES-
MACÍAS, 2014
[39]
Grãos de café
verdes e
torrados
Cafeína SE-Sonicação
On-line SPE
Mini-coluna
de C18
UV-vis
SOARES et al.,
2010 [43]
Café moído
torrado,
descafeinado,
instantâneo e
misturado
com cereais
Acrilamida MSPD SPE GC-MS
YANG, et al.,2010
[3] Grão de Café 69 Agrotóxicos LLE
GPC
SPE
GC-MS
ZHAO et al., 2011
[44]
Chás verde,
verde pu-ehr e
branco
18 compostos do
chá SE-Sonicação - UPLC/DAD/MS
38
1.3.1 Método de Extração Sólido Líquido por Sonicação
O uso da energia ultrassônica em meios líquidos e sólidos tem sido extenso em
aplicações nos processos alimentícios e tem incentivado a utilização em tratamento de
amostras, durante muitos anos. Seus efeitos mecânicos provêm de uma maior
penetração do solvente no material celular o que aumenta a transferência de massa
devido aos efeitos de micro-fluxos gerados pelas ondas. Durante o processo de
sonicação ondas longitudinais são criadas quando a onda sônica entra em contato com
um meio líquido, criando regiões alternadas de ondas de compressão e rarefação
induzidas em moléculas do meio caracterizando o processo de cavitação [40,45] visto
detalhadamente na Figura 5.
Figura 5 - Processo de cavitação. Fonte: SEIDI e YAMINI (2012) [46].
Estas ondas que caracterizam o ultrassom são ondas mecânicas que precisam de
um meio elástico para se propagar, podendo ter baixa ou alta intensidade. Esta pode
alterar as propriedades físicas ou químicas do alimento e tem entre outras aplicações a
capacidade de acelerar e melhorar a eficiência do preparo da amostra. Com isso o uso de
ultrassom com alta intensidade/baixa frequência (16-100 kHz) é mais frequente [47].
39
Dessa forma, o processo de cavitação com o ciclo de formação, crescimento e
colapso implosivo de vacúolos de gás em solução, vistos na Figura 5, caracteriza o
procedimento de extração. Que tem o aumento da cavidade dependente da intensidade
da onda sonora, podendo ocorrer o colapso como uma compressão adiabática e gerar
altas temperatura e pressão. A alta temperatura resulta em uma maior solubilidade dos
analitos no solvente extrator e a difusividade dos analitos da matriz para a região
externa. Já o aumento da pressão favorece a penetração do solvente extrator na matriz e
o transporte entre a matriz sólida e a fase líquida na interface, mecanismo este
demonstrado na Figura 6 [45,47].
Este método de extração sólido-líquido também denominado de “lixiviação” é
ditado por mecanismos de solubilidade e fenômenos de transporte, além disso, possui
três etapas cruciais:
I. O solvente extrator é colocado em contato com a superfície e com o interior da
matriz iniciando o processo de extração;
II. Os analitos retidos serão removidos por deslocamentos dos sítios ativos da
matriz seja por maior afinidade e/ou concentração das moléculas do solvente.
III. Os analitos serão transportados do interior da matriz para a superfície
essencialmente por forças de difusão e fora da matriz por forças principalmente
de convecção, a lixiviação fornecida é executada em modo dinâmico.
Com isso o mecanismo de lixiviação envolve alguns efeitos como o colapso dos
vacúolos formados na proximidade da superfície sólida produzindo micro-fluxos de alta
velocidade que corroem a superfície e podem aumentar as taxas de transporte e a área
superficial; ocorre também a fragmentação das partículas através da colisão que
aumenta a superfície de contato e facilita a penetração do solvente extrator no interior
da matriz. E ainda a transmissão acústica promove a interrupção da camada de difusão
na superfície e a energia ultrassônica facilita a difusão das substâncias analisadas para a
zona externa [45].
40
Figura 6 - Mecanismo de extração/lixiviação por sonicação (a) na ausência e (b) na
presença das ondas ultrassônicas. Fonte: CASTRO e CAPOTE (2007) [45].
A prolixidade do método de extração sólido-líquido por sonicação pode ser
verificada na Tabela 6 com sua utilização como uma etapa de preparo de diferentes
amostras para um posterior método de extração, bem como sua aplicação em
metodologias de extração de compostos orgânicos e inorgânicos. Contudo esta técnica
possui hifenizações a exemplo da UMAE (extração assistida por microondas e
ultrassom), IL-UMAE (extração assistida por microondas e ultrassom com líquidos
iônicos), USASFE (extração por fluido supercrítico assistida por ultrassom), entre outros
exemplos encontrados na literatura garantindo uma ampla aplicação deste método para
as mais diversas matrizes [46].
1.4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
A cromatografia é um método de análise que apresenta ampla versatilidade
destacando-se dentre outros, pois efetua separação, identificação e quantificação das
substâncias químicas presente em uma mistura [48]. É uma técnica de separação
baseada em um processo físico-químico e geralmente composta de dois componentes
primários: a fase estacionária e a fase móvel gerando a distribuição da mistura pelas
duas fases e a retenção seletiva na fase estacionária [48,49].
O princípio do processo de separação dos componentes de uma amostra por
cromatografia e sua denominação são atribuídos ao russo Mikhael Semenovich Tswett
em 1906. Desde então inúmeros progressos aconteceram no âmbito da cromatografia,
41
como o desenvolvimento de outras modalidades e várias modificações foram
introduzidas à cromatografia líquida clássica utilizada por Tswett, caracterizando a
cromatografia líquida moderna, inventada por Snyder e Kirkland com vantagens,
segundo os autores, de ser mais conveniente, precisa, rápida e apta a realizar separações
difíceis, sendo ilustrada esquematicamente na Figura 7 [48,50].
Figura 7 - Esquema básico de um sistema de cromatografia líquida com detector
espectrofotométrico e espectrometria de massas. Fonte: Baseado em NAUSHAD e
KHAN, 2014; MEYER, 2010 e SNYDER et al., 2010 [49,51,52].
Com isso, a denominada atualmente de cromatografia líquida de alta eficiência,
CLAE, mais popularmente conhecida por HPLC, em inglês High Performance Liquid
Chromatography passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins
qualitativos e quantitativos em menos de trinta anos. Tendo como razões para este
crescimento a sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa
sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis
além de sua aplicação em determinações ambientais e em muitos outros campos da
ciência [53].
A ampla variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna esta
técnica extremamente versátil e de grande aplicação. Quando utilizada para a
identificação de compostos este dado é obtido através da comparação com padrões
analíticos, permitindo também a purificação separando o analito de interesse de
Fase Móvel
Bomba
Misturador Amostra
s
Válvula
de
Injeção
Fase
Estacionária
Lâmpada
Detector
Descarte
Registrador
TQD
Espectrômetro de Massas
42
substâncias indesejadas [48]. A separação dos compostos de uma amostra pode ser
realizada por um sistema com condições fixas (modo isocrático) ou por meio de uma
composição variável da fase móvel durante a separação (modo gradiente) [54].
Hoje, compostos com concentrações em nível de traço chegando a partes por
bilhão podem ser mais facilmente identificados e a HPLC está sendo muito aplicada
para este fim em análises de alimentos, fármacos, cosméticos, matrizes ambientais,
forense e produtos químicos industriais. Em 2004, a Waters®, realizou muitos avanços
na instrumentação e tecnologia da coluna para alcançar aumentos mais significativos na
resolução, na velocidade de análise e na sensibilidade na cromatografia líquida. Para
tanto, surgiram fases estacionárias com tamanho de partículas menores (< 2 μm) e para
empregar tais fases à instrumentação foram necessárias modificações que suportassem
altas pressões para fluir a fase móvel e atingir este nível de eficiência, criando um novo
sistema conhecido como cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC). Este sistema
é baseado no mesmo princípio que a HPLC, ou seja, cromatografia de partição com um
adsorvente de tamanho muito reduzido para aumentar a área superficial
consequentemente a retenção [49].
No sistema UPLC em decorrência do aumento da eficiência, resolução e alta
velocidade pode-se afirmar que a eficiência tem valores três vezes maior com colunas
de 1,7 μm quando comparadas com aquelas de 5 μm. A resolução é 70% maior do que
com colunas de 5 μm e 40% em colunas de 3,5 μm. A alta velocidade é obtida porque o
comprimento da coluna é reduzido em um fator de 3 em relação as colunas de 5 μm e o
fluxo pode ser três vezes maior. Portanto, as separações se tornam nove vezes mais
rápidas com igual resolução, permitindo a obtenção de resultados mais rápidos com
mais resolução, informação e robustez comportando a análise de mais amostras por
sistema e analista [49].
No entanto, outro componente do sistema cromatográfico que contribui
significativamente para a obtenção destas respostas é o detector. Existem diversos tipo
de detectores disponíveis para a cromatografia líquida, em contrapartida, poucos são
amplamente utilizados devido a limitações inerentes à técnica. Destacando-se os de
absorção no UV-Vis, o índice de refração, a fluorescência e o espectrômetro de massas.
Sendo o espectrômetro de massas de caráter universal, com boa sensibilidade além de
possuir ruído bem reduzido, vem ampliando suas aplicações e números de usuários
apesar do custo, tornando-se o detector mais promissor para a cromatografia líquida
43
fornecendo informações mais sensíveis em análises de traços, resíduos de agrotóxicos,
contaminantes em alimentos entre outros [50].
Com o avanço das técnicas de separação e o seu respaldo na Química Analítica
pela capacidade de realizarem análises qualitativas e quantitativas em amostras
ambientais, farmacêuticas, biológicas e em alimentos, novas metodologias vem sendo
desenvolvidas por cromatografia. Ampliando a necessidade de garantir a qualidade das
medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade,
realizada por meio do processo de validação [55]. Que segundo a ANVISA [56],
“A validação de determinado procedimento analítico objetiva demonstrar que o
mesmo é adequado aos objetivos propostos, ou seja, que os parâmetros de desempenho
avaliados atendem aos critérios de aceitação preconizados.”
