DEGRADACION MICROBIANA DE SUBPRODUCTOS lIGNOCElUlOSICOS.

C.SAIZ-JlMENEZ

Dirección General del Medio Ambiente.

Junta de Andalucía.

Avda.República Argentin8,21-B

SEVILLA-lI

INTRODUCCION.

La 1ignina, junto a la celulosa, es el polímero más abundante en la naturale­

za. Se ha estimado que la producción anual de b:i.omasa terrestre es de 100 x

109 toneladas, de las que 20 x 109 toneladas corresponden a ligOl.na (Bassharn,1975).

Normalmente, el concepto lignlna se suele asociar al de madera, ya que

es en el xilema de árboles y arbustos donde en encuentra más abundantemente,

en proporción del 20 al 30%. En una fibra típica de l:1aclera, la lámina media

posee la mayor concentración de llgnina (60-90%), de entre ~odas las capas

~¡,;e forman la ?ared celular, lo que representa el lG-30% del tetal de llgnlna

~n la fibra. La concent:,aclon de llgr,~na ~n :2S pared~!;: cl",ulares p,¡ma:'la

y secwndaris es relativamente baja, pero representa el 70-90% del t.ot.al de

lignina. Sin embargo, también existe lignina, en mayor o menor cantidad, en

otras partes de la planta, como raices,frutos, semillas,etc. Los tallos de

helechos, hierbas e incluso algunos musgos contlenen elevados porcentajes de

lignins, respecto a su biomasa total.

La función de la lignina es conferir solidez, rigidez y elasticidad a

los teJidos. Las sequoias gigantes de California dan una ldea de la perslstencia

de los tejidos lignificados, ya que alcanzan periodos de vlda de 4 a 5.000

años, alturas superiores a 90 metros y soportan varias toneladas de peso. Durante

todos esos años han debico resistir innumerables tormentas, fuegos y ataques

de iQsectos y microorganismos.

En las plantas, la lignina no sólo incrusta las microfibrillas de celulosa,

recubriéndolas, slno que

vegetales. Químicamente.

metabólico que limita la

está física y químicamente unida a los paliaae'áridos

la unión lignina-carbohidratos origina un bloqueo

acción de las celulasas microbianas, de forma que

miroorganismo~ celuloliticos muy activos. como Trichoderma v~ride. Mvro·thecium

verrucaria, en~re hongos, o Bacillus polymixa. ThermomonQs para fusca o los

habitantes del rumen, entre las bacterias, no pueden alterar la celulo~a de

la madera. FiSlcarnente. la Uo.gnl.na forma una barrera que impide la pene-tración

de las enzimas (Kird y Harkin, 1973). POr ello. la lignina. que es el polímero

natural más reSl.stente al ataque microbiano, confiere protección a los vegetales

frente a los microorganismos patógenos, limitando la eficiencia y grado de

utilización de los polisacáridos, tanto por aquellos como por los animales.

La utilización de la celulosa como sustrato para procesos de conversión

enzimática viene deter~inada por su cristaliniaad, la lignificación de las

paredes celulares y M.I accesibilidad a las enzimas extracelulares y metabolitos

secretados por los Qilcroor~anismos celuloliticos, puesto que el contacto f.ísico

directo es un prerequ1s1to para la hidrólisis. En este último caso, la hidrólisis

sólo puede producirse por difusión de las enzimas en la compleja matriz estructural

de los vegetale~, ya que las enzimas celuloliticas, como otras enzimas, son

moléculas pro~éicas solubles en agua. Tales enzimas degradan más fácilmente

las porciones amorfas de celulosa que las cristalinas y, consecuentemente,

a medida que progresa la hidrolisis, se observa un significativo incremento

en la cristalinidad óe la celulosa y, por tanto, una mayor resistencia a la

degradación del material residual. Esta mayor resistencia de la celulosa cristalina

(moléculas lineales de celulosa, enlazadas lateralmente por puentes de hidrógeno

y. asociadas en diversos grados de paralelismo), altamente orientada, se debe

no sólo a su inaccesibilidad a las moléculas de enzimas, sino también a la

configuraci6n y rigidez estérica de las unidades de glUcosa en las regiones

cristalinas (Cowling y Kirk, 1976).

La protección de la celulosa por la lignina obliga a que, cualquier proceso

que pretenda obtener celulosa de materiales lignocelulósicos, deba utilizar

un sistema que perm::.ta 1& aolubilizar.:ión o extracción de la lignina y rompa

las unione$ 11gn~n~-carbohidrato. La delignificación puede efectuarse quimica,

física o hiológicilment~o. Químicamente se realiza mediante hidrólisis ácida

o alcalina, $ul1·u.. ... ,> ';lódl.cc> alcalino, cloruro de zinc, dióxido de azufre en

caliente, etf" {Grant et al.. 1977; Millet et al., 1975_76; Gonzalez Santillana,

1978;Greenhalgn. 1978), algunos de cuyos procesos ya fueron revisados en el

marco de la anter10r Reunión, celebrada en esta Escuela. así como los tratamientos

físicos (DulPhf! 1978).

