NOUREDDINE BEJAOUI

STRUCTURE PRIMAIRE DE LA 8-LACTAMASE CARR-4 T GENETIQUE ATOMIQUE DFS ACIDFS AMINFS

R234 A S244 DANS L'HYDROLYSE DES ANTIBIOTIQUES.

Thèse prbsentee

à la Faculte des Études Sup8rieures de I'Universit6 Laval

pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département de microbiologie-immunologie FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITE LAVAL QUÉBEC

OCTOBRE 1996

ONoureddine Bejaoui, 1996

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RÉSUMÉ COURT

La B-lactamase CARB-4. bien qu'hydrolysant differentes O- lactamines, demontre une vitesse d'hydrolyse de la carb4nicilline bien plus Olev6e que pour les autres O-lactamines. Cest le critbre majeur qui a facilite la classification de cette enzyme parmi les carbénicillinases.

Nous avons tente d'élucider le rôie de certains acides amines dans la sp6cificit6 et l'hydrolyse de la carb6nicilline. Une region bien spécifique du site actif a 616 la cible de notre travail. Celui-ci a et6 bas6 sur une mutagénbse dirigde site-specifique. Nous n'avons pas r6ussi à abolir compl&ement 11activit6 enzymatique de CARB-4 bien que nous ayons obtenu une reduction de 100 fois la CM1 par rapport à la carb6nicillinase sauvage. Cependant nous avons obtenu des mutants possédant une activit6 contre les c6phalosporines de troisibme génération notamment la ceftazidime et la cefotaxime. Ces mutants ne demontrent pas cette activit6 si nous changeons d'autres acides amines en amont des premières substitutions, ceci indiquant la nécessite d u ne collaboration étroite au niveau du site actif.

REMERCIEMENTS

Je voudrais remercier trbs sinchernent tous ceux qui ont contribué de prbs ou de loin à l'élaboration du prdsent projet de recherche et à la preparation de cette these.

Je veux particuli6rement souligner la contribution de mon directeur de thhse, le docteur Roger C. Levesque. Je desire le remercier de m'avoir fourni un encadrement scientifique et les facilites mat6rielles n6cessaires mon projet de recherche. Sa bibliothèque, ses conseils et ses encouragements ont et6 judicieux et apprbci6s. Je lui exprime toute ma gratitude.

Je suis &alement redevable aux assistants de recherche impliqu6s de près, Jean Lachapelle et Josde Mercier, ou de loin, Marie-Josee Morency, Martine Bastien el François Sanschagrin.

Je remercie les professeurs et le personnel de la Faculte de medecine qui ont contribue A ma formation. Je remercie le personnel du Departement de microbiologie, notamment Suzanne Bernatchez et Andree Jobin. Je n'oublierai pas non plus le directeur du programme, Denis Beauchamp, pour sa compréhension et son aide administrative. Je remercie Stéphane Guay et Pierre de Grandpr6 pour leur aide technique.

Je voudrais &alement remercier les docteurs Maurice Boissinot, Morris Goldner et Roger C. Levesque pour la correction du manuscrit de cette thèse. Les commentaires proposés ont permis d'améliorer de beaucoup cet ouvrage et m'ont permis d'apprendre l'art d'écrire de bons documents scientifiques.

Finalement, je remercie ma famille pour son soutien moral et financier tout au long de ma formation.

TABLE DES MATIERES

. . RÉSUME COURT .................................................................................................... ....II

... ........................................................................................................................ RÉSUMÉ II 1

REMERCIEMENTS .................................................................................................. iv

TABLE DES MATIÈRES ................................................................................... ..... v

. . LISTE DES TABLEAUX .............................................................................................. vil

... ..................... LISTE DES FIGURES .. ...................................................... .. ................. VIII

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION

................... Généralités sur les antibiotiques ...... ........................................... 2 ......... 1.1.1 Agents chimioth6rapeutiques et origine de I'antibioth6rapie 2

................................... 1 . 1 . 2 Définition et mode d'action des antibiotiques 5 1 . 1 . 3 Cas des O-lactamines ............................................................................ 8

....................... 1.1.3.1 Chronologie d'apparition des antibiotiques 8 1.1.3.2 Structure des B-lactamines ....... ....................... ............ 12

............. ....... 1.1.3.3 Mode d'action des O-lactamines ........... 20 ............................ . 1.1.3.3.1 Synthèse du peptidoglycan 20

.... 1.1.3.3.2. Mécanisme moléculaire des B-lactamines 21

................................................ RBsistance bactérienne aux antibiotiques 22 1.2.1 Historique ............................................. ........................................... 22 1.2.2 Structure de la paroi bacterienne ................... ........ ............... 24 1.2.3 Mécanisme de r6sistance ......... ................ ................................. 26

G4nBralit6s sur la cinetique enzymatique ................... ............ .................... 29

Le d6veloppement de la classification des i34actamases ................. 32

....... ...........*................. MBcanique enzymatique des B-lactamases ......... 35

Structure des R-lactamases ...... ................ ., ..... 37

Les O-lactamases de la classe A de type carb6nicillinase .... .. ............... 40

Nature du probl6rne ......................................................................................... 46

........................................................................ But et motifs du prdsent travail 47

CHAPITRE 2: RESULTATS PARTIE 1

2.1 Gene Cloning. Primary Structure of blacARB.4 and b l a ~ w - ~ Genes and .................................................................. Evolution of the Carbenicillinases 50

CHAPITRE 3: RESULTATS PARTIE 2

3.1 Structure Function Analysis of the B344 Strand junction of Class A ....... B-lactamase in the Hydrolysis of Third Generation Cephalosporins 83

.......................................................................... 3.2 Résultats ve rsus hypot hese 1 07

CHAPITRE 4: CONCLUSION

4.1 Conclusion gen6rale ................... ..... ................................................................ 1 10

Implications pour le

CHAPITRE 5:

................................................................................ futur 1 13

BIBLIOGRAPHIE

5.1 Bibliographie ................................................................................................... 1 15

LISTE DES TABLEAUX

CHAPîTRE 1 . . . ..................................................... Tableau 1 : Classification des p4nicillines. 1 5

Table 1

Table 2

: Bacterial Strains and Plasmids Used ......................................... 70

: Identities between Class A and Class D 8-lactamases having . . . . . .............................................................. carbenicillr nase activities 72

CHAPITRE 3

Table I : Mutants Description ................................................... ................ 1 02

Table Il : Antibiotic Susceptibility (Penams) ............. .... .... ........... 1 03

Table Il : Antibiotic Susceptibility (Cephams) ................... .. ........... .... 104

........................ Table IV : Mutants Kinetic Results .......... ......................... 1 05

Table V : Inhibition Studies (150) ............................................................. 1 06

viii

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE 1

Figure 1 : Chronologie de l'apparition des antibiotiques ............................ -9

................................................ Figure 2 : Structure de base d'une p6nbrne 13

Figure 3 Diffhntes voies de synthbse et structure du GAPA ............... 14

Figure 4 : Illustration des liens possibles du carbone a determinant la ................................................................ classe de la phiciIline 15

Figure 5 : Structure des chaînes lat6rales. positions dans la structure générale de la pénicilline et noms scientifiques de quelques

..................................... pénicillines de quelques p6nicillines 16

Figure 6 : Structure des chaînes latérales. positions dans la structure générale de la céphalosporine et noms scientifiques de

................................ quelques c6phalosporines ........................... 17

..... Figure 7 : Structure et nomenclature de quelques c6phalosponnes 19

Figure 8 : Illustration comparative de la paroi cellulaire des bactdries G ram-positives (A) et Gram-ndgatives (B) .............................. ... 24

Figure 9 : Courbe théorique de progression d'une réaction enzymatique ................................. de premier ordre ............................ ...... 2 9

Figure 10 : Equation de Michaelis-Menten de premier ordre ..................... 31 Figure 1 1 : Classification des 8-lactamases ................. .. .......................... 34

............ ......... Figure 12 : Les étapes de l'hydrolyse des antibiotiques .. 35

......... Figure 13 : Schéma des structures secondaires des B-lactamases 38

Figure 14 : Alignement de 31 séquences d'acides aminés de B-lactamases ................................... ....... de classe A et D ............................... .... 44

CHAPITRE 2

Figure 1 : Molecular Cloning of the bla CAR&# Gene ............................... 75

Figure 2 : Physical Maps of recombinant plasmids pMON1039(A) and pMON5l O(C) ..........................~...................................................... 76

Figure 3 A : Nucleotide Sequence of the bla CAR&$ (A) ...................-...-.-.... 77

Figure 3 8 : Nucleotide Sequence of the b k AER-I (B) ................-................. 78

Figure 4 : Alignment of CARB-4 and AER-1 amino acid sequnces with the sequences of class A ezyme having carbenicilin-hydrolizing

............................................................................................... activity 79

Figure 5 : Dendrogram showing relationships among carbenicillinases clustered on the basis of amino acid sequence identities and using the alignment depicted in Fig. 4 ........................................ 81

CHAPITRE 1

INTRODUCTION

1.1 Généralités sur les antibiotiques

1.1.1 Agents chimiothérapeutiques et origine de I'antibiotMrapie

Sur le plan historique le traitement des plaies et des blessures est mentionne dans les registres m6dicaux et la pharmacopde des civilisations anciennes comme celles de la Chine, de l'Égypte et de la Mésopotamie. Les premiers agents therapeutiques furent des teintures, des colorants et des d6riv6s toxiques pr6parés à partir d'arsenic et de recette à base d'antiseptiques. Les Égyptiens utilisaient de l'encens, de la myrrhe, du benjoin et de la terbbenthine. Les Babyloniens et les Assyriens traitaient les maladies des yeux et de la peau avec des minéraux comme le souffre, l'arsenic, l'antimoine, le cuivre et le mercure (Garrod et coll., 1972). Cependant, les études scientifiques de ces traitements ne sont devenus possibles qu'au 1 9ikrne siecle, avec la découverte et la possibilité d'isoler les micro-organismes infectieux. Depuis la deuxieme moitié du 19ieme siècle, on savait que la putréfaction aussi bien que les maladies humaines et animales, étaient dues à des organismes vivants qui pouvaient être transmis par voies aériennes. Ceci ouvrait la voie a une ère intensive de recherche pour trouver des agents capables de détruire ces microbes. Un de ces agents, i'acide carbonique, préparé par Calvert à Manchester, était la base du fameux pulvérisant antiseptique utilise par Joseph Lister en 1866 pour prévenir la septicémie post-op6ratoire.

William Roberts, à Manchester, dans une communication sur la biogénèse soumis à la Sociét6 Royale en 1874, mentionnait que la croissance des champignons était souvent antagoniste aux bactéries e l vice-versa. L'antagonisme entre le Penicillium et les bactéries avait aussi 616 observé par le physicien Tyndall en 1876. Au même moment, Louis Pasteur, travaillant avec J.F. Joubert en 1877, nota que si des cultures de bacilles a anthrax &aient contaminées avec des bactéries venant de l'air, le bacille de l'anthrax ne démontrait aucune croissance. Sur le plan therapeutique, cette observation était prometteuse. Un autre français, Babes, démontra en 1885 qu'un organisme pouvait 6laborer une substance diffusible inhibant la croissance d'autres organismes. Durant la deuxieme partie du 1 gi&m* siècle, une multitude d1exp6riences se sont succ4dees dans le but d'élaborer l'efficacité des micro- organismes comme agents th6rapeutiques. Cantani, en 1885, traita la tuberculose pulmonaire en insufflant dans la gorge de ses patients un organisme

nomme BaR tenno. En 1909. un rnbdecin danois, Schiotz, tenta de guerir la diphterie en vaporisant une culture de staphylocoques dans la gorge d'un patient. Apparemment, ceci n'eut pas d'effets secondaires et l'on peut supposer que le traitement fut bendfique puisqu'il a et6 démontre plus tard, que certaines souches de Staphyloooccus aureus produisaient des substances antagonistes contre Corynebacferium diphtenae (Parker et Simmons, 1 959). Bien avant le debut des travaux du groupe d'Oxford sur l'isolement de la p6nicilline. Dubos tentait d'isoler du sol des bacteries produisant des antibiotiques. II traitait le sol avec des suspensions de cocci Gram-positifs d'espèces diffdrentes. Plus tard il isola une souche de Bacillus brevis qui s'attaquait aux cocci Gram-positifs en produisant une substance, le tyrothncin. SubsBquemment, deux compos6s actifs de celle- ci, la gramicidine et la tyrocidine, furent identifibs (Dubos, 1939; Hotchkiss et Dubos, 1940). Enfin, vers les années 1960, une forme de thérapie bactérienne de remplacement fut developpee en utilisant des lactobacilles pour contrer des organismes intestinaux nuisibles.

En 1929, Fleming nota qu'une culture de staphylocoques contaminée par des moisissures devenait transparente, su bissant une lyse apparente. Une substance bactériolytique semblait être produite par la moisissure et le bouillon de culture de cette moisissure, a 200C, avait acquis une proprieté inhibitrice, bactéricide et bacténolytique contre plusieurs bactéries pathogènes communes. II vérifia d'autres espèces de moisissures et de champignons afin d'identifier la production dune substance similaire, mais seulement une souche de Penicillum sur huit était positive. La substance en question avait exactement les mêmes caractéristiques que fa culture originale contaminante des staphylocoques. II était bien clair-que la production de cette substance n'était pas commune à tous les bouillons ni a tous les types de Peniciiiium, prouvant qu'il ne s'agissait pas d'une action non spécifique (e.g changement de pH). II démontra que cette phiciIline était produite de façon lente et n'agissait pas sur toutes les bactdries de la même façon. En effet l'action semblait spdcifique aux bacteries et. plus important encore, il fut rapidement Btablit une absence de toxicité pour l'animal. Cette substance servait 6galement a isoler H. influenzae (Fleming, 1929) car ce pathogbne difficile à purifier y était insensible contrairement aux autres micro- organismes. Fleming écrira plus tard que les difficultes techniques & surmonter, dues à Itinstabilit6 du son filtrat, étaient décourageantes.

Emerich aussi avait note qu'une culture bactérienne en phase stationnaire tardive de B. pyocyaneus possedait une activité bacté riolytique marqude (Levy, 1992). L'agent responsable &ait la pyocyanase qui poss6dait des propMt6s semblables à la penicilline en &ant rbsistante B la chaleur el presente dans le filtrat d'une culture liquide (Sabath et coll., 1965). Elle agissait comme la p6nicilline sur certains microbes. Les bacilles causant l'anthrax, la diphtbrie, le choléra et la typhoTde y Btaient tr8s sensibles mais les cocci pyogènes semblaient résistants à la pyocyanase. Aprbs quelques annees, la possibilit6 que la pénicilline pouvait être utilise dans la thérapeutique n'ayant pas 6t6 démontrbe, Fleming se concentra sur les sulfamidds. Lavenement de la deuxiéme guerre mondiale et l'investissement des capitaux américains dans la lutte contre les infections engendra un bond drastique au niveau de la recherche sur les antibiotiques. S'intéressant au phénomène d'antagonisme microbien, Chain et Florey décidbrent d'étudier les substances responsables de celui-ci en effectuant un sommaire systématique des substances antimicrobiennes produites par des micro-organismes. La pénicilline fut retenue comme candidat potentiel a cause de son activité contre les staphylocoques, malgré son instabilité relative (Chain et coll., 1940).

Au printemps de 1940, Florey démontra qu'une pénicilline pouvait guérir des infections à streptocoques et à staphylocoques chez la souris qui autrement mourrait si non traitée. Des efforts furent entrepris pour produire suffisammen! de pénicilline pour un essai clinique. Les premières preparations, rion purifiées, avaient comme effet secondaire une augmentation importante de la temperature chez l'humain, effet causé par la présence d'impuretés pyogéniques. Ces produits furent elimin6s par chromatographie. Les r6sultats furent impressionnants mais limités par la quantité de pénicilline disponible.

A la suite de la découverte de la pénicilline, la recherche sur les antibiotiques provenant des organismes du sol fut reprise. Les premiers succès furent obtenus en 1944 quand Waksman et ses collègues, aprbs une étude exhaustive portant sur 10 000 espèces, isolèrent la streptomycine (Schatz et coll., 1 944). Les recherches subséquentes portèrent sur l'analyse microbiologique de milliers d'6chantillons de sol à travers le monde. Un nombre significatif d'antibiotiques furent caractérisés a partir de nombreuses souches de Streptomyces (Baber et Ganriud, 1963: Florey, 1949).

La recherche d'agents thdrapeutiques provenant de cellules vivantes ne s'&ait pas limitée aux micro-organismes et dans les annees 1940 beaucoup d'extraits de plantes furent BtudiBs Quelques annees plus tard, George (George et coll., 1949) produisit des extraits a partir de 190 plantes medicinales indiennes et trouva de I'activit6 dans l'ensemble de ces plantes. Le cornpos6 principal de la racine d'une plante, M. pterygospenna, fut partiellement purifie et on lui donna le nom de pterygosperrnine. Ce compos6 inhibait la croissance de S. aureus, B. subtils, AU. tuberculosis et M. phlei dans une dilution de 1 dans 200,000 (Rao et George, 1 949). Pratt extraya à partir d'espèces d'algues Chlorella vulgaris et Chloreila pyrenoidosa une substance qu'ils appelbrent chlorelline et qui avait une activité considérable contre les cultures de S. aureus, S. pyogenes, E. cdi et P. pyocyanea (Pratt et coll., 1 944; Sabath et coll., 1965; Brumfitt et coll., 1 967). La chlorelline, appararnment, inhibait la croissance des algues qui la produisait (Barber et Garraud, 1963). Des substances actives contre des bacilles Gram- négatifs ont même été trouvées dans le jus de chou et d'autres légumes (Pederson et Fisher, 1 944).

1 .1 .2 Définition et mode d'action des antibiotiques

L'analyse étymologique du mot antibiotique nous donne "s'opposant a la vien. Au cours des années, la definition de ce terme se précisa pour devenir, en 1947, "toute substance chimique, produite par un micro-organisme, ayant la propriété d'inhiber la croissance et même de détruire les bactéries et autres micro-organismes d'une manière spécifique" (Janot et coll., 1953). Avec la venue du g6nie chimique, la "substance" n'avait plus a provenir d'un organisme vivant pour faire partie de la définition mais pouvait aussi bien être produite totalement ou en partie de façon synthétique. D'une façon générale, un antibiotique doit, pour être efficace, agir sur une ou plusieurs cibles dans la cellule bactérienne (ex. la synthèse de la paroi), atteindre ces cibles (ex. traverser la membrane externe) en concentration suffisante et éviter l'inactivation par des substances produites par la bacterie en réponse à son agression (ex. les O-lactamases produites en réponse à la présence des molécules antibiotiques O- lactames). En g6n6ral' leur efficacite tient B une action spécifique au niveau du m6tabolisme ou d'un équilibre physico-chimique indispensable à la vie de la bactérie. Les principaux mecanismes d'action se situent au niveau de la

synthbse de la paroi cellulaire, de la replication de l'ADN, de la transcription, de la synthese protéique et de la synthese nucléique de la bactérie.

En ce qui concerne les antibiotiques inhibiteurs de la synthhse de la paroi cellulaire bactbrienne, on peut distinguer quatre modes d'actions. Le premier est I'inhibition de la synthese de l'acide muramique: la phosphonomycine, ou acide 1,2-époxypropylphosphonique, inhibe de façon irreversible l'enzyme qui catalyse la réaction de transfert du groupe Bnolpyruvique B partir du phospho6nolpyruvate (PEP) au Cg de I'UDP-N- acétylglucosamine (Asselineau et coll., 1973). Le deuxième concerne l'inhibition de la synthèse du peptide D-ala-D-ala. Par exemple, la cyclosérine, ou D-4- amino-3-isoxazol-idone, est un inhibiteur par blocage de la reaction de transpeptidation compétitif de la L-alanine racémase et de la D-alanine synthétase et agit plus efficacement sur les bactéries positives. La L-alanine racémase est une enzyme qui necessite le pyridoxal phosphate comme coenzyme. La cyclosérine peut former, avec ce coenzyme, une base de Shiff. II est possible que l'antibiotique donne lieu à inhibition en agissnat sur le pyridoxal phosphate (Strominger, 1970). Le troisihme modèle implique le fonctionnement du cycle de la synthese de l'unité d'4longation. La bacitracine, par exemple, est un antibiotique polypeptidique produit par Bacillus licheniformis. Elle provoque une cessation de la synthese de la paroi cellulaire en inhibant la peptidoglycan synthétase. L'inhibition de l'hydrolyse de la liaison pyrophosphate du P-P. lipide provoque son accumulation, le transporteur P-lipide n'étant plus libéré ne peut plus participer à un nouveau cycle. Elle n'est bact6riolytique que pour les bactéries en croissance (Strominger, 1970). D'autres antiobiotiques inhibent la réaction du transfert du disaccharide-pentapeptide depuis l'intermédiaire lipide a l'accepteur. Enfin, notons l'inhibition de la synthese du polymère. Par exemple, la pénicilline inhibe la biosynthèse des parois cellulaires de certaine bactéries en agissant sur le peptidoglycan par blocage de la réaction de transpeptidation permettant le pontage par la pentaglycine suite h I'acylation de la transpeptidase. Un autre phénomène est observe avec les antibiotiques polypeptidiques basiques, comme la polymixine et la gramicidine. II s'agit de polypeptides cycliques de caractère basique, que l'on peut rapprocher des d6tergents cationiques. Ils provoquent un effet immédiat sur les bactéries, quelque soit leur 6tat physiologique. Ceci ce traduit par une importante élimination dans le milieu environnant de substances de petit poids moléculaire, et de nature variee (ions,

acides aminbs, bases puriques ou pyrimidiques, etc.). La polymixine B interagit la fois avec les regions polaires et non-polaires des phospolipides. Elle peut

rendre la paroi cellulaire plus facilement attaquable par les lysosymes. De même que pour les polymixines, l'activité de la gramicidine S dépend de la présence de groupes amines libres (Asselineau et coll., 1973; Michel-Briand, 1986).

