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Dako EnVision®+ System–HRP (AEC) For Use With Rabbit Primary Antibodies

English Code K4008 Code K4009 Ready-to-use

Intended use

For In Vitro diagnostic use. These instructions apply to the Dako EnVision®+ System, Peroxidase (Dako EnVision+ System, HRP). This kit is intended for use with primary antibodies from rabbit supplied by the user for the qualitative identification of antigens by light microscopy in normal and pathological paraffin-embedded tissues, cryostat tissues or cell preparations. Tissues processed in a variety of fixatives including ethanol, B-5, Bouin’s, zinc formalin, and neutral buffered formalin may be used.

Summary and explanation

The Dako EnVision+ System, HRP is a two-step IHC staining technique. This system is based on an HRP labelled polymer which is conjugated with secondary antibodies. The labelled polymer does not contain avidin or biotin. Consequently, nonspecific staining resulting from endogenous avidin-biotin activity in liver, kidney, lymphoid tissues and cryostat sections is eliminated or significantly reduced. All reagents in the Dako EnVision+ System, HRP with AEC+ substrate are ready-to-use. This system is an extremely sensitive method and, as a result, optimal dilutions of the primary antibody are up to 20 times higher than those used for the traditional PAP technique, and several-fold greater than those used for the traditional ABC or LSAB methods. This protocol offers an enhanced signal generating system for the detection of antigens present in low concentrations or for low titer primary antibodies. Primary antibodies produced in rabbit react well with the labelled polymer. The interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with proper controls.

Principles of procedure

Quench any endogenous peroxidase activity by incubating the specimen for five minutes with Dako’s Peroxidase Block. The specimen is then incubated with an appropriately characterized and diluted rabbit primary antibody, followed by incubation with the labelled polymer using two sequential 30-minute incubations. It should be noted that for antibodies requiring enzyme digestion or target retrieval, it may be necessary to increase incubation times of the primary antibody and labelled polymer by 5 to 10 minutes. Staining is completed by a 5–30 minute incubation with 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)+ substrate-chromogen which results in a red-colored precipitate at the antigen site. (AEC is a potential carcinogen, see Precautions Section).

Reagents provided

Code K4008 The following materials, sufficient for 150 tissue sections, based upon 100 µL per section, are included in this kit:

Quantity Description 1x15 mL Peroxidase Block

0.03% hydrogen peroxide containing sodium azide.

1x15 mL Labelled Polymer

Peroxidase labelled polymer conjugated to goat anti-rabbit immunoglobulins in Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an anti-microbial agent.

1x15 mL AEC+ Substrate Chromogen

3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers and an anti-microbial agent. Keep at 28°C .

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Code K4009

The following materials, sufficient for 1100 tissue sections, based upon 100 µL per section, are included in this kit:

Quantity Description 1x110 mL Peroxidase Block

0.03% hydrogen peroxide containing sodium azide.

1x110 mL Labelled Polymer

Peroxidase labelled polymer conjugated to goat anti-rabbit immunoglobulins in Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an anti-microbial agent.

1x110 mL AEC+ Substrate-Chromogen

3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers and an anti-microbial agent. Keep at 28°C.

Materials required, but not supplied

Absorbent wipes Control tissue, positive and negative Counterstain; aqueous based, such as Mayer’s Hematoxylin or Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (code S3309) Coverslips Distilled water Ethanol, absolute and 95% Light microscope (20x–800x) Mounting media, such as Glycergel® Mounting Medium (code C0563) or Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) or nonaqueous permanent mounting medium, Ultramount (code S1964) Primary antibodies and negative control reagent Slides, poly-L-lysine coated or Silanized Slides (code S3003) Staining jars or baths Timer (capable of 3–40 minute intervals) Wash bottles Wash Buffer Solution Xylene, toluene or xylene substitutes Optional materials Ammonium hydroxide, 15 mol/L diluted to 0.037 mol/L PAP Pen (code S2002)

Precautions

1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product

concentrations, though not classified as hazardous, build-ups of NaN3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal oxides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.1,2

3. The AEC+ Substrate-Chromogen is sensitive to contamination from a variety of oxidizing agents such as metals, bacteria, dust and commonly used laboratory glassware. To avoid contamination and premature expiration, avoid exposing the AEC+ solution to any potential source of contamination and never pipette directly from the bottle. Pour out required amount into a clean container and pipette from it. Do not return excess AEC+ solution to the primary storage container.

4. Do not use reagents beyond expiration date for prescribed storage method. If reagents are stored under any conditions other than those specified in the product insert, they must be validated by the user.

5. Do not substitute reagents from other lot numbers or from kits of other manufacturers. 6. Enzymes and substrate-chromogens may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do

not store kit components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 7. Incubation times or temperatures other than those specified may give erroneous results; any such changes

must be validated by the user. 8. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 9. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 10. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. 11. Safety Data Sheet available for professional users on request.

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Danger AEC+ Substrate Chromogen: 5-10% Polyethylene glycol, 1-5% N-Methyl-2-pyrrolidone, 0.1-1% Acetic acid, 0.1-1% 3-amino-9-ethyl carbazole H320 Causes eye irritation. H350 May cause cancer. P201 Obtain special instructions before use. P202 Do not handle until all safety precautions have been read and understood. P281 Use personal protective equipment as required. P280 Wear eye or face protection. P264 Wash hands thoroughly after handling. P308 + P313 IF exposed or concerned: Get medical attention. P305 + P351 + P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention. P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and

international regulations.

Storage Reagents of the Dako EnVision+ System, HRP are to be stored at 28°C. Do not freeze. Do not use after expiration printed on reagent vials and kit label. Alteration in the appearance of any reagent, such as precipitation, may indicate instability or deterioration. In such cases, the reagent(s) is (are) not to be used. The AEC+ Substrate-Chromogen solution is unstable at temperatures greater than 8°C. Store the AEC+ Substrate-Chromogen solution at the recommended 28°C temperature range. This solution may be used immediately after removal from the refrigerator. After use, return to 28°C storage as soon as possible. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with the kit is suspected, contact Dako Technical Support.

Reagent preparation

It is convenient to prepare the following reagents prior to staining. Wash Buffer Solution TBST, 0.05 mol/L Tris Buffered Saline with Tween (code S3006), is the recommended wash buffer for the automated and manual IHC detection. TBS, 0.05 mol/L Tris Buffered Saline (code S1968), and PBS, 0.02 mol/L Phosphate Buffered Saline (code S3024), are also suitable wash buffer solutions for manual staining. Wash buffer solutions containing sodium azide are not recommended. Sodium azide will inactivate horseradish peroxidase (HRP) resulting in negative staining. Discard buffer if cloudy in appearance. Distilled water may be used for rinsing the peroxidase block, substrate and counterstain. Primary Antibody NP-Series “Plus” ready-to-use antibodies are optimized and recommended for use with Dako “Plus” high sensitivity detection systems. Concentrated antibodies are also available from Dako. Optimization of concentrated antibodies is required by the end user. Dilutions should be prepared using Antibody Diluent (code S0809), or a diluent containing 0.05 mol/L Tris-HCl buffer with 1% bovine serum albumin (BSA). Dako N-Series, ready-to-use antibodies are not optimized for use with Dako “Plus” detection systems. Negative Control Reagent When using Dako NP-Series “Plus” ready-to-use antibodies, Universal Negative Control(s)+ is recommended as a negative control reagent. These controls are optimized for use with either mouse (code NP015) or rabbit (code NP001) NP-Series “Plus” ready-to-use antibodies. Counterstain The colored end-product of the staining reaction is alcohol soluble and should only be used with aqueous-based counterstains such as Mayer’s hematoxylin or Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (code S3309). Follow counterstaining of hematoxylin with a thorough rinse in distilled water, then immerse tissue slides into a bath of 0.037 mol/L ammonia or similar bluing agent. 0.037 mol/L ammonia water is prepared by mixing 2.5 mL of 15 mol/L (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of water. Unused 0.037 mol/L ammonia may be stored at room temperature (20–25°C) in a tightly capped bottle for up to 12 months. Consult manufacturers’ guidelines for alternative counterstaining procedures.

