8/2/2019 D-Orn D-Arg plant

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 9 0 ) 9 4 , 6 7 - 7 00 0 3 2 - 0 8 8 9 / 9 0 / 9 4 / 0 0 6 7 / 0 4 / $ 0 1 . 0 0 / 0 R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n M a r c h 1 2 , 1 9 9 0A c c e p t e d May 1 , 1 9 9 0

A H i g h e r P l a n t Enzyme E x h i b i t i n g B r o a d A c c e p t a n c e o fS t e r e o i s o m e r s 'D e n i s e K a v a n a u g h , M i l a n A . B e r g e , a n d G e r a l d A . R o s e n t h a l *

T h e G r a d u a t e C e n t e r f o r T o x i c o l o g y ( D . K . , M . A . B . , G . A . R . ) , a n d T h e T . H . M o r g a n S c h o o l o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s( G . A . R . ) , U n i v e r s i t y o f K e n t u c k y , L e x i n g t o n , K e n t u c k y 4 0 5 0 6ABSTRACT

An a r g i n a s e , p u r i f i e d f r o m t h e l e a f o f t he j a ck b e a n , C a n a v a l i ae n s i f o r m i s , c a n e f f e c t i v e l y h y d r o l y z e b o t h L - a n d D - a r g i n i n e . A r -g i n a s e s , e x a m i n e d f r o m a n u m b e r o f o t h e r p l a n t a n d a n i m a ls o u r c e s , e x h i b i t m a r k e d s u b s t r a t e s t e r e o s p e c i f i c i t y a n d f a i l t oc a t a b o l i z e D - a r g i n i n e . I n o r d e r t o p r o v i d e e s s e n t i a l n i t r o g e n , j a c kb e a n l e a f a r g i n a s e a l s o c a t a b o l i z e s L - c a n a v a n i n e , a n a r g i n i n ea n a l o g t h a t i s a p r e d o m i n a n t n i t r o g e n - s t o r i n g m e t a b o l i t e o f t h i sl e g u m e . T h e a b i l i t y o f a r g i n a s e t o m e t a b o l i z e b o t h s t e r e o i s o m e r so f a r g i n i n e may r e s u l t f r o m t h e r e q u i r e m e n t f o r t h i s enzyme t oe x h i b i t l i m i t e d s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y i n o r d e r t o h y d r o l y z e b o t ha r g i n i n e a n d c a n a v e n i n e .

r a c e m a s e a b l e t o p r o d u c e t h e L - i s o m e r f r o m t h e D - i s o m e rp r i o r t o h y d r o l y s i s o f t h e n e w l y f o r m e d L - c a n a v a n i n e b ya r g i n a s e . A l t e r n a t i v e l y , t h e p l a n t ma y p r o d u c e a h i g h l y u n -u s u a l a r g i n a s e a b l e t o u s e t h e D - i s o m e r o f c a n a v a n i n e a s as u b s t r a t e . O u r s e a r c h o f t h e r e l e v a n t l i t e r a t u r e f a i l e d t o f i n da n e x a m p l e o f a h i g h e r p l a n t e n z y m e t h a t f u n c t i o n s i n t h em e t a b o l i s m o f t h e L - i s o m e r o f a n a m i n o a c i d t h a t i s a l s o a b l et o u s e e f f e c t i v e l y t h e c o r r e s p o n d i n g D - i s o m e r . I n a r e v i e w o fD - a m i n o a c i d s , R o b i n s o n ( 9 ) r e p o r t e d t h e o c c u r r e n c e o f D -a m i n o a c i d s i n h i g h e r p l a n t s . He p r o p o s e d , h o w e v e r , t h a t t h e yw e r e f o r m e d e i t h e r b y r a c e m i z a t i o n o f t h e L - f o r m o r b ye n z y m e s s p e c i f i c f o r t h e D - a m i n o a c i d . R e s o l u t i o n o f t h ea b o v e t w o p o s s i b i l i t i e s i n s t i g a t e d t h i s i n v e s t i g a t i o n .

T h e n o n p r o t e i n a m i n o a c i d , L - c a n a v a n i n e , L - 2 - a m i n o - 4 -( g u a n i d i n o o x y ) b u t y r i c a c i d , i s a n a t u r a l l y o c c u r r i n g , p o t e n ta n t i m e t a b o l i t e o f L - a r g i n i n e .H 2 N - C - ( N H 2 ) = N - O - C H 2 - C H 2 - C H ( N H 2 ) C O O HL - C a n a v a n i n e