Le deuxihe groupe d'antibiotiques concerne ceux qui agissent sur le processus de r6plication et transcription. Tout d'abord il y a ceux qui agissent directement au niveau de I'ADN, soit par liaison covalente ou par formation de complexe avec I'ADN. Les mitomycines ainsi que les porfiromycines, sous forme réduite activée, se lient aux acides nucléiques par alcoylation. Ceci a pour effet de lier les deux brins complémentaires et d1interf6rer avec le passage de la fourche de réplication. Ensuite, il y a les antibiotiques qui inhibent la synthese de I'ARN dépendante de l'ADN. L'actinomycine forme ainsi un complexe avec I'ADN en double hélice. Quant à la daunomycine, un glycoside de la daunosamine, forme avec I'ADN un complexe par intercallation de type acndine-ADN. Elle a une nette action anti-mitotique. Pour ce qui est des antibiotiques agissant sur les polym&ases, mentionnons la nfamycine et ses dérivés. Elle se lie B la sous- unité beta de I'ARN polymérase et inhibe une étape de la préinitiation de la biosynthbse de celle-ci. Elle se lie à raison d'une molécule d'antibiotique par molécule d'enzyme. Les enzymes extraites de bactéries mutantes résistantes à la rifampicine ne forme pas de complexe avec I'antibiotique.

Le troisième groupe comprend les antibiotiques modifiant directement I'accessibilit~ du site aminoacyl. Les tétracyclines inhibent le processus de synthese des protéines en se fixant sur la sous-unit6 des ribosomes et en inhibant la mise en place de I'aminoacyl-tARN au niveau du site A. D'autres provoquent des erreurs d'appariement codon-anticodon comme par exemple la streptomycine qui, en se fixant sur la sous-unité 30 S. provoque des désordres métaboliques divers en inhibant la synthèse protéiques. Elle détermine des erreurs de lecture au cours du processus de reconnaissance entre certains codons du mARN et les anticodons des tARN correspondants.

Finalement le quatrième groupe d'action concerne les antibiotiques agissant sur les précurseurs des acides nucl6iques. Certains bloquent, par alcoylation d'un groupe -SH, l'enzyme catalysant la conversion du formylglycinéamide ribotide de I'amidine correspondante, sur le chemin

m6tabolique de la biosynthèse de I'acide inosinique précurseur de I'acide guanylique et de I'acide adenylique (Asselineau et coll., 1973)). Par exemple, la cordyc6pine s'incorpore dans I'acide ribonucléique. est phosphorylée dans la bacterie en cordycepine-triphosphate, analogue de I'ATP d6pourvu du -OH, et provoque l'inhibition de la synthèse de I'ARN.

1.1.3 Cas des 8-lactamines

1.1.3.1 Chronologie d'apparition des antibiotiques

La résistance aux antibiotiques fut à l'origine du développement de la gamme d'antibiotiques que l'on connaît aujourd'hui. Bien que les premières pénicillines et cephalosporines naturelles et semi-synthétiques soient encore prescrites de nos jours, on a vu apparaitre durant les deux dernières décennies de nouvelles molécules contenant des noyaux O-lactames. Jusqu'à 1970, toutes les B-lactamines connues étaient divisées en quatre groupes repr6sentes par les pénicillines, céphalosporines, monobactames et carbapenemes (Baldwing et coli., 1992) (figure 1 ).

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Figure 1 : Chronologie de l'apparition des antibiotiques via la synthèse organique. La description des cornpos6s et les dates importantes sont indiquées dans le texte. La structure commune est le noyau 8-lactame sauf pour le Ly223447 ayant un noyau bicyclique (Baldwing et coll., 1992).

Etant donne un besoin immediat pour traiter les infections à Gram- négatif, la pénicilline offrait un bon potentiel. Ceci &ait devenu realisable après la découverte majeure du 6-APA, ou acide p6nicillanique, qui pouvait être obtenu apr6s traitement chimique de la benzyl-p6nicilline ou du phhoxym6thyl- phiciIline. Les d6riv6s obtenus 6largissaient le spectre d'activite pour corn battre les infections. Du cet8 des c6phalosporines, le compos6 qui s'approchait le plus, du point de vue structure, du 6-APA fut le 7-APA. Les chimistes ont vite rdalisds que celui-ci offrait plus de possibilit6 de modification chimique et offrait une meilleure resistance aux 8-lactamases que les p6nicillines.

La production des cephamycines (7 a-methoxy-c6phalosporines) par les actinornycetes et leur découverte en 1970 incorporent un troisième groupe en importance dans les 0-lactamines. Les cephamycines se différencient du premier groupe, les pénicillines, par la présence d'un lien additionnel dans le noyau bicyclique, comme c'est le cas des céphalosporines, et se distinguent de ces dernières par la presence d'un groupe méthoxyle (-OCH3) attache au noyau O- lactame du cbté du carbone 7a. Ce groupe a définit le concept de O-lactamines a large spectre. La grande stabilité que les céphalosporines présentaient contre les B-lactamases des bactéries Gram-négatives et positives était due au méthoxyle (-OCH3) lié au carbone 7a (Betina, 1983).

Les oxacephemes sont des céphamycines ayant deux particularités: un atome d'oxygène remplace i'atome de soufre dans l'anneau dihydrothiazine des céphalosporines et un hydrogène se retrouve a la place du groupe méthoxyle (-OCH3). Ce noyau particulier n'est pas naturel. Une synthèse chimique à partir de l'acide 6-aminopénicillanique (6-APA) bien que difficile a contrôler, est capable de donner un noyau où I'oxygbne remplace le soufre. Cette substitution génère une augmentation de la reactivit6 chimique du compos6 et une meilleure hydrophobicit6. Elle est responsable de I'augmentation de l'activité antibactérienne des oxacéphèmes lorsque comparée aux céphalosporines. A la même Bpoque, les chimistes de la compagnie Merck et Co. ont synthétise la 1-oxacéphalotine racémique. Ce compose avait une activité antibactérienne parallèle à celle de la c6phalotine démontrant du coup que le soufre n'était pas un prerequis & l'activité des c6phalosporines. Des analyses exhaustives ont montre que I'activit6 des 1 -oxacéphèmes dépendait de la stoechiométrie du groupe -R li6 au carbone 6, de la double liaison et de la

necessite d'une configuration B de i'amine rattachée au carbone 6. L'antibiotique le plus representatif de ce groupe est le moxalactame (Betina. 1983).

En 1 976. cinquante ans apres la découverte de la pénicilline et vingt ans apres celle des céphalosporines, trois O-lactamines biogdn&iques, I'acide clavulanique, la nocardicine, un inhibiteur de O-lactamases, et la thi6namycine' une carbap6n&mel ont et6 d6crites.

L'entreprise Beecham et Co. élabora un nouveau et puissant inhibiteur de 8-lactamase. II &ait efficace, en synergie avec I'ampicilline ou la c6phaloridine, contre les bacteries Gram-positives et n6gatives produisant des B-lactamases. II était produit par Streptomycetes clavuligerus. Etant elle-même une 0-lactamine on la désigna sous le nom d'acide clavulanique. C'est un inhibiteur suicide et son efficacité est due à plusieurs conformations du complexe acyl-enzyme. II est le premier exemple d'un composé naturel contenant le noyau clavane (1 -0xadethiapenamine). C'est aussi un inhibiteur progressif (l'efficacité d'inhibition augmente avec le temps). Sa structure ressemble plus à une pénicilline qu'à une céphalosporine. II n'a pas de chaîne latérale mais a un noyau oxazolidine ou le soufre du noyau thiazolidine est remplacé par un atome d'oxygène. II n'existe cependant pas de double liaison dans le noyau oxazolidine comme chez les céphalosporines (Betina, 1983).

Les recherches japonaises (Aoki et coll., 1976; Hashimoto et coll., 1976) ont abouti à la découverte de la nocardicine. II s'agit de la seule O-

lactamine naturelle monocyclique ayant une activit6 puissante surtout contre E. coli et P. aenrginosa. Elle a une parenté stéréochimique et biologique avec les pénicillines et céphalosporines. Finalement, elle a un groupement B-hydroxyphénylglycine et une fonction oxime qui sont rarement retrouves dans la nature. Quant aux carbapen8mesl ce sont des antibiotiques à large spectre, stables vis-à-vis des B-lactamases et agissant sur la paroi bactérienne. On les considère a la fois inhibiteurs et antibiotiques. Ce sont les seuls antibiotiques sensibles aux dipeptidases des mammifères. Ils dérivent de I'acide carboxylique carbap6nème, ce qui indique qu'un carbone remplace le soufre dans l'anneau thiazolidine. La liaison double est sous forte tension; en conséquence le noyau O-lactame est trbs réactif en dehors d'un pH neutre, pH qui doit être maintenu durant le processus d'isolation. La configuration optique des chaînes latérales et

la st6reochimie du lien carbone C5-Cg sont des consid6rations majeures dans i'activitd.

1.1 -3.2 Structure des B-lactamines

Les antibiotiques varient énorm6ment dans leur structure et la plupart sont complexes, avec des regions hydrophiles qui facilitent la diffusion dans la cellule. Les facteurs les plus importants responsables de l'activité biologique des 8-lactamines sont leurs propri6tes physico-chimiques, leur arrangement st6rique et la pr6sence de composantes bioactives dans leur structure (BetinaJ 983). Le noyau i3-lactame des antibiotiques est responsable de I'activitb anti bacte rienne. Cependant, d'autres composantes, comme la chaine latérale, influencent grandement le spectre d'activité. Bien qu'il ait et6 propos6 en 1943 que la phiciIline contienne un noyau B-lactame, il a fallu attendre les résultats des expériences de diffraction aux rayons-X pour confirmer et élucider sa structure. Jusqu'à la fin des années soixante, la penicilline et la céphalosporine étaient les seuls exemples connus d'antibiotiques naturels dérivés d'un noyau 0-lactame (Neuhaus et coll., 1 992).

La structure de base des pénicillines consiste en un noyau thiazolidlne (5 membres dont le soufre avec lequel débute la nomenclature des liaisons chimiques) fusionn6 a un noyau 0-lactame (4 membres ayant un carbone à la position 6 pouvant recevoir 2 chaînes latérales (OR) l'une en position a et l'autre en position B) (figure 2). Le noyau B-lactame est responsable de certains traits essentiels: il comporte le groupe amine dans une configuration constituant un excellent analogue de la D-Ala-D-Ala (D-alanyl-D-alanine) dans la réaction de transpeptidation durant la synthèse du peptidoglycan (Tipper et Strominger. 1965; Frère et Joris, 1985). 11 a une configuration compacte, ce qui suppose qu'un clivage de son lien acide produit assez d'énergie pour former un lien covalent avec l'enzyme qui devient inactif. Ce lien est instable en milieu acide. Bien que cette structure de base est essentielle à l'activité antibactdrienne, plusieurs substitutions du cet6 de l'acyle à la position 60 sont possibles et produisent des changements dans le spectre d'activitb et dans les propriétés pharmacologiques (figure 2). On peut aussi introduire des substitutions à la place du radical - R a lie au carbone 6 et obtenir une banne activite contre la plupart des bactéries Grams-négatives aérobiques ainsi qu'une bonne stabilité

contre les B-lactamases, mais le développement a grande échelle de ces compos6s n'est pas pour l'immédiat (Betina, 1 983).

CON

coo-

Figure 2: Structure de base d'une péneme. La numérotation débute par l'atome de soufre selon le sens des aiguilles d'une montre. Seuls les carbones 3 et 6 sont indiqués. Le groupe carboxy (-COO-) est rattaché au carbone 3 du noyau thiazolidine. Le carbone 6 du noyau B-lactame a deux chaînes latérales (4) en position a et B (Huovinen, 1988).

La clé du succès dans la synthèse chimique des antibiotiques (pénarnes) fut la découverte de l'acide 6-aminopénicillanique (6-APA) au début des années 50 (Behrens et coll., 1 948). La synthèse naturelle directe du 64PA était difficile et avait un pourcentage de récupération bas en plus de sa faible activité antimicrobienne. La possibilité de conversion de la pénicilline V ou G en 6-APA par des traitements a I'amidase, qui enlèvent la chaîne latérale de la pénicilline naturelle, ou une culture de PeniciIiium chrysogenurn dans un bouillon n'ayant pas de donneur d'acyle, ouvre la voie a d'autres types de conversion (figure 3).

B iosy n t hcsis

/ P. cltr).vogcrrtttrt

IiyJroIysis

Chcmical

acylation \

hydroiysis acylation

Figure 3: Différentes voies de synthèse et structure du 6-APA (Richmond, 1981, p.15; Betina, 1983, p.312).

Le composé obtenu, le &APA, peut être facilement condensé avec plusieurs acides carboxyliques donnant naissance à une gamme d'antibiotiques très variée (Batchelor et coll., 1959). L'abondance de la 6-APA a stimulé l'expansion de l'industrie de la fermentation et la commercialisation d'antibiotiques semi-synthétiques (figure 3). Le but était de créer une gamme d'antibiotiques possédant différents niveaux de résistance à la pénicillinase, une distribution pharmacologique altérée et un spectre d'activité plus large, surtout contre les bactéries Gram-négatives. La méthicilline fut la première de ce genre à être approuvée pour une utilisation clinique.

Plusieurs dérives du 6-APA modifiés dans leur noyau thiazolidine ont été synthétisés. N'ayant pas obtenu d'amélioration rnarquee de l'activité antibactérienne, la conclusion logique de t'industrie pharmaceutique fut qu'une pénicilline bioactive doit avoir un résidu carboxylique lie au carbone 3 et que l'acide pénicillanique est le noyau de choix pour la préparation de composés antimicrobiens. Les modifications de la chaine latérale donnent plus de possibilités grâce à la réactivit6 du groupe amine du carbone 6 du 6-APA. Cette dernière condition ne s'applique pas dans le cas du m6cilliname, un inhibiteur puissant de quelques bactéries Gram-négatives, où la chaine latérale -CH=N est

liée au carbone 6. Les pénicillines sont classifiées (figure 4, tableau 1 et figure 5) selon les liens hydrogènes que peut avoir le carbone a de la chaîne latérale -R (Betina, 1 983).

I d C-CO-N I

Figure 4: Illustration des liens possibles du carbone a déterminant la classe de la pénicilline selon le nombre d'atomes d'hydrogène qui lui sont rattachés (Betina, 1983).

Tableau 1 : Classification des pénicillines

Classe Nomenclature Stéréochimie du Carbone Alpha

p. - -

1 Méthylmono-substitué deux liens hydrogènes

2 Méthyldi-su bstitue un lien hydrogène

3 Méthyltri-substitué aucun lien hydrogène

4 Carbone insaturé liens multiples

5 Heterocycle, cycloalkyle le carbone fait partie d'un noyau

RCONH

C,H5CH=CHCHr Oxacillin Pen F

Pen V Pen X

Pen K

Dicloxacillin Pen N

Propicillin

Diphenicillin

OMe

Quinaciilin Methicillin

Ticarciltin PHCH- I NH2

Ampicillin

Figure 5: Structure des chaînes latérales, positions dans la structure g6nerale de la pénicilline et noms scientifiques de quelques pénicillines (Page,

Les chercheurs réalisèrent que la céphalosporhe pouvait être traitée comme la pénicilline. En effet, le noyau cépheme avait une extrémité amin6e à laquelle on pouvait ajouter différents radicaux alkyles pour augmenter et varier la gamme des céphalosporines (figure 6). De la fermentation de Cephalospurkm découle trois produits actifs: la céphalosporine Nt une pénicilline avec un groupement amino-carboxybutyle comme chaîne latérale, la c6phalosporine Pl un stéroïde avec un spectre très limite d'activité bactérienne, et la cephalosporine C, produit majeur constituant la base des nouvelles céphalospon'nes semi- synthétiques. Sa structure ressemble à la pénicilline mais le noyau thiazolidine est remplacé par un dihydrothiazine.

CON

Figure 6: Structure de base des céphalosporines. La numérotation débute à la position de l'atome de soufre. Les carbones 3 et 7 sont indiqués. Le carbone 7 a deux chaînes latérales. II y a une double liaison entre le carbone 3

et 4. Le groupe carboxyle est lie au carbone 4. Le noyau comprenant le soufre est l'anneau dihydrothiazolidine (Huovinen, 1988).

La cephalosponne C originale a longtemps été ignorée à cause de son activité réduite (Abraham et Newton, 1961). Le traitement acide de la

céphalosporine C abouti à la formation et à l'isolation du précurseur 7-amino- céphalosporanique (7-ACA), l'analogue du 6-APA. Par analogie avec les expériences de la phiciIline, des substitutions de diffdrents groupes à la fonction Ta-acylamine du noyau 8-lactame, on pouvait obtenir plusieurs dérives de la céphalosporine. II a été démontré que les modifications en position 7 du %AGA

sont associées à des altérations dans 11activit6 antibactérienne tandis que des changements en position 3 du noyau dihydrothiazine sont associ6s à des changements dans la pharmacocin4tique et les paramètres m6taboliques. Le système de classification, en trois g6n6rationss bien qu'il soit arbitraire, est une maniare utile de cataloguer differents cornpos6s (figure 7) selon leur utilit6 clinique. Les g6n6rations sont basdes sur les caract6ristiques de 11activit6 antimicrobienne. En effet, les céphalosporines de la première gendration, telle la céfalotine, ont une bonne activité contre les bactéries Gram-positives et plus ou moins modeste contre les Gram-negatives. La plupart des cocci Gram-positifs y sont sensibles. La deuxième genération, exemple la dfuroxirne. présente une activit6 améliorée contre les bact6ries Gram-négatives mais beaucoup moins forte que la troisième génération. La troisième génération est plus active que la première génération contre les bactéries Gram-nbgatives et moins active que la premiere génération contre les Gram-positives. Une sous-famille de la troisième géneration (la ceftazidime, non-indiquée dans la figure 7) est active contre Pseudomonas. En géndral, l'augmentation dans l'activité contre les bacteries Gram-négatives est accompagnée d'une di minution d'efficacité contre les Gram- positives.

Cep halosporin R L

Oral cephalosporins cephaloglycin ceph alexin cefaclor cefatrithe

Fim-generation cephalosporins

cephalothin

cephaloridine

N-N

cefazolin

Second-generation cephalosponns cefamandole

N-N

cefuroxime

N. OMe

cepham ycin

Third-pneration cephalosponns

. OMe

.- , N

cefot axirne

Figure 7: Structure des chaines latérales, positions dans la structure générale de la céphalosporine et noms scientifiques de quelques céphalosporines (Page, 1992).

1.1 -3.3 Mode d'action des B-lactamines

1 -1 -3.3.1 SynthBse du peptidoglycan

Avant même que la structure de la paroi cellulaire de la bacterie ne soit 6tudi6e en détail il &ait reconnu que l'action de la p6nicilline sur les bacteries sensibles consistait en la rupture et la lyse de cette paroi (Queener et coll., 1986). La comprhhension du processus de synthèse du peptidoglycan a permi d'identifier ces sites d'action. La sene de reaction de synthese peut être divisée en 3 Btapes: Ia production des unit& de base, la condensation de ces unit& en chaînes de peptidoglycan puis la formation de liens entre ces chaînes (Lancini et coll., 1982).

Dans la première étape les unités de base sont formées par l'ajout de 5 acides aminés à l'acide uridine-diphosphate-N-acetyl-muranique pour former la molecu le uridine-diphosphate-N-acétyl-muranyl-pentapeptide (UDP-pep5).

La deuxieme étape consiste à coupler I'UDP-peps à un transporteur lipidique riche en énergie, l'alcool Cs5-isoprenoïde. Par la suite une molécule de N-acetyl-glucosamine est ajoutée à la portion N-acétyl-muranique de la molécule pour former un disaccharide, 1'6nergie de cette r6action provenant du N-acétyl- glucosamine qui entre dans la réaction en tant que dérive uridine-diphosphate. Une reaction de transglycolysation suit, où de longues chaînes de polysaccharides sont formées par le couplage de glucides amines N-acetyl- glucosamine et N-acétyl-muranyl-pentapeptide. Ce dernier provient du UDP- pep5-Cs5-isoprenoïde dont le bris du lien, entre I'UDP-pep5 et son transporteur, produit l'énergie nécessaire à la transg lycolysation. Cette rbaction de polyrn6risation a lieu du côte externe de la membrane interne (Richmond, M.H., 1981 ).