Dessa forma, os parâmetros avaliados para validar um método analítico
envolvem Especificidade/Seletividade, Linearidade, Sensibilidade, Exatidão, Precisão
(repetitividade, precisão intermediária e reprodutividade), Limite de Detecção (LD) e
Limite de Quantificação (LQ) [57]. Para tanto, testes ao longo do desenvolvimento da
metodologia foram realizados com o intuito de atingir as especificações destes critérios,
que serão posteriormente detalhados em correlação com os resultados obtidos neste
trabalho, atingindo os objetivos propostos, descritos a seguir.
44
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho visa desenvolver uma metodologia simples e eficiente para a
avaliação de resíduos de agrotóxicos em café torrado utilizando a técnica de extração
por sonicação e clean-up por extração líquido-líquido e análise por cromatografia
líquida de ultra eficiência (UPLC) acoplada a espectrometria de massas sequencial.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Selecionar os agrotóxicos, de acordo com a utilização na cultura do café;
Otimizar as condições cromatográficas para a análise simultânea dos agrotóxicos;
Desenvolver uma metodologia de extração;
Desenvolver uma metodologia de clean-up;
Validar o método desenvolvido.
45
3. METODOLOGIA
3.1 REAGENTES
Acetonitrila grau Absolv (Tedia, EUA), diclorometano HPLC/SPECTRO
(Tedia, EUA), água deionizada, adsorvente C18 (Agilent Tecnologies), Sílica gel 70-230
mesh (Tedia, Brasil)
3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Erlenmeyer (25 mL), Vials (40 mL), funil de vidro, béquer, tubo de ensaio de
fundo cônico, seringa de vidro, balança analítica (Sartorius BL 2105), micropipetador
automático (KASVI, China), lavadora ultrassônica (Unique USC-1400), agitador
mecânico (IKA®), centrífuga (Universal).
3.3 PADRÕES DOS AGROTÓXICOS E SOLUÇÕES
Os padrões certificados dos agrotóxicos utilizados para o trabalho foram:
Carbofurano (AccuStandard, EUA), cipermetrina (Fluka, Suíça), clorpirifós (Dr.
Ehrenstorfer GmbH, Alemanha), clotianidina (Fluka, Suíça), dissulfotom (SUPELCO,
EUA), endosulfan (Sigma-Aldrich, Alemanha), espirodiclofeno (Sigma-Aldrich,
Alemanha), haloxifope (Sigma-Aldrich, Alemanha), imidacloprido (Rieldel-de Haën,
Alemanha), tebuconazol (AccuStandard, EUA), triadimefom (Sigma-Aldrich,
Alemanha), triadimenol (Sigma-Aldrich, Alemanha). A partir destes padrões as
soluções estoque foram preparadas nas seguintes concentrações: carbofurano 590 μg
mL-1
em metanol, tebuconazol 500 μg mL-1
, cipermetrina, clorpirifós, clotianidina,
endosulfan espirodiclofeno, haloxifope, imidacloprido, triadimefon e triadimenol 1000
μg mL-1
em acetonitrila e dissulfotom 4000 μg mL-1
em acetonitrila.
Por meio destas soluções individuais foram preparadas soluções intermediárias
individuais para então posterior elaboração de soluções conjuntas de trabalho, segundo a
Figura 8. Todas as soluções utilizadas neste trabalho foram armazenadas em freezer e
tiveram suas respectivas características confirmadas antes das análises realizadas.
46
Figura 8 - Fluxograma utilizado para preparar as soluções de trabalho dos agrotóxicos em estudo seguido da elaboração das soluções analisadas
para a obtenção das curvas analíticas.
* Este volume é dependente da concentração da solução individual do agrotóxico (SEÇÃO 3.3);
** SCJ - Solução Conjunta dos Agrotóxicos.
Pad
rão I
nd
ivid
ual
100 μ
g m
L-1
2000 μL 200 μL * 5000 μL 500 μL *
SC
J *
*
1 μ
g m
L-1
0,50 μg mL-1
500 μL 1000 μL
0,25 μg mL-1
250 μL 1000 μL
0,10 μg mL-1
100 μL 1000 μL
0,01 μg mL-1
10 μL 1000 μL
SC
J *
*
10 μ
g m
L-1
47
3.4 SELEÇÃO DOS AGROTÓXICOS EM ESTUDO
Os agrotóxicos deste trabalho possuem o modo de ação voltado para o combate
das principais pragas da cafeicultura brasileira (Tabela 2). Estes agrotóxicos foram
relatados em um documento de Conselho Internacional do Café (ICC) com seus
respectivos Limites Máximos de Resíduos (LMRs), com o intuito de fornecer o
conhecimento deste aspecto, principalmente, para âmbito da segurança alimentar [26].
3.5 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS DE ANÁLISE
I. HPLC-DAD (SISTEMA 1)
O estudo prévio das soluções dos agrotóxicos bem como dos extratos produzidos
pelo desenvolvimento da metodologia de extração foi realizado em um cromatógrafo
líquido modelo Prominence da marca Shimadzu (Quioto, Japão). Sua configuração
consiste em: desgaseificador DGU-20A3, sistema binário de bombas LC-6AD, módulo
de comunicação CBM-20A, auto-injetor SIL-20A, detector espectrofotométrico com
arranjo de diodos SPD-M20A. Como fase estacionária a coluna Sinergi 4u polar-RP
80A (250 mm x 4,6 mm x 4μm) da marca Phenomenex e coluna de guarda RP (4 x 3)
mm, utilizando os parâmetros descritos na Tabela 7 e respectivo gradiente de eluição da
Tabela 8.
II. UPLC (SISTEMA 2 e 3)
Com a metodologia de extração definida no SISTEMA 1 as análises
instrumentais passaram a ser realizadas em um cromatógrafo líquido de ultra eficiência
Acquity UPLC®
H Class da marca Waters, composto por um sistema de bombas
quaternário QSM, módulo de comunicação e auto-injetor SM, detector
espectrofotométrico com arranjo de diodos e um analisador de massas triploquadrupolo
(TQD). O analisador de massa possui fonte de ionização por eletrospray utilizando o
modo positivo de ionização. As fases estacionárias foram as colunas CSH Phenyl-Hexyl
(50 mm x 2,1 mm x 1,7 µm) e BEH C18 (50 mm x 2,1 mm x 1,7 µm), respectivamente
nos sistemas. Com as condições de análise relatadas na Tabela 7 e gradientes de eluição
da Tabela 8.
48
Tabela 7 - Condições de análise nos sistemas cromatográficos utilizados.
Parâmetro SISTEMA 1 SISTEMA 2 SISTEMA 3
Gradiente Tabela 8 Tabela 8 Tabela 8
Fase Móvel Acetonitrila: Água Metanol: Água
Vazão da Fase
Móvel 0,8 mL min
-1 0,6 mL min
-1 0,3 mL min
-1
Volume de
Injeção 20,0 μL 2,0 μL 2,0 μL
Softwares de
tratamento de
dados
LC Solution MassLinx MassLinx
Comprimentos
de Ondas
Selecionados
220 nm
CBN, CIP, CLF,
DIS, END, ESP,
HLX, TBC, TDF
e TDN
-
269 nm CTD e IMD
Fragmentos
Selecionados -
Quantificação
m/z
Identificação
m/z
CTD 168,9 131,9
IMD 208,9 175,0
CBN 122,9 165,0
HLX 316,0 91,1
TDF 196,9 224,9
TDN 70,0 227,1
TBC 69,9 124,9
DIS 88,9 61,0
CLF 96,7 197,8
ESP 70,7 313,3
CIP 190,8 126,9
49
Tabela 8 - Gradientes de eluição para cada sistema cromatográfico utilizado.
Sistema Cromatográfico Gradiente de Eluição
SISTEMA 1
Fase estacionária: coluna
Sinergi 4u polar-RP 80A
Tempo (min) H2O(%) ACN (%)
0,01 95,0 5,0
60,00 0,0 100,0
65,00 95,0 5,0
70,00 95,0 5,0
SISTEMA 2
Fase estacionária: coluna
CSH Phenyl-Hexyl
Tempo (min) H2O(%) ACN (%) H2O(%) ACN (%)
0,01 45,0 2,5 50,0 2,5
18,00 15,0 35,0 20,0 30,0
23,00 45,0 2,5 50,0 2,5
33,00 45,0 2,5 50,0 2,5
SISTEMA 3
Fase estacionária: coluna
BEH C18
Tempo (min) H2O(%) MeOH (%)
0,01 95,0 5,0
0,25 95,0 5,0
8,75 1,0 99,0
9,50 1,0 99,0
9,51 95,0 5,0
15,00 95,0 5,0
50
3.6 OBTENÇÃO E ACONDICIONAMENTO DA AMOSTRA DE CAFÉ
TORRADO
Os grãos de café torrados (Coffea arabica) utilizados para o trabalho foram
produzidos e processados na região sul de Minas Gerais. O preparo da amostra
constituiu da moagem dos grãos com auxílio de um mixer e homogeneização com
almofariz e pistilo (Figura 9). A amostra homogeneizada foi armazenada em frasco de
tampa rosqueável à temperatura ambiente.
Figura 9 - Café torrado moído e homogeneizado.
3.7 METODOLOGIA DE EXTRAÇÃO
3.7.1 Fortificação das Amostras Para a Extração
A amostra de café torrado foi extraída segundo a metodologia descrita na Figura
10, fazendo a contaminação das amostras antes da etapa de sonicação com 0,5 mL da
solução conjunta dos agrotóxicos permanecendo em contato com 0,5 g do café torrado
por dez minutos, seguindo então para o banho ultrassônico. Na etapa de sonicação foi
adicionado um volume de 5 mL de acetonitrila para a extração durante quinze minutos.
Este procedimento foi utilizado da mesma forma para a obtenção do branco, contudo, a
etapa de adição dos analitos à amostra não foi realizada.