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Mounting Media Glycergel Mounting Medium (code C0563) or Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) is recommended for aqueous mounting. Glycergel must be heated to at least 50°C just prior to use. Non-aqueous permanent mounting medium (Ultramount, code S1964) may also be used.

Specimen preparation

Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. The most common fixatives for IHC tissue preparations are discussed in the “General Instructions for Immunohistochemistry”. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user.

Staining procedure

Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with the kit contents prior to use.

The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the kit reagents or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous results.

Peroxidase Block and Labelled Polymer should be equilibrated to room temperature (20–25°C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. For convenience the AEC+ substrate may be used immediately after removal from the refrigerator and does not have to be brought to room temperature before use. After use, return to 2–8°C storage. Storage at temperature above 8°C adversely affects the stability of the AEC+ substrate-chromogen.

Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations are used, place tissues in a humid environment.

The sensitivity of the Dako EnVision+ System, HRP can be further increased by lengthening the incubation times of Steps 2 and 3 for 5–10 minutes.

Staining Protocol STEP 1 PEROXIDASE BLOCK

Tap off excess buffer. Using a lintless tissue (such as Kimwipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagent within the prescribed area.

Apply enough Peroxidase Block to cover specimen. Incubate 5 (±1) minutes.

Rinse gently with distilled water or buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath.

STEP 2 PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROL REAGENT Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough optimally diluted primary antibody or negative control reagent to cover specimen. Incubate 30 (±1) minutes.

Rinse gently with buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath. If the staining procedure must be interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the primary antibody (Step 2) for up to one hour at room temperature (20–25°C) without affecting the staining performance.

STEP 3 PEROXIDASE LABELLED POLYMER Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough Labelled Polymer to cover specimen. Incubate 30 (±1) minutes. Rinse slides as in Step 2.

STEP 4 SUBSTRATE-CHROMOGEN Wipe slides as before.

Apply enough of the ready-to-use AEC+ substrate-chromogen solution to cover specimen. Incubate for 5–30 minutes.

Rinse gently with distilled water from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue). Collect substrate-chromogen waste in a hazardous materials container for proper disposal.

STEP 5 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (optional) Immerse slides in a bath of aqueous hematoxylin (code S3309). Length of incubation depends on the strength of hematoxylin used.

Rinse gently in a distilled water bath. Dip slides 10 times into a bath of 0.037 mol/L ammonia or similar bluing agent. Rinse slides in a bath of distilled or deionized water for 2–5 minutes.

STEP 6 MOUNTING Specimens may be mounted and coverslipped with an aqueous-based mounting medium such as Glycergel Mounting Medium (code C0563) or Faramount (code S3025) or Non-aqueous permanent mounting medium, Ultramount (code S1964).

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Note: The AEC reaction product is soluble in organic solvents and is therefore not compatible with toluene- or xylene-based permanent mounting media.

Note: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are exposed to strong light over a period of one week. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20–25°C).

Quality control

Differences in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the following procedures. See the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry and references 3 through 5 for additional information. Refer to the specification sheet of each primary antibody used for details regarding sensitivity and immunoreactivity. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for further information on positive and negative controls.

Staining interpretation

Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for interpretation guidelines.

General limitations

Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for general limitations.

Product specific limitations

Tissue staining is dependent on the proper handling and processing of tissues prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, heating, sectioning or contamination with other tissues or fluids may produce artifacts, antibody trapping, or false-negative results. Use of old or unbuffered fixatives, or exposure of tissues to excessive heat (greater than 60°C) during processing may result in decreased staining sensitivity. Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome, and catalase as well as in eosinophils.6,7 This activity can be inhibited by incubating specimens with Peroxidase Block of the Dako EnVision+ System, HRP for five minutes prior to the application of the primary antibody. Blood and bone marrow smears and frozen tissues can also be treated with this reagent. However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. Alternately, a solution of methanol-hydrogen peroxide can be used. Some antigens may become denatured with this procedure. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase.8

Normal/nonimmune sera from the same animal source as the secondary antisera used in blocking steps may cause false-negative or false-positive results due to auto-antibodies or natural antibodies. The reagents supplied in this kit have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen detection.

Troubleshooting

Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of

any slides. 1a. Reagents not used in proper

order. 1a. Review application of reagents.

1b. Sodium azide in buffer bath. 1b. Use fresh azide-free buffer. 2. Weak staining

of all slides. 2a. Sections retain too much solution

after wash bath. 2a. Gently tap off excess solution before

wiping around section. 2b. Slides not incubated long enough

with antibodies or substrate. 2b. Review recommended incubation times.

3. Excessive background staining in all slides.

3a. Specimens contain high endogenous peroxidase activity.

3a. Use longer incubation time of peroxidase block.

3b. Paraffin incompletely removed. 3b. Use fresh xylene or toluene baths. If several slides are staining simultaneously, the second xylene bath should contain fresh xylene.

3c. Slides not properly rinsed. 3c. Use fresh solutions in buffer baths and wash bottles. Use TBST as wash buffer.

3d. Faster than normal substrate reaction due to e.g. excessive room temperature.

3d. Use shorter incubation time with substrate-chromogen solution.

3e. Sections dried during staining procedure.

3e. Use humidity chamber. Wipe only three to four slides at a time before applying reagent.

3f. Nonspecific binding of reagents to tissue section.

3f. Apply a blocking solution containing an irrelevant protein.

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3g. Antibody too concentrated. 3g. Use higher dilution of the primary antibody.

NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call Dako Technical Support for further assistance. Additional information on staining techniques and specimen preparation can be found in the Handbook -Immunochemical Staining Methods9 (available from Dako), Atlas of Immunohistology10 and Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.11

Français

Réf. K4008 Réf. K4009 Prêt à l’emploi

Utilisation prévue

Pour utilisation diagnostique in vitro. Ces instructions concernent le kit Dako EnVision®+ System, peroxydase de raifort (kit Dako EnVision+ System, HRP). Ce kit est conçu pour être utilisé avec des anticorps primaires de lapin (fournis par l’utilisateur) dans l’identification qualitative des antigènes par microscopie optique dans différents tissus inclus en paraffine, tissus cryostat ou préparations cellulaires sains et pathologiques. Les tissus peuvent être traités à l’aide de divers fixateurs : éthanol, B-5, liquide de Bouin, zinc-formol et formol neutre tamponné.