COll'lPara-t '""'te, la delignificación biológica ofrece apreciables ventajas

14~

respecto a los anteriores trata.1entos, como son el bajo costo, alta especificidad,

míniru. producción de residuos,. y fOI'lll8.ción de subproductos utilizables. Ya

Worgan (1978) presentó algunos aspectos de este interesante prOceso, sin embargo r

desde entonces se ha progresado enormemente, tanto

como en los puramente quimicoa y bioquimicoa,

volver a incidir nuevamente en el tema.

BIOQUIMICA DE LA DEGRADACION.

en los aspectos biotecno16gicos.

por lo que parece justificado.

De todos los diferentes grupos taxonómicos de microorganismos, los más eficien­

tes en la degradación de residuos lignoce1ulósicos son los Basidiomicetos (Setliff

y Eudy, 1980; Eriksson ,1981; Sáiz-Jimenez. ,1983) , mientras que las bacterias

degradan nula o escasamente la madera o afectan sólo a algunos de sus componentes,

principalmente los polisacáridos (Cravford,1978), si bien Haider y colaboradores

(1978,1980) han demostrado la degradación, en cultivos axénicos, de fenoles

deri vados de la lignina y polimeros sintéticos semejantes a la 11gnina. Otros

grupos de hongos. como los Hifomicetos y Ascomicetos atacan la madera, degradando

la celulosa, pero alterando debi1mente la 1ignina, siendo la demetilación de

grupos metoxilos su acción más importante (Duresn ,1960; Kirk ,1971 ¡ Haider y

Trojanowski,1978)o.

Mientras que los mecanismos enzimáticos implicados en la degradación de

la celulosa han sido especialmente bien estudiados en los hongos (Reese, 1977¡

Eriksson ,1981), en los que se ha demostrado que el ataque hidroHtico se lleva

a cabo, principalmente, por tres diferentes tipos de enzimas. endo y exo-l, 4_

p-glucanasas y l,4-P-g1ucosidasa (figura 1), el conocimiento de la degradación

de la lignina está lejos óe ser completo,aunque en los últimos años se han

realiz.ado aceptables progresos.

La información sobre la degrada-=ión de la lignins, una de cuyas estructuras

típicas se muestra en la Figura 2, se roñen! mediante comparación químico-estructu­

ral de 1igninas y sus prOductos de óegradación, antes y después de la incubación

con hongos, fundamentalmente Basidiomicetos (Haider et al.,1981; Chua et al .• 1982;

Chen et al. ,1983). as! como por el estudio del metabolismo de compuestos simples,

tipo ácido vanl11ico, ácido ferúlico,alcOhol verátrico,etc. (Lundquist y Kirk,1978¡

Buswell et al. ,1979,1982: Ander et al., 1980¡ Gupta et al., 1981) Y la identifica­

ción de las enzimas implicadas en estos procesos (Westermark y Eriksson,1974¡

Yajima et al. ,1979; Buswell f!'- al., 1981). Estas últimas, .1un"to a la fenoloxidasa

(Kirk.1975; Ander y Eriksson,1976) participan indudablemente en la degradaCión

142

lignina

celulosa HzÜ® H202 m '8/ / Ui Ó °2 oligo- S '1 ~A / sacáridos ,/

~2 quinona ,/

\ í2\ ¿ fenol H20 \ ~ \ \B)eliO;~;éD ceIOb';:tonOlacton;aCidO celoOiónic,

]¿--._~j ~\ ~/-H20

glucosa ~9IUCOnolacto~ acido glucónico

~H2020H20~ Sporotrichum pulverulemum

Figura l. Mecan1Smos enzimáticos de la degradación de celulosa y su regul!

ción extracelular por Sporotrichum pulverulentum. según Eriksson.

(1981). Las enzimas implicadas son: l. endo-l,4-p-glucanasas; 2.

exo-l,4-p-glucanasa; 3. P-glucosidasas: 4. glucosaoxidasa¡ 5. C!

lobiosaoxidas8: 6. celooiosa:quinona-oxidoreductasa; 7. catalasa.

A (fenolox1dasa) y B (peroxidasa) representan enzimas que inter­

vienen en la degradación de la 11gnina.

C

1: , C

He JI/) II¿-a-

CH,oH I

HC-O­I

HCOH H('zO ICHJOHI ~ CU,QH

I! CH,o I (,H~H

-OCH o o/;CH ~H CH,D o 11 15 HroH I H ~OO ,

OH

rn,o I CH,D $14 HOH,('('(:;,.. O--(H . O" H ~O r HD("¡ OCH, /0,,

UroH I o HI; eH Q He I I I He --CH 2 HCOH CH,oH I I

H~OH -$ HoJ9\..CH~ HC'O/CH I O--CH JI) }=dHCoH I (-H,O OCH, OCH~/O

IIC---O S OCH)

o .$ HOH'¡¡ CHp HOC",H) 1) HC

He; OCH) HC.OH HC-O ~

r,¿., CH,DH H,cOH eH oY CH,ay I 1) o

O---("H HC I ,

~H ~O CHP~~~i

Figura 2. Principales estructuras d~ una lignine de conífera. Los enlaces

entre'las unidades 1 y 2, 2 Y 3, ~ Y 5, 6 Y 7, Y 7 Y 8 son los

más abundantes. Otros enlaces c~antitativamente importantes son

los existentes entre las unida6es 3 y 4, 5 Y 6, Y 8 Y 9. Según

Kirk y Fenn (1982).