3.7.2 Procedimento de Clean-up
Em sequência uma alíquota de 1 mL é utilizada para a etapa de extração líquido-
líquido (clean-up). Nesta etapa são adicionados 1 mL de água e 1 mL de diclorometano
51
nesta ordem, sendo agitado em vortex por quinze segundos após cada adição e o
resultado centrifugado por um minuto a 2100 rpm. Com as duas fases formadas, a fase
superior, constituída de acetonitrila e água, foi removida e descartada, enquanto a fase
de interesse com diclorometano e água foi colocada em fluxo de nitrogênio para
mudança de solvente e o volume reconstituído com 1 mL de MeOH:H2O (50:50, v/v)
centrifugado por cinco minutos a 2100 rpm e filtrado em membrana de Nylon 0,22 μm.
Por fim este extrato foi submetido a análise instrumental em um dos sistemas
cromatográficos segundo as condições da seção 3.4.
Figura 10 - Procedimento de extração da amostra de café torrado.
3.8 LIMPEZA DOS MATERIAIS
No preparo das soluções e no processo de extração os materiais utilizados foram
lavados seguindo o procedimento descrito abaixo:
Reserva do material imerso em água;
Sonicação por trinta minutos com solvente apolar;
Enxague com água deionizada;
Sonicação por trinta minutos com solvente polar;
Enxague com água deionizada;
Secagem em estufa;
52
Armazenado com papel alumínio ou filme nas extremidades abertas em armários
fechados.
3.9 DESCARTE DE RESÍDUOS DOS REAGENTES
As soluções dos agrotóxicos foram descartadas em frascos de vidro e
armazenadas no laboratório enquanto os solventes utilizados nas análises e lavagem das
vidrarias foram colocados em bombonas para posterior coleta e destino apropriado com
menor impacto ambiental, realizados por empresa responsável.
53
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para o desenvolvimento da metodologia proposta neste trabalho, por sonicação e
extração líquido-líquido com análise por cromatografia líquida, preliminarmente, foram
otimizadas as condições cromatográficas para a determinação simultânea dos
agrotóxicos selecionados, seguida dos experimentos realizados em bancada para a
seleção do método mais eficiente de clean-up e de extração para a amostra de café
torrado. Por conseguinte, testes de validação da metodologia descrita na seção 3.7 foram
realizados.
4.1 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 1 (HPLC-DAD)
4.1.1 Otimização das Condições de Análise
A princípio foram realizadas análises cromatográficas dos padrões certificados
dos agrotóxicos por meio de suas soluções individuais, para avaliar sua detectabilidade
e em sequência otimizar as condições de análise por cromatografia líquida com detector
espectrofotométrico com arranjo de fotodiodos. Para tanto, estas análises utilizaram um
gradiente exploratório (Figura 11), que consiste da variação linear da composição da
fase móvel de 5 a 100% do solvente orgânico em determinado tempo [54], no caso,
sessenta minutos. Assim, os tempos de retenção de cada agrotóxico foram identificados
e consequentemente a proporção de solvente orgânico necessária para eluir cada um
deles. A partir disto foram avaliados parâmetros como pureza e comprimento de onda
de máxima absorção, tendo em vista que este gradiente de eluição mostrou-se eficiente
para a análise simultânea dos agrotóxicos.
Figura 11 - Cromatograma da análise exploratória dos analitos em estudo no SISTEMA
1 (HPLC-DAD)
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
efo
m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
uV(x100,000)
54
4.1.1.1 Seleção dos comprimentos de onda de máxima absorção
O detector do sistema de análise cromatográfica 1 (HPLC-DAD) utiliza arranjo
de fotodiodos. Este arranjo permite que cada diodo monitore uma faixa estreita de
comprimentos de onda, realizando ao final uma varredura de toda a região de interesse,
obtendo o espetro de absorção para cada analito (Figura 12) [50].
Estes espectros adquiridos fornecem o comprimento de onda de melhor absorção
da luz de cada agrotóxico analisado, permitindo assim a análise de amostras complexas
e de substâncias que absorvem em diferentes comprimentos de onda. Com base nisso e
observando o comprimento de onda de absorção do solvente da fase móvel, denominado
cut-off, foi realizada a seleção dos comprimentos de onda que seriam aplicados no
processo de detecção [50].
Dessa forma, o comprimento de onda 269 nm foi observado no espectro da
Figura 12 como o mais eficiente para os agrotóxicos Clotianidina (CTD) e
Imidacloprido (IMD), pois permitiria uma sensibilidade maior resultando em uma
melhor resposta, isto é, sinais mais intensos em concentrações mais baixas em
decorrência da melhor absorção pela substância no comprimento de onda escolhido.
Para os demais analitos as absorções de melhor resposta estavam na região de 220 nm,
sendo assim este foi selecionado sem perda relevante da intensidade do sinal evitando
também a região de comprimento de onda próximo a 190 e 210 nm, relativo à absorção
da acetonitrila e do metanol, respectivamente, utilizados na fase móvel.
55
Figura 12 - Espectros de absorção indicando o comprimento de onda de máxima absorção avaliados no SISTEMA 1.
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
25
50
75
100
125
mAU
196
225
276
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
700mAU
198
275
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
50
100
150
200
250
300
350
400
mAU
269
212
389
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
25
50
75
100
125
150
175
mAU
266
214
412
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
50
100
150
200
250
300
350
400mAU
222
275
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
50
100
150
200
250
300
mAU
223
275
Triadimefom
(TDF)
Clotianidina
(CTD)
Imidacloprido
(IMD)
Carbofurano
(CBN) Haloxifope
(HLX)
Triadimenol
(TDN)
56
(continuação da Figura 12)
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
mAU
307
364
431
400
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
25
50
75
100
125
150
175
mAU
211
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
mAU
229
288
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
mAU
412
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
700
800
mAU
271
412
200 250 300 350 400 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100mAU
220
268
261
323
Espirodiclofeno
(ESP)
Tebuconazol
(TBC)
Dissulfotom
(DIS)
Endosulfan
(END)
Clorpirifós
(CLP)
Cipermetrina
(CIP)
57
Após a definição das condições adequadas para a análise simultânea dos
agrotóxicos foram iniciados os experimentos em bancada para a determinação da
metodologia de extração mais eficiente, combinando um método de extração simples e
rápido com um método de clean-up apto para a redução de interferentes sem perdas
quantitivas dos analitos. Dessa forma, uma otimização do método de extração foi
realizada de acordo com o descrito no tópico a seguir.
4.1.2 Otimização do método de extração
Para identificação do perfil cromatográfico do café torrado foram feitas
extrações por sonicação com 2,0 g da amostra de café, descrita no item 3.6, e 50 mL de
acetonitrila e depois com diclorometano durante 30 minutos, os extratos obtidos foram
filtrados em papel de filtro e concentrados em evaporador rotatório aferindo o volume
para 1 mL de extrato final em fluxo de N2. Destas amostras foi possível observar a
quantidade de compostos e sua sensibilidade ao método, o que pode ser notado pela
Figura 13 além de um interferente majoritário com tempo de retenção (tr) de 16,44
minutos e área de 10986145 mUA para acetonitrila e tr de 16,51 minutos e área
13417751 mUA para diclorometano, influenciando na obtenção de resultados com
amostras em baixas concentrações, sendo necessária uma etapa de clean-up. As análises
cromatográficas relatadas nesta seção foram realizadas no SISTEMA 1 com a
programação descrita no item 3.5.
Figura 13 - Cromatogramas dos extratos por sonicação utilizando ACN (preto) e DCM
(vermelho) como solvente extrator.
58
4.1.2.1 Procedimento de seleção do método de clean-up
Proposta 1: SPE com C18 como adsorvente
Esta proposta teve como referência Salinas-Vargas e Cañizares-Macias, 2014
[39] que utilizou uma mini-coluna com adsorvente C18 no método de SPE-Online para a
extração da cafeína em grãos verdes e torrados. No entanto, o intuito deste
procedimento foi remover o interferente que indicava ser a cafeína, por ser um
composto do café que absorve no comprimento de onda 272 nm que a caracteriza.
Com base na extração por sonicação, descrita no item 4.1.2 uma alíquota de 500
μL do extrato final foi retirada para a diluição em 5 mL para a eluição em um cartucho
com 0, 250 mg de fase C18 condicionada com 2 mL de MeOH. Este primeiro volume foi
recolhido e concentrado para 1 mL em evaporador rotatório e fluxo de N2 para posterior
análise. Em seguida com 5 mL de MeOH: H2O (25: 75, v/v) foi utilizado para eluir
segundo a literatura a cafeína retida. Porém, não ocorreu o esperado e o interferente foi
observado na primeira fração da coluna de SPE com C18, como mostra a Figura 14.
Sendo descartada esta proposta por ineficiência na retenção do interferente da matriz.
Figura 14 - Cromatogramas da Proposta 1 de clean-up, em vermelho o primeira fração
e em preto o interferente retido seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1.
Proposta 2: MSPD e sonicação baseado em REZAI e HOSSEINI, 2011 [58].
A literatura relata o adsorvente C18 em muitas extrações e análise de compostos
do café, com isso, foi proposta a utilização do mesmo como agente dispersante no
método MSPD. Para o desenvolvimento do método 0,5 g da amostra de café foi
homogeneizada com 1,0 g de C18 por um minuto. A amostra homogeneizada com o
adsorvente foi transferida para um erlenmeyer e adicionado 25 mL de ACN para a
sonicação por 30 minutos. O extrato obtido foi filtrado em papel filtro e retirada uma
59
alíquota de 1 mL que foi filtrada em filtro de seringa de Nylon 0,45 μm. Da análise foi
observada uma redução na área do interferente de 10986145 para 5024743 mUA, sendo
esta proposta mais eficiente que a anterior, como pode ser visto na Figura 15.
Figura 15 - Cromatogramas do método da Proposta 2, em vermelho o extrato e em
preto o branco do adsorvente seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1.