A la dernière étape la structure est consolid6e par la formation de ponts ("cross-linking") entre les longues chaînes de peptidoglycan par une réaction de transpeptidation, pour former le produit final qu'est le peptidoglycan mature. Cette transpeptidation consiste en la formation d'un lien peptide entre le groupe amine de l'acide diaminopielique ou lysine d'une chaîne et le groupe carboxyle du premier des deux D-alanine de l'autre chaîne. Ceci mène à la libération d'un D-alanine ce qui fournit l'énergie necessaire pour la formation du

lien peptidique. II faut comprendre que cette dernibre 6tape de transpeptidation peut vari6e d'une souche bacterienne à une autre. La plupart des antibiotiques 8-lactarniques agissent sur cette dernihre étape, en se liant et en inactivant ainsi l'enzyme de transpeptidation. La cellule continue donc à grandir et B augmenter son contenu interne, sans l'effet solidifiant et protecteur d'un peptidoglycan mature, pour finalement se lyser (Richmond, M.H., 1981 ).

1 -1.3.3.2 Mécanisme mol6culaire des B-lactamines

Du point de vue moléculaire, une fois que la 0-lactamine s'est Me, la chaine latérale sur le carbone 6 (penerne) ou 7 (cephame) interagit avec un groupe spécifique de la PLP, induisant un changement conformationnel dans la protéine (Waxman et Strorninger, 1983). L'inhibition de ces protéines par les 0- lactamines est le résultat de I'acylation d'un résidu sérine du site actif. Le complexe initial subit un changement permanent impliquant l'ouverture du noyau C-lactamine avec I'acylation d'un hydroxyle (-OH) d'un résidu sérine de la PLP (Yocurn et coll., 1979). Bien que la formation du complexe acyl-enzyme soit réversible, sa demi-vie peut approcher les sept ou huit jours (Ghuysen et coll. 1979). Cette longue inactivation est la cl6 de I'efficacit6 thérapeutique des 0- lactamines (Kelly et coll., 1987). La PLP est relâchée trés lentement. Ce complexe a besoin d'une molécule d'eau pour être déacyl6 et ce processus n'est pas favorise chez les DD-transpeptidases. En augmentant l'aspect électrophile du carbonyle du noyau B-lactame le complexe stable entre dans une conformation qui empêche toute attaque par un nucléophile exogène. C'est ainsi que la pénicilline interfère avec la formation de la membrane en inhibant la transpeptidation (Strominger, 1 970). La microscopie électronique montre que les cellules traitées à la pénicilline accumulent du matériel amorphe dans l'espace périplasmique. II existe une similarité entre la structure du noyau O-lactame de la phiciIline et le D-ala-D-ala et ce noyau hautement energétique réagit avec la transpeptidase pour former un lieu covalent stable qui inhibe l'enzyme et le noyau B-lactame. Le substrat normal, D-ala-D-ala, réagit avec le même groupe de l'enzyme mais subit la transpeptidation.

1.2 RBsistance bactérienne aux antibiotiques

1.2.1 Historique

Dans une perspective historique, la chimioth6rapie a considérablement diminue le taux 6lev6 de mortalit4 relie aux infections bactériennes (Bergan, 1978). Cependant, l'apparition de bactéries r8sistantes aux antibiotiques diminua les ardeurs des plus optimistes et une controverse s'ensuivit. Les adeptes de la thdorie de Lamarckian stipulaient que n'importe quelle cellule dans une culture avait une probabilite finie de survivre au traitement s6lectif et que le trait génétique acquis &ait transmis aux générations subséquentes de ce clone. La théorie qui s'opposait a celle proposée par Lamarckian se basait sur la préexistence de mutations chez les bactdries. Ceci les favoriseraient en cas de rencontre avec l'agent de sélection en 6lirninant les micro-organismes sensibles. Luria et Delbruck dans leur élégant test de fluctuation ont démontre la plausibilit6 de la théorie des mutations préexistantes (Luria et Delbruck, 1943). Partant d'une même culture ils ont inocule une série de tubes en milieu stérile. A la phase stationnaire, une aliquote de chaque tube était réensemencé dans des conditions de sélection sur de I'agar sature de phages Tl. Par la suite le nombre des colonies résistantes était compte. Si le traitement sélectif induisait un changement dans la cellule (immunité acquise) alors il ne devait pas y avoir de différence entre le traitement sélectif applique à dix échantillons de la même culture ou dix échantillons de dix cultures différentes. Par contre si les colonies résistantes reflétaient le nombre de mutations préexistantes alors dix échantillons de la même culture devraient toujours avoir le même nombre de colonies et dix Bchantillons de dix cultures différentes devraient avoir un nombre de colonies différents. Le résultat de leur expérience fut en faveur de la théorie de la mutation préexistante.

Toutefois, depuis les débuts de I'antibioth6rapie' on a vu s'accroître le nombre de bactéries devenues résistantes a un antibiotique, c'est-&-dire capables de se multiplier en présence dune concentration d'antibiotique plus 6levée que celle qui inhibe normalement les souches de cette même espbce. Cette rdsistance acquise n'est pas due a l'adaptation d'une ou de plusieurs bactéries à un antibiotique. Elle dépend soit d'une mutation du chromosome bactérien (Levy, 1992), soit de l'acquisition d'un ou de plusieurs fragments d'ADN

extrachromosorniques. Ce phénomène se manifeste chez une seule ou chez plusieurs bacteries à l'intérieur dune souche. et non chez toute l'espèce.

Dans le cas de la résistance chromosomique, il est désormais prouve qu'il s'agit d'une mutation qui peut se produire en l'absence de ['antibiotique (Levy, 1992). La mutation se produit au moment de la replication du chromosome bactérien et elle represente un changement ou une alt6ration d'un gdne bactdrien: elle a donc un caractere herdditaire el permanent. Quoiqu'une mutation chromosomique crbant une r6sistance soit un phhomene rare, si l'on considère la frequence ou le taux de mutation global, la possibilité de transfeit de cette nouvelle information g6n6tique d'une bact6rie a une autre dans une même espece ou même d'une espéce à une autre augmente l'impact du problème (Spratt et coll., 1994; Spratt et coll., 1995).

Pour sa part, la résistance extrachromosomique est due à l'acquisition de particules d'ADN par la bact6rie. Ces el6ments sont soit des plasmides ou des transposons. Les plasmides sont des molécules d'ADN bicaténaire de petite taille qui varient selon les facteurs de résistance. Ils se répliquent indépendamment du chromosome et peuvent se transférer d'une espece bactérienne à une autre. Certains plasmides portent des caractères de résistance aux antibiotiques ce qui rend la bactérie qui les héberge résistante a plus d'un antibiotique à la fois. Le transfert des plasmides de résistance d'une bactérie à l'autre peut se faire par conjugaison (Burrows et coll., 1973), c'est-à- dire par simple contact entre les bactéries. Ce dernier est le principal mécanisme de transfert de résistance des bacilles Gram-négatifs. Le transfert des plasmides peut aussi se faire par transduction ou par transformation. La transduction est le mode de transmission le plus fréquemment observe actuellement chez les cocci Gram-positifs. La transformation est un mécanisme de résistance rare et I'ADN transféré s'incorpore au chromosome ou à I'ADN du plasmide (Balows et coll., 1 980).

Les transposons, ou genes sauteurs, sont des séquences d'ADN porteuses de caractères de résistance, qui ont la capacit6 de se déplacer d'un plasmide à un autre, d'un plasmide à un chromosome et du chromosome à un plasmide. Le déplacement des transposons d'un plasmide à l'autre expliquerait le fait qu'un plasmide peut posséder plusieurs genes de résistance à des antibiotiques différents (Joset et coll., 1993).

1.2.2 Structure de la paroi bactérienne

La Figure 8 est une comparaison l'échelle de la paroi des batbries Gram-positives et Gram-négatives respectivement.

O ani igm - Potin trimer -

Periplasrnic mace 1

mmbtam

Figure 8: Illustration comparative de la paroi cellulaire des bactérÏes Gram-positives (A) et Gram-négatives (B). Les détails et l'explication des différentes composantes sont présentés dans le texte (Pelczar et coll.,l991).

La paroi des bactéries Gram-positives (20-25 nm) est relativement simple. La membrane cytoplasmique se compose d'une double couche de phospholipides dans laquelle sont ancrées des protéines. Elle est le site de la perméabilité sélective. du transport de solutés et d'électrons dans les espèces aérobies, et de i'excrétion d'exo-enzymes hydrolytiques. Elle est aussi le site des enzymes et molécules transporteuses qui agissent dans la biosynthèse de l'ADN, des polymères de la paroi. des lipides membranaires et des récepteurs et autres protéines du système chimiotactique. Au moins 50% de la membrane cytoplasmique doit être dans un 6tat semi-fluide pour permettre à la cellule de croître. Au-dessus de cette membrane cytoplasmique s'amasse une multitude de couches de peptidoglycan (50% du poids sec de la paroi bactérienne). Cest ce qui donne à la paroi sa rigidité, sinon la pression interne créée par le transport

des solut6s serait suffisante pour faire éclater la cellule. D'ailleurs une composante majeure des bactéries Gramgositives sont les polysaccharides tels les acides teichoïque et teichuronique. Ce sont des polymères de glyc6rol et de ribitol phosphate. Ils peuvent être attaches soit au peptidoglycan soit B la membrane cytoplasmique. Ils sont charges nbgativement et pourraient aider au transport d'ions positifs et à l'emmagasinage du phosphate. Ils constituent la majeure partie des antigènes de surface. Chez les bactéries Gram-positives il n'existe pas d'espace p6riplasmique proprement dit, ce qui en font des secreteurs d'enzymes I'ext6rieur de la bact6rie.

Les bacteries Gram-negatives ont le même type de membrane cytoplasmique que les Gram-positives. Cependant, la premibre différence d'avec les Gram-positifs se situe au niveau du peptidoglycan, qui se retrouve en concentration plus faible (10% du poids sec de la paroi) dans l'espace périplasmique. La deuxième différence est l'existence d'une membrane externe. Elle est formée d'une bicouche phospholipidique. Les phospholipides qui font face a l'espace périplasmique sont de même nature que les phospholipides de la membrane cytoplasmique. Ceux qui font face au milieu externe sont des lipopolysaccharides (LPS). Ils sont composés d'un lipide A fermement attache à la membrane, d'un bloc polysaccharidique se trouvant à la surface de la membrane externe et d'un antigène O qui est une rdpétition d'unité de glucides. Cet agencement est responsable des propriétés sérologiques des LPS. L'espace contient des enzymes et des PLP. La communication avec le milieu extérieur se fait essentiellement via des porines qui sont des canaux de différents diamètres. On retrouve aussi dans I'espace périplasmique des lipoprotéines qui rattachent la membrane externe au peptidoglycan. Plusieurs traits contribuent à la rudesse du peptidoglycan, comme par exemples le lien 0-1, 4 entre deux glycans, donnant une forme serrée particulière, ou l'altération des acides aminés L-alanine et D-alanine dans le tetrapeptide, offrant un polymère plus compact qu'un monomère de l'un des deux acides amines. Le peptidoglycan, appelé quelquefois sacculus murein, est solide mais également souple car il subi des contractions dans la mobilité. Les liens croisés des peptidoglycans permettent des échanges osmotiques pour élargir et contracter substantiellement le volume de la bactérie. Les bactéries Gram-négatives avec leurs membranes fines sont hautement perméables et la cellule se fie sur la porosité de la membrane externe

pour limiter l'accès de différentes molécules a la membrane cytoplasmique (Pelczar et coll., 1991 ).

1 -2-3 Mecanisme de résistance

La r6sistance acquise de certaines espèces bactériennes a diffdrents antibiotiques peut être li6e B plusieurs m6canismes notamment a) la diminution de la perrneabilit6 de la bactérie à I'antibiotique, b) la modification du site d'action. c) l'inactivation de I'antibiotique par la synthèse d'enzymes bactériennes, d) le développement d'une voie mbtabolique remplaçant la voie bloquée par I'antibiotique, e) la deficience du processus d'autodestruction des bactéries par les autolysines.

Bien que l'absence de perm6abilit6 est un phénomène de résistance naturelle chez certaines espèces, d'autres peuvent acquérir cette imperméabilité suite à une mutation ou à l'acquisition de plasmides. Le peptidoglycan de la paroi des bactéries Gram-positives n'oppose pas de v6ritable barrière au passage des antibiotiques. Quant aux bactéries Gram-négatives, la mince couche de leur peptidoglycan est recouverte d'une membrane externe qui joue un rôle sélectif vis-à-vis l'environnement. Cette membrane est en effet traversée par des protéines trimères, les porines, qui permettent la diffusion passive de petites molécules (Hancock et Carey, 1979; Sawai et coll., 1979; Jaffe et coll., 1982; Angus et Hancock, 1983; Hancock, 1987). L'altération des porines, a la suite d'une mutation, peut limiter le passage des molécules et réduit ainsi la sensibilité des bactéries à certaines classes d'antibiotiques (Harder, 1981 ; Büscher, 1 987). La pénétration de certains antibiotiques comme les aminosides nécessite un mécanisme de transport actif au niveau de la membrane cytoplasmique, afin de mettre en action la chaîne de transport d'électrons (Levy, 1992). Toute mutation qui transforme le système de transport d' électrons peut entraîner un phénomène de résistance générale ou plus spécifique.

La plupart des antibiotiques inhibent le métabolisme cellulaire en se fixant sur des protéines ou autres molécules à l'intérieur de la bactérie. Si la cible a subit une altération, I'antibiotique sera incapable de se fixer ou se fixera

mal, d'où la diminution ou disparition de son action destructrice et inhibitrice. Plus pr&is&nent, on peut avoir soit une diminution de l'affinité des PLP existantes par mutation ou la production de nouvelles PLP qui résistent à ces antibiotiques (Spratt et coll., 1988). Tel que déjà mentionn6 les PLP sont des transpeptidases et des carboxypeptidases qui catalysent I16tape finale de la biosynthèse du peptidoglycan, et une fois fix6es aux B-lactamines, elles ne peuvent plus participer a la synthese de la paroi (Bush et Sykes, 1984; Kelly et coll., 1986; Buono et coll., 1993). D'autres enzymes sont aussi la cible de certains antibiotiques, notamment les quinolones, qui agissent sur la gyrase durant la réplication de I'ADN. Une modification de la gyrase peut entraîner une non-recon naissance ou, dans certains cas, une reconnaissance imparfaite. Cette résistance est d'origine chromosomique au site du gène de la gyrase. Notons aussi I'ARN-polymerase-ADN-dépendante qui a une sous-unité sensible à la rifampicine. Une modification de cette sous-unité peut engendrer une incapacité de liaison entre I'antibiotique et la sous-unité, ce qui permet à la transcription de se faire normalement, malgré la présence de l'antibiotique. Le ribosome ou quelques unes de ses sous-unités sont aussi la cible de certains antibiotiques. Une mutation d'un seul acide amine ou une méthylation de I'ARN ribosornal peut s'accompagner d'une diminution de l'affinité de ces antibiotiques pour leur cibles (Spratt, 1978).

L'inactivation des antibiotiques par des enzymes bactériens coincide souvent avec la présence d'un plasmide. Ces enzymes destructices d'antibiotiques sont des O-lactamases qui hydrolysent le noyau B-lactame et produisent des dérivés inactifs. Les O-lactamases sont soit inductibles ou constitutives selon le taux de synthese en présence ou en absence du substrat. Par la suite elles sont soit libérées dans l'environnement, pour les bacteries Gram-positives, soit dans l'espace périplasmique, pour les bactéries Gram- négatives. A l'opposé, les enzymes agissant sur les aminosides sont intracellulaires. L'antibiotique. dans ce cas, n'est modifie qu'une fois a l'intérieur de la bactérie. Ces enzymes sont généralement codees par un plasmide ou un transposon et on les classe en trois groupes: 1) les acétyltransférases, qui agissent par acetylation du groupement amine, 2) les nucléotidyltransférases, qui agissent par I'adhylation du groupement hydroxyle, 3) les phosphotransféraseç, qui agissent par la phosphorylation du groupement hydroxyle. A remarquer que

ces enzymes sont très spécifiques certains substrats, par exemple une des sept phosphotransférases est active seulement contre la streptomycine.

On remarque un autre type de resistance avec les sulfarnid6s. En effet, le d6veloppement d'une voie m6tabolique visant 2i remplacer la voie bloqu6e par l'antibiotique est genhlement observe. Ces bactéries produisent deux enzymes dont l'une est insensible à I'antibiotique. C'est le cas de la dihydropt6roate synthetaçe qui n'est pas inhibe0 par l'agent et catalyse ainsi la production d'acide dihydropt6roÎque à pariir d'une pt6rine et de PABA. On remarque le même phhomene avec la trimbthoprirne, mais cette foisci l'enzyme est la dihydrofolate synthdtase qui est insensible. La synthhse d'ADN se fait normalement en présence de cet enzyme.

Finalement. la déficience du processus d'autodestruction est un mécanisme de résistance obsewé principalement chez les bactéries Gram- positives. Le phénomène d'autodestruction implique normalement les autolysines. dont le système de répression est inactivé, suite a la liaison des B- lactamines aux PLP (Newman, 1981 ). Cependant une tolérance se développe. Celle-ci n'est pas encore bien comprise et diverses hypothbses sont avancees.

1.3 Généralités sur la cinétique enzymatique

Théoriquement une courbe de progression mesurant la cinétique d'une réaction enzymatique a l'aspect de celle illustrée de la figure 9 (Dixon et coll., 1992). Dans la pratique, la vitesse peut diminuer avec le temps pour plusieurs raisons: le produit final peut inhiber l'enzyme, le degré de saturation diminue avec la chute de la concentration du substrat, l'enzyme peut devenir instable, etc. Ceci a pour conséquence la modification de l'allure de la courbe. C'est pour cela que les chercheurs ont adopté la mesure de la vitesse initiale comme outil d'étude de l'activité enzymatique. Dans les conditions initiales, les raisons mentionnées ci-haut ne rentrent pas en jeu et les paramètres sont adéquats pour les mesures. Pour obtenir la vitesse initiale, il est seulement nécessaire de déterminer la première partie de la courbe et de calculer la tangente à partir de l'origine. Ces tangentes sont des lignes droites tant et aussi longtemps que la quantité du substrat changé n'excède pas 20% du total (Eisenthal et coll., 1992).

0 TEMPS

Figure 9: Courbe théorique de progression d'une réaction enzymatique de premier ordre (Dixon et Webb, 1992).

Les méthodes utilisees pour suivre les réactions enzymatiques sont, en général, de deux types. La première est la m6thode de I'échantillonage où on

pr6lbve des 6chantillons au fur et à mesure que la reaction continue. C'est une methode essentiellement discontinue qui donne des lectures tout au long de la courbe de progression. Cette methode se base sur une estimation chimique de ce qui se passe avec le substrat ou le produit de la reaction. On pr6ldve trois points pour chaque d6termination. Le premier point represente le temps zero. le deuxième point doit être situ6 dans un intervalle raisonnable et le troisième sera le double du deuxihme. Ceci permet de vérifier la linbarité de la courbe comprise dans l'intervalle choisi. Quant la methode continue, les mesures sont prises d'une façon automatique. La majorit6 des enzymes peuvent être etudides de cette manibre ce qui est trhs pratique. La vitesse initiale dans ces cas est calculée via la pente de la courbe. Beaucoup de substrats et produits de reactions enzymatiques absorbent de lumière à des longeurs d'ondes sp6cifiques du visible A l'ultraviolet. La présence @un lien double ou d'un anneau peut donner un spectre d'absorption que Iton peut mesurer au spectrophotomètre. C'est le cas des B-lactamines avec leur anneau 8-lactame qui absorbe aux environs de 230-260 nm. Les 8-lactamases hydrolysent les antibiotiques en détruisant le noyau O-lactame, ce qui correspond à une diminution de la densité optique. Cette diminution est directement correlée à une unité d'activité enzymatique exprimee dans un intervalle de temps pr4cis. En suivant des réactions enzymatiques de cet ordre, il est essentiel d'avoir une cellule sous contrôle thermodynamique pour mimer les conditions physiologiques.

Les réactions catalysées par les B-lactamases se font dans des conditions complexes. La concentration des différentes composantes de ce système dépend de la concentration enzymatique, des reactifs ainsi que de l'affinité de l'enzyme pour ces réactifs. La détermination de l'affinité enzymatique est d'une importance capitale pour l'étude des réactions enzymatiques. L'équilibre entre le complexe et les différentes composantes libres de ce complexe peut être exprime en terme de constante d'association ou de dissociation. C'est cette dernière qui est ghéralement utilisde dans la litterature. La relation qui existe entre la concentration du substrat et la vitesse initiale est d'une importance majeure dans la cinetique enzymatique et est souvent exprimde de cette façon:

Figure 10: Équation de Michaelis-Menten de premier ordre. v: vitesse initiale; s: concentration de substrat; V: vitesse maximum pour des concentrations saturantes de subçtrat; Km: constante d'affinité.