144

de la lignina.pero,desgraciadamente. hoy día es imposible conocer cada una

de las enzimas que intervienen en el proceso y el papel que juegan en éste.

La 1.Illportancia de la fenoloxidas8 en la degradación de la lignina ha sido,

puesta de manlfiento recientemente por Ander y Eriksson (1976), si bien ya

anteriorment~ se ;onocia Ld relacl.Ón existente entre los hongos capaces de

degradar ll.gnl.na y la reaccl.ón de fenoloxidasa posi ti va -test de Bavertiarnm ,...

(Davidson et al., 193P; Sundmam y Nase, 1971).

En ~fecto. Ander y Eriksson (1976) obtuvieron un mutar.te de Sporotrichum

pulverulentum restado ~onidial.imperfecto. de Phanerocheete chrysosporiUlll)

sin fenolox:i.rlllsu, incapn~ l~ riegradar la 1ignina de la Ilu:.Jera, mientras que

el revert::l.ente de: ::.;;e,-, llutrun:e degradaba la lignina en la misma proporción

que la e~tlrpe orlg~nal.

La accl.Ón de .!.é t'enolo:iUdasl:l. t!S oxida1:l.va, formando quinonas (Ishihara,

1980; Hi¡uchi. 19H1 ¡, y lJuestc =!ue para ~llo se requiere la presencia de hidroxilos

fenólicos l:ibret;. ,~Q'" 'f'eno.í.~s ~tel:"i.f:i.cadoa nO pueden ser substra'tos de la enzima.

Ejemplo de "':.81 ,"!acci6r -as .!.a degradación de sl.rl.ngi1glico1-,B-guayacil éter

por P01reorus versl.co1or y ~ frustulatum (Kirk et al., 1968) Y la producción

de 2,6-dimetoxi-p-benzoquinona (Figura 3).

H~-O-Q

*HCOH 1::::

H3CO O OCH 3

OH

9

--_O ('¡¡ HjCO~OCH3

O

Figura3. Degradación de siringilglicol-j&-guayacil éter

por Polreorus versicolor y Stereum frustulatum.

Las estimaciones del número de hidroxilos fenólicos por diversos métodos

arrojan un valor de 20 grupos fenólicos por cada 100 unidades fenilpropano

(unidad básica. de 1n Hgl1l..na). por 10 que es evidente que las 80 unidades restantes

no r;luoden Udl:: ('3Ubtrtl'~i:o de la tenoloxidas8 y requieren otro tipo de enzimas

capaces de romper el ~fllace I)t:ereo. La existencia de eterasas fué demostrada

por .·Wcu:uml. ~t a.l.. (1969) y más recientemente por Weinstein et al. (1980).

mediante incubac1.6n de veratrilglicerol-~guayacil éter y obtenci6n del alcohol

14·5

verátrieo{Jigura 4) en cultivos de Phañerochaete chryaosporiu..

CH20H

I Hi-o-Q ;2:;' VOCH3

OCH:.

~:,"' OCH:.

Figura4. Degradaci6n de veratrilglicero1-)5-guayacil_

éter por Phanerochaete chrysosporium

Otras reacciones implicadas en la degradación de la lignina son las de

metilaci6n, ruptura oxidativa de puentes . t.<. -C, y C.s -Cr en cadenas laterales.

oxidación de grupos hidroxilos a carbonilos, ruptura oxidativa de nucleos aromáti­

cos, etc. (Chen et al., 1982; Tai et al., 1982; Chen et al., 1983).

El ácido vimíllico es el producto de degradaci6n más abundante obtenido

en el ataque de madera de abeto por Phanerochaete chrysosporium (Chen et al ...

1982) Y prOducido por la ruptura de la cadena alifática entre los ~ y C..s' y

posterior oxidación del carbono ,en las distinas unidades representadas en

la ·figura 2 ••

El metabolismo del ácido vanillico ha sido estudiado por Andel' et al.

(1980) y Buswell et al., (1982), qUienes encontraron que éste era decarboxilado

oxidativamente a metoxihidroquinona, y 8imu1 táneamente reducido a va nillina

y alcohol vaníllico. El primer proceso tiene lugar en medios de cultivo con

ácido vanillico como fuente de carbono. Asimismo, se producen reacciones de

polimerización de fenoles. Sporotrichum pulverulentum parece introducir un

nuevo grupo' hidroxilo en el anillo 'bencénico, necesario para su ruptura, como

se muestra en la· Figura 5 . (Buswell y Eriksson, 19.79)

Las reacciones presentadas anteriormente son sólo una pequeña parte de

las muchas existentes a lo largo de la degradación de un polímero tan complejo

y con tantos enlaces de diferente naturaleza, como la lignina, hecho que puede

apreciarse en la ilgura 2.

en

La degradación de la ligni08 es el resultado de un metabolismo secundario

los Basidiomicetos (hongos de Ja podredumbre blanca), puesto que la actividad

COOH

~OCH3 OH

C021 OH

~OCHj OH

reductasa 1 CHO CH20H !cY reductasa II !cY-~OCH3 ~OCH3

fen 010J(.