Prosseguindo com este método outro adsorvente foi testado, a sílica, buscando
uma limpeza mais eficiente do extrato para possibilitar a análise dos agrotóxicos. Com
isso, o mesmo procedimento experimental foi realizado para a obtenção do extrato e
posterior análise no SISTEMA 1 com uma resposta melhor do que o adsorvente C18,
Figura 16.
Figura 16 - Sobreposição dos cromatogramas da Proposta 2 com adsorvente C18 em
vermelho e com a sílica em preto seguindo as condições da Tabela 7 no SISTEMA 1.
Outro teste realizado com esta proposta foi a mudança na forma de extração, ou
seja, a extração por sonicação foi substituída por uma simples agitação a 100 rpm
durante o mesmo tempo 30 minutos utilizando C18. Como resultado foi visto um valor
de área maior do que o obtido nesta proposta com o adsorvente sílica, porém com um
perfil semelhante, Figura 17, com valores de área que diminuíram de 5024743 para
60
4867217 e para 4546037 correspondendo, respectivamente, aos extratos de C18 por
sonicação, C18 por agitação e sílica por sonicação, definindo para esta proposta a
utilização da sílica como adsorvente mais propício para as análises.
Figura 17 - Cromatogramas com a comparação dos extratos oriundo da Proposta 2 com
o adsorvente C18 por sonicação na cor preta e por agitação na cor vermelha seguindo as
condições da Tabela 7 no SISTEMA 1.
Todavia a realização deste procedimento em amostras contaminadas com os
agrotóxicos não gerou dados com respostas quantitativas. Fato este notado no
cromatograma pela ausência de picos nos tempos de retenção dos analitos em estudo,
como pode ser analisado na Figura 18, ocasionando a eliminação desta proposta pela
inviabilidade do mesmo em fornecer dados essenciais para o trabalho.
Figura 18 - Cromatogramas da análise do extrato fortificado por sonicação utilizando a
sílica (preto) e da solução conjunta dos agrotóxicos seguindo as condições da Tabela 7
no SISTEMA 1.
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
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oto
m
Clo
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ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
61
Proposta 3: Sonicação e LLE
Neste procedimento as amostras avaliadas foram todas contaminadas com 1 mL
de uma solução conjunta dos agrotóxicos na concentração de 10 μg mL-1
aguardando 5
minutos para a evaporação do solvente e absorção dos analitos na amostra. A
quantidade de amostra utilizada para este experimento foi de 1,0 g, o solvente de
extração foi acetonitrila, 5 mL, para a sonicação durante 15 minutos. O extrato
originado foi filtrado em papel de filtro e uma alíquota de 1 mL foi transferida para um
tubo de vidro.
Com a quantidade de amostra transferida foi realizado uma extração líquido-
líquido como clean-up da seguinte forma:
I. Adição de 1 mL de água deionizada seguida de agitação em vortex por 15
segundos;
II. Adição de 1 mL de diclorometano misturando em vortex novamente durante 15
segundos;
III. Com as duas fases formadas para garantir a separação as amostras foram
centrifugadas por 1 minuto a 2100 rpm.
A fase superior (acetonitrila: água) foi descartada enquanto a outra fase
(diclorometano: água) foi submetida a fluxo de N2 para a redução ao máximo do
solvente de extração com posterior retomada e mudança para 1 mL do solvente de
análise (acetonitrila) sendo filtrado em membrana de Nylon 0,22 μm. Utilizando esta
metodologia foram testados diferentes volumes de solvente extrator (1, 2 e 3 mL), com
o intuito de verificar sua influência no método de extração. O resultado obtido pode ser
observado na Figura 19, constatando uma diferença mínima entre os perfis dos
cromatogramas implicando na utilização de 1 mL para a quantidade de diclorometano a
ser utilizado.
62
Figura 19 - Cromatogramas da análise da influência do solvente extrator
Diclorometano no método de extração, sendo o volume de 1 mL em vermelho, 2 mL em
preto e 3 mL em azul e a solução de comparação dos agrotóxicos em verde, utilizando o
SISTEMA 1 e condições descritas na Tabela 7.
Desta avaliação foi perceptível a eficiência do método proposto, tendo em vista
que sinais dos analitos foram notados independentemente do volume de solvente
extrator, como pode ser na Figura 20. Com isso, a metodologia foi estabelecida com
estes métodos de extração e de clean-up dando sequência as análises cromatográficas no
SISTEMA 2 (UPLC-DAD).
Figura 20 - Cromatogramas das análises das amostras contaminadas utilizando a
metodologia de extração da Proposta 3 e o SISTEMA 1 de análise nas condições da
Tabela 7. Em vermelho, preto e azul constam os extratos com diferentes volumes de
Diclorometano e em verde a solução conjunta dos agrotóxicos.
63
4.2 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 2 (UPLC-DAD)
Prosseguindo com as análise dos extratos no SISTEMA 2, foi necessário otimizar
todo o sistema por conta das características diferenciadas que a cromatografia líquida de
ultra eficiência possui, como já mencionado na seção 1.4. Tendo em vista a verificação
da ordem de eluição já observada no SISTEMA 1 foi realizada uma análise em
gradiente exploratório de eluição, contudo, utilizando um tempo de corrida reduzido de
60 para 30 minutos, com a coluna BEH C18 com vazão da fase móvel 0,6 mL min-1
(Figura 21)
Este cromatograma permitiu, em decorrência da presença do mesmo detector do
SISTEMA 1, a verificação/confirmação dos comprimentos de onda de máxima absorção
da luz pelos analitos, como pode ser observado na Figura 22, afirmando que a
propriedade de detecção independe dos sistemas cromatográficos. Todavia, a análise
gerada em virtude dos diversos parâmetros envolvidos no processo de separação
cromatográfica foi passível de avaliação neste sistema para a obtenção da condição
cromatográfica otimizada para as demais análises. Parâmetros estes como vazão da fase
móvel, composição da fase estacionária, gradiente de eluição, tempo de equilíbrio entre
outros que serão descritos posteriormente
Figura 21 - Cromatograma da análise exploratória dos agrotóxicos estudados a partir de
uma solução conjunta em 25 ug mL-1
, utilizando a fase estacionária composta por C18 e
um fluxo de 0,6 mL min-1
.
Time
64
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
25
50
75
100
125
mAU
196
225
276
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
700mAU
198
275
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
50
100
150
200
250
300
350
400
mAU
269
212
389
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
25
50
75
100
125
150
175
mAU
266
214
412
Clotianidina
(CTD)
Imidacloprido
(IMD)
Carbofurano
(CBN)
Haloxifope
(HLX)
Figura 22 - Espectros de absorção em detector UV/Vis com arranjo de fotodiodos dos agrotóxicos em estudo. Em vermelho a varredura dada
pelo SISTEMA 2, em preto para o SISTEMA 1.
65
(continuação da Figura 22)
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
50
100
150
200
250
300
350
400mAU
222
275
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
50
100
150
200
250
300
mAU
223
275
200 250 300 350 400 nm
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100mAU
220
268
261
323
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
mAU
307
364
431
400
Triadimenol
(TDN)
Triadimefom
(TDF)
Tebuconazol
(TBC)
Dissulfotom
(DIS)
66
(continuação da Figura 22)
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
mAU
412
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
mAU
229
288
200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm
0
100
200
300
400
500
600
700
800
mAU
271
412
Endosulfan
(END)
Clorpirifós
(CLF)
Espirodiclofeno
(ESP)
Cipermetrina
(CIP)
67
4.2.1 Parâmetros Avaliados no Sistema UPLC-DAD (SISTEMA 2)
I. Vazão da Fase Móvel
Para o primeiro parâmetro foram avaliados três fluxos: 0,3, 0,6 e 0,7 mL min-1
como pode ser observado na Figura 23, estabelecendo 0,6 mL min-1
como fluxo mais
adequado devido ao perfil dos sinais dos analitos ser mais simétrico e sem muitas
deformações como caudas e assimetria frontal além de não apresentar coeluições dos
agrotóxicos.
Figura 23 - Comparação de diferentes fluxos por meio de solução padrão dos
agrotóxicos em 25 µg mL-1
. O primeiro cromatograma corresponde ao fluxo de 0,3 mL
min-1
, o segundo de 0,6 mL min-1
e o terceiro de 0,7 mL min-1
utilizando gradiente de
eluição em análise exploratória na coluna BEH C18.
II. Fase estacionária
Posterior à analise da vazão da fase móvel foi verificada a composição da fase
estacionária. Com isso foram testadas as colunas BEH C18, HSS CN e CSH Phenyl-
Hexyl da Waters® que apresentam diferentes tipos de ligantes ao suporte sólido de sílica
conferindo polaridades e interações diversas, com a estrutura de cada fase estacionária
descrita na Figura 24.
CLP
CLP
Imid
aclo
pri
do
/
Clo
tian
idin
a
Car
bofu
rano
Hal
oxif
ope
Tri
adim
enol
Tri
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stro
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Tri
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Tri
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efom
Teb
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Dis
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m
Pir
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stro
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Endosu
lfan
Esp
irodic
lofe
no
Cip
erm
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na/
Per
met
rina
Clo
tian
idin
a C
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daz
im
Tia
met
oxam
Imid
aclo
pri
do
Hal
oxif
ope
Clo
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Per
met
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Car
bofu
rano
Tri
adim
enol
Tri
adim
efom
Teb
uco
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ol
Dis
sulf
oto
m
Esp
irodic
lofe
no
Pir
aclo
stro
bin
a
Car
ben
daz
im
Tia
met
oxam
Imid
aclo
pri
do
Hal
oxif
ope
Endosu
lfan
Per
met
rina
Clo
tian
idin
a
Clo
rpir
ifós
Per
met
rina
Cip
erm
etri
na
68
Segundo o fabricante a coluna BEH (Pontes híbridas de etileno) apresenta um
substrato trifuncionalizado ligado ao C18 o que confere seu caráter apolar sendo uma
coluna universal em fase reversa. A respeito da HSS CN (Sílica de alta resistência) que
apresenta grupos propil-ciano ligados ao suporte sólido caracterizando uma fase
estacionária de média polaridade. Já a coluna CSH Phenyl-Hexyl (Superfícies hibridas
carregadas) possui uma seletividade maior do que as colunas tradicionais, pois, o
suporte sólido trifuncionalizado ligado ao C6-fenil retém seletivamente compostos
poliaromáticos através de interações π-π [59,60].