Le Km peut être détermine grgce à plusieurs méthodes graphiques. Elle est égale à la concentration de substrat qui donne la moitié de la vitesse maximale. Elle a été souvent considérée comme étant la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat, mais il est clair que ce n'est pas toujours le cas. II est donc nécessaire de faire la distinction entre ces deux paramètres et de rester avec la nomenclature de Km pour la constante de Michaelis-Menten et Ks pour la constante de dissociation (ou d'équilibre).

1 A Le ddveloppement de la classification des Slactamases

En ce qui concerne les bacteries Gram-positives, les staphylocoques sont les principaux pathogènes produisant les B-lactamases. On en distingue quatre types. d6sign6s de A D, grâce à des methodes s6rologiques. Celles-ci hydrolysent de pr6f6rem les p6nicillines et sont en majorite inducti bles dans cette esphce. Elles sont, en gendral, plasmidiques et transferables par transduction ce qui contribua à leur dissemination (Balows et coll., 1980).

Pour ce qui est des bact6ries Gram-nBgatives, la variet6 de O- lactamases produites a engendre plusieurs classifications. Les premibres &aient basees sur des profils de substrat comme la comparaison entre le taux d'hydrolyse des pénicillines versus celui des cephalosporines. Ceci pouvait être compl6t6 par des études @inhibition et immunologiques. Richmond et Sykes ont base leur classification sur ces criteres (Richmond et Sykes, 1973; Sykes, 1982). Ils ont divisé les 0-lactamases en cinq classes qui ont servi de base à partir de cette période. La classe I est celle qui hydrolyse fortement les céphalosporines (cephalosporinases). Cette classe inclut les O-lactamases chromosomiques de la plupart des Enterobacteres et Pseudomonas (Bergstrom et coll., 1982). Les Proteus et Klebsiella sont plus actifs contre les pénicillines, et c'est pour cela que ces espèces sont incluses dans les classe II et IV respectivement. La Classe III est composée de B-lactamases plasmidiques de type TEM à l'encontre de la classe V qui, bien qu'étant un groupe hétérogène, englobe les enzymes hydrolysant la cloxacilline et la carbénicilline. Cette hétérogénéité ainsi que ies problèmes de définition des paramètres d'inhibition enzymatique comme le parachlorornercuribenzaate (PCMB) ont rendu cette classification difficile. Les progrés technologiques ont apport6 au domaine des B-lactamases d'autres techniques d'identification telles les gels de polyacrylamide bases sur les points iso6lectriques (Matthew et coll., 1 976). Cette technique a permis a des chercheurs d'identifier les 0-lactamases partir d'un extrait brut sans purification prealable, c'est-&dire que le mélange pouvait contenir plus d'une B-lactamase à la fois. La méthode est très sensible, au point de révéler la présence d'une D-lactamase dans toutes les bactéries Gram- négatives Btudiées jusqu'à date. Le modèle de migration dans le gel peut aussi servir d'empreinte digitale de la B-lactamase si on fait migrer un standard connu sur le même gel. Ces données Btaient souvent associées à des valeurs de

cinetique enzymatique rendant ainsi la tâche plus facile surtout si on &ait en pr6sence de plusieurs Bchantillons cliniques.

Plus tard, les. nouvelles methodes de sequençage permettant de determiner la s6quence en acides amines des O-lactamases déjà decrites ont contribue au développement d'une nouvelle approche de classification (Bushl 1984; Medeiros, 1984; Joris et coll., 1991). Se basant sur des btudes d'&olution, deux groupes distincts ont émerge et forment de nos jours l'essentiel de cette classification. Le premier représente les enzymes à serine et le deuxième les enzymes à zinc. Le premier groupe se subdivise en classe A et C. Par définition, les B-lactamases de la classe A posshdent une sefine dans leur site actif et, en g6n6ralI ont un poids mol~culaire de 29 KDa. Ces B-lactamases demontrent une forte homologie de séquence des acides amines principalement dans les régions impliquées dans I'activitd enzymatique. De plus elles hydrolysent de préférence les pénicillines. On les retrouve aussi bien chez les bacteries Gram-positives que Gram-négatives. Notons que la séquence autour du site actif de la classe A est homologue à celle du site actif des PLP ce qui laisse supposer que les B-lactamases dérivent des PLP qui sont impliquées dans la synthése du peptidoglycan. Pour ce qui est des oxacillinases, qui sont trbs actives contre I'oxacilline et dont la séquence est differentes des autres 8- lactamases, elles ont été regroupées sous la classe Dl tout en étant des enzymes a serines. Ce sont des enzymes trés disseminees et sont les mieux connues après les TEM.

La classe B est composée de rnetailoenzymes qui s'attaquent aux céphalosporines et requièrent le zinc (Sabath et coll., 1966) pour être dans des conditions optimales, quoique le cadmium ou le cobalt puissent senrir de substitut, conférant cependant à l'enzyme une activité moindre (Mitsuhashi et coll, 1982; Bicknell, 1985). Les enzymes de la classe B hydrolysent presque toutes les 8-lactamines mais les inhibiteurs connus des 0-lactamases, tel l'acide clavulanique, ne les affectent pas. Cependant, les agents chélateurs les inhibent tout en n'ayant aucune conséquence sur les B-lactamases à sérine.

La classe Cl par contre, est constitu6e des céphalosporinases chromosomiques d'E. coli qui montrent une homologie de sequence avec les Klebsiella, Sa/monella, Senafia et Pseudomonas. Ce sont aussi des enzymes à sérine mais elles n'ont pas d'homologie de sequence avec la classe A. Notons

aussi l'apparition de céphalosporines plasmidiques (Bush et coll., 1995). La figure1 1 illustre cette classification.

O-LACTAMASES

CLASS 1 B I

CLASSE C

I Bacillus cereus 1 I

I Pénicillinases

I Cépha losporinases

Pseudomonas maltophilia L- 1 1 chromosomiques Bacféroides fragilis Aerom onas hydroph yla

1 P. a erughosa

E cdi

I E cloacae Shi@?lla sonnei Sh$ella flexneri

1 S. typhirn urbm G rarn-positives Gram-négatives S. marcescens

1 LASSE D K. pneumoniae SfaphyIococcus a ureus Bacillus cereus I et I I I

C m 1 a 20 SHV-1 A SHV-6

I OXA-1; OXA-2

8ac17lus fir'chenfomis PSE-1,3,4 OXA-5; LCR-1 Sfreptom yces CARB-3, CAR8-4 PSE-2 Actinomadura R-39 CARS-5, AER- 1

Figure 1 1 : Classification des B-lactamases. N.B.: Cette figure resume les résultats obtenus de diverses publications (Am bler, 1 980; Bush, 1 995).

1 b Mécanique enzymatique des Blactamases

Les etudes d'alignement après sbquençage ont ouvert la voie aux analyses de structure-fonction qui ont et continuent de dominer le champ des O- lactamases. II est à remarquer qu'un bon alignement est le critère le plus important dans toute évaluation et étude de site spécifique directement associ6 avec 11activit6 d'une enzyme. Suite a ces études, plusieurs acides aminés ou groupes d'acides amines ont 6té identifies comme étant impliqués dans l'hydrolyse des antibiotiques. Les sites conservés ont été classifiés par boite, chacune pouvant englober un ou plusieurs acides amines, numérotées de I a VII. La boîte qui a été l'objet de notre étude est la boîte numéro VI!, qui se trouve a la jonction des brins B3 et 04, formant le dessous de la cavité du site actif. Ce qui est frappant dans cette boite c'est la conservation du résidu arginine à la position 234 (numérotation de Ambler) ainsi que la présence d'une glycine à la position 238 qui, bien que non exclusive aux carbénicillinases, représente un site très important pour l'activité des céphalosporinases si elle est changée pour une sérine. Nous nous sommes vite aperçu du potentiel que pouvait avoir divers combinaisons qui impliqueraient I'arginine 234 et la glycine 238. 11 est évident que ces résidus ne sont pas les seuls impliqués dans I'hydrolyse des antibiotiques (pénames et céphames). Le travail accompli par les résidus formant le site actif pour détruire l'antibiotique est complexe mais nous essayerons de le décrire. On remarque en général trois étapes. La première implique une association réversible, entre l'enzyme (E) et le substrat (S), donnant un complexe non-covalent (ES) (figure 12). l'évidence de la nécessité d'un intermédiaire acyl-enzyme, durant le phénomène d'hydrolyse. a été prouv6e pour la première fois après l'analyse de l'enzyme RTEM en présence de la c6foxitime. La deuxième étape constitue donc en la formation proprement dite du complexe covalent (E-acyl), suivit de la troisième étape qui est I'hydrolyse.

Figure 1 2. Les étapes de I'hydrolyse des antibiotiques

+ P

(Waley, 1992).

Les constantes pour I'acylation et la deacylation sont k2 et k3 et si l'un est consid6rablement plus petit que l'autre, alors cette étape devient le facteur limitant. Des dtudes structurales et cinetiques ont abouti à un consensus en ce qui concerne les acides amines impliqu6s dans Iractivit6 des B-lactamases de classe A. Dans cette hypothhse, le glutamine 166 enlhve un proton une molécule d'eau activée qui s'apprêtait B attaquer le groupement hydroxyle de la serine 70 du site actif (Labia et coll., 1991). La lysine 73, quant à elle, s'engage dans une interaction charge-charge avec le glutamine 166. La lysine 73 va aussi agir comme base g6n6rale en enlevant un proton de la sérine 70 et en le transférant au noyau thiazolidine de la O-lactamine. L'attaque du noyau O- lactamine est initiée par la senne 70, assistee par le trou oxyanion qui augmente la polarit6 du carbonyle du noyau Blactarne (Waley, 1992). Le lien crée entre la lysine 73 et la sérine 70 faciliterait le transport de l'électrons entre la molécule d'eau et la sérine 70. 11 ne faut pas oublier le résidu serine 130, qui pourrait laisser interagir son groupement hydroxyle (-OH) avec la senne 70 et la lysine 234. Tout changement affectant la sérine 130 a un effet direct sur l'activité c6phalosponnase (Joris et coll., 1991 ; Juteau et coll., 1992; Jacob et coll., 1990, 1 991 ). La position 234 semble être critique pour l'activité tant et aussi longtemps qu'il y a une charge positive à cet endroit (arginine, lysine, histidine) (Ellerby et coll., 1990; Brannigan et coll., 1991). Finalement, mentionnons qu'il y a une interaction entre I'arginine 220 et la thréonine 216 (Frère et coll., 1991). Cette dernière a un lien avec la thréonine 235 qui forme un lien hydrogène avec le carboxylate du substrat.

t .6 Structure des î3-lactamases

Des progrès ont 6t6 réalises aussitôt que les él6ments de la structure secondaire de D-ala-D-ala-peptidase de Streptomyces R61 ont et6 corn pares aux 8-lactamases de Bacillus licheniformis et a la &lactamase I (Kelly et coll., 1986; Fladwick et Waley, 1987; Frère et coll., 1993). La d6couverte dans la structure tertiaire d'une region assez large et commune suggbre fortement I'bvoluüon par divergence à partir d'un ancêtre commun (Samraoui et coll., 1986). La premiere i3-lactamase Btudi6e par cristallographie haute r6solution fut celle de S. aureus PC1 (Herzberg et coll., 1987, 1991). Cette 6tude démontra qu'il y avait deux domaines etroitement associ6s au site actif comprenant la sérine 70. Ce site &ait donc dans une crevasse sitube entre les deux domaines. En plus la serine 70 &ait a la fin de l'hélice alpha du cote N-terminal, une région qui doit avoir une charge positive pour permettre une coopération. Les deux autres acides aminés les plus proches &aient la lysine 73 et la glutamine 166. Ces deux derniers formaient un pont salin de 2.8 A qui permettait à la lysine 73 de se rapprocher beaucoup plus de la serine 70. La formation d'un complexe acyl- enzyme impliquant la sérine 70 suggérait que Je substrat était positionne de façon a ce que le groupe carboxylate de l'anneau thiazolidine soit mis a nu (c'est à dire non recouvert de solvant) et que sa charge soit stabilisée par un pont salin avec la lysine 234. La position plus favorable du substrat a engendré des interactions entre l'oxygène du groupement carbonyle du noyau B-lactame et le groupe -NH des résidus serine 70 et lysine 234. Ceci est capital dans la catalyse puisque cela permet la stabilisation, complète ou partielle, de la charge négative de l'atome oxygène de l'intermédiaire tétrahèdre. Notons aussi une structure créée par l'interaction entre les r6sidus 166 et 167. Ce lien cis est critique dans l'orientation de certains résidus à l'intérieur du site actif. Finalement, il y a une cavité en dessous du site actif qui est remplie de six molécules de solvent; ceci permet, avec l'aide d'une autre sous cavit6 adjacente ayant trois molecules de solvent, d'isoler la boucle du site actif. Cette boucle est instable et peut être déformée d'où la formation d'un pont salin entre I'arginine 1 64 et l'asparagine 1 79

(Neu, 1992).

Une autre structure importante a 6t6 la O-lactamase de Bacillus licheniformis 749/C à 2.0 A (Moews et coll., 1990). Elle se compose d'un mélange d'hélices a (1 1 au total) et d'un seul feuillet B (5 brins) (figure 13)

comme chez les DD-peptidases de Streptomyces R61 (Joris et coll., 1988). Bien que la cristallisation se soit faite à un pH de 5.5 et celle de Staphylococccrs aureos PC1 à un pH 8.0 il n'y a pas eu de diffdrence majeure, au niveau du site actif, attribuable au pH. Le groupement hydroxyle (-OH) de la senne 70 est dirige vers la face alpha du noyau O-lactame (dans cette étude la pénicilline). La chaîne latérale de la pénicilline a un lien hydrogène avec le groupement carbonyle de l'alanine 237 (Healy et coll., 1989). Les données obtenues concernant les molécules d'eau ont démontré jusqu'a sept molécules dans le site actif. Lors de l'incorporation du substrat au site actif la présence d'une de ces molécules d'eau serait essentielle pour l'étape de déacylation.

Figure 1 3: Schéma des structures secondaires des B-lactamases. Les cylindres numérotes correspondent aux hélices a et les flèches sont les brins du feuillet B. (Moews et Knox , 1991).

Des études de mutagénese dirigée ont aussi contribué a élucider l'importance de certains acides aminés. Le cas classique impliquait la B- lactamase RTEM où les rbsidus sérine 70 et threonine 71 ont été interchangés (Dalbadie-McFarland et coll., 1982, 1986; Schultz et coll., 1987). Le double mutant était inactif. Une autre expérience, concernant la 8-lactamase de

Streptomyces albus G consista à changer la lysine 234 pour une histidine (Dideberg et coll., 1987; Brannigan et coll., 1991). La conclusion à tirer de cette &ude serait la nécessite d'avoir un résidu charge positivement en position 234, une remarque confirmee par des mutants ayant l'alanine ou le glutamate à cette position chez Bacillus lichenifomis. Une autre Btude mentionnait que si la charge nhgative &ait absente d'un substrat, la charge positive dans le site actif n'&ait plus un prerequis pour I'activit6 de f'enzyme (Joris et coll.. 1991). Que dire aussi du changement de sp6cificit6 que ces enzymes pouvaient avoir B la suite d'une mutation, comme dans le cas de RTEM, où la pr6ference pour les phicillines versus les c6phalosporines n'&ait plus valable si l'alanine 237 faisant partie du trou a oxyanion &ait chang6e pour la thrdonine ou l'asparagine (Healy et coll., 1989; Adachi et coll., 1 991, 1992). Le remplacement de I'asparagine 1 32, faisant partie de la boucle SDN, par une serine chez Streptomyces albus G, n'avait pas d'effet sur l'activité contre les pénicillines mais on remarqua une baisse importante de I'activit6 contre les c6phalosporines (Jacob et coll., 1 990). Des modèles construits a l'ordinateur et utilisant la pénicilline démontrèrent que le groupe amide de l'asparagine 132 pouvait faire des liens hydrogènes avec le susbstrat (Page, 1 992).

1.7 Les O-lactamases de la classe A de type carbenicillinase

Par définition une carbécillinase est une O-lactamase ayant une vitesse d'hydrolyse rapide pour la carbénicilline mais moyenne a faible pour les autres antibiotiques Si noyau &lactame. II est important de faire la remarque suivante sur la nomenclature des carb6nicillinases. Les premidres carb6nicillinases ont Bt6 decouvertes chez Pseudomonas aeruginosa. La croyance gendrale voulait qu'on ne pouvait les retrouver que chez ces dernieres, ce qui justifia la nomenclature PSE (Pseudomonas Specifics Enzymes). A partir du moment où on comrnenca à les déceler chez d'autres souches la nomenclature ne tenait plus et c'est ainsi qu'on s'est tourne vers une nomenclature de type CARB suivie d'un chiffre qui indique le rang de cette enzyme.

Le critère le plus important chez les carbénicillinases est leur forte hydrolyse de la carbénicilline tout en étant efficace contre les pénicillines. La première enzyme décrite fut PSE-1 qui a été décelée par la suite chez Escherichia coli, Proteus mirabilis, les Salmonella et Shigellae (Mede i ros et CO l l ., 1985). PSE-1 a aussi démontré une activité contre les céphalosporines et elle est connue pour avoir un point isoélectrique de 5.7. Des études cliniques suggèrent une localisation chromosomique. Au contraire des autres carbénicillinases, PSEB démontre une activité contre I'oxacilline, la cloxacilline et la methicilline. Son point isoélectrique est de 6.1 (Philllipon et coll., 1983). Cette enzyme fut classée parmis les carbénicillinases pendant une brève période pour finalement être redefinie comme une oxacillinase (Classe D dans la figure 1 1) (Huovinen, 1988).

On retrouve d'autre part, chez Enterobacter clocae , une B-lactamase de type PSE hydrolysant la carbénicilline. Elle fait partie d'un transposon Tt72101 qui donne la résistance aux streptomycine, sulfanilamide, spectinomycine, ampicilline et au mercure. Ce transposon a et6 identifie dans le plasmide Rms433 isole chez cette espace. II peut transposer parmi plusieurs r4plicons comme les plasmides et les chromosomes hôtes et dans plusieurs sites d'un même replicon indépendamment de la fonction recA normale de l'hôte (Mitsuhashi et coll., 1982).

Une nouvelle carbhicillinase a 6t6 d6couveRe chez Aeromonas hydrophla. L'enzyme ressemble aux carbénicillinases de type plasmidique dans son profil de substrat mais elle a un point iso6lectrique de 5.9, un poids mol6culaire de 22 KDa et porte le nom AER-1 (Hedges et cool., 1985). 11 n'y a pas d'évidence d'une localisation plasmidique dans Aeromonas hydrophila mais le ghne & / ~ A E R - ~ , ainsi que la resistance aux chloramph6nicol, streptomycine et sulfamide, peuvent être mobilis6s par le plasmide lncP vers Eschenchia mli. Cet assemblage de gène s'intbgre a un site chromosomique unique. La multiresistance est similaire à celle retrouvée chez les transposons multir6sistants mais, puisque l'insertion est site spdcifique el dépendant de la fonction recA+, cet assemblage n'est pas un transposon fonction ne1 (Medeiros et coll., 1985).

Le plasmide de résistance Incc de 1 13 Kb codant pour la O-lactamase SAR-1 (33.7 KDa) a été isole d'une souche de Vibrio cholerae (Amyes et Reig, 1986). Elle a un point iso6lectrique de 4.3 tout en étant differente des carbénicillinase CARB-4 et PSE-4 dans son profil d'inhibition. Ce plasmide code pour la résistance à la carbénicilline ainsi qu'à la triméthoprime (dihydrofolate réductase de type 1). L'identification de SAR-1 dans V. cholerae est analogue à la découverte de ROB-1 dans Haemophilus influenzae puisque TEM-1 est la seule enzyme retrouvée chez ces deux espèces auparavant (Aymes et Gould, 1 984; Aymes et Reid, 1 986).

La carbénicillinase PSE-4 a été isolée à partir de Pseudomonas aeruginosa souche Dalgleish (Furth, 1975). Le gene structural code pour un polypeptide de 252 acides aminés ayant un poids moléculaire de 29 KDa (Boissinot et coll., 1990). La similarite dans la structure entre PSE-4 et les B-lactamases de classe A implique une plus grande association que ne laissaient supposer les premières Btudes et résultats biochimiques. L'analyse des sbquences d'ADN adjacentes de PSE-4 revelent un site d'intégration commun aux gènes de résistance aux antibiotiques pouvant s'insérer dans le transposon de la famille Tn21 (Sinclair et Holloway, 1982).

Quant à la carbenicillinase CARB-3' elle a été isolée de Pseudomonas aeruginosa souche Cilote (Labia et coll.. 1981). CARB-3 fait partie d'un transposon de 25 Kb. Tn1408(Levesque et Jacoby, 1988). Le gene structural code pour une protéine mature de 268 acides amines (Lachapelle et coll., 1991 ).

qui confbre la rbsistance au chloramphénicol, à la streptomycine et aux sulfamides. Les Btudes d'homologie et d'analyse l'ordinateur confirment son appartenance à la classe A. CARB-3 a des constantes cinétiques similaires à PSE-1 et PSE-4 mais des diffdrences mineures dans la valeur du point iso6lectrique. Si on tient compte de i'alignement de la figure 1 1 on remarque que CARB-3 se differencie de PSE-4 par deux acides amines qui se trouvent en dehors des boîtes consew6es. Des anticorps contre CARB-3 réagissent aussi avec PSE-1 et PSE-4 (Philippon et cull., 1986; Labia et coll., 1981 ).