'(j~

CO2

autooxidación

fo

~

OH ~o ¡o OH

(fO )

~ O

() + YOCH3

O

dime ros y oligómeros

1 celobiosa quinona

oxidoreductasa

[HO);] • ~OCH3

OH

productos de la ruptu ra

del anillo aromatico

Figura 5. Metabolismo del ácido vaníllico por Sporotrichum pulverulentum

(según· Ander et al., 1980),

14.7

ligninolítica no aparece en cultivos hasta que no se ha completado el crecimiento

primario (Kirk y Fenn.1982). Aharonow1tz y Dema!n (1980) consideran que la

diferenciación del metabolislftO primario del secundario está en función de la

nutrición. y en ese sentido la actividad 11gninolítica es una respuesta al

agotamiento de la fuente de nitrógeno (como la síntesis de peniCilina por especies

de Penicillium 8e debe a la limitación de carbono o la de alcaloides en Claviceps

a la de fosfato). Sin embargo, éste no es un fenómeno generalizado en los Basidio­

micetos. ya Que se han encontrado especies en las que el nitrógeno no reprime

la actividad 1igninol!tica (Leatham y Kirk.19B3)~

Esta influencia del nitrógeno en la degradación de la lignina pudiera

estar relacionada con su bajo contenido en la madera, considerando que cuando

los Basidiomicetos invaden un substrato leñoso, el crecimiento primario es

probablemente una etapa transitoria, cuyo prinCipal objetivo es el establecimiento

de las hifas. En consecuencia, los componentes no est.ucturales de la madera

servirían como substrato para dicho crecimiento, el nitrógeno se agota:-ia rápida­

mente y se iniciaría el metabolismo secundario, con la degradación de la ligoina,

que haria más aCCesible la celulosa y hemicelulosas, y el progresivo deterioro

de todos los componentes de la madera.

UTILIZACION DE SUBPRODUCTOS LIGNOCELULOSICOS POR BASIDIO~aCETOS.

El incremen~o de, la demanda de proteínas de elevada calidad para la alimenta­

ción hlll",-na y an:'mal ha impulsado, en los úl timos años, el desarrollo de la

biotecnologíe y de los procesos de conversión enzimática de s~bproductos ag:-ícolas.

lh cierto nmero de microorganismos han sido utilizados come fuente de proteínas

y vitaminas, en~re los que destaca Candida utilis,cuya princ1pal oesventaja

es la exigencia de fuentes de carbono relativamente simples (hexosas, pentosas) ,

lo que la hace inadecuada para la transformación directa de materiales lignoceluló­slcos.

Los mismo sucede en el proceso Pekilo, desarrollade en Finlandia. consistente

en la producción de micelios de Paecilomvces va:-iotii él pa:-tir de monosacáridos,

ya que el hongo no puede utilizar oligómeros solubles en agua o polisac:áridos

insolubles. Estos y otros subs~ratos han de se~ hidrolizados antes de le fermenta­

ción (Forss, 1973; Ek Y Eriksson, 1975).

Muchos microorganismos requieren un pretratamiento de los substratos,

148

generalmente una hidrólisis ácida o alcalina, como Cellulomonas y Alcaligenes

(Han y Callihan, 1974). Trichodenna viride (flei tersen,1975), diversas especies

de Penicillium. Scopulariops;is. AspergilluB. Trichoderma, Cladosporium y Fusarium

(Updegraff y Grant, 1975) , Chaetomium cel!ulolyticum (Moo-YollOg et al .• 1977).

Geotrichum cand1dum y Tr~chosporum penicilatum (Pou y Gar~ido,1983). etc.,

por lo que suelen pr~sen'tar difieul tades por la manipulación que encarece el

subproducto, el largo tiempo de ~ncubación de muchos de ellos requieren, o

la baja producción de biomasa. DI'! entre todos los microorganismos citados,

Chaetomium cellulolyt~cum rindió la mayor cantidad de proteína cruda (2,? g/litro)

y la máxima pr?duct'ivi<1ad "'"fe; 1JIg/htro/hora), en el menor tiempo de cultivo

{36 horas}. ::..z, ?r"te5.na ·:;on'tieN' :-elativamen'te altas proporciones de todos

los aminoácidos eS{!\"lt' vil "'JO. , _~l'lperiores a las recomendadas por la FAO para nutrición

humana, sa}.vc r·"~t1.,",~. O~:"I "!xpe,":;'t:rlCl.as de nutrl.cl.ón con ::-atas, éstas no mostraron

ningún tipc. .";1(.; "laJ.:t();"',"1~cJ.6r" "'caccioneR pa'tológicas cuando el AO% de su die'ta

;:¡roteinica se :.\Us".:ituVQ por la proteína de Chaetomium cellulolvticum.

Debido a las lnu.1:.aciones fis).ológl.ca::. que presentan las bacterias y la

mayoría de los grupos ::'axonóml.cos de hongos, en los úl tl.mos tiempos se está

prestando consl.deraoÁe atención a los Basidiomicetos, y particularmente a los

hongos de la podredt.:more blanca, ya que poseen la ..capacidaa de degradar tanto

la celulosa como la lignina, lo que evita la necesidad de tratamL{mtos fisicos

y químicos, previos a la utilización de materiales lignocelulósicos.