Résumé et explications

Le kit Dako EnVision+ System, HRP est une technique de coloration par IHC en deux étapes. Ce kit repose sur l’utilisation d’un polymère marqué à la peroxydase de raifort (HRP), conjugué à des anticorps secondaires. Le polymère marqué ne contient pas d’avidine ou de biotine. Par conséquent, la coloration non spécifique due à l’activité avidine-biotine endogène dans le foie, le rein, les tissus lymphoïdes et les coupes cryostat est éliminée ou réduite de manière significative. Tous les réactifs du kit Dako EnVision+ System, HRP avec substrat AEC+ sont prêts à l’emploi. Ce kit est une méthode extrêmement sensible. Par conséquent, les dilutions optimales de l’anticorps primaire sont jusqu’à 20 fois plus élevées que celles utilisées pour la technique PAP classique, et 7 fois plus élevées que celles utilisées pour les méthodes ABC ou LSAB traditionnelles. Ce protocole comporte une fonction avancée de génération de signal pour la détection des antigènes présents à de faibles concentrations ou pour les anticorps primaires à faible titre. Les anticorps primaires de lapin réagissent bien avec le polymère marqué. L’interprétation de toute coloration positive ou absence de coloration doit être complétée par des analyses morphologiques et histologiques utilisant les contrôles adaptés.

Principes de la procédure

Interrompre toute activité endogène de la peroxydase en incubant l’échantillon pendant cinq minutes dans le Peroxidase Block de Dako. L’échantillon est alors incubé avec un anticorps primaire de lapin dilué et caractérisé de manière appropriée, puis incubé avec le polymère marqué, via deux incubations successives de 30 minutes. Il convient de noter que si vous utilisez des anticorps nécessitant une digestion enzymatique ou une restauration des cibles, il peut être indispensable d’augmenter les temps d’incubation de l’anticorps primaire et du polymère marqué de 5 à 10 minutes. La coloration se termine par une incubation de 5 à 30 minutes avec un substrat chromogène 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC)+, qui entraîne un précipité rouge au niveau du site de l’antigène. (L’AEC est un produit potentiellement cancérigène, voir la section Précautions).

Réactifs fournis

Réf. K4008 Le kit comprend les matériels suivants, en quantité suffisante pour 150 coupes de tissu, sur la base de 100 µl par coupe :

Quantité Description 1x15 ml Peroxidase Block (Agent bloquant de la peroxydase)

Peroxyde d’hydrogène à 0,03 % contenant de l’azide de sodium.

1x15 ml Labelled Polymer (Polymère marqué)

Polymère marqué à la peroxydase conjugué à des immunoglobulines anti-lapin de chèvre, dans du tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

1x15 ml AEC+ Substrate Chromogen (Substrat chromogène AEC+)

3-amino-9-éthylcarbazole contenant du peroxyde d’hydrogène, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien. Conserver entre 2 et 8 °C.

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Réf. K4009 Le kit comprend les matériels suivants, en quantité suffisante pour 1100 coupes de tissu, sur la base de 100 µl par coupe :

Quantité Description 1x110 ml Peroxidase Block (Agent bloquant de la peroxydase)

Peroxyde d’hydrogène à 0,03 % contenant de l’azide de sodium.

1x110 ml Labelled Polymer (Polymère marqué)

Polymère marqué à la peroxydase conjugué à des immunoglobulines anti-lapin de chèvre, dans du tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

1x110 ml AEC+ Substrate Chromogen (Substrat chromogène AEC+)

3-amino-9-éthylcarbazole contenant du peroxyde d’hydrogène, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien. Conserver entre 2 et 8 °C.

Matériels requis mais non fournis

Lingettes absorbantes Tissu de contrôle, positif et négatif Contre-colorant avec base aqueuse, de type hématoxyline de Mayer ou Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (hématoxyline de Mayer modifiée par Lillie) (réf. S3309) Lamelles de protection Eau distillée Éthanol, absolu et 95 % Microscope optique (20x–800x) Milieu de montage, de type Glycergel® Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount Aqueous Mounting Medium, milieu de montage aqueux, prêt à l'emploi (réf. S3025) ou milieu de montage permanent non aqueux, Ultramount (réf. S1964) Anticorps primaires et réactif de contrôle négatif Lames, enduites de poly-L-lysine ou Silanized Slides (lames silanisées) (réf. S3003) – Cuves de coloration Chronomètre (pouvant accepter des intervalles de 3 à 40 minutes) Flacons de lavage Solution de tampon de lavage Xylène, substituts de xylène ou de toluène Matériels facultatifs Hydroxyde d’ammonium, 15 mol/L, dilué à 0,037 mol/L PAP Pen (réf. S2002)

Précautions

1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure.

Aux concentrations utilisées, bien que non classé comme dangereux, l’accumulation de NaN3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides de métal hautement explosifs. Lors de l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azide dans les canalisations.1,2

3. Le substrat chromogène AEC+ est sensible à la contamination pouvant être causée par divers agents oxydants : métaux, bactéries, poussière et verrerie couramment utilisée en laboratoire. Pour éviter toute contamination et une péremption prématurée des produits, éviter d’exposer la solution AEC+ à toute source potentielle de contamination et ne jamais pipeter directement dans le flacon. Verser la quantité requise dans un récipient propre et pipeter à partir de ces récipients. Ne pas remettre l’excès de solution AEC+ dans le conteneur d’origine.

4. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption en fonction de la méthode de conservation recommandée. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées dans la notice, celles-ci doivent être validées par l’utilisateur.

5. Ne pas utiliser de réactifs portant un autre numéro de lot ou provenant de kits d’autres fabricants. 6. Les enzymes et les substrats chromogènes peuvent être endommagés s’ils sont exposés à une lumière

excessive. Ne pas stocker les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière directe du soleil.

7. Des temps ou des températures d’incubation autres que ceux indiqués peuvent produire des résultats erronés et doivent être validés par l’utilisateur.

8. Comme avec tout produit d’origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées.

9. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau 10. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales. 11. La Fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande.

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Danger AEC+ Substrate Chromogen: 5-10% Polyethylene glycol, 1-5% N-Methyl-2-pyrrolidone, 0.1-1% Acetic acid, 0.1-1% 3-amino-9-ethyl carbazole H320 Provoque une irritation des yeux. H350 Peut provoquer le cancer. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d'avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P281 Utiliser l’équipement de protection individuel requis. P280 Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P308 + P313 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée: Consulter un médecin. P305 + P351 + P338

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.

P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes réglementations locales,

régionales, nationales, et internationales.

Conservation Les réactifs du kit Dako EnVision+ System, HRP doivent être conservés entre 2 et 8 °C. Ne pas congeler. Ne pas utiliser après la date de péremption imprimée sur l’étiquette des flacons de réactif et du kit.

Une modification de l’apparence d’un réactif, tel un précipité, peut indiquer une instabilité ou une détérioration du produit. Dans ce cas, ne pas utiliser le(s) réactif(s).

La solution de substrat chromogène AEC+ est instable à des températures supérieures à 8 °C. Conserver ce produit dans la plage de températures recommandée (entre 2 et 8 °C). Cette solution peut être utilisée dès sa sortie du réfrigérateur. Après utilisation, la replacer entre 2 et 8 °C dès que possible.

Il n’y a aucun signe indiquant l’instabilité de ces produits. Par conséquent, les contrôles positif et négatif doivent être testés en même temps que des échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d’un problème dans le kit, contacter l’assistance technique Dako.