Proteus mirabilis GN79 produit aussi une phiciIlinase qui hydrolyse la carbénicilline (Sawai et coll., 1 968). C'est la première carb6nicillinase medide par un chromosome chez des bactbnes ent6riques. Le gbne structural a &te cloné à partir de l'ADN chromosomique. Un manque d'hybridation entre un fragment d'ADN du gène structural et l'ADN total d'isolats naturels de P. mirabilis suggère que la carbenicillinase n'est pas spécifique à l'espèce (Sawai et coll., 19% ). Ce gène structural code pour une protéine de 270 acides amines et il a les caractéristiques biochimiques d'une carbénicillinase. L'enzyme peut être distingu6 des PSE-1, 2, 3 et 4 par son profil de substrat ainsi que sa non r6activit6 à un anticorps dirige contre une carbenicillinase plasmidique (Takahashi et coll., 1983).

Une souche d' Acinobacter calcoaceticus var. anitratus possbde une résistance élevée (851 20 pg/ml) à la ticarcilline mais y devient sensible si l'acide clavulanique y est ajoute. Cette souche produit une B-lactamase constitutive ayant un profil de substrat caractéristique des enzymes hydrolysant la carbénicilline. Cette enzyme, désignée CARB-5 (Phillipon et coll., 1989), a un poids moléculaire de 18KDa et un point isoelectrique de 6.3. Elle est reconnue par un anticorps dirigé contre CARBB mais non par celui dirige contre TEM-1 (Morin et coll., 1987).

Une autre B-lactamase hydrolysant la carbénicilline a ét4 découverte en France dans une souche de Pseudomonas aeruginosa. Elle a un point iso4lectrique 4.3 et a et6 nommee CARB-4. Le gène b l a c ~ ~ ~ - # est détermine par un plasmide transmissible multir6sistant, pUD12, qui appartient au groupe d'incompatibilité IncP2. En plus de la résistance à I'ampicilline, le plasmide pUD12 de 45 Kb code pour la résistance au chloramphenicol, à la gentamycine, a la tobramycine, aux sulfamides, au borate et au tellurite. Ce plasmide pUD12

est conjugatif et tramferable A la souche Pseudomonas aeruginosa PA0303 (Philippon et coll.. 1986). L'enzyme puri f ih hydrolyse efficacement la carb6nicilline mais non la méthicilline, I'oxacilline ou la cloxacilline. Elle a une faible activit6 contre les c6phalosporinesI d6terminant ainsi un profil de substrat typique des B-lactamases, hydrolysant la carb6nicillineI retrouvees chez Pseudomonas aetuginosa. CARB-4 est in hibde par le p-chlorornercuribenzoate, l'acide clavulanique et le sulbactame mais son activit6 n'est pas inhib6e par 100 mM d'ions chlorure, une r6action spdcifique des 0-lactamases de la classe des carb6nicillinases L'absence d'activité hydrolytique contre la cefsulodine contraste avec la resistance observ8e vis-&-vis cet antibiotique. Ceci suggère que CARB-4, comme d'autres O-lactamases plasmidiques ou chromosomiques (Jacoby et Sutton, 1985), donne aussi une r4sistance via un mécanisme non- hydrolytique (Sanders, 1984; Vu et Nikaido, 1985). La s6quence nucléotidique du gène structural b l a c ~ ~ s - 4 a 616 déterminée dans notre travail. L'analyse du cadre de lecture (séquence protéique) par rapport à d'autres 0-lactamases a confirme son appartenance à la classe A. Elle ne diffère de PSE-4 que de quelques acides aminés. Cette haute consenration des acides aminés dans la boîte VI1 nous a permis de faire une extrapolation des résultats anterieurs (Boissinot et Levesque, 1990), où les auteurs ont construit un modèle de PSE-4 en se basant sur les données atomiques et/ou cristallographiques de TEM-1 et PCI. Rappelons que S. aureus PC1 représentait le modèle de la classe A cristallographie à haute résolution le mieux connu à cette date. La Figure 14 présente l'alignement de la séquence primaire de CARB-4 et PSE-4; toutes les boîtes numérotées de I a VI1 sont consenrées.

Tm-4 TM-1 S m 4 sw-1 OHIO-1 LEN-1 c m - 3 P S E 4 CAM-4 RCAP KOm BCESH BCESB BLIP B a 2 AHAD CADSM BADIUS CAKCC ROB-1 PC1 Pm101 L A W FRAD ALBUS SABLA

ABL

PSE-2 OXA-5 0s-2 iCX- 1 OXA-1

SBL

T m - 4 m-1 s w - 4 SHV-1 OHIO-1 EN-1 f A ! - 3 PSE-4 c m - 4 RCAP KOXY 9CESH BCESB BLI P 9CE2 AMAD CADSM WIUS C M C C ROB-1 PC 1 PUB101 LAVEN F m ALBUS SABLA

ABL

PSE-2 on-S ou-2 LCR-1 OXA-1

DBL

E S F .. .RPE LESF ... RPE LTAW.. .RAD LTAW ... RAD LTAW ... RAD L A A W . . ,RAD hD.Y...NGN Wb.Y...NGN

VAY. ,. . R E V.TH.. .NDR 1 .Ti.i...WiD L.SY...RAD

. ATN .K .PRA.MKQ.. D .LT. .L. TTN

KLVF ... ... .... LVHN T.QYS.IAN.. D.QT...L. Y AQF .- .T-PKG-HE1 -.. N.HT-- .P.

+ + + <II> 70

Figure ; 4. Alignement de 31 çéquenceidîacides &Les de 8-lactamases' de classe A et D. La numérotation standard de ABL est utilisbe. Les chiffres romains indiquent que les boîtes sont conserv6es selon Coulson (Coulson et coll., 1991 ). Pour la définition des O-lactamases voir la rbférence citee. (Couture et coll., 1992)

f U I - 4 IW-l SHV-4 SHV- 1 OHIO-1 EN-1 CARB-3 PSE-4 CARB-4 RCAP KOXY BCESH BCESB BLXP BCEZ A ! ! CADSH BADIUS CAKCC 308-1 PC1 PUBlOl L A E N FatD ALBUS SABLA

AaL

TE-4 IEM- 1 SHV-4 SHV- i OHIO-1 E N - 1 CA--3 FSS-5 c m - 4 RC AD KOXY BCES Fi BCESB BLIP BCEZ A! ! CADSM BADIUS CAKCC ROB- 1 PC I PUB101 U V E N FRAD ALBUS SABLA

DBL

QNISCGIDK. . .P. - ANICGGIDK. . .F - . - ADPSTSNGD . - ,Y.. . LEP.PNCE. . .F. . Q0FX;DKERhUGLTE 199

150 200

VI1

..-------H.W. 286

. . - W . 286 . . . . . . .IiUû-R. 286 ,. P.NN .KA. ER.IWf.YtR.DTPASMAERN~IAGIG~IE.,. .... WQ-R. 286 .P.NN.KA.ER.iWX.fLR.DTPAS~RN~fAGIA.....,........Q.R. 279 ,. P.DG .m. a . I W I .m. DTPASMAERNQtfïAGIG ..,....,,-.-.- Q.R. 279 ..S,EH.QA,PI-IVSI.YLA.Q~ASWRNDAIVKIGRSIFD.V.1..YTSQSR. 288 ..S.EH.QA.PI.IVSI.YtA-QfQASHfERNDAIVKIGHSIFD.V..-.YTSQSR. 288 ..S,EA.QS.PI.fVSi.YUL.QlEASIADRNDAIWIGRSIFE.V.~-.YSSQSR. 288 ,.P.EG.GA.PW.IATM.FIS-DTDAEfEVRNEAU(DtCUWA,V,....VRE-. 293 .. P.EN.HA.PL.VLC.YTr.QPWDAKSWEVLAAAAK.IVT ...-.,... EL. 290 .. P.PN.RA.PI.IIAI.LSS.KDEKEAf~NQLIAEATKVXVK,A -..- L,...R, 307 .. P.PN.RS.PI.IIAI.LSS.KDEKEATYDNQLIKEAAEW1D.A .... I....K. 306 . .P .PK.GD . p w ! k t . R D K K D A K Y D D K I . K . 307 ..P.PN.KK.PI.VtSI.~N.HDKEDAEYDDTLIAbATKIVLE.T..,,WIVTNK. 316 ..P.PE.D..PI.VIAV.HST-REQEDAEFDNALVSCATEVVVE.A,..-L.-.Ae- 303 .. R.PD.GR.PL.W.Mvx.GHmDAELDSEL1ARATEWAD.R. -.. L...G. 314 ., P.PD.SA.PI.VXAi.LSH.RCTKbAEPDDELfAEAASWD.S....L...SS. 313 .. P.PG.RA.PI.WSV.WH.GDTQDAEPHDELVmGLWAD.G...,L ..,K.. 303 ,.I.PN.RKtPI.WX.HST.Q~EEAKFNNKLVEDAAKQWH-T,,..t..QLN. 305 . .P .KG .QSEP-.KDNKSDKPND-K. E - - . . F . . . . . . 281 .P.KG.QSEPI.VLVI.FRI.KDNKSDKPNDKLfSETAKSVMK.E....F...,.. 281 ., P.PH.RP.PV,VMW.LTT.HDRPDAVADNPLVAKTARUAS.A.. .. L....C. 305

.A-...M...TD. 306

.T .... L .... G. 314 E - L T 312

EALV .TEAAPEYL .~G.I. . . . I . . AG. 266 EAW-TEATPEYL .EGIf..-.f...ûG. 267 DLMI . VEAGRNWX IEALPPNPAVNSDAAR 275 M ADENAQYR IGAFP......,..TK 260 m. QDLDNSTKLY I~NAITILNTLN.. . .L.. . . . . 276

= +* + + + . . . . . 250

1.8 Nature du probleme

Les B-lactamases sont des enzymes bactériennes ayant pour tâche d'inactiver les p6nicillines et autres antibiotiques contenant le noyau B-lactame. Ces enzymes sont la cause principale de la r6sistance aux pdnicillines et c6phalosporines en medecine clinique ce qui contribue d'une manihre significative aux grands dangers que reprdsentent les maladies infectieuses.

Les O-lactamases peuvent être d'origine chromosomique ou plasmidique. Ces dernieres sont les plus menaçantes vu la capacit6 et la facilite de dissdmi nation qu'elles posshdent, transferant cette rdsistance d'une souche à une autre. L'utilisation massive des antibiotiques a amplifie ce probldme en s6lectionnant des souches rdsistantes. Ceci a engendre une mosaCque de O- lactamases defiant les nouveaux antibiotiques disponibles sur le marche. Les carbénicillines n'échappent pas au problème et on retrouve plus d'une dizaine de carbecillinases dont la sequence est connue. Les premières furent trouvées chez P. aeruginosa et on a longtemps pense qu'elles y &aient sp6cifiques. De nos jours on en a identifié chez A. hydrophila, V. cholerae, P. mirabilis, etc ...

La principale caractéristique des carbénicillinases est une forte hydrolyse de la carbénicil line par rapport A d'autres 8-lactamines (Labia et coll.. 1981). Dans la classification dtAmbler, elles font partie de la classe A (s6rine 70 au site actif) comme la 8-lactamase de S. aureus PC1, qui a 6té la prerniere B- lactamase cristallographiée à servir de modèle pour définir la structure en trois dimensions des B-lactamases de classe A. Suite aux études d'alignement de séquences protéiques comparant plusieurs 8-lactamases. Joris a identifié plusieurs régions ou motifs (boîtes I a VII) qui étaient conservés dans les 6- lactamases de classe A (Joris et coll., 1988; Couture et coll., 1992). La sequence en acides amines des carb6nicillinases soutenue par le modèle cristallographique de la B-lactamase de S. aureus PC1 suggbrent et impliquent certains acides amines dans I'activit6 et la sp6cificit4 carb6cillinase. La boîte VII a été particulièrement décrite dans une étude récente (Boissinot et Levesque, 1990; Juteau et coll., 1992; Hulesky et coll. 1993) où les auteurs ont utilise la carbénicillinase PSE-4 comme enzyme modèle des carb6nicillinases de la classe A.

1.9 But et motifs du présent travail

Le phenornene ou l'impasse qui existe entre l'apparition de nouveaux antibiotiques et la r6sistance qui en d6coule peut d6courager et rendre sceptique beaucoup de scientifiques.

L'industrie pharmaceutique pour sa part a besoin de plus en plus de données sur la stnicture-fonction des enzymes pour synthétiser de meilleurs antibiotiques eVou inhibiteurs. II est tout aussi important de d4velopper des logiciels qui pourraient permettre de pr&dire le comportement d'antibiotiques ou inhibiteurs potentiels, face aux B-lactamases, avant même la synthèse de ces derniers. Ce type de logiciel requibrerait le plus de donnees possible pour s'approcher de la réalit6 tndimentionnelle de l'interaction enzyme-substrat. Notre modeste contribution à ce besoin illimite de donnees a et6 d'essayer de mieux comprendre les ph6nomenes associes à la carbécillinase.

Les données cristallographiques de différentes études ont permis de préciser et localiser certains motifs conserv6s dans la forme tridimensionnelle des B-lactamases notamment de classe A. La carbénicillinase PSE-4 a été clon6e et sequencée dans notre laboratoire. Pour mieux comprendre la base des interactions enzyme-substrat, nous avons profite des résultats obtenus avec PSE-4. Une stratégie de mutation dirigee (sitespécifique) a ét6 établie suite aux observations faite avec PSE-4, où on montre les motifs fortement conserv6s et uniques aux carbénicillinases. Suite à l'obtention de ces résultats nous avons décidé de:

cloner et sequencer deux membres de la famille des carbénicillinases, soient CARB-4 et AER-1, et de le comparer aux autres carbénicillinases;

faire une étude comparative des sdquences nucléotidiques connues avec la famille de carb6nicillinases, incluant CARB-4, pour concentrer nos efforts sur les régions conservées;

analyser par mutation ponctuelle une région spécifique du site actif: la boite VI1 dans notre cas, dont fait partie la triade RSG soupçonnée d'être impliquée dans la spécificité de la carbenicillinase;

4) analyser phhotypiquement les mutants pour mettre en bvidence les acides amines importants dans I'activit6 carb6nicillinase;

5) tenter de faire une corr6lation entre les r6sultats phhotypiques et la ci netique enzymatique (Michaelis-Menten).

CHAPITRE 2

RÉSULTATS

PARTIE 1

2.1 Gene Cloning, Primary Structure of b l a c ~ ~ m and b i a ~ ~ ~ ~ Genes and Evolution of Carbenfcillinases

Nous avons isole le @ne structural de & / ~ C A R B ~ de Pseudomonas aeruginosa partir de Tn 14 13, un transposon mulür6sistant "Tn21-like" qui code pour la rhsistance aux 8-lactamines (bla), à la kanamycin (aadB) et aux sulfarnidés (Su). Un fragment BamHl de 4,3 Kb codant pour la rdsistance & I'ampicilline a BtB clone dans pACYC184 et cartographi6 à l'aide d'endonucleases de restriction. Des experiences de sousclonage ont permis de localiser le gene structural de b l a c ~ ~ ~ - 4 dans une région de 1.2 Kb et de démontrer une homologie de 89% avec b l a c ~ ~ ~ - 3 au niveau des acides aminés. Le polypeptide de 288 acides amin& résultant est une carbenicillinase typique et possède les mêmes motifs consenhs dans PSE-4, CARB-3 et PSE-1. Le gene structural bla codant pour la Wactamase AER-1 dtAeromonas hydrophila a aussi 6te séquence et le polypeptide qui en découle a été compare aux O-lactamases de classe A, BI C et D. L'analyse de sbquences génétiques clonées d'un géne bla non usuel, retrouvé dans un élement mobile site-specifique de l'organisme, et les comparaisons des sequences polypeptidiques déduites avec les autres enzymes ont révélé une enzyme de type carbénicillinase. L'analyse de la séquence des acides aminés a montré une tétrade unique STHK dans le site actif de AER-1 ainsi que d'autres résidus consetvés dans les B-lactamases de classe A. Les études d'homologie montrent une similarité de 58% avec les enzymes de type carbénicillase ("CARB-like"). Les études d'alignement de toutes les carbénicillinases incluant CARB-4 et AER-1, ont permis de localiser des régions critiques pour l'activité enzymatique.

Ma contribution personnelle dans cet article couvre le clonage, le sequençage et la vérification du cadre de lecture ouvert pour la carb6nicillinase CAR B-4.

Gene Cloning, Primary Structure of ~&ARBJ and

~ I ~ A E R - ~ Genes and Evolution of Carbenicillinases.

NOUREDDINE BEJAOUI, FRANÇOIS SANSCHAGRIN

AND ROGER C. LEVESQUE'

Microbiologie Moléculaire et GBnie des Protéines, Faculté de médecine et Pavillon Charles-Eugène Marchand

Université Laval, Ste-Foy, Québec, Canada. G1 K 7P4

Running title: CARB-4 and AER-1 bla genes.

'Corresponding author TBI: (41 8) 656-3070

FAX: (41 8) 656-71 76

' Corresponding author Tel: (418) 656-3070 Fax: (41 8) 656-71 76

ABSTRACT

The b l a c ~ ~ e - ~ structural gene was isolated from Tn 1413, a Tn21-like muliresistance transposon which codes for 8-lactarn (bla), kanamycin (aadB) and sulfonamide (Sul) resistance. A 4.3 Kb BamHl DNA fragment coding for am picillin resistance was cloned into pACYC184 and mapped with restriction endonucleases. Subcloning experiments localized the b l a c ~ ~ ~ ~ structural gene in a 1.2 Kb region. Nucleotide sequencing identified the b l a c ~ ~ ~ ~ as a variant of blac~~~3~arbeni~illin-hydroiyZing9nzyme sharing 89% identity at the amino acid level. The CARB-4 deduced polypeptide of 288 amino acids is a typical carbenicillinase related to PSE-4, CARB-3 and PSE-1. The bla structural gene coding for AER-1 B-lactamase was also sequenced and the deduced AER-1 O- lactamase peptide compared to class A, B, C and D enzymes. Gene cloning, sequence analysis of an unusual bla gene found in a site-specific mobile element fromAeromonas hydrophila and cornparisons of the deduced polypeptide sequence with other enzymes revealed a carbenicillinase-type enzyme. Analysis of amino acid sequences of AER-1 showed an unusual STHK tetrad active site also found in PSEJ. Other conserved residues were typical of class A B-lactamases. Homology studies showed that AER-1 had 57% identity with PSE- 3. Alignment of class A carbenicillin-hydrolyzing-enzymes including CARB-4 and AER-1 identified regions important for carbenicillin hydrolysis. Phylogenetic analysis defined four clades with subgroups having evolved a long time ago.

INTRODUCTION

Since Abraham and Chain identified the production of O-lactamase in bacteria, these enzymes have been shown to play an important role in resistance of microorganisms against i3-lactam antibiotics. The reaction catalyzed causes hydrolysis of the &lactam ring in penicillins and cephalosporins giving a product devoid of antibacterial activity (1 , 23, 31 , 49). In the past few years, a collection of sequences from plasmid-mediated and chromosomal O-lactamase genes that produce enzymes having distinct biochemical properties have becorne available. Most have conserved motifs and are typical of serine active-site enzymes divided into three major classes A, C and D on the basis of amino acid sequence identity between members of each class (2, 10). In 1969, a carbenicillin hydrolysing enzyme was found in Pseudomonas aenrginosa strain Dalgleish. A notion was developed that these enzymes were species-specific, hence the nomenclature PSE (Pseudomonas-specific enzyme) or CAR6 (carbenicillinase) (25, 49).

However, these enzymes were subsequently discovered in other bacterial species and their genes are now known to be part of complex rnultiresistance transposons (1 4, 34, 37, 47). From the four original B-lactamases called PSE-1, PSE-2, ?SE-3 and PSE-4, a plethora of plasmid-mediated enzymes capable of hydrolysing carbenicillin at a high rate but which have unusual biochemical properties have been identified not only in P. aeruginosa but also in other bacterial species (1 0, 14, 25. 26, 29, 38, 39,47, 49). The amino acid sequences of the PSE-1, ?SE-2, PSE-3. PSE-4 and CARB-3 carbenicillinases have been deduced and compared to other class A and class D enzymes, giving rernarkable information on their phylogeny and on the possibility to associate specificities in subtrate profiles with certain amino acid residues (4, 5, 10, 17, 21). We have focused our structure-function studies on carbenicillinases identified from a clinical isolate P. aeruginosa strain p83372, containing the pUD12 plasmid and producing the CARB-4. This enzyme has an acidic isoelectric point (4.3) and hydrolyses very eff icientl y carbenici llin (39).