Los Basidl.oml.ce'tos tl.ene la ven'taja de que los cuerpos fructiferos de

un gran número de especies se consumen en muchos países en can'tidades considerables

(champiñones, setas) y pueden crecer en cultivos liqUidaS. Sin embargo, en

la mayoría de los casos, el crecimiento es lento en fermentadores, por lo que

actualmente son pocas las espeCies que se emplean para la producción industrial

de al~rnentosj entre ellas destaca Polyporus squamosus, utilizado industrialmente

en Sulgaria, donde exis'ten fábricas con una prOducción de varios miles de toneladas

de micelio (Torev,1973).

En la literatura no abundan los casos de utilización de Basidiomicetos

para la producción de proteínas a partir de subproductos agrícolas o su transforma­

ción con vl.sta a un posible empleo de nutrición animal. Kirk y Moore (1972)

investigaron la capaCi.dad de 9 hongos de la podredumbre blanca para degradar

lignina de álamo y abedul. encontrando que, comparativamente, la mayoría de

ellos degradaban más lignina que polisacáridos, originando, por tanto, un incremen­

to de la diges'tibil1dad de la madera, que alcanz6 valores de más del 60% frente

a un 20% del control, sin incubación.

Jauhri et al. (1978) incubaron Pleurotus ostreatus y Coprinus aratus en

un medio simple, conteniendo bag~o. paja de trigo o estiércol de vace. como

substratos, obteniendo un máximo de 7 &flitro de peso seco de micelio, con

un 20% de proteína cruda, al cabo de 14 dias.

Desde 1974 se viene trabajando continuamente en diversos paises con Phanero­

chaete chrysosporiUIII (Hofsten y HOfsten,1974; Eriksson y Larsson, 1975; Hofsten,

1976; Ek Y Eriksson,1977,1980; Daugulis y Bone, 1977,1978: Cardoso y Nica~i,198la,

b: Sáiz-Jimenez,1983), un basidiomiceto termotolerante, con una temperatura

óptima de crecimiento de 39 2C, pudiendo crecer desde los 122 a los SOIC. Se

caracteriza fundamentalmente por una muy activa degradación de la madera, habiendo­

se aislado de pilas de troncos talados de Estados Unidos, Suecia. Polonia y

Rusia, donde suele producir graves pérdidas (Saiz-Jiménez,1983l.

El hongo era conocido en su estado imperfecto. conidial, desde 1927, como

Sporotrichum pruinosum. Posteriores aislamientos e identificaciones llevaron

a las descripciones de las especies Chrvsosporium pruinosum (en 1962), Chrysospo­

rium lignorum (en 1966) y Sporotrichum pulverulentum (en 1972). Burdsall y

Eslyn (1974) demostraron que estas especies se correspondian con Phanerochaete

chrysosporium/ cuyo holotipo procede de. un ejemplar_ con -basidiocarpos:,' aislado

de un tronco muerto de Platanus \!lrightii (sicomoro de Arizona), en el desierto

de Sonora. Estos autores describieron sus carac'teristicas taxonómicas y morfológi-

cas en medios de cultivos.

La pOS1ble utilizaci6n del hongo en procesos ·de conversión .enzimática

y biotecnologia ya fué apuntada por Hofsten y. Rofsten (1974). quienes es·tudiaron

su crecimiento en diferentes substra'tos, tales como salvado de trigo y arroz

y harinas de cet.ada y centeno, todo los cuales fueron completamente degradados

entre 2 y 5 di as , sugiriendo que el hongo pOdria ser una nueva e interesante

fuente de proteínas.

Hofsten y Ryden (1975) cultivaron Soorotrichum pulverulen'tum en diversas

harinas de cereales, analizando la biomasa prodUCida, respecto al contenido

en aminoácidos,cuyos resultados se mues'tran en la Tabla 1.

como

Comparando la proteina del hongo con las de trigo, cebada y arroz se_observa

compite ventajosamente con todas ellas l~abla 2), con una composición

muy favorable al hongo, incluso en lisina, factor limitante en muchos cereales.

En un estudio posterior, Hofsten(1976) utilizó una amplia gama de substratos

en el cultivo del hongo (paja. salvado, mazorcas de maíz, bagazo, melazas,

harinas de cereales, etc) obteniendo un máximo de proteinas del 25 al 40%,

TABLA 1

Porcentaje de aminoácidos en muestras de ~. pulverulentum liofilizadas

g aminoácido/lOO gr. micelio crecido sobre

aminoácido salvado de trigo harina de cebada (cultivo en frasco)

harina de cebada (fermentador)

l18ina

histidina

arginina

ácido aspártico

treonina

serina

ácido glutámico

prolina

glicina

alanina

valina

metlo\U.na

cistina

iaoleucina

leucina

tirosina

fenilalanina

triptófano

aminoácido

isoleucina

leucina

Hnna

fenilalanina

tirosina

cistina

metionina

treonina

triptófano

vaHna

a.l LO

2.6

2.8

L5

l.5

5.4

l.5

l.5

l.9

l.7

0.5

1.1

l.3

l.3

l.1

l.2

l.6

0.7

2.0

2.5

l.4

L5

3.9

L4

l.4

2.0

l.6

0.6

l.0

Ll

a.O l.0

l.2

0.5

TABLA 2

Aminoácidos esenciales en diversas proteínas

2.1

0.8

a.1

3.2

l.6

l.6

8.4

l.3

l.7

2.0

l.7

0.7

0.8

l.3

2.3

l.0

2.1

0.5

mg aminoácido/g proteina.--------

S. pulverulentum

39

69

6a

65

31

as 19

49

15

50

trigo

38

64

27

46

32

21

16

a9

13

43

cebaoa

38

69

34

50

35

21

14

37

l'