Préparation des réactifs

Il est recommandé de préparer les réactifs suivants avant la coloration.

Solution de tampon de lavage Le TBST, Tris Buffered Saline with Tween à 0,05 mol/L (solution saline de tampon Tris à 0,05 mol/L avec Tween) (réf. S3006), est le tampon de lavage recommandé pour les procédures d’IHC automatiques et manuelles. Le TBS, Tris Buffered Saline (solution saline de tampon Tris) à 0,05 mol/L (réf. S1968), et le PBS, Phosphate Buffered Saline (solution saline de tampon phosphate) à 0,02 mol/L (réf. S3024), conviennent également pour le lavage lors de colorations manuelles. L’utilisation de solutions de tampon de lavage contenant de l'azide de sodium n’est pas recommandée. L’azide de sodium inactive la peroxydase de raifort (HRP), ce qui entraîne une coloration négative. Jeter le tampon s'il semble trouble.

L’eau distillée peut être utilisée pour le rinçage de l’agent bloquant de la peroxydase, du substrat et du contre-colorant.

Anticorps primaire Les anticorps « Plus » de la série NP prêts à l’emploi sont optimisés et recommandés pour être utilisés avec les kits de détection haute sensibilité « Plus » de Dako. Des anticorps concentrés sont également disponibles auprès de Dako. L’utilisateur final est responsable de l'optimisation des anticorps concentrés. Les dilutions doivent être effectuées en utilisant le Antibody Diluent (diluant d’anticorps) (réf. S0809) ou un diluant contenant du tampon Tris-HCl à 0,05 mol/L avec 1 % d’albumine sérique bovine. Les anticorps de la série N prêts à l’emploi de Dako ne sont pas optimisés pour être utilisés avec les kits de détection « Plus » de Dako.

Réactif de contrôle négatif Lors de l’utilisation des anticorps « Plus » de la série NP prêts à l’emploi Dako, le(s) Universal Negative Control(s)+ est/sont recommandé(s) comme réactif de contrôle négatif. Ces contrôles sont optimisés pour les anticorps « Plus » de la série NP prêts à l’emploi, de mouse (souris) (réf. NP015) ou de rabbit (lapin) (réf. NP001).

Contre-colorant Le produit coloré de la réaction de coloration est soluble dans l’alcool et ne doit être utilisé qu’avec des contre-colorants à base aqueuse comme l’hématoxyline de Mayer ou Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (hématoxyline de Mayer modifiée par Lillie) (réf. S3309). Après contre-coloration de l'hématoxyline, rincer abondamment à l’eau distillée, puis immerger les lames dans un bain d’ammoniaque à 0,037 mol/L ou d’un agent de bleuissement similaire. L’ammoniaque à 0,037 mol/L est préparée en mélangeant 2,5 ml d’hydroxyde d’ammonium à 15 mol/L (concentré) et 1 litre d’eau.

L’ammoniaque à 0,037 mol/L non utilisée peut être conservée à température ambiante (20–25 °C) dans un flacon fermé hermétiquement pendant 12 mois maximum.

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Consulter les instructions du fabricant pour connaître d’autres procédures de contre-coloration.

Milieu de montage Le milieu de montage Glycergel Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount Aqueous Mounting Medium, milieu de montage aqueux, prêt à l’emploi (réf. S3025) est recommandé pour le montage aqueux. Le Glycergel doit être chauffé à 50 °C minimum juste avant utilisation. Un milieu de montage permanent non aqueux (Ultramount, réf. 1964) peut également être utilisé.

Préparation des échantillons

Avant la coloration IHC, les tissus doivent être fixés et traités. Leur fixation évite l’autolyse et la putréfaction des tissus excisés, préserve l’antigénicité, améliore l’indice de réfraction des composants tissulaires et accroît la résistance des éléments cellulaires au traitement des tissus. Le traitement des tissus inclut la déshydratation, l’élimination des agents déshydratants, l’infiltration du milieu d’inclusion, l’inclusion et la coupe des tissus. Les fixateurs les plus courants pour la préparation IHC des tissus sont présentés dans les "General Instructions for Immunohistochemistry" (« Instructions générales d’immunohistochimie »). Il ne s’agit là que de conseils. Les procédures optimales doivent être déterminées et vérifiées par l’utilisateur.

Procédure de coloration

Remarques sur la procédure L’utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec le contenu du kit avant utilisation. Les réactifs fournis dans ce kit et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales. Toute dilution supplémentaire des réactifs du kit, ainsi que toute modification des temps et températures d’incubation, peut produire des résultats erronés. L’agent bloquant de la peroxydase et le polymère marqué doivent être amenés à température ambiante (20–25 °C) avant la coloration. De même, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Le substrat AEC+ peut être utilisé dès sa sortie du réfrigérateur et n’a pas besoin d’être à température ambiante avant utilisation. Après utilisation, replacer au réfrigérateur entre 2 et 8 °C. La conservation à une température supérieure à 8 °C peut nuire à la stabilité du substrat chromogène AEC+. Ne pas laisser les lames sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Couvrir les lames exposées aux courants d'air. Si la durée d’incubation est prolongée, placer les tissus dans un environnement humide. La sensibilité du kit Dako EnVision+ System, HRP peut être augmentée en allongeant la durée d'incubation des étapes 2 et 3 de 5 à 10 minutes. Protocole de coloration ÉTAPE 1 AGENT BLOQUANT DE LA PEROXYDASE

Secouer pour enlever l’excès de tampon. Avec un tissu non pelucheux (ex. : Kimwipe ou gaze), essuyer avec précaution autour de l’échantillon pour enlever tout liquide restant et maintenir le réactif dans la zone indiquée.

Appliquer suffisamment de Peroxidase Block pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 5 minutes ± 1 minute.

Rincer doucement à l’eau distillée ou avec une solution tampon contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé.

ÉTAPE 2 ANTICORPS PRIMAIRE OU RÉACTIF DE CONTRÔLE NÉGATIF Secouer pour enlever l’excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d’anticorps primaire ou de réactif de contrôle négatif à dilution optimale pour recouvrir l’échantillon.

Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute. Rincer doucement avec une solution tampon contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé. Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être maintenues dans un bain de tampon après incubation de l’anticorps primaire (étape 2) pendant une heure maximum à température ambiante (20–25 °C) sans que cela n’affecte les performances de la coloration.

ÉTAPE 3 POLYMÈRE MARQUÉ À LA PEROXYDASE Secouer pour enlever l’excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de polymère marqué pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute. Rincer les lames comme indiqué à l’étape 2.

ÉTAPE 4 SUBSTRAT CHROMOGÈNE Essuyer les lames comme décrit ci-avant.

Appliquer suffisamment de substrat chromogène AEC+ prêt à l’emploi pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 5 à 30 minutes.

Rincer doucement avec de l’eau distillée contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus). Recueillir les déchets du substrat chromogène dans un conteneur pour déchets biologiques pour les éliminer de manière appropriée.

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ÉTAPE 5 CONTRE-COLORATION À L’HÉMATOXYLINE (facultatif) Immerger les lames dans un bain d’hématoxyline aqueuse (réf. S3309). La durée d’incubation dépend de la puissance de l’hématoxyline utilisée.