Unusual O-lactamases such as a zinc enzyme have been reported in Aeromonas hydrophila, a water-borne gram-negative rod known to be highly resistant to B-lactam antibiotics, including carbenicillin (45). An carbenicillin- hydrolyzing O-lactamase has been discovered in a blood isolate of A. hydrophila (14). The AER-1 enzyme resembled plasmid-rnediated carbenicillinases in

substrate profile but differs in isoelectric point (pl of 5.9) and molecular mass (22 KDa); these values are reminescent of B R 0 4 (pl 5-45), PÇE-1 (5.7), CARB-3 (5.75) and CARB-5 (6.35). The gene coding for AER-1 is part of the R n 1 1 unit which is lncP mobilizable but RecA dependent and inserts only between purC and guaB at a specific site into the E. coli chromosome (1 4). The Ri71 1 unit cotransfers resistance to chlorarnphenicol, streptomycin and sulfonarnide. properties analogous to those of Tn7 and from rnultiresistance O-lactamase transposons. In this report, we present the nucleotide sequence of b l a ~ ~ ~ - 1 and b l a c ~ ~ ~ - ~ , compare the deduced AER-1 and CARB-4 polypeptides with other known carbenicillinases and suggest structure-function analogies for these enzymes.

MATERJALS AND MElHODS

Bacterial strains, plasmids and phages. The bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Table 1 . Bacteria were grown on tryptic soy agar (TSA) plates (Difco laboratories, Detroit, MI) containing appropriate antibiotics (ampicillin, 50 pglml; kanamycin, 50 pg/ml; chlorarnphenical, 30 pg/rnl; tetracycline, I O kglml). The cloning vector used initially was pACYC184 (chloramphenicol, CmR; tetracycline, ~etR; origin of replication, P15A) (9, 41). E. coli HBlOl transformants were selected on Cm containing plates and as susceptible to Tet. E. col; strain HBlO1 was the recipient of pMON1028, pMON510, and recombinant plasmid derivatives coding for CARB-4 and AER-1 B-lactamases. Transformants selected were confirmed to produce the prototype enzymes by isoelectric focusing (26). For single-stranded DNA production and sequencing, the blaca~s4, and b k ? ~ ~ - ~ genes were subcloned into the phages M13mp18 and M13rnp19 (32). E. coliJMlOl was used as a recipient and kept on minimal medium without proline (33). Bacteriophages M l 3mpl8 and Ml 3mpl9, the phagemids pBGS18+ and pBGS19+ replicative forms as well as single-stranded DNA was performed following standard procedures (32, 33, 43, 48).

Enzymes and chemicals. Ail chemicals were from the highest grade commercially available. Restriction enzymes were used with the manufacturer's recommendations and were from Pharmacia LKB, Baie d'Urfé, Montréal, Qu&; New England Biolabs, Miçsissaugua, Ont.; and Gibco BRL, Mississaugua, Ontario. Radioisotopes ~ ~ S ~ A T P were from Amersham.

Preparation of DNA and related techniques. Large plasrnid DNA preparations were prepared by the cleared lysate method, with modifications for cell lysis (1 mg of lysozyme per ml, 0.0075M disodiurn EDTA, 1 % sodium dodecyl sulfate, pH 8.0) and purified by cesium chloride, ethidium bromide gradient ultracentrifugation (13, 46). Restriction enzymes digests were done as recommended by the manufacturer, ligation, transformation and selection of recombinant molecules following standard procedures (30).

DNA sequencing. Nucleotide sequencing of sing le-st randed DNA was done by the dideoxy T7 polymerase chain termination method (30, 44) using the Phamacia LKB sequencing kit and (a-3%) dCTP (Amersharn). Sequencing

primers were usually 17-mers selected from the last fifty nucleotides read on autoradiograms and synthesized on a Gene Assembler Plus apparatus (Pharrnacia) and an Beckrnan Oligo1000 DNA synthesizer. The oligonucleotides were purified on short 20% polyacrylarnide-urea sequencing gels (3).

Computer analysis. DNA sequence analysis were done on a VAX cornputer using softwares from the Genetics Computer Group (GCG) of the University of Wisconsin and PIR (1 1, 12). Cornparisons of sequences with the GenBank, European Molecular Biology Laboratory, and National Biomedical Research Foundation databases was done using the GCG software packages adapted to a UNIX-based system using WORDSEARCH, TFASTA and BLAST programs. The sequences reported in this study have been assigned GenBank accession numbers U14748 and U14749.

RESULTS

Physical mapping and subcloning of bla structural gene. We reported the cloning of a 4 kb BamHl DNA fragment containing the b l a c ~ ~ ~ - ~ and a 1.5 kb Sau3Al fragment coding for b l a ~ ~ ~ - ~ isolated respectively from the multiresistance transposon Tn1473 (Apr, Gd, Kmr Sur, Tm3 and from a genomic library of E. coli J53-1 Ri71 1 (see ref. 28). Selected E. col; HBlOt transformants were selected for ampicillin resistance containing recombinant plasmids pMON1025 and pMON510 and confirmed to produce CARB -4 (pl 4.3) and AER-1 (pl 5.9) 0-lactamases by isoelectric focusing (data not shown). From pMONlO25, we constructed the plasmidç pMON1026, pMONlO27 and pMON1028 as depicted in Fig. 1. Phenotypic analysis of E. coli HBl O1 transformants using ampicillin, kanamycin and sulfonamide and correlation with the plasmid physical maps indicated b k c ~ ~ g - 4 within the 480 bp and 680 bp Hindlll fragments. For phenotypic, analysis to confirm the physical maps and produce the CARB-4 enzyme, a 1.6 kb Clal-Pvull fragment from pMON1025 was subcloned into pBGS19 + (Table 1). As shown in Fig. 1, further subcloning and construction of pMON1038 localized b l a c ~ ~ ~ . 4 within a 1.3 kb Nrul - Hindlll fragment; while the subclone pMONIO39 depicted in Fig.2A was used to produce CARB-4 and for nucleotide sequencing. We also constructed a more detailed physical map of pMON510 as shown in Fig. 2C. The b l a ~ ~ ~ - ~ structural gene was centrally mapped by deletions of Aval fragments as depicted on the physical map and associated with ampicillin susceptibility for the recipient E. coli st rai n.

DNA sequence of b l a c ~ ~ 8 - 4 and ~IBAER-I genes. The 650 bp Xbal, the 480 bp Hindlll and the 1 100 bp Bglll-Xhol fragments isolated from pMON1028 and pMON1039 as shown in Fig. 2A were cloned in both orientations into the sequencing phage vectors Ml 3mpl8 and Ml 3rnpl9. For b l a ~ ~ ~ - 1 . a 2 kb Hindlil-San fragment from pMON510 was cloned into Ml 3mp8 and M13mp9. The 2.2 Kb San-Hindll fragment from pMON510 was subloned in both orientations into the phagemids pBGs18+ and pBGS19+ and used also for nucleotide sequencing as given in Table 1. In both cases, complementary DNA strands were completely sequenced in bla coding regions using a primer walking sequencing strategy illustrated in Fig. 28 and in Fig. 2D. The first nucleotide sequence obtained shown in Fig. 3A is 1151 bp long including the b l a ~ ~ ~ ~ - 4

open reading frame (ORF) coding for a putative peptide of 288 amino acids. We noted an STFK tetrad (amino acid positions 65-68) characteristic of B-lactamase active sites, and a SDN triad (amino acid positions 125-127) and a RSG tnad (amino acid positions 229-231 ) characteristic of conserved residues in penicillin- recognizing proteins (PRPs) (1 5, 16, 19, 20). The entire nucleotide sequence obtained for b l a , q ~ ~ - l including the structural gene and flanking sequences is l n 3 bp long and is shown in Fig. 38. Translation in al1 6 frames is identified a single ORF of 304 amino acids long enough to encode AER-1. Analysis of the putative AER-1 polypeptide identified an STHK tetrad active site at amino acid (aa) positions 83 to 86. Other features typical of PRPs and underlined in Fig. 38 include an SDN (aa positions 144 to 146) and the KTG triad (aa positions 248 to 250). The nucleotide sequences shown in Fig. 3A and in Fig. 3B as well as the deduced peptides from ORFs were used to search for homologous sequences in avai lable databases.

Homology with other O-lactamases. The nucleotide sequences of CAR&$ and b l a ~ ~ ~ - l as well as the deduced CARB-4 and AER-1 amino acid sequences were compared with known class A, B, C and D 8-lactamase sequences available in databases. Both CARBJ and AER-1 had consistently higher pair-wise identity values with class A enzymes. Since CARB -4 and AER-1 O-lactamases show sig nificant hydrolysis of carbenicillin, we focused our analysis by comparisons with known class A and class D carbenicillinases (1 0, 17, 21).

As shown in Table 2, CARB-4 had the highest identity value with CAR83 (86.8%) and PSE-4 (86.1%); while AER-1 had significant identity with PSE-3 (57.6%), CARBS (44.9%) and CARB-4 (44.7%). In contrast, ciass D enzymes having carbenicillinase activity such as LCR-1 and shared low identity with CARB-4 (1 9.3%) and AER-1 (20.2%) as indicated in Table 2.

To better assess relatedness between O-lactamases having so-called carbenicil linase activity and moslty defined as Group2c (7), we alig ned CARB-4 and AER-1 with CARBJ, PSE-1, PSE-4, N-29, CARB-4, PSE-3, GN79 and Rcapsul as shown in Fig. 4. The Staphylococcus aureus PC1 penicillinase was used for inspection of conserved motifs because its three-dimensional structure is well defined at less than 2 A, and because we positioned secondary structure units according to the PC1 enzyme secondary stnicture elements as a reference (data not shown). The seven canonical amino acid boxes representing

conserved motifs of PRPs are also weIl conserved in CARB-4 as well as in AER- 1. Blocks of amino acids are well conserved flanking the SXXK tetrad and the WWSKG triad. The alignrnent in Fig. 4 highlights features of carbenicillinases, specifically at the 83-84 junction when compared to the pnmary structure of the PC1 penicillinase. An arginine (position 234) residue is found in typical carbenicillinases in the RSG triad compared to KTG in the G-barre! 07 strand of class A enzymes; while a HTG is consewed in the same position for the R61 DD- peptidase (1 9, 20). We noted important residues which are the conserved proline and leucine (positions 67 and 68) flanking the active sites and unique to al1 carbenicillinases including CARB-4 and AER-1. In contrast, the TEM and the SHV enzymes have a proline and methionine at the same position while 8- lactamases from gram-positive bacteria have alanine and phenylalanine. Finally, we also noted a partially conserved glycine and a common phenylalanine (positions 240 and 241 ) in carbenicillinase sequences.

The phylogenetic relationship between the nine carbenicillinases multiple alignment in Fig. 4 was represented as a dendrogram according to a distance-matnx method. As depicted in Fig. 5, the dendrogram indicated four clades: CARBB, PSE-1, PSE-4, N-29 with CARB-4 subgroup. The AER-1 and PSE-3 enzymes form a distinct clade having long branches. The GN-79 enzyme is a sub-group of this clade; the long branch indicates a common ancestor but very distant in tirne. Finally, The R. capsulata O-lactamase is distantly related and forrns a distinct clade.

Homology of flanking sequences. A systematic search of databases identified at 77 nucleotides from the pACYC184 cloning site a region of 82 nucleotides (nucleotid positions 1 to 82 as in Fig.38) 100% homologous to the upstream region of the dihydropteroate synthase (suAl) gene found in pLS88 and in the broad-hast range plasmid RSFlOlO (37, 44). This observation suggested that the AER-1 bla gene is integrated in a transcriptional region and would have been acquired recently by the 771 1 mobile element.

We sequenced the complet0 b l a c ~ ~ 0 - 4 from P. aeruginosa and b l a ~ ~ u - 1 from A. hydrophila and did an exhaustive homology search with sequences available in databases. Amino acid comparisons demonstrated that CARB-4 and AER-1 are class A B-lactamases of the carbenicillinase subgroup according to phylogenetic classification schemes (2, 10). These enzymes are know to belong to group2c as carbenidIlin-hydrolyzing enzymes (7). Nucleic acid hybndization studies as an approach to develop bla gene probes have shown that b/aps~-r , ~ I ~ c A R B - ~ , b l a c ~ ~ ~ - 4 and blaps~-4 are related and could have evolved from a common progenitor (5). The relationship of CARB-4 to other plasmid-mediated 8-lactamases has been tested previously by determining the neut ralization of benzylpenicillin- hydrolyzing activity with antisera prepared against purified TEM-1, OXA-4 and CARB-3 O-lactamases (39). Antisera prepared with CARB-3 antigen inactivated CARB-4 i3-lactamase as well as the PSE-1, PSE-4 and CARB-3 enzymes (25,39). Even though the b l a c ~ ~ s 3 and b l a ~ ~ ~ & # genes have been identified in two completely distinct transposons of 7 kb (Tn 1413) and 25 kb (Tn 1408) respectively and from bacterial strains of distinct ongins, comparisons of sequence identity is 89% between their structural genes. AS for b / a c ~ ~ ~ - j and bkps~-d, the ~ ~ C A R B - ~ has a ~ O W G + C Content of 38.5 % when cornpared to typical P. aenrginosa genes having a G + C content of 67 %

(4, 26).

Anaiysis of the 1 71 3 bp DNA sequence from the A. hydrophila R7711 mobile element gave a G + C content of 54.8 %; the 914 bp b l a , q ~ ~ - ~ structural gene had a G + C content of 55%. The deduced AER-1 B-lactamase was found to be a polypeptide product of 26,647 daltons cornpared to 22,000, as previously reported by biochemical methods (14). As given in Table 2 and shown in Fig. 4 and in Fig. 5, AER-1 can be considered a carbenicillinase which is in agreement with the biochemical data, including an isoelectric value of 5.9 for this enzyme

(1 4)-

Analysis of primary of secondary structure elements of the CARB-4 and AER-1 deduced polypeptides and alignment of sequences revealed blocks (box I to VI1 in PRPs) of amino acids typically conserved in class A B-lactamases (1 , 1 0, 1 9, 20). In addition, we identified amino acid residues u niquely conserved

in carbenicillinase sequences that could promote carbenicillin hydrolysis. The first set of sequence was the GD (WE) RFPL (positions 61 to 68) flanking the SXXK active-site tetrad. The second region of interest is the omega loop delimited in carbenicillinases by two proline residues (positions 167 to 183). Inspection of the three-dimensional rnodel of 8-lactamases constructed from the TEM, the Bacillus licheniformis and the S. aureus PC1 enzyme atomic coordinates indicated that modification in this region would change the accessibility of the active site cavity and influence substrate docking because the omega loop forms the floor of the active site (4, 15, 16, 35). A final region of interest and significance are consewed residues typical of carbenicillinases found in the B3-B4 secondary structures. Amino acid changes at these positions for SHV-type and TEM-type enzymes leads to hydrolysis of broad-spectrum cephalosporins such as cefotaxime and ceftazidime. The flexibility of the structure found in class A enzymes between residues 234 to 244 should permit the hydrolysis of bulky substrates. It has been suggested by computer assisted rnodeling of PSE-4 that the three-dimensional structures of the active site of carbenicillinases such as PSE-4, CARB-3 and presumably CARB-4 and related enzymes would present distinct features from the TEM enzyme in the active site region (4, F. Sanschagrin and R.C. Levesque, unpublished observations). Site- directed mutagenesis in TEM-1 has been attempted to correlate carbenicillin hydrolysis with the L234 change to R and the PSE-3 and AER-1 enzymes that have an R or L at position 165. The mutation K234R and E240G in TEM-1 noticeably increased the hydrolysis of carboxypenicillins relative to other penicillins by approximately sixfold and twofold, respectively (27). These carbenicillinases also consenred L68, T l 04 and G240. Attempts to correlate carbenicillin hydrolysis with changes at these positions in the TEM-1 structure were not succesfu1. These structure-function observations of carbenicillin specific amino acid residues in TEM-1 are still circurnstantial and extrapolations made should be interpreted with caution. O-lactamases can tolerate many amino acid replacements and activity againts B-lactams is still maintained. Further studies to define hydrolysis of carboxypenicillins will need to be done by site- specific as well as cassette-replacement mutagenesis directly in a prototype carbenicillin-hydrolyzing enzyme such as in PSE-4 (24). Site-specific mutagenesis at positions 67 and 68 in PSE-4 indicated a structure-activity relationship for hydrolysis of penicillins, particularly carbenicillin (F. Sanschagrin and R.C. Levesque, manuscnpt in preparation).

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by the Canadian Centers of Excellence via the Canadian Bacterial Diseases Network. R.C.1. is a Research scholar of exceptional ment of the Fonds de la Recherche en Sant6 du Quebec. Work in R.C.L.'s laboratory is also funded by the Medical research Council of Canada and by the Canadian Cystic Fi brosis Foundation.

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Table 1. Bacterial strains and plasmids used

Strains and Plasmids Relevant Characteristicsa Reference

Eschenchia coli HB10 1 F- a m 14 ga/ K2 hsds (20) 6 IacYl leu Mti- l pmA2 recA 13 rpsL20 SupE44 thi xyl-5

E. coli JM101 SupE thi A(lac-proAB) P (traD36 proAB la& ZAM15)

E. coli J53-2 F-met pro Ri f

Aeromonas hydrophila VL7711 isolated from a human blood sample, lndia 14

Apr Cmr Sm? Sur T d

El coli J3-2 Q7711

Plasmids

pACYCl84

pMK2O .

pBGS19+

pMON 1 025

F' met pro Ri f R7711 Apr Cmr Smr Sur Tcr 14

Cmr Tcr pl 5A derivative 9, 41

Apr C d Sur; a 4.3 kb BamHl 28 fragment from pMK20: Tn 1413

Cmr Kmr; deletion of a 1.8 kb Bgl II fragment. This work

Cmr Kmr; deletion of 3 HindiIl fragments covenng 3 kb.

Apr Cmr Krnr; deletion of a 1.8 kb Hindlll fragment.

Apr Cmr; deletion of a 1.8 kb San-Xhol fragment.

Apr Cmr; deletion of a 0.7 kb Nrul fragment.

Apr Kmr; a 1.2 kb Hindlll -Xhol fragment

Apr Kmr; a 1.6 kb Clal-Pvull fragment from pMONl025.

J53-2 R7711, 1.5 kb Sau3Al chromosonal DNA fragment.

Ap'; a 2.2 kb SaA-Hindlll from pMON510 in pBGS18+

Apr; a 2.2 kb Hindlll-Sa4 from pMON510 in pBGS19+

71

This work

This worù

This work

This work

This work

28

This work

This work

a, Except for pMON1039 and pMON1040, pMON511 and pMON512 where p BG S 1 8+ and pBGS19+ was the cloning vector, al1 other plasmid CO nstructions we re pACYC184 de rivatives.

Table 2 . Identities between class A and c lass D 8-lactamases having

carbenicillinase a c t i v i t i e s .

PC1 36,33 36.69 34.53 31.18 30.47

LCR- 1 18.11 1 8 J 1 19.29 14.12 20.24 12.00

PSE-2 13.85 13,85 12.31 10.34 19.76 14.40 33.07

PSE-1 99.65 99.65 86.51 43.51 45.04 34.05 18.54 22.76

N-2 9 97.92 97.92 86.16 43.86 45.39 35.74 18.50 22.18 98.27

GN-7 9 45.61 45.68 44.64 48.80 46.21 34.29 21.63 19.52 45.33 45.33

R, capsul. 37.59 38.08 38.79 39.93 39.38 25.90 20.16 18.33 37.72 37.72 39.93

a Percent identities are indicated as the number of ident i t ies per 100 aligned residues calculated using a multiple alignment method.

FIGURE LEGENDS

Fig. 1. Molecular cloning of the ~ ~ C A R B - ~ gene. Plasmid pMON1025 was constructed by cloning a 4.2 Kb BamHl fragment from pMK20::Tn 1413 into the BAMHI site of pACYC184 (28). Subsequent deletions of restriction fragments gave the final pMON1038 construct. Cloned DNA fragments are represented by open-boxed lines. Abbreviations used: B, BamHI; Bg, Bglll, Cl Clal; E, EcoRI; H, HindiIl; N, Nrul; P, Pstl; S., San, X, Xho; Apr: ampicillin resistance; Cmr: chloramphenicol; Kmr: kanamycin.

Fig. 2. Physical maps of recombinant plasmids pMON1039 (A) and pMON510 (C). Only the DNA inserts are depicted as open-boxed lines including restriction sites used for subcloning into M l 3mpl8 and M l 3mpl9 sequencing vectors. The sequencing strategies used for blac~~8-4 (B) and & ~ A E R - I (D) are indicated below each map. The wavy lines represent the location of bla structural genes. The extent and direction of each sequencing reaction is indicated by arrows using sequencing primers synthesized as 17-mers from the last nucleotides read.

Fig. 3. Nucleotide sequences of b h c ~ f l s - ~ (A) and b l a ~ ~ ~ . t (B ) genes. The deduced amino acid sequence is indicated by the one-letter code beginning under the first nucleotide of each codon. The consewed amino acids found in PRPs are underlined (1 6, 17). The stop codon in each sequence is indicated by an asterisk.