50

arroz

39

80

37

52

33

11

2'

41

l'

57

',=r~

151---

dependiendo de las condiciones d~l cultivo. El contenido en ácidos nucleicos

vari6 entre un 2,5 y 3,5%. En bas.e a estas experiencias, el autor consider6

que 1 Kg de harina de cebada, suplementada con una fuente de nitr6geno inorgánica,

podría prOducir 500 g de micelio (peso seco) conteniendo de 150 a 200 g de.

proteína de alta calidad. Por el contrario, la misma cantidad de cebada utilizada

para alimentar cerdos rendiría sólo de 15 a 20 g de proteína de carne.

Ek Y Eriksson (1975) investigaron el crecimiento del hongo en diferentes

fuentes de carbono (glucosa, celobiosa, seda, algo~ón, fibras de celulosa,

etc.) estimando el contenido en proteína del micelio en más de un 40% en los

dos primeros casos, alrededor del 30% con celulosa y seda, y un 22% en algodón.

En el caso de las fibr~s residuales de celulosa, procedentes de una planta

de pulpa de celulosa, obtuvieron una producción de 350 mg de micelio/litro/hora,

a 392C y pH 4,5. La producción de proteina fué de 95 mg/11 tro/hora, y eran

utilizados simultáneantente 640 mg de fibra. El coste estimado por los autoreS

fué de 400$ por TIII de producto, con un contenido del 25-30% de proteína, en

una planta con capacidad de producción de 10.000 Tm/año, suponiendo nulo el

coste de la fibra. También fué sugerida la posibilidad de efectuar un proceso

simbiótico entre el hongo y Candida utilis o Paecilomvces v~iotii.

Ek Y Eriksson (1980) desarrollaron un proceso que perrni "tió la conversión

de fibras de celulosa, procedentes de una fábrica de cartón, y prese!ltes en

las aguas residuales, en biomasa de 'Ep:lrotridun p..tlve:tiLentum aCsras de la pu.-ifica­

ción del agua. En fermentación con"':l.nua '" pH 4,2 Y 39!1C de temperatura, se

obtuvieron, a las 26 horas, una concentración de micelios de 4,9 g/!i tro, con

un 42% de proteína cruda (producto· seco al aire), una reducción de la OB07 del

73% y de la noo del 52%,' así como una reducción oel 88% de las p,!rticulas en

suspenSión. En el aspecto económico. para una planta de cartÓ"l de 150.00:0 Tm/ai'io.

y un 2% de materia seca en las aguas ~esiduales. de la cual el 80% es f~rmentable,

se obtuvieron una concentración de micelios de 3.700 Tm/año. El producto obtenido

se empleó en -la alimentación de cerdos y ovejas, y si bien, comparado con el

preCio de la harina de soja, origina un déficit de 460S/Tm, hay que tener en

cuenta el beneficio añadido tIe la purificación parcial del agua .residual,' ya

que para la producción de 1 Tm de micelios se consuml.an entre 1 y 1,5 Tm de

DBO?, y los .cl?stes de depuración de· ésta serian sensiblemente mayores.

Oaugulis y Bone (1978) cul ti varon Phanerochaete chrvsosporium sobre corteza

de arce, pl.no y cedro, obteniendo 1.500, 1.200 Y 800 mg de proteína/litro,

y una productividad de 2,63, 4,07 Y 3,32 x 10-2 b de proteina/litro/ho~a, respec~i-

vamente.

52

Recientemente, Cardoso 1 Hico11 (1981a, b) obtuvieron casi 12 g/litro

je micelio de Phanarochaete chrysosporium. en cultivos sobre vinazas. El micelio

:ontenía un 23% de proteínas.

Thomke et al. (1SBO) estudiaron el valor nutritivo de la proteína de Sporotri­

::hurn oulverulentum en dietas sunll.nistradas a ratas, cerdos y ovejas. Los análisis

químicos de la proteína I!lQstraron que la suma de los aminoácidos corresponden

al 70% de prote;(n~ bruta, y un 20% corresponde a amonio, ácido (-aminobutírico

'1 glucosarnina. Lb diges'C:lbllidad ae los aminoácidos de Spotrichum pulverulentum

~n ratas fup inferio).'" a la oe harina de SOJB, y del mismo nivel que la harina

de cebada. En cerdo~ 5~ confirmó el bajo valor nutritivo del hongo, en comparación

'::00 la harina de sOJa. derivado de la pobre digestibilidad de la glucosamina

y del ácido t -aminobutírico. Las experiencias con ovejas mostraron resultados

m~s satisfactorios que con especies monogástricas, con una digestibilidad de

la proteína cruda del 82%.

UTILIZACION DE ALPECHIN POR PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM.

Ya hemos expuesto am:eriormente cómo el estado imperfecto de Phanerochaete

chrysosporium ha sido utilizado en Suecia para la producción de biomasa y purifica­

ción de aguas residuales de una fábrica de cartón. Igualmente, Eaton et al.