Rincer doucement dans un bain d’eau distillée. Tremper les lames 10 fois dans un bain d’ammoniaque à 0,037 mol/L ou d’un agent de bleuissement similaire. Rincer les lames dans un bain d’eau distillée ou déionisée pendant 2 à 5 minutes.

ÉTAPE 6 MONTAGE Les échantillons peuvent être montés et recouverts en utilisant un milieu de montage aqueux de type Glycergel Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount (réf. S3025), ou un milieu de montage permanent non aqueux, Ultramount (réf. S1964). Remarque : Le produit de la réaction AEC est soluble dans des solvants organiques et n’est donc pas compatible avec les milieux de montage permanents comportant du toluène ou du xylène.

Remarque : Les lames peuvent être lues à tout moment. Cependant, une atténuation peut se produire si les lames sont exposées à une lumière vive pendant plus d’une semaine. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l’obscurité à température ambiante (20–25 °C).

Contrôle qualité

Des différences dans les procédures techniques et le traitement des tissus du laboratoire peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers, en complément des consignes suivantes. Voir les consignes de contrôle qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du College of American Pathologists (CAP) et les références 3 à 5 pour plus d’informations. Consulter la fiche technique de chaque anticorps primaire utilisé pour plus de détails concernant la sensibilité et l’immunoréactivité.

Consulter les "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (« Instructions générales de coloration immunohistochimique ») pour plus d’informations sur les contrôles positifs et négatifs.

Interprétation de la coloration

Consulter les "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (« Instructions générales de coloration immunohistochimique ») pour l’interprétation.

Limites générales

Consulter les "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (« Instructions générales de coloration immunohistochimique ») pour les limites générales.

Limites spécifiques au produit

La coloration des tissus dépend de la manipulation et du traitement des tissus avant la coloration. Les fixation, congélation, décongélation, lavage, séchage, chauffage, coupe inadaptés ou une contamination par d’autres tissus ou fluides peuvent générer des artéfacts, un piégeage des anticorps ou des faux négatifs. L’utilisation de fixateurs périmés ou non tamponnés, ou l’exposition des tissus à une température excessive (supérieure à 60 °C) au cours du traitement peut réduire la sensibilité de coloration.

Une activité endogène peroxydasique ou pseudoperoxydasique peut se manifester dans les hémoprotéines comme l'hémoglobine, la myoglobine, les cytochromes et la catalase, ainsi que dans les éosinophiles.6,7 Cette activité peut être inhibée en incubant les échantillons avec le Peroxydase Block du kit Dako EnVision+ System, HRP pendant cinq minutes avant application de l’anticorps primaire. Les frottis sanguins et médullaires, ainsi que les coupes de tissus congelés, peuvent également être traités en utilisant ce réactif. Cependant, cette procédure n'élimine pas la pigmentation rouge brunâtre des hémoprotéines. Il est également possible d’utiliser une solution de méthanol-peroxyde d’hydrogène. Certains antigènes peuvent être dénaturés au cours de cette procédure.

Les tissus de patients infectés par le virus de l’hépatite B et porteurs de l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort.8

Des sérums normaux/non immuns provenant du même animal que les antisérums secondaires utilisés dans les étapes de blocage peuvent générer des faux négatifs ou des faux positifs du fait des auto-anticorps ou des anticorps naturels.

Les réactifs fournis dans ce kit sont dilués de manière optimale Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de détection des antigènes.

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Dépannage

Problème Cause probable Action recommandée 1. Coloration

d’aucune lame.

1a. Les réactifs n’ont pas été utilisés dans l’ordre.

1a. Revoir l’application des réactifs.

1b. Azide de sodium dans un bain de tampon.

1b. Utiliser un nouveau tampon sans azide.

2. Coloration faible de toutes les lames.

2a. Les coupes conservent trop de solution après un bain de lavage.

2a. Tapoter doucement pour éliminer l’excès de solution avant d’essuyer autour des coupes.

2b. Les lames ne sont pas incubées assez longtemps avec les anticorps ou le substrat.

2b. Revoir les temps d’incubation recommandés.

3. Bruit de fond excessif sur toutes les lames.

3a. Les échantillons présentent une forte activité peroxydasique endogène.

3a. Prolonger le temps d’incubation de l’agent bloquant de la peroxydase.

3b. La paraffine n’a pas été complètement enlevée.

3b. Utiliser de nouveaux bains de xylène ou de toluène. Si plusieurs lames se colorent en même temps, le second bain de xylène doit contenir du xylène fraîchement renouvelé.

3c. Les lames ne sont pas bien rincées.

3c. Utiliser des nouvelles solutions dans les bains de tampon et les flacons de lavage. Utiliser le TBST comme tampon de lavage.

3d. La réaction du substrat est plus rapide que la normale du fait, par exemple, d’une température ambiante trop élevée.

3d. Raccourcir le temps d’incubation avec la solution de substrat chromogène.

3e. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration.

3e. Utiliser une chambre humide. Essuyer seulement trois à quatre lames en même temps avant d’appliquer le réactif.

3f. Liaison non spécifique des réactifs aux coupes de tissus.

3f. Appliquer une solution de blocage contenant une protéine non pertinente.

3g. Anticorps trop concentré. 3g. Utiliser une dilution plus élevée de l’anticorps primaire.

REMARQUE : Si le problème ne peut pas être attribué à l’une des causes mentionnées ci-avant, ou si l’action corrective échoue, appeler l’assistance technique de Dako pour obtenir de l’aide. Plus d’informations sur les techniques de coloration et la préparation des échantillons sont disponibles dans les ouvrages Handbook - Immunochemical Staining Methods9 (disponible auprès de Dako), Atlas of Immunohistology10 et Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.11

Deutsch

Code K4008 Code K4009 Gebrauchsfertig

Verwendungszweck

Zur In-vitro Diagnostik. Diese Anweisungen gelten für das Dako EnVision®+ System, Peroxidase (Dako EnVision+ System, HRP). Dieses Kit dient zur qualitativen Identifizierung von Antigenen in normalen und pathologischen paraffineingebetteten Geweben, Gefriergeweben und Zellpräparaten durch Lichtmikroskopie unter Verwendung von vom Anwender bereitgestellten primären Kaninchen-Antikörpern. Es können Gewebe verwendet werden, die mit unterschiedlichen Fixiermitteln wie Ethanol, Bouin-Lösung, Zink-Formalin und neutralem gepuffertem Formalin behandelt wurden.

Zusammenfassung und Erklärung

Das Dako EnVision+ System, HRP ist ein aus zwei Schritten bestehendes Färbeverfahren. Das System beruht auf einem HRP-markierten Polymer, das an sekundäre Antikörper konjugiert ist. Das markierte Polymer enthält kein Avidin oder Biotin. Deshalb werden unspezifische Färbungen aus endogenen Avidin-Biotin-Aktivitäten in der Leber, Niere, im Lymphgewebe und in Gefrierschnitten eliminiert oder bedeutend abgeschwächt. Alle im Dako EnVision+ System, HRP mit AEC+-Substrat enthaltenen Reagenzien sind gebrauchsfertig. Dieses System ist äußerst empfindlich, daher sind optimale Verdünnungen des primären Antikörpers bis zu 20 mal höher als Verdünnungen, die für herkömmliche PAP-Verfahren verwendet werden, und um mehrere Male höher als die herkömmlichen ABC-oder LSAB-Verfahren. Dieses Verfahren bietet eine verbesserte Signalerzeugung, um Antigene in geringen Konzentrationen oder in geringem primärem

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Antikörpertiter nachzuweisen. In Kaninchen erzeugte primäre Antikörper reagieren gut mit dem markierten Polymer. Die Auswertung vorhandener oder fehlender Färbungen sollte durch morphologische und histologische Untersuchungen mit entsprechenden Kontrollen ergänzt werden.