Fig. 4. Alignment of the CARB-4 and AER-1 amino acid sequences with the sequences of class A enzymes having carbenicillin-hydrolyzing activity. The alignment was done by using the protein sequence multiple alignment program. Abbreviations: PSE-1, O-lactamase (BLA) of P. aeruginosa RPL11 (1 8 ) ; PSE-4, BLA of P. aervginosa Dalgleish (4); CARB-3, BLA of P. aeruginosa Cilote p l 1 5 (26); CARB-4, BLA of P. aeruginosa P83372 (39); PSE-3, BLA of P. aeivginosa ps142 (8); N-29, BLA of Proteus minbalis N-29 (42) ; BLA of P. miribalis GN-79 (50); AER-1, BLA of A. hydrophila VL7711 R7711 (1 4); Rcapsul, BLA of Rhodopseudomonas capsulata (8). Conserved residues in al1 carbenicillinases are indicated by astensks. The numerotation follows the standard Ambler nomenclature (indicated as ABL) when gaps are considered and when boxes I (STFK) and VLL (KTG) are aligned (2, 10).

Fig. 5. Dendrograrn showing relationships among carbenicillinases clustered on the basis of amino acid sequence identities and using the alignment depicted in Fig. 4. The dendrogram was obtained using the GCG package softwares (1 2).

Fig .

Fig. 3

. . . * . * ACAGGCTCGCATGCNCCTCACTCGGGGCGGTTGAGGTCTTGCGTGCCGCTTTCAGGTCGCGATATGCGGCCTAACAATTCGTCCAAGCCGACGC

* * * * . *

AGCTTTTACTGGTATTTTCGCTTTTAATACCGTCTATGGTGTTTGCAAATAGTTCAAAGTTTCAACAGGTTGAACAAGATGCTAAGGTAATTGAAGCATC L L L V F S L L I P S M V F A N S S K F Q Q V E Q D A K V f E A S . * * 0 *

TCTTTCTGCGCATATAGGGATTTCTCTTCTTCTTGATACTCAAACTGGAGAGTATTGGGATTACAATGGCAATCAGCGTTTTCCTTTGACAAGTACTTTTAAA L S A H I G I S V L D T Q T G E Y W D Y N G N Q R F P L T S T F K

. . . . * * . * * ACAATAGCTTGTGCTAAATTATTATATGATGCTGnCCAAGGGGAAATAAACCCTAAGAGTACAATTGAGATCAAAAAAGCAG4TCTTGTGACCTATTCTC T I A C A K L L Y D A E Q G E I N P K S T I E I K K A D L V T Y S P . e . I s * # a a

CCGTAATAGAAAAGCAAGTAGGACAAGCAATAACGCTCGATGATGCGTGTTTTGCAACTATGACGACAAGTGATAATGCAGCAGCAAATATCATCCTAAA V I E K Q V G Q A I T L D D A C F A T M T T D A A A N I X L N

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Fig. 5

RÉSULTATS

PARTIE 2

3.1 Structure Function Analysis of the 03-04 Strand Junction of Class A blactamase in the Hydrolysis of Third Generation Cephalosporins

Le deuxième article a 816 la suite logique de notre plan de travail. Une fois que la séquence nucl6otidique de la carbénicillinase a et6 vérifiée, ainsi que son appartenace la famille des carb6nicillinases, la voie etait ouverte à la rnutag6n6se site-spécifique. Les 6tudes d'alignement dans le premier article mettent en dvidence les acides amines que nous avons choisis pour la mutagénése.

Le troisième chapitre comporte l'article decrivant les résultats obtenus avec quelques mutants. La premibre serie de r6sultats décrit les rdsultats phénotypiques pour six mutants. Ces derniers ont et6 test& contre des antibiotiques appartenant aussi bien à la famille des pénames que des céphames. L'étape intermédiaire dans cet article concerne des donn6es sur la cinétique des mutants (Michaelis-Menten) soit le Vmax et le Km. Finalement, des études de compétition et d'inhibition sont présentées pour les mutants difficilement analysables.

Nous avons remodelé, à l'aide de mutagenese dirigée, la jonction formée des brins 03 et 04 du feuillet R située en dessous de la cavité du site actif de la B-lactamase CARB-4. Les études d'alignement nous ont guidé dans la construction et le choix des différents mutants. Nous avons été conservateur dans notre approche en ne remplaçant qu'un acide aminé pour un autre reconnu pour les 8-lactamases de la classe A. Notre analyse démontre bien la puissance et la versatilité que possède la carbenicillinase CARB -4 à changer et acquérir de nouvelles spécificités par de simples mutations ponctuelles. Peu de changements sont necessaires à partir de la carbhicillinase CARBJ pour gagner la résistance à la cefotaxime et à la ceftazidime. En même temps, on observe une chute dans la résistance la carbhicilline sans jamais atteindre une abolition complète de Itactivit6 carbénicillinase. Un des mutants a et6 dot6 de la résistance a la cloxacilline et au cephalotin mais la perd des qu'on ajoute une autre mutation en amont. En conclusion, nos résultats démontrent une coopération et un équilibre au niveau du site actif suite aux observations suivantes: 1) le manque de corrélation entre l'activité in vitro (spectrophotometre) et in vivo (CMI) est intriguant bien qu'il semble que ce cas

ne soit pas unique (Sanders, 1987); 2) le mutant qui a acquis la rbsistance à la c6fotaxime et à la ceftazidime semble avoir un intermediaire acylsnzyme assez stable pour permettre une 6tude cristallographique; 3) I'aspect mucoîde qu'on observe chez certains mutants semble être l'expression ph6notypique de la s6quence de ces mutants plutôt qu'un artefact de laboratoire.

STRUCTURE FUNCTION ANALYSE OF THE 03-04 STRAND JUNCTION OF CLASS A O-LACTAMASE

IN THE HYDROLYSIS OF THlRD GENERATION CEPHALOSPORiNS

Running title: C3-04 STRUCTURE FUNCTION ANALYSIS

N. Bejaoui, and R.C. Levesque'

Laboratoire de Microbiologie moléculaire et génie des protéines, Département de Microbiologie, Faculte de Médecine, Université Laval, Ste-Foy, Québec, Canada,

G1 K 7P4

Corresponding author TBI.: (41 8) 656-3070 FAX: (418)656-7176

O

Corresponding author Tblephone: (41 8) 656-3070 Fax: (41 8) 656-71 76

SUMMARY

We have remodeled the 03-04 junction of the carbenicillinase gene CARB-4. This ngion has been described as a major part of the active site of O-lactamases. Alignment studies set the stage for the construction of differents mutants by identifying amino acids t hat could be involved in the carbenicillinase activity. Direct replacement of these amino acids, by others found at the same position in other class A B-lactamase, was undertaken with the ultimate goal of abolis hing the carbenicillinase activity. Our investigation reveals an u nsuspected flexibility and adaptability of the enzyme that broaden its spectrum of activity. Only a few amino acid changes, namely 1034 and S238, are needed to display activity to ceftazidime and cefotaxime whether separately or toward both at the same time. Finally, we achieved a drastic reduction in carbenicillinase activity yet were unable to abolish it completely. Three substitutions are needed simultaneously to almost abolish the carbenicillinase activity (1 00-fold decrease in MIC compared to the wild type). Other mutants with different combinations were not as efficient as the three substitutions that provided the 100-fold reduction in MIC. One mutant exhibited a new activity toward cloxacillin and cephalothi n yet decreased its activity against piperacillin (R234K). Our results demonstrate a cooperativity and a balance that should be accounted for in future mutagenesis studies.

INTRODUCTION

The production of C-ladamases that cleave the amino bond is the most common mechanism of bacterial resistance (Bush and Sykes, 1984; Medeiros, 1984). The abundance of the enzymes among pathogenic bacteria has considerably reduced the usefulness of O-lactam antibiotic therapy. In addition, these enzymes have also been studied as models for understanding protein structure and function (Joris et d, 1988), as well as genetic markers in molecular biology, mainly due to the wealth of DNA sequences available. Rational study of the influence of amino acid sequence on the three dimensional structure and function of a protein would benefit greatly from the ability to change specific amino acids (Dalbadie-McFarland et al., 1 982, 1 986). Various roles have been assigned to some of the consenred residues within the active site of O- lactamases (Lerner et al., 1994; Sawai et al., 1994; Palzkill et al., 1994; Labia et al.. 1994). Thus, despite the evolutionary conservation of one amino acid within the active site (Joris et al., 1991 ., Couture et al., 1992). there could be a high degree of tolerance for substitution (Barany, 1985; Dube and Loeb., 1989; G huysen, 1 990; Barany and Zabala, 1 991 ; Palzkill et al., 1 992).

We have already shown for the carbenicillinase PSE-4 (Boissinot et al., 1990) that the RSG triad in BOX VI1 may be important in substrate specificity and hydrolysis of carbenicillin. In order to probe and understand the structure function relationship of a carbenicillinase, we undertook different point mutations in a defined region of CARB-4: the 83-84 junction which spans the RSG triad and few amino acids beyond. Another important residue, glycine 238 has previously been shown to enable cephalosporinase to hydrolyse cefotaxime and ceftazidime upon single replacement by serine 238 (Barth61emy et al., 1988; Sougakoff et al., 1988,1989; Syvanern et al., 1991 ; Huletsky et al., 1993). We were interested in finding out the importance of this residue in the carbenicillinase CAM-4 toward third generation cephalosporins, and whether we would be able to extend the activity spectrum by replacing it, and constructing double and multiple mutants. Upstream of R234 are three residues (F240, G241, S244) that could only be found in the carbenicillinase family. Thus it was important to find out if these residues are relevant to the carbenicillinase activity. In the present studie, we will determine the phenotypic significance of these changes by MIC determination and Michaelis-Menten constants (Km and Vmax).

MATERIALS AND METHODS

Strains. E. coli MVllgO (A(lac-proAB), thi, supE, A(sr1-vecA), 306::Tnl O[Fx2raA36, AproAB, laclqZAM151) was used to prepare DNA (plasmid mini preparation) in order to transfomi E. coli SN03 (ampA1, AarnpC8, recA. pyrB, thi) so as to eliminate O-lactamase background from the host cell (Nonark et aL.1977 ). Bacteria were grown on tryptic soy agar (TSA) plates (Difco laboratones, Detroit, MI) containing appropriate antibiotics (ampicillin 50 pg/pl; kanarnycin 50pg/pl). E. coli CJ236[ung, dut, thi, relA; pCJ105 cmz)] (Joyce. 1 9û4) was used as a host to produce single stranded uracil containing template.

DNA sequencing. The nucleotide sequences were determined by the dideoxynucleotide polymerase chain termination method (Sanger et a/., 1977) using specific oligonucleotides (Atkinson and Smith, 1984) and ~ 3 5 triphosphate as radioactive label. Oligonucleotides were synthesized using a Gene Assembler Plus apparatus (Pharmacia LKB) and purified by electrophoresis on 20% po lyacry lamide u rea.

Cloning and Site directed Mutagenesis. Our wild type CARB-4 was cloned in Ml 3mpl9 and transformed in CJ 236 strain. Uracil containing template was produced and mutagenesis was performed according to the Kunkel method (Kunkel et al., 1987) with the muta-gene Kit (BIORAD Laboratories, Mississauga, Ont).

Antibiotics. Ampicillin, benzylpenicillin, cephaloridine, cephalothin, carbenicillin, piperacillin, ticarcillin, oxacillin, cloxacillin, cefotaxime, were purchased from Sigma. Ceftaridirne was obtained from Glaxo Canada Inc., and kanamycin was from Sigma. Nitrocefin was purchased from Oxoid (Nepean).

Enzyme production and purification. Cnide B-lactamase extracts were prepared by ultrasonication as previously described (Dufresne et al., 1988) but the buffer was adjusted to 10mM phosphate pH 7.0. This crude extract was passed through a Sephadex G75 column (40 x 2.5cm). Fractions were collected and aliquots tested with nitrocefin. Positive fractions were pooled (usually 3-4 fractions of 2 ml each) and frozen at -20%. No loss of activity occurred after thawing of an aliquot. Enzyme kept up to six hours at room temperature (250C) showed no loss of activity as judged by the hydrolysis of nitrocefin. The strain

used for the production was always SN03 for al1 the constracts (see Table 1 for mutants and wildtype plasmid description).

MIC determination. E. coli SN03 transformants producing mutant O-lactamase and the wild type were tested for antibiotic susceptibility against cephalosporin and penicillin. Prelirninary screening was done using antibiograms on TSA plates (Difco, Detroit, MI), according to the Kirby-Bauer disc diffusion rnethod (Bauer et al., 1966). Minimum inhibitory concentration (MIC) of vaflous penicillins and cephalosponns were determined on TSA agar (Difco, detroit, MI) at the indicated concentrations (see Resuhs). The multiple inoculator (Craft Machine, Chester, Pa) was used and growth was rnonitored after 24h at 37%.

Kinetic studies. Activity toward vanous substrates was determined spectrophotometically on partially pun'fied B-lactamase extract with a CARY21 9 spectrophotometer (Varian, Boston, MA) using a 1 cm path-length cell. Hydrolysis was monitored at 250C in a lOmM phosphate buffer pH 7.0. Changes in absorbency were recorded at 495 nm for nitrocefin, 232 nm for ampicillin and carbenicillin, 240 nm for benzylpenicillin, 260 nm for cephalothin (Bush et all, 1984). Values for Km and Vmax were obtained by initial velocity measurement (three determinations) for five to six concentrations and determined by a Lineweaver-Burk plot. Vmax was expressed as prnole of hydrolyzed substrate per min per mg of protein. For inhibition studies, the enzyme preparation was mixed with different in hibitors (antibiotics) at various concentrations. Enough nitrocefin was present to set the Vmax condition for each mutant. The concentration of antibiotic which gave 50% inhibition of the Vmax is the referred to as 150.

RESULTS

The single mutation R234K (pMON1029) has no effect on the carbenicillinase and penicillinase activity of CARB-4. While the MIC has not changed except for a significant decrease for piperacillin and ticarcillin (see Table II), the hydrolysis as judged by the decrease in absorbance was impossible to record. This mutant gained resistance to cephalothin, and was the only mutant to

display hydrolysis in vitro (spectrophotometry) against this antibiotic. Any argument that the failure of hydrolysis of penicillin is due ta pH, temperature or buffer composition would be difficuit to reconcile with the fact that an appropriate hydrolysis of cephalothin occured under the same conditions. This mutant also gained cloxacillin resistance cornpared to the wild type. This mutation seemed to accommodate larger molecules (cephalothin and cloxacillin) without loss of affinity or recognition of the penam. The relative efficiency of nitrocefin hydrolysis, namely the Vmax/Km, is less than a quarter of the wild type showing a disturbed mechanism.

The substitution G238S (pMON1030) has been shown to change substrate specificity of cephalosporinase TEM-2 and SHV-2 (Barthélemy et al., 1988; Sougakoff et al., 1988; Huletsky et al., 1993). On the other hand, CARB- 4 has a glycine at this position and a single change to serine would be intriguing to assess. However, the activity of this mutant against the antibiotics tested in this study was not abolished. In fact, this mutant (pMON1030) has the same hydrolysis inefficiency than pMON1029. Although nitrocefin is hydrolysed, the Vmax is almost the same as for the other mutant (pMON1029), but still twenty times less than the wild type. Actually, the efficiency of the mutant (Vmax/Km) is eighteen tirnes less than the wild type. Inhibition studies showed that this mutant can use a wide range of antibiotics to inhibit and compete for the hydrolysis of nitrocefin. The guanidine group of R234 may contribute to this behavior since this is the only mutant still having an R234 while al1 the others have K234.

The double mutation R234K + G238S (pMON1032) is a combination of the single mutants pMON1029 + pMON1030. The new mutant, pMON1032, does not combine the phenotypic properties of these distinct single mutant. It is the only mutant which has a significant decrease in MIC for benzylpenicillin and especially ampicillin. The slightly increased resistance to ceftazidime does

confimi the importance of the cornbination K234 and S238 (as seen in TEM-2 and SHV-2). The presence of these two amino acids is critical for the hydrolysis of third generation cephalosporins. The R234K change maintains the same positive charge but lysine, due to its relative smaller sire, may be more "flexible" than arginine and could fa in smaller pockets. Also the lysine positive charge, at the amino terminal end, is not exactly at the same position than the positive charge of the arginine guanidium group used to be. S234 does provide a hydrogen (theoretically replacing the -H of glycine), but not at the same position in the active site. This cornbination regains activity against ticarcillin that was lost by the single mutant pMON1029 (see Table II). In this case, it seems that a cooperation was imposed by the new environment and one amino acid compensates for the loss of another amino acid. The hydrolysis of nitrocefin for this mutant is very slow which allows for the possibility of a long lived acyl- enzyme complex (Ghuysen, 1991). lndeed the enzyme production was induced by antibiotics. The probability exist that each enzyme is still in the acyl-enzyme complex but slowly completing its cycle, and once free starts nitrocefin hydrolysis. This may be why there is a steady increase in hydrolysis without any sudden burst thus, no initial velocity could be recorded (Table IV, see pMON 1032 lack of result).

The quadruple mutant R234K; G238S; F240E; G241 R @MON1 041) is more effective than the double mutant toward penicillin, yet the Vmax for nitrocefin hydrolysis is eight fold lower than the double mutant. This is the only combination that exhibits resistance to cefotaxime. The substitution involve E240, a small and polar amino acid, and R241 which is large yet still polar. Accessibility and the ease with which these amino acid could be rnanipulated or manuvered inside the active site pocket could be critical. Access to the oxime group of cefotaxime was accomplished without interferring with the recognition and hydrolysis of ceftazidime. Finaly there is a mucoid phenotype that was apparent with this mutant. Philippon (Phillipon et a/., 1992) had descnbed a mucoid phenotype in Klebsiella pneumoniae that was in close association with the cephalosporinase activity. It is notewoRhy that this phenornenon is seen in the mutant that acquired a cephalosporinase activity (pMON1041); it seems that at least two mutations could induce this situation, wich is probably related to a signaling mechanism.

The final combination R234K; 0238s; F U 0 E; G241 R, S244G (pMON1042) display a general decrease in the MIC against al1 the antibiotics tested in this study. The single substitution S244G abolishes the ceftazidimase and cefotaximase activity that was gained with the quadruple mutant @MON1 041). This mutant is identical in these positions to SHV-2 and TEM-2 yet the affinity for nitrocefin is the highest while the Vmax is half of the quadruple

mutant. This combination has lost the mucoid phenotype, that was the allmark of pMON1041, simply by a SM40 change.

Kinetics. The kinetics data obtained with this series of mutants is illustrated in Table IV. Nitrocefin, a chromogenic substrate for O-lactamase, was hydrolysed by al1 the mutants except the double mutant pMON1032. Indeed, incubation of this mutant with nitrocefin took between 15 and 20 minutes to initially see a small variation in the optical density. This lag time is extensive compared to the milliseconds that is normal for other mutants to initiate hydrolysis. Surprisingly, this was the mutant that showed activity against ceftazidime. Another unexpected result was the apparent failure of hydrolysis of ampicillin, carbenicillin and benzylpenicillin as judged by spectrophotometry. This does not correlate with the two single mutants phenotype, since they have the same MIC as the wild type toward theses antibiotics. The activity observed with the single mutant (pMON1029) toward cephalotin at the MIC level was confirmed by spectrophotometry as it was elementary to follow the decrease in optical density. This was in complete opposition with the other antibiotics where it was impossible to demonstrate this kind of activity. Alteration in the experimental conditions (buffer, pH, temperature) did not result in any improvement.

This lack of hydrolysis with some of the antibiotics tested was of some concern in light of the MIC obtained, but the investigation proceed in order to determine if this deficient activity was due to a lack of recognition in vitro in contrast to the results in vivo (MIC). Studies based on the cornpetition between vanous antibiotics and nitrocefin, where the latter acts as reporter substrate, were undertaken for each mutant, to determine the concentration of antibiotic in hibiting 50% (150) of the initial velocity of hydrolysis (see Table IV).

lnhibitory profile. Larger antibiotics Iike ticarcillin, piperacillin, oxacillin and cloxacillin need only small concentrations to compete with nitrocefin

for the active site of the single mutant pMON1029, compared to the larger concentration required by the other single mutant pMON1030. The double mutant pMONlO32 was not tested since it does not hydrolyse nitrocefin at all. In the case of the quadruple mutant pMON1041, lower concentrations of carbenicillin are sufficient for competing with nitrocefin unlike the single mutant pMON1029 and pMON1030 that require relatively higher concentrations. With the antibiotic ampicillin, a higher concentration seem to satisfy the condition for cornpetition with al1 the mutants compared to the wild type. On the other hand, the reverse occured for ticarcillin with the wild type compared to the mutants (se8 Table V). Finally cefotaxime and ceftazidime were unable to compete with nitrocefin even with large concentrations (up to 300 PM) even when applied to pMON1032, the only mutants that showed activity against these two antibiotics at the MIC level.