Figura 24 - Esquema da estrutura das fases estacionárias testadas no trabalho. Fonte:
(WATERS) [60]
Com estas características e os dados obtidos pelas análises em modo
exploratório da solução conjunta dos agrotóxicos nestas colunas, observadas na Figura
25 a fase CSH Phenyl-Hexyl foi selecionada para o trabalho. O que apesar do formato
dos picos não apresentar boa simetria na análise prévia foi vinculado um interesse na
otimização das condições nesta fase estacionária devido aos valores maiores ou
comparáveis de intensidade dos picos quando relacionados com as outras colunas, que
poderá permitir análises em níveis mais baixos com uma melhor resposta em relação
aos interferentes, aspectos melhor visualizados na Figura 25.
HSS CN
CSH Phenyl-Hexyl
BEH C18
69
Figura 25 - Comparação do perfil dos picos nos cromatogramas obtidos da análise da
solução conjunta dos agrotóxicos em 25 µg mL-1
com as diferentes fases estacionárias,
o primeiro cromatograma corresponde à coluna BEH C18, o segundo corresponde à
resposta da coluna CSH Phenyl-Hexyl e o último gráfico à HSS CN em gradiente de
eluição em análise exploratória com vazão de 0,6 mL min-1
.
III. Gradiente de Eluição
Apesar da intensidade dos picos ser melhor em relação as outras colunas, a
separação obtida na coluna CSH Phenyl-Hexyl não foi eficiente, resultando em picos
mal resolvidos e sem simetria. Dessa maneira alguns testes foram realizados
modificando as composições das fases móveis, como mostrado na Figura 26 seguindo
os respectivos gradientes da Tabela 9.
Dessa forma, dois aspectos foram observados com as alterações realizadas, a
influência do tempo de equilíbrio e da taxa de mudança da composição da fase móvel.
Ambos contribuem de modo indesejável para a separação dos analitos da seguinte
forma, o tempo de equilíbrio curto não permite a estabilização adequada da coluna
impedindo uma analise sequencial reprodutível e com picos bem resolvidos, observado
na Figura 26 (b), (c) e (d). No que se refere à taxa de mudança da composição da fase
Car
bofu
rano
Tri
adim
enol
Tri
adim
efom
Teb
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lofe
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Cip
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na
Per
met
rina
Car
bofu
rano
Tri
adim
enol
Tri
adim
efom
70
móvel quanto mais lenta maior a perda da simetria dos picos aumentando a “cauda”,
como pode ser notado na Figura 26 (b). Portanto, o gradiente de eluição que apresentou
uma resposta com resolução melhor foi o gradiente com a programação correspondente
a Figura 26(a) na Tabela 9.
(d)
(c)
(b)
(a)
Figura 26 – Cromatogramas da solução conjunta dos analitos em 10µg mL-1
comparando diferentes gradientes presentes na Tabela 9 utilizados para a otimização do
programa de eluição dos analitos, utilizando a coluna CSH Phenyl-Hexyl, vazão de 0,6
mL min-1
e volume de injeção de 10 µL.
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stro
bin
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Endosu
lfan
Esp
irodic
lofe
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Cip
erm
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Per
met
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adim
efom
Endosu
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pri
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Clo
tian
idin
a
Car
bofu
rano
Hal
oxif
ope
Tri
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enol
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Pir
aclo
stro
bin
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Esp
irodic
lofe
no
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Hal
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ope
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Esp
irodic
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Imid
aclo
pri
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Clo
tian
idin
a
Tia
met
oxam
Dis
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oto
m
Pir
aclo
stro
bin
a
Cip
erm
etri
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Per
met
rina
Car
bofu
rano
Tri
adim
efom
Endosu
lfan
Tri
adim
enol
71
Tabela 9 - Composições dos gradientes de eluição dos cromatogramas apresentados na
Figura 26.
Gradiente Programação (Sistema Quaternário)
Figura 26 (a)
Tempo(min) H2O ACN H2O ACN
0,01 45 2,5 50 2,5
25,00 5 45 10 40
30,00 45 2,5 50 2,5
40,00 45 2,5 50 2,5
Figura 26 (b)
Tempo(min) H2O ACN H2O ACN
0,01 45 2,5 50 2,5
2,00 45 3,0 48,5 3,5
3,00 45 3,0 48,5 3,5
5,00 45 2,5 50 2,5
20,00 15 35 10 40
25,00 45 2,5 50 2,5
30,00 45 2,5 50 2,5
Figura 26 (c)
Tempo(min) H2O ACN H2O ACN
0,01 45 2,5 50 2,5
20,00 15 35 15 35
25,00 45 2,5 50 2,5
30,00 45 2,5 50 2,5
Figura 26 (d)
Tempo(min) H2O ACN H2O ACN
0,01 45 2,5 50 2,5
20,00 0 50 0 50
25,00 45 2,5 50 2,5
30,00 45 2,5 50 2,5
72
IV. Tempo de Equilíbrio
Foi verificado no tópico anterior que o tempo de equilíbrio influencia a
estabilização da coluna e com isso a resposta obtida proncipalmente para os analitos que
possuem pouca interação com a coluna, ou seja, clotianidina e imidacloprido, como
pode ser indicado pelas informações de suas propriedades fisico-químicas e estruturas
química presentes nas Tabela 2 e Tabela 5, respectivamente. Para tanto foi calculado o
tempo de equilíbrio (𝑡𝑒𝑞) segundo a Equação 1, visando minimizar os problemas
ocasionados pela falta de estabilização da fase estacionária.
𝑡𝑀 = 0,5𝐿
𝐹(𝑑)2 ∴ 𝑡𝑀 = 0,18 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠
𝑡𝑒𝑞 = 𝑡𝑀 . 0,15(∆%𝐵) ∴ 𝑡𝑒𝑞 = 2,62 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠 (1)
Onde 𝑡𝑀 é o tempo morto; L, o comprimento da coluna; F, a vazão; d, o
diâmetro da partícula e ∆%B variação da quantidade de solvente orgânico.
Em contrapartida este tempo adicionado após a programação do gradiente para a
estabilização da coluna entre as corridas não foi suficiente para evitar a baixa resolução.
Este é um dos problemas do modo gradiente de eluição o “atraso do
equipamento”,“volume de persistência” ou ainda “tempo de persistência”. Desta forma,
o gradiente executado chega ao injetor da amostra, na entrada da coluna, sofrendo um
retardo e a segunda injeção de amostra ocorre antes do final do gradiente anterior ter
alcançado a entrada da coluna. Como resultado, os primeiros picos serão eluídos por
uma fase móvel que está muito forte, comprimindo esses primeiros picos e resultando
em uma pobre resolução. Para evitar o problema, é necessário introduzir uma etapa de
equilíbrio da coluna entre as corridas de duração 𝑡𝑒𝑞 ≥ 𝑡𝑀 [54,52].
Sendo assim diferentes tempos acima do 𝑡𝑒𝑞 foram testados: 5, 6,6 e 10 minutos
(Figura 27). Estabelecendo o tempo de equilíbrio, 𝑡𝑒𝑞, igual à 10 minutos como o mais
eficiente para reduzir a coeluição e o problema da resolução. Possibilitando análises
sequenciais sem perda ou redução dos dados quantitativos necessários para o
desenvolvimento da metodologia.
73
Figura 27 – Cromatogramas das análises da solução conjunta dos agrotóxicos com
concentração de 10µg mL-1
para a otimização do tempo de equilíbrio, onde (a) 2,62
minutos, (b) 5,00 minutos, (c) 6,60 minutos e (d) 10 minutos.
(b)
(c)
(d)
(a)
Clo
tian
idin
a Im
idac
lop
rid
o
Car
bo
fura
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Hal
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Tri
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m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
Car
ben
daz
im
Tia
met
ox
am
Pir
aclo
stro
bin
a
Per
met
rin
a
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
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do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
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l
Tri
adim
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m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
74
V. Volume de Injeção
Após definir todos estes parâmetros foi realizado um teste com intuito de
verificar a influência da quantidade de massa injetada na coluna diminuindo o volume
de injeção de 10 para 5 µL, resultado este observado na Figura 28. Concluindo que a
alteração seria pertinente e necessária para otimizar a separação, realizando assim
análises com os volumes de injeção de 2,5, 2,0, 1,5, 1,0 e 0,5 µL, identificando que o
volume que permitiu obter um pico mais simétrico sem uma diminuição significativa da
intensidade, foi de 2,0 µL, comprovado na Figura 29.
Figura 28 - Otimização do volume de injeção, teste envolvendo a redução de 10 (preto)
para 5 µL (vermelho) com o gradiente do tópico III da seção 4.2.1 e tempo de equilíbrio
do tópico IV da seção 4.2.1 utilizando a solução conjunta dos analitos.
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
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op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
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uco
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ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
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s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
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etri
na
End
osu
lfan
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
efo
m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
75
Figura 29 - Otimização do volume de injeção, análises com volumes de 2,5 a 0,5 µL
nas condições estabelecidas anteriormente presentes na Tabela 7 e Tabela 8.
Com as condições de análise cromatográficas definidas foi verificada a resposta
da metodologia da Proposta 3 descrita na seção 4.1.2.1 na qual foi observada a presença
das substâncias de interesse por meio da cromatografia líquida de alta eficiência. Neste
âmbito o SISTEMA 2 foi utilizado visando minimizar a quantidade de solvente na
eluição e o tempo de análise, além de aumentar a eficiência e a resolução [49] quando
comparados com SISTEMA 1.
4.2.2 Avaliação da Metodologia no SISTEMA 2 (UPLC-DAD)
Nesta etapa, as duas fases formadas pelo processo foram analisadas com fase
estacionária CSH Phenyl-Hexyl, fase móvel acetonitrila: água e gradiente de eluição da
Tabela 7 e Tabela 8. A verificação mostrou que as respostas dos dois sistemas foram
semelhantes, como observado nas Figura 30 e 31.