Verfahrensprinzip Endogene Peroxidase-Aktivität durch fünfminütige Inkubation der Probe mit dem Dako Peroxidase-Block unterdrücken. Die Probe wird dann mit einem gekennzeichneten und verdünnten primären Kaninchen-Antikörper und anschließend mit dem markierten Polymer in zwei aufeinanderfolgenden Inkubationen von jeweils 30 Minuten inkubiert. Bei Antikörpern, die eine Enzymandauung oder eine Demaskierung erfordern, kann die erforderliche Inkubationszeit des primären Antikörpers und des markierten Polymers um 5 bis 10 Minuten verlängert werden. Die Färbung wird mit einer Inkubation von 5–30 Minuten mit einem 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC)+ Substrat-Chromogen abgeschlossen, was zu einem rotgefärbten Präzipitat an der Antigenstelle führt. (AEC ist potenziell karzinogen, siehe Abschnitt Vorsichtsmaßnahmen).

Mitgelieferte Reagenzien

Code K4008 Die folgenden Materialien sind in diesem Kit enthalten und reichen für 150 Gewebeschnitte, berechnet für 100 µl pro Schnitt.

Menge Beschreibung 1 x 15 ml Peroxidase Block (Peroxidase-Block)

0,03 % Wasserstoffperoxid, enthält Natriumazid.

1 x 15 ml Labelled Polymer (Markiertes Polymer)

Mit Peroxidase markiertes Polymer, konjugiert mit Anti-Kaninchen-Immunoglobulinen (Ziege) in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisierungsproteinen und einem antimikrobiellen Wirkstoff.

1 x 15 ml AEC+ Substrate Chromogen (AEC+-Substrat-Chromogen)

3-Amino-9-Ethylcarbazol mit Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Verstärker und einem antimikrobiellen Wirkstoff. Bei 2–8 °C aufbewahren.

Code K4009

Die folgenden Materialien sind in diesem Kit enthalten und reichen für 1100 Gewebeschnitte, berechnet für 100 µl pro Schnitt.

Menge Beschreibung 1 x 110 ml Peroxidase Block (Peroxidase-Block)

0,03 % Wasserstoffperoxid, enthält Natriumazid.

1 x 110 ml Labelled Polymer (Markiertes Polymer)

Mit Peroxidase markiertes Polymer, konjugiert mit Anti-Kaninchen-Immunoglobulinen (Ziege) in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisierungsproteinen und einem antimikrobiellen Wirkstoff.

1 x 110 ml AEC+ Substrate-Chromogen (AEC+-Substrat-Chromogen)

3-Amino-9-Ethylcarbazol mit Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Verstärker und einem antimikrobiellen Wirkstoff. Bei 2–8 °C aufbewahren.

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Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien

Absorbierende Tücher Kontrollgewebe, positiv und negativ Gegenfärbung; wässrig, wie Mayer-Hämatoxylin oder Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (Code S3309) Deckgläser Destilliertes Wasser Ethanol, absolut und 95 % Lichtmikroskop (20x–800x) Fixiermittel, wie Glycergel® Mounting Medium (Code C0563) oder Faramount, Aqueous Mounting Medium, gebrauchsfertig (Code S3025) oder nichtwässriges permanentes Fixiermittel, Ultramount (Code S1964) Primäre Antikörper und negatives Kontrollreagenz Objektträger, Poly-L-Lysin beschichtet oder Silanized Slides (Code S3003) Färbeschalen oder -bäder Zeitmesser (muss Intervalle von 3–40 Minuten anzeigen können) Waschflaschen Waschpufferlösung Xylol, Toluol oder Xylolersatz Optionale Materialien Ammoniumhydroxid, 15 mol/L, verdünnt auf 0,037 mol/L PAP Pen (Code S2002)

Vorsichtsmaßnahmen

1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Bei

Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, können Ansammlungen von NaN3 mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach deren Entsorgung stets mit viel Wasser nachspülen, um Ansammlungen von Aziden in den Leitungen vorzubeugen.1,2

3. Das AEC+-Substrat-Chromogen reagiert empfindlich auf Verunreinigungen durch verschiedene oxidierende Mittel wie Metalle, Bakterien, Staub und gewöhnliche Laborglasbehälter. Um Verunreinigungen und einen frühzeitigen Verfall zu vermeiden, Kontakt der AEC+-Lösung mit möglichen Verunreinigungsquellen vermeiden und nie direkt aus der Flasche pipettieren. Erforderliche Menge in sauberen Behälter gießen und aus diesem pipettieren. Überschüssige AEC+-Lösung nicht in Aufbewahrungsbehälter zurückgießen.

4. Reagenzien dürfen nach Ablauf des für diese Aufbewahrungsmethode angegebenen Verfalldatums nicht mehr verwendet werden. Werden die Reagenzien nicht gemäß den in der Packungsbeilage angegebenen Bedingungen aufbewahrt, muss deren Verwendung vom Anwender validiert werden.

5. Keine Reagenzien aus anderen Chargen oder aus Kits anderer Hersteller verwenden. 6. Zu starke Lichteinstrahlung kann für Enzyme und Substrat-Chromogene schädlich sein. Keine

Komponenten des Kits bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie z. B. direktem Sonnenlicht, vornehmen.

7. Andere als die angegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen; solche Abänderungen müssen vom Anwender bestätigt werden.

8. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs muss auch dieses entsprechend gehandhabt werden. 9. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 10. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, staatlichen und bundesstaatlichen Richtlinien zu

entsorgen. 11. Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich.

Gefahr AEC+ Substrate Chromogen: 5-10% Polyethylene glycol, 1-5% N-Methyl-2-pyrrolidone, 0.1-1% Acetic acid, 0.1-1% 3-amino-9-ethyl carbazole H320 Verursacht Augenreizungen. H350 Kann Krebs erzeugen. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P202 Vor Gebrauch alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. P281 Vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung verwenden. P280 Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P308 + P313 BEI Exposition oder falls betroffen Ärztliche Hilfe anfordern. P305 + P351 + P338

BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.

P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und internationalen

Vorschriften der Entsorgung zuführen.

Aufbewahrung Reagenzien des Dako EnVision+ Systems, HRP bei 2–8 °C aufbewahren. Nicht einfrieren. Nicht nach Ablauf des auf den Reagenzgläsern oder Kit-Etiketten aufgedruckten Datums verwenden.