C a n a v a n i n e c a n e l i c i t d e l e t e r i o u s e f f e c t s i n a w i d e s p e c t r u mo f l i v i n g s y s t e m s , p a r t i c u l a r l y i n s e c t s ( 1 1 ) . R e c e n t l y , we s o u g h tt o a s s e s s t h e a n t i m e t a b o l i c p r o p e r t i e s o f t h e D - e n a n t i o m e r o ft h i s n o n p r o t e i n a m i n o a c i d . To o b t a i n t h e r e q u i r e d com-p o u n d , we f i r s t s y n t h e s i z e d D L - c a n a v a n i n e f r o m D L - h o m o s e r -i n e ( 7 ) . We p l a n n e d t o e m p l o y p a r t i a l l y p u r i f i e d a r g i n a s e ( E C3 . 5 . 3 . 1 ) , d e r i v e d f r o m l e a v e s o f t h e j a c k b e a n p l a n t , C a n a v a l i ae n s i f o r m i s , t o h y d r o l y z e L - c a n a v a n i n e t o L - c a n a l i n e a n d u r e a ,a n d t h e r e a f t e r i s o l a t e w h a t we e x p e c t e d t o b e u n r e a c t e d D -c a n a v a n i n e .H 2 N - C - ( N H 2 ) = N - O - C H 2 - C H 2 - C H ( N H 2 ) C O O H -L - C a n a v a n i n eH 2 N - O - C H 2 - C H 2 - C H ( N H 2 ) C O O H

+ L - C a n a l i n eH 2 N - C ( = O ) - N H 2U r e aH o w e v e r , r e a c t i o n o f D L - c a n a v a n i n e w i t h t h i s a r g i n a s ep r e p a r a t i o n d e s t r o y e d b o t h c a n a v a n i n e e n a n t i o m e r s . T h i ss u r p r i s i n g f i n d i n g ma y r e s u l t f r o m t h e p r e s e n c e o f a p l a n tT h e a u t h o r s a c k n o w l e d g e g r a t e f u l l y s u p p o r t b y t h e N a t i o n a lS c i e n c e F o u n d a t i o n ( D C B - 8 9 0 1 7 4 9 ) , N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t hB i o m e d i c a l R e s e a r c h G r a n t ( 2 - S 0 7 - R R O 7 1 1 4 - 2 1 ) , t h e G r a d u a t eS c h o o l o f t h e U n i v e r s i t y o f K e n t u c k y , a n d t h e D e p a r t m e n t o f E d u -c a i t o n M i n o r i t y P a r t i c i p a t i o n i n G r a d u a t e E d u c a t i o n P r o g r a m .

MATERIALS AND MET HODSM a t e r i a l s

L - C a n a v a n i n e w a s p r e p a r e d f r o m a c e t o n e - d e f a t t e d j a c kb e a n s e e d s ( C a n a v a l i a e n s i f o r m i s ) ( 1 3 ) . A l l o t h e r b i o c h e m i c a l sw e r e p u rc h a s e d f r om S i g m a C h e m i c a l C o .Enzyme A s s a yA r g i n a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d i n d u p l i c a t e b y m e a s u ri n gt h e f o r m a t i o n o f D - o r L - o r n i t h i n e f r o m D - o r L - a r g i n i n e . T h ee n z y m e ( 0 . 5 m L ) w a s m e t a l - a c t i v a t e d a t 3 7 C f o r 1 5 m i n i nt h e p r e s e n c e o f 1 . 0 mM M n C l 2 , 1 mM d i t h i o t h r e i t o l , a n d 1 0 0mm p o t a s s i u m g l y c l y g l y c i n e ( p H 9 . 7 ) w h e n a r g i n i n e s e r v e da s t h e s u b s t r a t e , o r 1 0 0 mm s o d i u m N - t r i s ( h y d r o x y -m e t h y l ) m e t h y l g l y c i n e [ t r i c i n e ] w h e n c a n a v a n i n e w a s t h es u b s t r a t e . T h e a p p r o p r i a t e s u b s t r a t e ( 0 . 5 mL) w a s a d d e d t oi n i t i a t e t h e e n z y m e a s s a y a n d a f t e r 1 5 m i n f o r L - a r g i n i n e o r4 5 m i n f o r D - a r g i n i n e o r L - c a n a v a n i n e , t h e r e a c t i o n w a st e r m i n a t e d .C o l o r i m e t r i c A s s a y sWhen o r n i t h i n e f o r m a t i o n f r o m a r g i n i n e w a s e v a l u a t e d ,t h e r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d w i t h 2 mL o f 5% ( w / v ) t r i c h l o -r o a c e t i c a c i d . O r n i t h i n e f o r m a t i o n w a s d e t e r m i n e d c o l o r i -m e t r i c a l l y i n t r i p l i c a t e b y t h e m e t h o d o f C h i n a r d ( 2 ) . Whenc a n a l i n e f o r m a t i o n f r o m c a n a v a n i n e w a s d e t e r m i n e d , t h er e a c t i o n w a s s t op p e d w i t h 1 mL o f 27% ( v / v ) p e r c h l o r i c a c i df o l l o w e d b y 1 mL o f 3 . 3 N KOH. P o t a s s i u m p e r c h l o r a t e w a sr e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n p r i o r t o d e t e r m i n i n g t h e c a n a l i n e

c o n t e n t b y t h e m e t h o d o f R o s e n t h a l ( 1 2 ) . P r o t e i n w a s d e t e r -m i n e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y ( 5 ) e m p l o y i n g b o v i n e s e r u ma l b u m i n a s t h e s t a n d a r d .6 7

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P l a n t P h y s i o l . V o l . 9 4 , 1 9 9 0

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