Por conseguinte, um teste em duplicata com esta metodologia foi realizado para
a obtenção de dados quantitativos de recuperação dos agrotóxicos utilizados na
contaminação da amostra no início do procedimento de extração. Os dados estatísticos
de recuperação para o nível de concentração de 2,0 μg mL-1
estão presentes no gráfico
da Figura 32 com porcentagens entre 26,2% ± 1,2% e 81,7% ± 13,2%. Tendo em vista
que, segundo a ANVISA, o procedimento estatístico para a análise de resíduos de
agrotóxicos apresenta valores de recuperação que podem variar entre 70,0 e 120,0%
com desvio padrão relativo ≤ 20%, porém, valores fora deste intervalo podem ser
0,5 µL
2,5 µL
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
efo
m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
76
admitidos desde que apesar da recuperação ter valores baixos o método demonstre ser
preciso, ou seja, o desvio padrão relativo deve ser mantido ≤ 20%. Sendo assim, os
agrotóxicos que obtiveram respostas quantitativas são pertencentes aos grupos químicos
triazol (TBC, TDF e TDN), organoclorado (END), organofosforado (CLF), cetoenol
(ESP) e piretroide (CIP), em contrapartida, é notável que ajustes ainda precisam ser
feitos possibilitando a obtenção de valores significativos de recuperação e com desvios
padrão reduzidos para todos os analitos.
Figura 30 - Cromatogramas das fases (a) ACN: H2O e (b) ACN: DCM obtidas pela
metodologia de extração da Proposta 3 da seção 4.1.2.1 seguindo as condições
cromatográficas do SISTEMA 2 presentes na Tabela 7.
Figura 31 - Cromatogramas da extração por sonicação e clean-up por LLE (Proposta
3), em verde - amostra testemunha, vermelho - fortificado, marrom - solução de
comparação e em preto - solução dos padrões, obtidos pelas condições otimizadas da
Tabela 7 no SISTEMA 2.
a
b
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
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m
Teb
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m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
End
osu
lfan
77
Figura 32 - Gráfico com valores de recuperação no nível de 2μg mL-1
(n = 2).
4.2.3 Otimização da Metodologia de Extração no SISTEMA 2
I. Tempo de sonicação
Em decorrência do formato dos sinais dos agrotóxicos e visando a redução do
tempo de extração no banho ultrassônico uma curva para averiguar se os analitos sofrem
degradação durante este processo foi realizada. Para tanto uma solução conjunta dos
agrotóxicos com concentração de 10 μg mL-1
foi submetida a tempo de extração na
faixa de 5 a 40 minutos recolhendo alíquotas a cada 5 minutos, a análise destes gerou os
cromatogramas nos quais foi possível observar que não ocorre degradação dos
agrotóxicos. No entanto, a variação da intensidade do sinal só pode ser avaliada através
do gráfico da Figura 33, construído a partir dos valores de intensidade de cada um dos
analitos indicando uma faixa mais estável de resposta entre 10 e 20 minutos para o
desenvolvimento do trabalho.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CTD IMD CBN HLX TDN TDF TBC END DIS CLF ESP CIP
% Recuperação
n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
n.d. - não detectado
81,7 ± 13,2
26,2 ± 1,2
49,6 ± 0,8
67,3 ± 10,9
63,8 ± 0,4
42,2 ± 1,9
50,0 ± 2,0
78
Figura 33 - Gráfico com os valores de intensidades obtidos pelo teste de degradação
dos agrotóxicos.
II. Solvente de Extração
De acordo com as características físico-químicas descritas na Tabela 5, a
solubilidade é parâmetro importante nesta etapa do trabalho. Esta propriedade
possibilita um conhecimento sobre o solvente que realizará uma transferência de massa
mais eficiente durante o processo de sonicação. Os dados apresentados na tabela
indicam que os agrotóxicos tem uma solubilidade maior em solventes orgânicos polares.
Sendo assim, a acetonitrila e o diclorometano foram avaliados na sonicação, no
entanto, outros solventes não puderam ser utilizados em virtude de sua miscibilidade em
relação aos solventes da etapa de clean-up. A sonicação com estes solventes propicia a
difusão destes para dentro da matriz e em sequência, por afinidade, os analitos acabam
migrando para o solvente extrator [45].
Os dados obtidos mostram que os perfis cromatográficos foram semelhantes,
como pode ser observado na Figura 34. Apesar disto, os resultados de recuperação da
Figura 35 demonstraram que a acetonitrila (58,8% - 79,0%) é um solvente extrator
melhor do que o diclorometano (49,9% - 94,8%) sendo selecionada para as demais
etapas de otimização.
79
Figura 35 - Dados de recuperação utilizando acetonitrila e diclorometano como
solvente extrator na sonicação (n = 2). Intensidade utilizadas foram obtidas através das
condições cromatográficas da Tabela 7
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
CTD IMD CBN HLX TDN TDF TBC DIS CLF ESP CIP
Diclorometano
Acetonitrila
49,9
± 3
,5
51,6
± 4
,7
94,8
± 2
,5
55,1
± 3
,1
58,0
± 7
,4
58,7
± 6
,4
57,9
± 7
,2
58,3
± 1
,6
77,8
± 0
,0
61,4
± 5
,6
61,4
± 1
,5
75,4
± 7
,08
77,8
± 5
,9
76,7
± 0
,8
58,8
± 3
,4
75,9
± 0
,1
77,8
± 0
,6
78,4
± 0
,1
76,6
± 1
,2
79,0
± 1
,0
76,2
± 0
,6
77,3
± 0
,7
Figura 34 - Cromatogramas obtido com a sonicação utilizando acetonitrila e
diclorometano como solventes extratores. Seguindo as condições cromatográficas da
Tabela 7 para o SISTEMA 2, onde o cromatograma em preto corresponde ao extrato
com diclorometano, em vermelho com Acetonitrila, em verde, o Branco da amostra e
em azul, a Solução Conjunta dos Agrotóxicos em 10µg mL-1
. C
loti
anid
ina
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
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naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
80
III. Solvente de clean-up
O solvente de clean-up também foi selecionado de acordo com a propriedade
físico-química solubilidade, descrita na Tabela 5, assim como no item II, verificando
sua imiscibilidade com o solvente extrator acetonitrila. Com isso, foram testados os
solventes, acetato de etila, clorofórmio e diclorometano, apresentando os perfis
cromatográficos da Figura 36, na qual podemos observar a presença dos sinais
referentes à matriz em tempos de retenção idênticos para qualquer um dos solventes,
não coeluindo com os agrotóxicos. O que permite nortear a seleção do solvente para
esta etapa em virtude dos valores de recuperação obtidos nas extrações (Figura 37).
Portanto, o solvente que demonstrou dados de recuperação superiores quando
relacionado com os demais foi o diclorometano apresentando recuperações na faixa de
58,8 – 79% com desvio relativo de 0,1 – 7,1%.
81
Figura 36 - Cromatogramas referentes à otimização do solvente de clean-up, onde (a)
Acetato de Etila, (b) Clorofórmio e (c) Diclorometano. No cromatograma em vermelho a
resposta equivalente ao Branco, em preto ao Fortificado e em azul a Solução de
Comparação, todas as análises de acordo com as condições da Tabela 7.
AU
A
U
AU
(a)
(b)
(c)
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
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m
Teb
uco
naz
ol
Dis
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m
Clo
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ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
efo
m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
oxif
op
e
Tri
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eno
l
Tri
adim
efo
m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
irod
iclo
feno
Cip
erm
etri
na
82
Figura 37 - Valores de recuperação obtidos através das análises cromatográficas (n = 2)
segundo a Tabela 7, evidenciando os solventes de clean-up utilizados na otimização do
método.
Após definir o diclorometano como o solvente a ser utilizado no clean-up por
meio da extração líquido-líquido juntamente com a água foi verificada a influência
destes no procedimento. Com isso, um teste adicionando primeiro o diclorometano e
depois a água e outro realizando o inverso foram feitos. Concluindo que essa ordem
influenciava, pois, ao adicionar primeiro a água o diclorometano se solubilizou melhor
na mistura acetonitrila: água e em virtude de sua imiscibilidade em água extraindo
menos os interferentes. O mesmo não foi observado quando o diclorometano foi
misturado primeiro ao extrato em acetonitrila porque ao se formar a mistura
diclorometano: acetonitrila a água adicionada não solubiliza os interferentes presentes
na mistura em decorrência da miscibilidade reduzida pela presença do diclorometano. O
que foi demonstrado pelos dados de recuperação deste experimento, apresentados na
Figura 38. Finalizando assim a otimização da metodologia de extração visualizada
anteriormente na Figura 21.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
CTD IMD CBN HLX TDN TDF TBC DIS CLF ESP CIP
Acetato de Etila
Clorofórmio
Diclorometano
35,7
± 7
,1
41,4
± 0
,9
40,1
± 0
,1
39,4
± 0
,3
34,9
± 2
,6
35,4
± 5
,0
35,4
± 7
,4
35,0
± 7
,9
32,1
± 2
,
36,3
± 1
,1
36,3
± 0
,9
38,6
± 1
,1
39,3
± 0
,1
44,6
± 1
,1
38,1
± 0
,0
30,6
± 3
,4
31,6
± 4
,2
36,7
± 6
,6
29,3
± 0
,1
34,4
± 6
,2
33,0
± 7
,5
75,4
± 7
,1
77,8
± 5
,9
76,7
± 0
,8
58,8
± 3
,4 75,9
± 0
,1
77,8
± 0
,6
78,4
± 0
,1
76,6
± 1
,2
79,0
± 1
,0
76,2
± 0
,6
77,3
± 0
,7
83
4.3 SISTEMA CROMATOGRÁFICO 3 (LC-MS/MS)
A fim de possibilitar as análises por espectrometria de massas, algumas variáveis
foram otimizadas para cada agrotóxico de acordo com a configuração do equipamento.