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Veränderungen der Reagenzien wie z. B. Präzipitate deuten auf Instabilität oder Produktzerfall hin. In solchen Fällen das Reagenz/die Reagenzien nicht mehr verwenden. Bei Temperaturen von über 8 °C ist die AEC+-Substrat-Chromogen-Lösung instabil. AEC+-Substrat-Chromogen-Lösung im empfohlenen Temperaturbereich von 2–8 °C aufbewahren. Diese Lösung muss sofort nach Entnahme aus dem Kühlschrank verwendet werden. Nach Verwendung so schnell wie möglich in den Kühlschrank (2–8 °C) zurückstellen. Es gibt keine Anzeichen, die auf eine Produktinstabilität hinweisen. Deshalb sollten die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit Patientenproben getestet werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht aus Unterschieden bei Laborverfahren erklären lässt und auf ein Problem mit dem Kit hindeutet, muss der technische Kundendienst von Dako verständigt werden

Vorbereitung der Reagenzien

Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen. Waschpufferlösung TBST, 0,05 mol/L Tris Buffered Saline with Tween (Code S3006) ist der empfohlene Waschpuffer für den automatischen und manuellen IHC-Nachweis. TBS, 0,05 mol/L Tris Buffered Saline (Code S1968) und PBS, 0,02 mol/L Phosphate Buffered Saline (Code S3024) eignen sich ebenfalls als Waschpufferlösungen für manuelles Färben. Waschpufferlösungen mit Natriumazid werden nicht empfohlen. Natriumazid inaktiviert die Meerrettichperoxidase (HRP) und führt zu einer negativen Färbung. Getrübten Puffer entsorgen. Peroxidase-Block, Substrat und Gegenfarbstoff können mit destilliertem Wasser gespült werden. Primärer Antikörper Die gebrauchsfertigen Antikörper der Serie NP „Plus“ sind optimal und werden für die Verwendung mit den Dako „Plus“ Detektionssystemen mit hoher Sensitivität empfohlen. Konzentrierte Antikörper sind ebenfalls von Dako erhältlich. Die konzentrierten Antikörper müssen im jeweiligen Labor optimiert werden. Verdünnungen sollten mit Antibody Diluent (Code S0809) oder einem Verdünnungsmittel mit 0,05 mol/L Tris-HCI-Puffer mit 1 % Rinderserum-Albumin (BSA) zubereitet werden. Die gebrauchsfertigen Dako Antikörper der Serie N sind nicht für die Verwendung mit dem Dako „Plus“ Detektionssystem optimiert. Negativkontrolle Bei Verwendung der gebrauchsfertigen Dako Antikörper der Serie NP werden Universal Negative Control(s)+ als Negativkontrollen empfohlen. Diese Kontrollen sind für gebrauchsfertige Antikörper von Mouse (Code NP015) oder Rabbit (Code NP001) der Serie NP „Plus“ optimiert. Gegenfärbung Das gefärbte Endprodukt der Färbereaktion ist alkohollöslich und sollte nur mit wässrigen Gegenfarbstoffen wie Mayer-Hämatoxylin oder Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (Code S3309) verwendet werden. Objektträger nach der Gegenfärbung mit Hämatoxylin gründlich in destilliertem Wasser spülen, dann in ein Bad mit 0,037 mol/L Ammoniak oder ähnlichem Bläuungsmittel tauchen. 0,037 mol/L Ammoniakwasser wird durch Mischen von 2,5 ml konzentriertem (15 mol/L) Ammoniumhydroxid mit 1 Liter Wasser zubereitet. Nicht verwendete 0,037 mol/L Ammoniaklösung kann bei Raumtemperatur (20–25 °C) in einer gut verschlossenen Flasche bis zu 12 Monate lang aufbewahrt werden. Für alternative Färbeverfahren die Herstellerrichtlinien zu Rate ziehen. Fixiermittel Zur wässrigen Fixierung werden Glycergel Mounting Medium (Code C0563) oder Faramount, Aqueous Mounting Medium, gebrauchsfertig (Code S3025) empfohlen. Glycergel muss vor Verwendung auf mindestens 50 °C erhitzt werden. Es kann auch ein nicht-wässriges permanentes Fixiermittel (Ultramount Code S1964) verwendet werden.

Vorbereitung der Probe

Vor der IHC-Färbung muss das Gewebe fixiert und verarbeitet werden. Eine Fixierung schützt vor Autolyse und Zerfall des exzidierten Gewebes, erhält die Antigenität, verstärkt den Refraktionsindex der Gewebeteile und steigert die Resistenz der Zellelemente gegen Gewebeverarbeitung. Zur Gewebeverarbeitung gehört Dehydrierung, Abscheidung von Dehydrierungsmitteln, Infiltration des Einbettungsmediums, Einbetten und Schneiden des Gewebes. Die am häufigsten verwendeten Fixiermittel für IHC-Gewebepräparate werden unter „General Instructions for Immunohistochemistry“ angeführt. Diese Angaben sind nur Richtlinien. Optimale Verfahren müssen vom Anwender bestimmt und überprüft werden.

Färbeverfahren

Hinweise Vor der Verwendung sollte der Anwender diese Anweisungen sorgfältig durchlesen und sich mit dem Inhalt des Kits vertraut machen.

Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationszeiten können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.

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Vor der Immunofärbung sollten der Peroxidase-Block und das markierte Polymer auf Raumtemperatur (20–25 °C) equilibriert werden. Alle Inkubationen sollten ebenfalls bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Der Einfachheit halber kann das AEC+-Substrat-Reagenz gleich nach Entnahme aus dem Kühlschrank verwendet werden und muss vor der Verwendung nicht auf Raumtemperatur gebracht werden. Nach Verwendung wieder bei 2–8 °C aufbewahren. Durch Aufbewahrung des AEC+-Substrat-Chromogens bei Temperaturen von über 8 °C wird die Stabilität beeinträchtigt.

Gewebeschnitte dürfen während der Färbung nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können häufig unspezifische Färbungen aufweisen. Dem Luftzug ausgesetzte Objektträger abdecken. Falls längere Inkubationszeiten erforderlich sind, die Gewebe in eine feuchte Umgebung stellen.

Die Sensitivität des Dako EnVision+ Systems, HRP kann weiter gesteigert werden, indem die Inkubationszeiten der Schritte 2 und 3 um 5–10 Minuten verlängert werden.

Färbeprotokoll SCHRITT 1 PEROXIDASE-BLOCK

Überschüssigen Puffer abschütteln. Mit einem flusenfreien Tuch (z.B. Kimwipe oder Gaze) sorgfältig den Bereich um die Probe herum abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen und um das Reagenz an der vorgesehenen Stelle zu behalten.

Genügend Peroxidase-Block zugeben, um die Probe zu bedecken. 5 (±1) Minuten inkubieren.

Mit destilliertem Wasser oder Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) gründlich spülen und in ein frisches Pufferbad legen.

SCHRITT 2 PRIMÄRER ANTIKÖRPER ODER NEGATIVKONTROLLE Überschüssigen Puffer abschütteln und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend optimal verdünnten primären Antikörper oder Negativkontrolle zugeben, um die Probe abzudecken. 30 (±1) Minuten inkubieren.

Mit Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) gründlich spülen und in ein frisches Pufferbad legen. Falls das Färbeverfahren unterbrochen werden muss, können Objektträger nach der Inkubation des primären Antikörpers (Schritt 2) bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur (20–25 °C) in einem Pufferbad belassen werden, ohne dass die Färbung beeinträchtigt wird.

SCHRITT 3 MIT PEROXIDASE MARKIERTES POLYMER Überschüssigen Puffer abschütteln und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend markiertes Polymer zugeben, um die Probe zu bedecken. 30 (±1) Minuten inkubieren. Objektträger wie im Schritt 2 spülen.