(1982) estudiaron la decolorac~ón de los efluentes de una fábrica de pulpa

de celulosa, encontrando una reducción de la DBO y DQO del 40%, y del 60% del

color. Consecuentemente. el hongo pOdrí.a utilizarse en nuestro país en el trata­

miento y purificación de dgUas residuales. ya que es primordial lograr el máximo

aprovechamiento de los recursos hídricos. especialmente en Andalucía, donde

nos encontramos con niveles de precipitación media anuales muy: bajos, y unas

condiciones defici tarias de almacenamiento y regulación de las .-aguas.

El problema se agrava, además, por la cantidad de industrias agrarias

existentes, cuya característica general es el requerim~ento de elevados volúmenes

de agua para sus procesos de producción. El mayor consumo de agua lleva consigo,

también, el aumento de las sobrantes o residuales, por lo que los cauces públicas

van cargados de residuos de origen agrícola. industrial o fecal. Por ello,

es necesario buscar soluciones que permitan evitar los vertidos nocivos e incluso

aprovecharlos mediante reciclado.

En la cuenca del Guadalquivir, que concentra el 70% de la producción nacional

dE. aceite. con tU) !'1úm~r" de nlmazaras próximas a las 900, repartidas sobre

60.000 Km2 I Iill ... er't~oo de alpeChín a los cauces públicos plantea graves inconve-

153

nientes, derivados fundamentalmente' de su alta carga orgánica y del caudal vertido,

Que puede alcanzar volumenes de hasta 2 millones de m3 Las condiciones de extrema sequía, en los últimos años, di6 lugar a la promulgación de un decreto por el

de hasta

que se favorecía la construcción

el 100%. Ello ha originado que, en

de balsas o lagunas. con subvenciones

de forma importante.

durante la estación

del residuo seco.

las últimas campañas, se haya extendido

el almacenamiento en balsas de alpechín, para su evaporación

seca, lo que perml tiría además. la utilización como abono

Si bien se han efectuado estudios para el aprovechamiento y depuración

de aguas residuales de almazaras, mediante digestión anaeróbica (Fiestas et al. 1979) • el lagunamiento de alpechines ofrece nuevas posibilidades para su

tratamiento por hongos, a fin de producir biomasa. En este sentido, la inoculación

de Phanarochaete chrvsosporium podría originar un enriquecimiento en proteínas

del residuo seco resultante, y su posible utiliza=:ión como pienso e incluso

como materia o~gánica compostable. para adiciona~ a suelos agricolas.

En una pUblicación anterior (Saiz-Jil'llénez, 1983) se exponian las ventajas

que se veian en la utilización del hongo, cuales eran:

- Un adecuado pH del alpechin

tampón del ~edio, necesario para el crecimient:o del hongo y un elevado poder

para una

de la materia orgánica y la producci6n de

máxima

biomasa.

eficiencia en la transformación

- La casi ca~encia de espuma, debido al pOder antiespumante del alpechín, que

facilitaría la utilización en fermentadores o la agit:ación y ai~eación de las

lagunas.

- El alpechin no necesitarla suplemento de nitrógeno. ya que los requerimientos

del hongo sor. mínimos, para una adecuada degradación de la celulosa, polisacáridos

y polifenoles.

Posibilidad de formación de pellets cuando el hongo crece en cultivos en

agi tación, englobando· la materia orgánica y partículas en suspensión, con lo

que se pU.!"ificaria el agua, reduciendo los sólidos en suspensión, OBO,OQO y

permitiendo una posterior reutilización del agua, parcialmente purificada.

- Posible presencia de elementos nut~itivos en el medio, producidos;xr el basidio­

miceto y activo frente a plantas, por lo que las aguas podrían utilizarse para

riegos.

54

Temperatura adecuada, por la insolación de la zona, para el crecimiento del

.ongo.

Rentabilidad del proceso, si se logra su optimización.

Los~posibles inconveniente que se consideraban, a priori, eran:

Elevado contenido en potasio y salinidad del alpechín.

. Condiciones anaeróbicas, que 1irn.i 'Carian el crecimiento del hongo. muy exigente

m oxígen'o. por lo que se t·equerl.ria una oxigenación del medio •

• Existenci.a de ~u:n::? ... m;.l..t.~ l.nhl.oldoras, que afectan al crec.ml.en'to de microorganis­

'05. por' ~ qu~ pOÓ-!":lan imoedl.r el proceso normal de desarrollo.

En eXperiencJ.i:lb, llevadas a cabo

11 el ele .... ado contem.oo en potasl.o ni

en el laboratorio, se ha demostrado que

las sustancias inhibldcras (polifenoles)

3 Lponen un obstáculo para el crecimiento de Phanerochaete cnIYsosporium sobre

llpechín4 Así, en metilOS de cultivo alpechín-agar, incubados a 30 t C, el hongo

üca nzó un ra<J,io de >l5mm en 5 dias (figura 6, B), mientras que en 10$ controles

je extracto oe- l1a.lt¡,.,.~agar :'0 >llcan~e en 3 dias (Figura 6,Al. Est:os periodos

:te tiempo se redllCCT"" r.-uando se 'I.ncubl". a 39 S1 C. su temperatura óptima de crecimiento,

jonde alcanza lon 4Smm de radio Qn 4 y 2 días reRpec~ivamente,

Parece ser que el efecto del alpechín sobre el hongo es un retraso en

la germinación de las esporas (12 a 24 horas en medios normales frente a 36

a 48 horas en alpechín) y un crecimiento de hifas más lento, si bien aún con

todo sigue siendo más ~ápido que la mayoría de los hongos.