Desta forma, uma análise dos principais fragmentos de cada analito foi realizada, com o
intuito de selecionar aqueles mais intensos, como pode ser observado na Figura 39.
Diante disto e com base nos dados pré-programados de máximos e mínimos
aceitáveis pelo analisador de massas, as voltagens da fonte (energia de capilar, 3,5 kV e
energia de cone, específica para cada analito como pode ser observado na Tabela 10), a
temperatura da fonte (dessolvatação do N2), 450 ºC, a vazão de gás na fonte (volume de
gás de dessolvatação, 900 L h-1
e volume de gás no cone, 50 L h-1
) e as energias de
colisão (Tabela 10), para gerar cada um dos fragmentos especificados na Figura 39,
foram os parâmetros otimizados individualmente para cada agrotóxico e que
possibilitaram o resultados observado na Figura 40 e 41.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
110,0
CTD IMD CBN HLX TDN TDF TBC DIS CLF ESP CIP
Diclorometano primeiro
Água primeiro
95,0
± 4
,4
102
,5 ±
2,5
98,6
± 4
,0
103
,1 ±
1,7
75,7
± 7
,1
77,9
± 5
,9
76,8
± 0
,8
75,9
± 0
,1
77,8
± 0
,6 91,9
± 3
,4
58,8
± 3
,4
84,0
± 1
,9
85,7
±
2,1
89,6
± 2
,9
74,1
± 6
,2
91,2
± 3
,4
91,9
± 3
,6
78,4
± 0
,1
76,6
± 1
,2
79,0
± 1
,0
76,2
± 0
,6
77,3
± 0
,7
Figura 38 - Dados de recuperação do teste realizado para verificar a influência da
ordem dos solventes utilizados no clean-up (n=2), separados com as condições
cromatográficas da Tabela 7.
84
Clotianidina
(CTD)
Imidacloprido
(IMD)
Haloxifope
(HLX)
Carbofurano
(CBN)
Figura 39 - Fragmentos utilizados para a quantificação e confirmação dos dados quantitativos das amostras analisadas no SISITEMA 3 segundo
as condições da Tabela 7.
85
(continuação da Figura 39)
Triadimefom
(TDF)
Triadimenol
(TDN)
Tebuconazol
(TBC)
Dissulfotom
(DIS)
86
(continuação da Figura 39)
Clorpirifós
(CLF)
Espirodiclofeno
(ESP)
Cipermetrina
(CIP)
87
Tabela 10 - Parâmetros otimizados no SISTEMA 3 (LC-MS/MS)
Agrotóxico Fragmentos (m/z) Econe (V) Ecolisão (V)
Clotianidina
m/z 249,9
Quantificação 168,8 23
13
Identificação 131,9 13
Imidacloprido
m/z 256,1
Quantificação 208,9 25
15
Identificação 175,0 15
Carbofurano
m/z 222,1
Quantificação 122,9 25
20
Identificação 165,0 10
Haloxifope
m/z 362,0
Quantificação 316,0 40
18
Identificação 91,1 28
Triadimefom
m/z 294,0
Quantificação 196,9 32
15
Identificação 224,9 15
Triadimenol
m/z 296,1
Quantificação 70,0 18
10
Identificação 227,1 10
Tebuconazol
m/z 308,2
Quantificação 69,9 38
20
Identificação 124,9 35
Dissulfotom
m/z 275,1
Quantificação 88,9 12
5
Identificação 61,0 39
Clorpirifós
m/z 350,0
Quantificação 96,7 27
33
Identificação 197,8 15
Espirodiclofeno
m/z 411,1
Quantificação 70,7 25
15
Identificação 313,3 11
Cipermetrina
m/z 433,0
Quantificação 190,8 25
11
Identificação 126,9 29
88
Figura 41 - Cromatograma da análise do extrato fortificado na concentração de 0,1 mg
L-1
com detector espectrofotométrico em 220 nm, seguindo as condições de análise
descritas nas Tabela 7 e Tabela 8.
Clo
tian
idin
a
Imid
aclo
pri
do
Car
bo
fura
no
Hal
ox
ifo
pe
Tri
adim
eno
l
Tri
adim
efo
m
Teb
uco
naz
ol
Dis
sulf
oto
m
Clo
rpir
ifó
s
Esp
iro
dic
lofe
no
Cip
erm
etri
na
Figura 40 - Cromatograma dos íons de quantificação dos agrotóxicos avaliados
utilizando as condições cromatográficas descritas nas Tabela 7 e Tabela 8.
89
4.4 VALIDAÇÃO
4.4.1 Linearidade e Sensibilidade
Com a metodologia definida foram realizadas análises no SISTEMA 2 e no
SISTEMA 3 das soluções conjuntas dos agrotóxicos para a obtenção das curvas
analíticas com concentrações 0,01, 0,5, 2,5, 5,0 e 10 mg L-1
para o SISTEMA 2 e 0,01,
0,1, 0,5 e 1,0 mg L-1
para o SISTEMA 3, dados estes descritos na Tabela 11 e Tabela
12, respectivamente.
Tabela 11 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos agrotóxicos em
um intervalo linear de 0,01 a 10 mg L-1
. Obtidos através dos valores de intensidade
fornecidos pela análise cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA
2 (n = 3).
Princípio
Ativo
Tempo de Retenção /
min Equação da Reta
Coeficiente de
Correlação
CTD 3,07 y = 1194,0x - 40,464 1,0000
IMD 3,60 y = 1470,2x + 39,776 0,9996
CBN 6,15 y = 1753,1x + 116,36 0,9999
HLX 7,68 y = 2312,3x + 64,348 0,9988
TDN 9,31 y = 1988,8x + 415,05 0,9995
TDF 10,36 y = 2421,0x + 17,699 0,9998
TBC 10,87 y = 5510,5x + 500,84 0,9999
DIS 13,33 y = 3615,2x + 630,94 0,9998
END 14,59 y = 1263,7x + 215,51 0,9996
CLF 15,14 y = 2377,8x + 142,34 0,9999
ESP 16,54 y = 5510,6x + 181,64 0,9999
CIP 17,52 y = 3402,5x + 106,18 0,9999
90
Tabela 12 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos agrotóxicos em
um intervalo linear de 0,01 a 1,0 mg L-1
. Obtidos através dos valores de intensidade
fornecidos pela análise cromatográficas segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA
3 (n = 3).
Princípio
Ativo
Tempo de Retenção /
min Equação da Reta
Coeficiente de
Correlação
CTD 4,57 y = 725,8x + 3125,1 0,9981
IMD 4,81 y = 962,8x + 3936,5 0,9979
CBN 6,08 y = 3403,9x + 7538,5 0,9998
HLX 7,11 y = 978,2x + 5058,9 0,9983
TDN 7,64 y = 1499,1x + 5183,2 0,9997
TDF 7,65 y = 7154,2x + 24020,8 0,9987
TBC 8,19 y = 7926,0x + 59327,5 0,9982
DIS 8,49 y = 501,8x + 2490,0 0,9985
CLF 9,11 y = 842,4x + 11576,8 0,9964
ESP 9,37 y = 2440,8x + 26344,0 0,9959
CIP 9,67 y = 196,9x + 5392,4 0,9974
Com isso, foi possível observar parâmetros como linearidade e sensibilidade, a
linearidade é dada pelo coeficiente de correlação do gráfico obtido pela equação da reta
de comportamento linear y = ax + b e a sensibilidade é caracterizada pelo coeficiente
angular (a) desta equação. A linearidade é considerada satisfatória quando o coeficiente
de correlação da reta não é diferente estatisticamente da unidade, sendo aceitável para a
ANVISA um mínimo de 0,99. Demonstrando que os resultados obtidos apresentam uma
relação linear ou diretamente proporcional com a concentração do analito dentro do
intervalo estabelecido [61].
A sensibilidade do método está correlacionada com o coeficiente angular, sendo
a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de confiança, duas
concentrações próximas. Portanto, uma pequena variação na concentração do analito
gera uma grande diferença no sinal de resposta, parâmetro este que expressa a
91
capacidade do método analítico suscitar mudanças na propriedade monitorada, no caso,
intensidade. Ou seja, quanto mais sensível o método maiores os valores dos coeficientes
angulares que variaram na faixa de 1194,0 - 5510,6 para o SISTEMA 2 e de 196,9 -
7926,0 para o SISTEMA 3, o que está de acordo com a Tabela 11 e Tabela 12 [57,61].
4.4.2 Efeito matriz
Este parâmetro investiga a ocorrência de substâncias inerentes da matriz que
coeluem com compostos de interesse. Apesar da cromatografia líquida de ultra
eficiência/espectrometria de massa ter uma elevada seletividade e especificidade
apresenta desvios, uma vez que a presença de substâncias oriundas da matriz que não
são monitoradas e que coeluem podem afetar a detecção dos analitos comprometendo a
ionização, o que define o efeito matriz. Sendo assim, há alguns fatores que contribuem
com este efeito, a competição entre o analito e componentes não voláteis presentes na
matriz, a transferência de elétrons do capilar para a solução e a separação de cargas na
superfície das gotas que irão dar origem aos íons do analito na fase gasosa [55,62].
Com isso, a quantificação do efeito matriz foi realizada através da razão dos
coeficientes angulares (RCA) das curvas analíticas preparadas no extrato da matriz e no
solvente, presentes na Tabela 12 e Tabela 13. Como resultado desta razão o valor igual
a 1,0 significa que nenhum efeito matriz foi observado, se este valor for menor que 1,0 a
houve a supressão da ionização e para valor maior que 1,0 indica um aumento na
ionização [62]. Portanto, o teste realizado demonstrou que segundo este conceito
ocorreu efeito matriz positivo em todos os agrotóxicos estudados com exceção da
cipermetrina, na qual o sinal foi suprimido, valores especificados na Tabela 14
evidenciando a necessidade de uma quantificação dos analitos através da curva
preparada no extrato da matriz.