SCHRITT 4 SUBSTRAT-CHROMOGEN Objektträger wie zuvor abwischen.

Genügend gebrauchsfertige AEC+-Substrat-Chromogen-Lösung zugeben, um die Probe zu bedecken.

5–30 Minuten inkubieren. Mit destilliertem Wasser aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) gründlich spülen. Abfallprodukte des Substrat-Chromogens in einem Sondermüllbehälter auffangen und entsprechend entsorgen.

SCHRITT 5 GEGENFÄRBUNG MIT HÄMATOXYLIN (optional) Objektträger in ein Bad mit Aqueous Hematoxylin (Code S3309) eintauchen. Inkubationsdauer hängt von der Stärke der verwendeten Hämatoxylinlösung ab.

Vorsichtig in einem Bad mit destilliertem Wasser spülen. Objektträger zehnmal in ein Bad mit 0,037 mol/L Ammoniak oder ähnlichem Bläuungsmittel tauchen. Objektträger 2–5 Minuten in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen.

SCHRITT 6 FIXIERUNG

Proben können mit einem wässrigen Fixiermittel wie Glycergel Mounting Medium (Code C0563) oder Faramount (Code S3025) oder einem nicht-wässrigen permanenten Fixiermittel wie Ultramount (Code S1964) fixiert und abgedeckt werden.

Hinweis: Das AEC-Reaktionsprodukt ist in organischen Lösungsmitteln löslich und ist deshalb mit permanenten Fixiermitteln auf Toluol- oder Xylolbasis nicht kompatibel.

Hinweis: Objektträger können zu einem beliebigen Zeitpunkt abgelesen werden. Es kann jedoch zu einem Verblassen kommen, wenn die Objektträger mehr als eine Woche lang starker Lichteinwirkung ausgesetzt sind. Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur (20–25 °C) aufbewahren, um Verblassen zu vermeiden.

Qualitätskontrolle

Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und technischen Verfahren im Labor des Anwenders können zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führen, daher müssen zusätzlich zu den folgenden Verfahren regelmäßige Leistungskontrollen im Labor durchgeführt werden. Weitere Informationen siehe Richtlinien zur Qualitätskontrolle des College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry

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und Literaturhinweise 3 bis 5. Weitere Angaben zu Sicherheit und Immunreaktivität sind dem Sicherheitsdatenblatt jedes verwendeten primären Antikörpers zu entnehmen.

Weitere Informationen über Positiv- und Negativkontrollen siehe „General Instructions for Immunohistochemical Staining“.

Auswertung der Färbung

Richtlinien zur Auswertung siehe „General Instructions for Immunohistochemical Staining“.

Allgemeine Beschränkungen

Allgemeine Beschränkungen siehe „General Instructions for Immunohistochemical Staining“.

Produktspezifische Beschränkungen

Gewebefärbungen hängen von der sachgemäßen Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor der Färbung ab. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen, Schneiden oder Verunreinigung durch andere Gewebe oder Flüssigkeiten kann zu Artefakten, Antikörper-Trapping oder falsch negativen Ergebnissen führen. Alte oder nicht gepufferte Fixiermittel oder Einwirkung von hohen Temperaturen auf das Gewebe (höher als 60 °C) während des Verfahrens können zu einer verringerten Sensitivität der Färbung führen.

In Hämoproteinen wie Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom und Katalase sowie in eosinophilen Zellen kann endogene Peroxidase-Aktivität oder Pseudoperoxidase-Aktivität auftreten.6,7 Diese Wirkungen können vermieden werden, indem Proben vor Zugabe des primären Antikörpers fünf Minuten mit Peroxidase-Block des Dako EnVision+ Systems, HRP inkubiert werden. Blut- und Knochenmarkabstriche und gefrorenes Gewebe können ebenfalls mit diesem Reagenz behandelt werden. Dieses Verfahren hebt jedoch die rot-braune Pigmentierung der Hämoproteine nicht auf. Als Alternative kann eine Methanol-Wasserstoffperoxidlösung verwendet werden. Einige Antigene können bei diesem Verfahren denaturiert werden.

Gewebe von mit dem Hepatitis-B-Virus infizierten Personen und Gewebe mit Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase eine unspezifische Färbung aufweisen.8

Normale/nichtimmune Sera desselben tierischen Ursprungs wie die in den Blockierungsschritten verwendeten sekundären Antisera können durch Auto-Antikörper oder natürliche Antikörper zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen.

Die in diesem Kit gelieferten Reagenzien wurden optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu vermindertem Antigennachweis führen.

Fehlersuche und -behebung

Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung

der Objektträger

1a. Reagenzien in falscher Reihenfolge verwendet.

1a. Anwendung der Reagenzien nachlesen

1b. Natriumazid im Pufferbad. 1b. Frischen azidfreien Puffer verwenden. 2. Schwache

Färbung aller Objektträger.

2a. Schnitte enthalten zu viel Lösung nach dem Waschbad.

2a. Überschüssige Lösung sorgfältig abschütteln, bevor um den Schnitt herum abgewischt wird.

2b. Objektträger nicht lange genug mit Antikörpern oder Substrat inkubiert.

2b. Empfohlene Inkubationszeiten nachlesen.

3. Übermäßige Hintergrundfärbung aller Objektträger

3a. Proben weisen hohe endogene Peroxidase-Aktivität auf.

3a. Längere Inkubationszeit mit Peroxidase-Block verwenden.

3b. Paraffin nicht vollständig entfernt.

3b. Bäder mit frischem Xylol oder Toluol verwenden. Wenn mehrere Objektträger gleichzeitig gefärbt werden, sollte das zweite Xylol-Bad frisches Xylol enthalten.

3c. Objektträger nicht ordnungsgemäß gespült.

3c. In Puffer-Bädern und Waschflaschen frische Lösungen verwenden. TBST als Waschpuffer verwenden.

3d. Schnellere als normale Substratreaktion z.B. wegen zu hoher Raumtemperatur

3d. Kürzere Inkubationszeit für Substrat-Chromogen-Lösung verwenden

3e. Schnitte trockneten während der Färbung aus.

3e. Feuchte Kammer verwenden. Nur drei bis vier Objektträger auf einmal abwischen, bevor das Reagenz zugegeben wird.

3f. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebeschnitte.

3f. Block-Lösung mit irrelevantem Protein zugeben.

3g. Zu stark konzentrierter Antikörper.

3g. Höhere Verdünnung des primären Antikörpers verwenden.

HINWEIS: Falls das Problem keiner der oben genannten Ursachen zugewiesen werden kann oder wenn die vorgeschlagene Maßnahme das Problem nicht behebt, bitte den technischen Kundendienst von Dako verständigen.

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Weitere Informationen zu Färbetechniken und Probenvorbereitung sind in den folgenden Werken enthalten: Handbook - Immunochemical Staining Methods9 (erhältlich von Dako), Atlas of Immunohistology10 und Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.11

References Bibliographie Literaturangaben

1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976

2. Centers for Disease Control Manual Guide - Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. “Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts.” April 30, 1976

3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and

definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control.

Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells.

J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago:

Amer Soc of Clin Pathol Press 1990:46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen:

A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Naish SJ (ed). Handbook - immunochemical staining methods. Carpinteria: DAKO Corporation 1989 10. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 11. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis.

Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986

Additional references Bibliographie supplémentaire Zusätzliche Literaturangaben

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