Al cabo de 7 dias, Phanerochaete chrysosporium comienza a decolorar el

medio de alpechín-agar (color inicial marrón oscuro a negrol, alcanzando el

halo los 45mru al caco de 13 dlas (figura 6 , C), adquiriendo el medio un color

amarillo claro. Ello ,ngnifica que los pigmentos presentes en el alpechín han

sido metablizados por· el hongo. de manera similar a como degrada la lignina,

es decir, como producto de un metabolismo secundario.

Al igual que ocurre con la madera, el inicio de este metabolismo pudiera

estar relacionado con el agotamiento de la fuente de ni trógeno I lo que induce

la act1vidatl fonolox1dll$a. Ello no debe sorprender si tenemos en cuenta que

la parte orgánica del aloechín se compone de carbohidratos. sustancias nitrogenadas

ácidos orgán1cos, p~c~ines, grasas, polifenoles, etc., siendo ésta última fracción

o o < a:

45

10

30

:;' 20 :;

10

2 3 4 5 6 7

OlAS

B 9 lO " 12 13 "

Figura 6. Crecimiento de Phanerocha~t~ ch~ysospo~ium, a 30t e, sobre __

extrac~o de malta-agar (A); alpechín-agar (6) y halo de deco­

loración de este último (C).

15$

156

la responsable del color oscuro que adopta.

Los componentes de naturaleza fenólica del alpechín (tabla 3) estudiados

por Vazque: Roncero et al. (1974) tienen estructuras similares o idénticas

a las prelSontea en la l.:i.grll.na o sus productos de degradac::.ón (ácidos p-cumárico,

caféico, protocatéqUl.cO y van!llico). Por otra parte, Pickart .y Westlake (1970)

aislaron una fenoloxldasn en Polrporus versicolor (hongo de la podredumbre

blanca, cuyo metabolismo guarda estrecha similitud con el de Phanerochaete

chrysosporiUlll, según i.eutharn :¡ Kirk, 1983), inducida por la presencia de flavonoi­

des y responssble de tlU degradación. Todo ello explica el pcr~qué el hongo es

capaz de degradar ostas estructuras. en las que intervienen las enzimas estudiadas

en la primera par~e de este trabajo.

Las enz~mas hidroliticas, liberadas durante la molienda de la aceituna,

entre 1 as que 3e encuentra ;lna fenoloxidasa, oXlda y polimeriza parte de los

reno les presentes el: ~l -'\lpechín ( fundamentalmente los ácidos caféico, protocaté­

Quico. vaníllicc:,.. t:r.l'osc.l. e h~Ol·oxlt;irosol). de la misma manera Que se ha demostra­

do Que ocut'i'c e['\ ((;:JO medios de ::ultl.vO de ciertos bongos (Saíz-Jiménez, 1975) ,

o en reacciones "in vitro" en el .LaOorat:orio (Sáiz-Jiménez et: a1.1979), originando

la form'ación de un polímero o pigmento marrón, de elevado peso molecular, que,

as{mismo.es ~~degradado por -Pbanerochaete chrysosporium.

En consecuencia, Pbanerochaete Chrysosporium posee los mecanismos enzimáticos

para la degradación de los polifenoles presentes en el alpechín, por lo que

es un hongo adeCuado. tant:o para la producción de biomasa, como para la purifica­

ción de aguas residuales de las almazaras, de las que elimina los polifenoles

y, consiguientemente, rebaja la OBO y 000.

Actualmente se trabaja en la reproducción del proceso de degradación en

medios líquidos, su optimización, a fin de obtener biomasa yagua parcialmente

purificada, y comprobar si el método podria ser rentable a gran escala,

TABLA 3

POLIFENOLES IDENTIFICADOS EN EL ALPECHIN

FLAVONOIDES O I OH HO~

OH ° 2 "1 Apigenina

Luteolina

Quercetina

~ FENOLES

R 2 3

Acido p-cumárico

Acido protocatéquico

Acido caféico

Acido vaníllico

Tirosol

Hidroxitirosol

GLUCOSIDOS FENOLICOS

Oleuropeina

l-cafeil glucosa

4-monoglucósido del hidroxitirosol

4_ diglucósidodel h:i.dro:<itirosol

Luteolin-7-g1ucósido

RI , R2"" H

R1= OH,R2= H

':t. R2= OH

RI= CH=CH-COOH, R2= H, R3= OH

R1= COOH, R2 , R3= OH

R1= CH=CH-COOH, R2 , R3= OH

RI = COOH, R2= OCH3, R3= OH

R1= CH2-CH20H, R2= OH, R2= H

F.I = Cr.2-CH20H. R2' R3= OH

CH C '1;.0H CH

300C-d- .OO-CH -CH l. -, ¡ CH-eH 2 2\ ~_.' OH

I'-Q-C 3 -' (J _H O e 11 5

157

158

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