92
Tabela 13 - Equação da reta e coeficientes de correlação da análise dos agrotóxicos
preparados no extrato da matriz em um intervalo linear de 0,01 a 1,0 mg L-1
. Dados
obtidos através dos valores de intensidade fornecidos pela análise cromatográficas
segundo a Tabela 7 e a Tabela 8 no SISTEMA 3.
Princípio
Ativo
Tempo de Retenção /
min Equação da Reta
Coeficiente de
Correlação
CTD 4,57 y = 3114,1x + 31031,4 0,9991
IMD 4,81 y = 4605,1x + 48319,1 0,9984
CBN 6,08 y = 22684,1x +67924 0,9996
HLX 7,11 y = 5017,6x +10522 0,9998
TDN 7,64 y = 9422,2x +58006,6 0,9974
TDF 7,65 y = 6925,4x + 35278,1 0,9962
TBC 8,19 y = 54041,2x + 319602 0,9944
DIS 8,49 y = 3014,1x – 5317,8 0,9996
CLF 9,11 y = 4178,1x + 10032,1 0,9988
ESP 9,37 y = 11498,7x -36873 0,9991
CIP 9,67 y = 94,9x + 93,6 0,9954
Tabela 14 - Valores das razoes dos coeficientes angulares das curvas analíticas
preparadas no extrato da matriz e no solvente.
Analito Coeficiente Angular
RCA Matriz Solvente
CTD 3114,1 725,8 4,3
IMD 4605,1 962,8 4,8
CBN 22684,1 3403,9 6,7
HLX 5017,6 978,3 5,1
TDN 9422,2 1499,1 6,3
TDF 6925,4 1193,9 5,8
TBC 54041,2 7926,0 6,8
DIS 3014,1 501,8 6,0
CLP 4178,1 842,4 5,0
ESP 11498,7 2440,8 4,7
CIP 95,0 197,0 0,5
93
4.4.3 Precisão
Segundo a ANVISA, a precisão é definida como a estimativa da dispersão de
resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras
semelhantes ou padrões, em condições definidas [56]. Existem diferentes formas de
avaliar este parâmetro: repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade. O
critério utilizado para este trabalho foi a repetitividade que a ANVISA estabelece que
seja verificado a partir de, no mínimo, nove determinações em três níveis com três
replicatas cada um. Com resultados expressados em função dos desvios padrão relativos
(RSD) ou coeficientes de variação (CV), seguindo a fórmula [55,56]:
𝑅𝑆𝐷 (%)𝑜𝑢 𝐶𝑉 (%) = 𝑠
�̅� 𝑥 100
Na qual, 𝑠 corresponde ao desvio padrão e �̅� a média aritmética das
determinações. Entretanto, em métodos de análise de traços são aceitos CV de até 20%
dependendo da complexidade da matriz [55,56,62]. De acordo com a Tabela 15, a
maioria dos agrotóxicos, menos a cipermetrina em uma das concentrações tiveram
valores de coeficiente de variação menores do que 20%, mostrando que a metodologia
desenvolvida é precisa.
94
Tabela 15 - Valores de desvio padrão e coeficiente de variação dos agrotóxicos estudados (n = 9).
Agrotóxico
Concentração
0,1 mg L-1
0,2 mg L-1
0,3 mg L-1
0,5 mg L-1
�̅� * 𝑠** CV *** �̅� 𝑠 CV �̅� 𝑠 CV �̅� 𝑠 CV
CTD 76,2 2,2 2,9 82,9 2,7 3,2 102,4 0,7 0,7 99,9 3,9 3,9
IMD 81,9 1,1 1,3 84,1 3,4 4,1 100,0 0,6 0,6 98,1 2,4 2,5
CBN 81,0 0,9 1,1 82,7 3,2 3,9 95,7 1,6 1,7 97,5 2,2 2,3
HLX 58,2 3,2 5,4 67,7 2,3 3,4 94,4 1,3 1,4 95,9 2,6 2,7
TDN 79,8 1,3 1,7 85,4 3,5 4,0 96,0 1,3 1,3 97,3 2,3 2,4
TDF 75,3 2,1 2,8 83,5 3,6 4,4 95,3 2,6 2,7 97,0 2,3 2,3
TBC 74,2 2,0 2,7 80,0 3,4 4,2 89,7 1,3 1,5 94,9 2,0 2,1
DIS 78,1 8,1 10,2 75,0 4,4 5,8 74,3 3,7 5,0 65,4 5,4 8,3
CLP 70,5 12,2 17,3 63,8 5,7 9,0 66,2 2,2 3,4 46,1 5,6 12,1
ESP 55,4 5,5 9,9 61,4 4,4 7,1 57,7 3,0 5,2 47,8 6,1 12,8
CIP - - - 60,5 7,5 12,4 65,0 9,9 17,1 37,1 11,8 24,7
*�̅� - média dos valores de recuperação; ** 𝑠 - desvio padrão; ***CV - coeficiente de variação.
95
4.4.4 Exatidão
A exatidão corresponde à proximidade dos resultados obtidos pelo método em
estudo em relação ao valor verdadeiro, segundo a definição da Resolução nº899 da
ANVISA [61]. A exatidão se correlaciona com os valores de precisão, pois estes
delimitam os limites para o método ser considerado exato. Estabelecendo uma
quantidade mínima para a avaliação deste parâmetro semelhante à precisão, mínimo de
nove determinações. Com isso, existem processos que são mais utilizados para avaliar a
exatidão de um método analítico são: materiais de referência, comparação de métodos,
ensaios de recuperação e adição padrão [55,62].
Para o trabalho o processo de ensaios de recuperação foi o escolhido para dar
sequência a validação da metodologia. Para tanto, os resultados foram comparados à
faixa aceitável estabelecida por órgãos regulamentadores para a análise de resíduos de
agrotóxicos de 70,0 %-120,0% [57,63]. O que torna a metodologia exata para os
analitos Clotianidina, Imidacloprido, Carbofurano, Triadimenol, Triadimefom,
Tebuconazol e Dissulfotom, para as concentrações de 0,1, 0,2 e 0,3 mg L-1
, como a
Figura 42 e a Tabela 15 confirmam com os valores de recuperação e seus respectivos
desvios padrão.
96
Figura 42 - Representação gráfica dos valores de recuperação dos agrotóxicos com seus respectivos desvios padrão presentes na Tabela 15 para
os quatro níveis de concentração avaliados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CBN CTD IMD DIS TDF TDN TBC CLP HLX ESP CIP
0,1 ug mL-1
0,2 ug mL-1
0,3 ug mL-1
0,5 ug mL-1
0,1 µg mL-1
0,2 µg mL-1
0,3 µg mL-1
0,5 µg mL-1
97
4.4.5 Limite de Detecção e Quantificação
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração que pode ser
detectada, mas não necessariamente quantificada, sob condições experimentais
estabelecidas. Como as análises dos brancos foram apresentadas como linha de base, as
seguintes fórmulas estimaram o valor de limite de detecção presentes na Tabela 16 [57].
𝑠𝑐𝑜𝑚 = √(𝑚−1)𝑠𝐴
2 +(𝑛−1)𝑠𝐵2
𝑚+ 𝑛−2 𝐿𝐷 =
2 𝑥 𝑡𝑛,95% 𝑥 𝑠𝑐𝑜𝑚
𝑆
onde m = o número de determinações do menor nível de fortificação; n = o
número de determinações do branco; 𝑠𝐴 = desvio-padrão da amostra do menor nível de
fortificação; 𝑠𝐵= desvio-padrão do branco; S = sensibilidade do aparelho e 𝑡𝑛,95% =
valor tabelado em função de n (número de análises).
Tabela 16 - Valores do limite de detecção dos agrotóxicos de trabalho.
Agrotóxico 𝒔𝒄𝒐𝒎 𝑳𝑫/ mg L-1
CTD 6,3 0,001
IMD 3,3 0,004
CBN 1,8 0,001
HLX 3,7 0,004
TDN 3,9 0,002
TDF 1,5 0,001
TBC 9,2 0,001
DIS 8,9 0,008
CLP 6,0 0,004
ESP 3,5 0,001
CIP 2,7 0,103
O limite de quantificação significa a menor concentração da substância em
análise que pode ser quantitativamente determinado com valores aceitáveis de precisão
e exatidão [57,62]. De acordo com os valores apresentados na Tabela 15, o limite de
98
quantificação foi estabelecido como 0,1 mg L-1
para clotianidina, imidacloprido,
carbofurano, triadimefom, triadimenol, tebuconazol e dissulfotom.
99
5. CONCLUSÃO
A metodologia proposta através da utilização das técnicas de extração em fase
sólida por sonicação e clean-up com extração líquido-liquido foi otimizada para o
sistema LC-MS/MS, mostrando-se apta para a finalidade do trabalho de avaliar os
resíduos dos agrotóxicos aplicados amplamente na cafeicultura. Com este sistema foi
possível atingir baixos níveis de concentração, com boa sensibilidade, em menor tempo
e melhor resolução quando comparadas com o sistema UPLC/DAD.
No entanto, os valores obtidos no processo de validação permitiu assegurar
dados confiáveis para sete dos onze agrotóxicos estudados, a clotianidina, o
imidacloprido, o carbofurano, o triadimefom, o triadimenol, o tebuconazol e o
dissulfotom, os quais apresentaram valores de exatidão (74,2% - 102,4%) e precisão
(0,6% - 10,2%) correspondendo à faixa aceitável para a análise de resíduos de
agrotóxicos que seria de 70,0-120,0% com CV ≤ 20,0%. Portanto a metodologia
desenvolvida para a avaliação dos agrotóxicos mostrou-se eficiente para a determinação
de agrotóxicos de diferentes grupos químicos.
6. PERSPECTIVAS DO TRABALHO
Avaliar cafés com diferentes graus de torrefação;
Inserir outros grupos químicos de agrotóxicos.
Aplicar a metodologia em café verde;
Comparar a quantidade de resíduos presentes no café verde e no torrado.
100
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