The result of the present studies indicates that R234 is not cntical in the carbenicillinase activity. This residue may be part of a combination that is able of displaying the carbenicillinase activity even when the R234 is not present. The conservation of this residue in the carbenicillinase seems to underline the importance of a positive charge rather than the presence of R234 itself (Ellerby et al., 1990; Brannigan et al., 1991 ; Labia et a1.J 991). Ali of our mutants have a K234 and retain activity against carbenicillin albeit at different levels. A stn'king reçut with our single mutant (pMON1 029) was the new activity displayed against cephalothin (see Table III). This new phenotype was not at the expense of carbenicillin, ampicillin or penicillin G yet the activity against ticarcillin was severely diminished (10 fold decrease, see Table II). The activity against ticarcillin was partially restored later with combinations that included bot h KZ34 and S238 (pMON1032), although the full activity was only recaptured when we change one more amino acid (pMON1041 see Table II). It is noteworthy to highlight the perfect correlation, in the case of cephalotin and pMONlO29, between the activity in vivo (as judged by MIC values) and Ni vitro (as judged by spectrophotometry studies). This was the only case where we could correlate such data. This K234 was the minimum change that wild type carbenicillinase requires to extend the spectnim of activity toward cephalosporins. Indeed, the mutant that displayed activity against ceftazidime and cefotaxime possess the two amino acid that caracterise the cephalosponnase TEM-2 and SHV-2, namely K234 and S238. S238 on its own without contribution from any other mutations in the CARB-4, cannot provide the carbenicillinase with activity against the cephalosporins of third generation as in the case of our mutant pMON1030 (see Table III), thus reassessing the need for a combination where the mutant should carry K234 and S238 at the sarne time. The mutant pMON1032 gave only ceftazidirne activity, while other changes at position E240 and R241 should be present in order to expand the activity to cefotaxime @MON1 041 see Table III). This result in a lower activity against ceftazidime by 30% when compared to the MIC of mutant pMON1032. These two cephalosporins are two of the most used third generation antibiotics and our resuts suggest that resistance could develop if sufficient time is allowed for the B-lactamases (i.e. carbebicillinases) to adapt to these molecule within few generations.

Our inhibition profile is not an indication of affinity, but was rather a measure of com petition benNeen an antibiotic whose degradation was impossible to record and a chromogenic substrat that is simpler to record. Indeed, we cannot distinguish between two situations: 1) when the mutant need a stronger antibiotic concentration because of very rapid hydrolysis, thus occupying the active site of the mutant and making the mutant not available to hydrolyse the reporter substrate (nitrocefin); 2) when a hig h concentration of antibiotic en hance the probability of encounter between the enzyme and the antibiotic hence prohibiting the hydrolysis of nitrocefin. The first observation concerns the antibiotic concentration that mutant pMON1030 requires when compared to the second single mutant pMON1029 (see Table V). Indeed, pMON1030 needed more antibiotic to compete with the hydrolysis of nitrocefin than pMON1029 although they both have the same Vmax but a different affinity constant Km (see TablelV). S238 may have also disturbed the affinity constant for the antibiotcs tested (especially ampicillin, carbenicillin and penicillin G) but that is not in accordance with the MIC value (see Table II) where these two mutants have the same value. Another striking result was the slower hydrolysis of nitrocefin with mutant pMON1032 (see table IV), allowing the possibility of a long lived acyl- enzyme. This mutant may be a perfect candidate for a cornputer analysis of the trapped acyl-enzyme cornplex, using nitrocefin or any antibiotic that will form such a complexe moleculai mode lization and/or cnstallog raphy.

The lack of hydrolysis experienced with the spectrophotometry aspect of the study is intriging since there seerns to be hydrolysis or destruction of the antibiotics in vivo (see MIC Table II and III). One possible explanation is that hydrolysis is still occurring but without the scission of the amide bond. This could be verified with radioactive antibiotics or mass spectrometry. The mutant that require further study is pMON1029 since it can no longer hydrolyse the penams as with the wild type but has acquire an activity against cephalothin. The other possibility could be the absence, in vitro, of a chaperon molecule (protein or cofactor) after the purification of the enzyme that is present in vivo. However this is not a likely phenomena since 8-lactamases are known to be fully functional.

As a final observation with regard to some of our mutants, we noticed a mucoid phenotype with two mutant, namely pMON1032 and pMON1041. These are the same mutants that showed resistance to ceftazidime and

cefotaxime. This charactenstic disappear when we add another mutation at 6244 (pMON1042. see Table 1). The phenotype seems to be in close association with the activity against third generation cephalosponns. Two or three amino acids seerns to induce this phenotype and we suggest that a signaling mechanism is probably triggered that allows the bacteria to secrete a factor or change the composition of the cell wall to dysplay the mucoid appearence (Parr et dl, 1984).

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by the Medical Research Council of Canada (Grant MA 8926). R. C. L is a member of the Canadian Centers of Excellence via the Canadian Bacterial Diseases Network and a research scholar of exceptional merit of Le Fonds de la recherche de la sant6 du Qu6bec .

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Table 1. Mutants Description.

pMON1028 R S G A G G F G A R S

(wild type)

Table II. Antibiotics Susceptibility (Penams). (MIC: pglml)

Amp Cb Pen G Pip Tic Oxa Clox

pMON 1 028 ~ 5 0 0 0 >5000 >SI00 >5000 >5000 >1200 700

(wild type)

pMON 1 029 >=O0 >5000 >NO0 1600 500 ~ 1 2 0 0 1800

pMON 1030 >5000 a5000 >5000 ~5000 5000 200 500

pMON 1 042 1400 1000 1000 200 500 200 200

Amp: Ampicillin; Cb: Carbenicillin; PenG: Benzylpenicillin; Pip: Piperacillin; Tic: Ticarcillin; Oxa: Oxacillin ; Clox: Cloxacillin.

Table III. Antibiotics Susceptibility (Cephams). (MC: pgfml)

CXI CEP CTZ cm

pMONl028 <8 60 0.4 <0.1 (wild type)

CXI: Cefoxitin; CEP: Cephalothin; CTZ: Ceftazidime; CTX: Cefotaxime.

Table IV. Mutants Klnetic Results

-- --

A ~ P Cb PenG c e ~ Nit Nit Vmax Km Vmax Km Vmax Km Vmax Km Vmax Km VmadKrn

Amp: Ampicillin; Cb: Carbenicillin; PenG: Benzylpenicillin; Cep: Cephalotin; Nit: Nitrocefin.

. go Unmeasurable

Table V. Inhibition Studies (150).

Arnp Cb PenGTic Pip Oxa Clox Cftz Cftx

pMON1028 7 2 80 400 80 8 70 ~ 3 0 0 >300

(wild type)

pMONl029 40 25 5 5 2 2 9 >300 >300

pMON1030 250 300 100 100 40 50 25 >300 >300

pMONl032 -- -- - -- - -- - >300 >300

pMONl041 40 1 8 20 5 50 0.5 >300 >300

pMONl042 12 1 10 10 4 50 8 >300 >300

Amp: Ampicillin; Cb: Carbenicillin; PenG: Benzylpenicillin; Tic: Ticarcillin; Pip: Piperacillin; Oxa: Oxacillin; Clox: Cloxacillin; Cftz: ceftazidime; Cftx: cefotaxime.

150: pM = final concentration of antibiotics which inhibit 50% of the hydrolysis (Vmax). Enzyme and Nitrocefin concentration are set to give

3.2 RBsultats versus hypothèse

A la lumi6re des r6sultats obtenus dans cette Btude nous pouvons faire les suggestions suivantes: le r6sidus R234 ne semble pas être la piece maitresse dans la sp6cificitd et I'activit6 hydrolytique des carb6nicillinases. Son remplacement par la lysine suggere et confine qu'il est beaucoup plus important d'avoir un acide amine avec une chaine laterale chargée positivement. II serait interessant de voir le comportement de mutants ayant différents acides amines à cette position. Cette position peut être importante dans une combinaison specifique aux carb6nicillinases, combinaison que nous n'avons mal heureusement pas identifibe dans cette 6tude.

Notre deuxiéme observation concerne le double mutant pMON1031. En effet, les deux acides amines changes, soient R234Ket G238S, demontrent leur implication dans I'activitd des cephalosponnases. Les dtudes précédentes (Hulesky et coll., 1992; Sougakoff et coll., 1988) confirment bien la corrélation qui existe entre la nature des résidus dans cette position et I'activité céphalosponnases. Le fait de pouvoir obtenir une activite céphalosporinase à partir de quelques changements de la sdquence sauvage de carbénicillines est inquiétant pour l'avenir des therapeutiques cliniques. En plus, ce gain d1activit& contre les céphalosporines ne s'est pas fait au detriement de l'activité carbénicillinase ce qui prouve la capacité qu'a le site actif de s'adapter à son nouvel environnement .

Dans cette étude, le dernier résidu ayant subit un changement a été

S245. A en juger par notre alignement ce résidu semblait être spécifique au carbenicillinases. Son changement n'a pas eu d'influence dans I'activité carbénicillinase. Cependant, cette position semble être importante pour les deux mutants qui ont montré une activit6 contre les c6phalosporines. Par contre ces deux mutants ont perdus leur activité suite au simple changement S245G. En plus, ce changement a eu un effet négatif sur l'aspect mucoïde observe avec ces deux mutants. Cette observation ne semble pas être le fruit du hasard ni un artefact de laboratoire mais bel et bien un effet dû B la presence de certains acides amines dans la sbquence des mutants.

Finalement il est important de mentionner deux (2) osbervations faites durant cette étude. Tout d'abord, l'absence d'hydrolyse in vitro

(spectrophotometre) ne semble pas être un phénomène unique aux mutants obtenus. En effet, la litterature scientifique (~ryand, 1984) a déjà essay6 d'expliquer ce comportement, soit par la formation @un complexe acyle-enzyme extremement stable, soit par un d6sdquilibre dans l'espace p6riplasmique entre la concentration de l'enzyme et celle du substrat. Dans ce dernier cas il y a toujours hydrolyse efficace bien qu'elle soit lente (Parr et coll., 1 984).

L'obsewation finale concerne le phhotype mucoide de quelques uns de nos mutants. Encure une fois, il y a eu des cas bien document& où l'aspect mucoÏde semblait contribuer B la rdsistance contre l'antibiotique en question (Bryand, 1984). Ce qui est nouveau dans notre 6tude c'est le fait que cet aspect semble corroborer avec la séquence des acides aminés des mutants. Plus important encore, cet aspect disparait avec le dernier changement d'acide amine que nous avons effectue. Ceci prouve que non seulement la présence de certains acides amines est importante pour ce phhotype mais aussi leur agencement dans l'espace tridimentionnel ainsi que la nature des acides amines avoisinants. Ces mutants ayant ce phénotype mériteraient d'être étudies plus en détail.

CHAPITRE 4

CONCLUSION

4.1 Conclusion gdndrale

La prernibre 6tape dans 1'6tude phhotypique des carb4nicillinases a 6t6 de cloner et d'isoler les g h e s responsables de î'activit6 enzymatique. Les ddl6tions faites sur le transposon multirdsistant Tn 1413 (ApR. GmR, KmR, SUR, TmR) ont permis d'isoler le clone pMON1025 vdhiculant le gbne b l a c ~ ~ . ~ Par contre, le clonage du @ne de la carb6nicillinase b / a ~ ~ ~ 1 aboutissant au clone pMON510, a été r6ussi à partir du criblage d'une banque g6nomique de E. coli comprenant Ifintégron J53-2Q7711. Plusieurs sous-clonages ont 616 effectues sur ces deux clones pour finalement donner des constructions plus simples qui ont permis une manipulation aisée. II était fondamental d'obtenir la sequence nucl6otidique de ces deux clones et, une fois la séquence en main, on a procédé à une analyse à l'ordinateur pour déceler tous les cadres de lectures ouverts. La sequence peptidique obtenue avait les mêmes caract6ristiques que les B- lactamases en general et plus particulièrement celles de la classe A. Des études d'homologie et les alignements faits en comparant CARB-4 et AER-1 aux B-lactamases de classe A mettent en valeur certains acides aminés qui semblent être propres aux carbénicillinases. Suite aux résultats cristallographiques et de modélisation mol6culaire de quelques O-lactamases de classe A on remarque la tétrade STFK, au site actif, et la triade KSG (RSG dans les carbénicillinases) faisant face la tétrade STFK, compldtant ainsi la poche du site actif du côté du feuillet bêta. Ces deux blocs d'acides aminés confirment bien l'appartenance de la sequence peptidique obtenue à une protéine reconnaissant et liant la pénicilline (PLP). La vitesse d'hydrolyse de la carôenicilline par ces enzymes est beaucoup plus élevée que celle des autres enzymes de classe A, ce qui suggère la participation de ces acides aminbs, propres aux carbénicillinases, dans la reconnaissance et l'hydrolyse de cet antibiotique. Nous avons dirige notre 6tude sur ces acides amin& ainsi que ceux adjacents au site actif, ce qui signifie que notre cible a porte essentiellement sur la triade RSG et quelques acides amines en amont sans pour autant dépasser le r6sidu S244.

La deuxibme Btape de notre étude a été de muter les nucléotides encodant pour les acides amines concernes un a la fois et ensuite de faire des combinaisons qui donnaient une sbquence connue et spécifique a une autre

8-lactamase (ex.: c4phalospon'nase). II est donc clair que les changements pratiques sur b l a c ~ ~ ~ - r l &aient conservateurs dans Ie sens que chaque nouvel acide amine faisait partie de la sequence d'une autre î3-lactamase de classe A (voir figure 14), c'est B dire que nous n'avons pas fait de changement pour un acide amine qui ne se trouve pas dans cette position chez dautres O-lactamases. Le residu R234 a 6td le premier acide amine à Qtre change pour une K234. Cette modification n'a pas confirrn6 l'hypothèse qu'il &ait le principal acteur dans Imactivit6 carb6nicillinase. En fait, tous les mutants obtenus dans cette Otude n'ont pas complètement aboli 11activit6 carbhicillinase bien que quelques mutants ont eu une activité consid6rabIement diminuée. L'autre résultat important implique le mutant S238 G pour deux raisons principales: la première &ait d'dtablir son importance chez la carbénicillinase et la deuxiéme &ait de vérifier son implication chez la cephalosporinase. Ce type de changement a été bien documenté dans la littérature dont le consensus suggere qu'il est nécessaire d'avoir une S238 pour qu'une activité c6phalosporinase de t roisierne g6n4 ration soit possible. Nous avons profite de la pr6sence de la G238 naturellement incluse chez la carbenicilinase et nous avons voulu vérifie l'influence que pouvait induire sa modification pour une S238 aussi bien dans l'activité carbécillinase que c6phalosporinase. Le résultat a bel et bien confirme l'importance de ce résidu dans l'activité céphalosporinase aussi bien que la possibilité d'obtenir une céphalosporinase ii partir d'une carb6nicillinase à la suite d'un ou de deux changements. A remarquer qu'il est important de vérifier si le contraire est possible. En effet, personne n'a décrit, le comportement des TEM-2 ou SHV-2 si la K234 était rernplaçée par R234. il est intéressant de noter que la combinaison que possède le mutant s'approchant le plus des céphalosporinases (ex.: SHV-2 ou TEM-2) comprenait les deux changements K234 et S238 en plus de quelques autres. Ce mutant (pMONlO42) n'a pas montre I'activit6 céphalosporinase, contre les cephalosporines de troisième génération testées, ce qui démontre bien le fait qu'il y a un équilibre sterique à respecter et qu'une copie conforme dans une région spécifique n'implique pas necessairement la même activitd que l'originale. II est 6vident que l'arrangement spatial est critique dans ce cas particulier. Plus important encore sont certains acides amines qui compensent et facilitent l'activité hydrolyt ique lorsqu'on a K234 ou deux changements (IQ34 et S238), mais qui ne sont plus capables de le faire lorsqu'on ajoute d'autres substitutions. II est probable que d'autres changements, dans des régions non soupçonnées jusqu'à date, peuvent rendre nos mutants actifs. II serait possible

de verifier cette hypothbçe avec des 6tudes de superpositions l'ordinateur impliquant les donnees atomiques obtenues grâce à la cristallographie d'une part et a la structure primaire des mutants d'autre part.

Cactivit6 carb6 nici llinase n'a pas Bt6 andantie bien qu'on en soit arrive B la diminuer assez fortement. Ceci sugghre que d'autres acides aminbs, non reconnus dans les Btudes ant&ieures, sont impliqu6s directement ou sont capable de compenser la perte d'un acide amine clef dans l'activité enzymatique. II est fort possible que certains de ces acides amines aient et6 conserves dans 1'6volution des 8-lactamases pour la simple raison que la bacterie, ayant essaye certaines combinaisons, ait garde la premibre qui lui permettait de s'adapter un nouvel antibiotique. II est probable que la bacterie n'a pas le temps ni 1'6nergie necessaire pour essayer toutes les combinaisons possibles et sélectionner l'enzyme passedant la meilleure activite tout en étant thermodynamiquement la plus stable. Ceci implique qu'on sera toujours dans une course contre la montre pour trouver des agents plus puissants dont on sait d'avance que la bactérie s'y adaptera.

Le manque de corrélation entre nos résultas phenotypiques (CMI) et I'activite enzymatique in vitro (hydrolyse) est probablement un problbme d'ordre atomique et mente d'être étudie plus en détails. II n'est pas prudent de sp6culer sur ces points mais notons qu'il existe plusieurs moyens techniques, non à notre disposition, pour essayer de comprendre ce phénomène, comme par exemple les spectroscopies de masse ou d'infrarouge. D'autres méthodes indirectes, comme les méthodes acidornétrique ou iodométrique sont possibles mais n6cessitent un équipement particulier. Le lien du noyau B-lactame qui est détruit ne génère pas de sous produit mesurable comme du CO2 ou quelconque mol6cule pourvant être marquee radioactivement. Le mutant dont ' la lysine remplace I'arginine à la position 234 est celui qui mêle un peu les cartes. En effet, on est capable d'avoir une cinétique enzymatique facilement observable au spectrop hotomètre. Ceci est valable seulement avec le cep halot in et non avec les autres antibiotiques. Cette cinetique disparait aussitôt qu'on ajoute une serine la position 238 au mutant ayant déjà K234 ce qui laisse ce dernier encore actif, in vivo (CMI), contre le céphalothin mais à un degré moindre que le mutant original.

4.2 Implications pour le futur

C&tude entreprise sur la carb6nicillinase CARB-4 montre bel et bien la puissance et la facilite d'accommodation des 8-lactamases face à plusieurs substrats, même ceux très peu differents les uns des autres. Quelques modifications au niveau de certains acides amines sont souvent tout ce qu'il faut à la O-lactamase pour s'adapter son nouvel environnement, ce qui implique une vitesse de réponse ne nécessitant que quelques gdndrations bact6riennes. II est clair que des dondes atomiques et cristallographiques, ainsi que des simulations à l'ordinateur, sont capitales pour le d4veloppernent de nouveaux agents antibiotiques puisque les combinaisons qui peuvent exister pour une seule O-lactamase sont quasi illimitées. Les acides amines ont toujours 4t6 rernplac6s par des acides amines se trouvant à la même position et faisant partie de la sequence sauvage d'autres O-lactamases de classe A comme indique dans I'alig nement contenu dans le premier article (voir fig. 14 chapitre 2). Nous n'avons pas essaye dans notre 6tude de changer un acide amine par un autre qui ne faisait pas partie d'une sequence connue. On ne sait pas non plus ce que peut générer une insertion ou une deletion dans les séquences des carbénicillinases. Tout effort aboutissant à la création et au d6veloppement de nouveaux antibiotiques et/ou inhibiteurs devrait prendre en considération ces possibilités pour la simple raison que l'évolution a bien montrd que les bactéries feront tout leur possible pour s'adapter à la nouvelle situation. II est plus logique de concentrer les efforts de d a t i o n de nouveaux antibiotiques eVou inhibiteurs vers des formules qui nbcessiteraient de grands &arrangements gdnetiques et non plus de simples mutations ponctuelles, ce qui implique des logiciels, de simulation de plus en plus puissant. Une autre situation interessante consiste à cr6er un agent dont on connait I'affinit6 pour la forme la plus instable d'une serie de mutants et ainsi mettre la bacterie devant un choix difficile: produire une enzyme instable mais ayant une grande affmit6 pour le substrat versus une enzyme stable mais moins specifique.

Du point de vue clinique, l'activité c6phalosporinase de troisibme génération est inquiétante. Le choix que le clinicien aura à offrir dans le traitement des infections devient de plus en plus restreint. Les combinaisons

peuvent toujours permettre une solution à court terme. Les 6tudes in vitro ne testent pas tous les antibiotiques disponibles et on devrait, à notre avis, developper des tests de simulations B l'ordinateur, avant de tester les nouveaux produits in vivo . Ceci reviendrait A developper un programme informatisd, qui tiendrait compte des donnees cristallographiques, atomiques et cinetiques d6jà obtenues, pour predire le devenir d'une mol6cule virtuelle (antibiotique) devant une st nicture virtuelle (O-lactamase). Les moldcules qui passeraient le test seraient celles qu'il faudrait tester in vivo. Les rh i ta ts negatifs permettraient de reajuster le programme.

CHAPITRE 5

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