Curso Basico Hplc v.08

Curso Básico de Cromatografía de Líquidos

de Alta ResoluciónHPLC

(High Pressure Liquid Chromatography)(High Performance Liquid

Chromatography)(High Priced Liquid Chromatography!!!!)

BUAP-CUV Sep.,12, 2008

22

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución

33

Definición.

Cromatografía es una técnica analítica basada en la separación parcial o total de los componentes de una mezcla como consecuencia de su migración diferencial en un sistema dinámico formado por una fase estacionaria y una fase móvil.

44

Inyección Migración Elución

Separación de los componentes de una muestra

Fase móvil

Proceso de separación cromatográfica

Fase estacionaria

Mezcla

55

Etimología

El botánico ruso Mikhail Semyonovich

Tswett (1872-1920), es conocido como el

“padre de la cromatografía”, como

resultado de sus experimentos en los

cuales usó columnas tipo gis “chalk” para

separar pigmentos extraídos de hojas.

Tswet presentó los principios básicos de

su método de separación en 1902,

después publicó dos artículos en 1906

en los cuales llamó al método

cromatografía.

66

Clasificación

De acuerdo a la naturaleza de la fase móvil, la cromatografía se clasifica en :

CROMATOGRAFIA DE GASES (Gas)

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (Líquido)

En ambos casos , la fase estacionaria se encuentra contenida en una tubería llamada COLUMNA.

77

Cromatografía

LSC

Partición (Reparto)

Exclusión portamaño.

Intercambio iónico.

GSC

Empacada

Capilar

GLC

Empacada

Capilar

Clasificación

88

Mecanismos de Separación

INTERCAMBIO IÓNICO

EXCLUSIÓN

PARTICIÓNXm

S ADSORCION

99

Aplicaciones Generales

Forense

Agropecuaria

Alimentos y Bebidas

Ambiental y Forestal

Farmacéutica

ClínicaBioquimica Polímeros

1010

Aplicaciones Generales

Insecticidas: carbamatos, organofosforados

Fungicidas: benzimidazoles, carbamatos

Herbicidas y reguladores del crecimiento: ureas,

fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)

Aflatoxinas: B1, B2, G1, G2

Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO)

Acidos Fenólicos, Carbohidratos

Proteínas, Aminoácidos

Antocianinas

Vitaminas Liposolubles e Hidrosolubles

Drogas de Abuso

Antibióticos,Esteroides,Analgésicos

1111

Sistema Cromatográfico,

FASE MÓVIL

BOMBAINYECTOR

CO

LU

MN

A

DETECTOR SISTEMA DE DATOS

1212

Proceso de separación cromatográfica

1313

Tiempo de Retención

to= tiempo muerto

tr= tiempo de retención absoluto

t´r= tiempo de retención relativo

tR

t´r= tr-to

´ < 20

1414

Factor de Capacidad

1515

Resolución (R)

• Mide la separación entre dos picos

• Considera la distancia y el ancho entre dos picos adyacentes

1616

Resolución (R)

R = ___( tr2-tr1)___

1/2(W1 + W2)

tr2,tr1= tiempos de retención de ambos picos

W1,W2= anchos de pico en la base

1717

Resolución (R)

Resolución vs Concentra-ción.•Para columnas nuevas es recomendable que R> 1.5

1818

Resolución (R)

La curva Gaussiana representa la distribución estadistica resultante de las moléculas en el espacio que ocupan

1919

Resolución (R)

Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:

La eficiencia de la columna es una función de la longitud de la columna y del tamaño y uniformidad de las partículas

2020

Resolución (R)

Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:

2121

• Mide los efectos de ensanchamiento de pico que se presentan cuando un componente migra a través de la columna

Eficiencia (N) [número de platos teóricos]

2222

Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP)

• La HETP relaciona la longitud de la columna con el número de platos teóricos.

• Valores de HETP más pequeños -> columna más eficiente.

2323


• La Ecuación de Van Deemter es una expresión teorica que define la eficiencia de la columna. Es la suma de los tres elementos que contribuyen al ensanchamiento de las bandas

2424


A = Difusión de Eddy

B = Difusión Longitudinal

C = Resistencia a la

transferencia de masa

µ = Flujo de fase móvil

2525

Eficiencia (N, Número de Platos teóricos )

• Número de veces que un componente presenta un estado de equilibrio entre las dos fases

• Se expresa cuantitativamente como el Número de Platos Teóricos

2626

Selectividad, α

• Selectividad es la medida de que una columna pueda distinguir entre dos componentes

Se ajusta al hacer cambios de fase móvil y fase estacionaria

2727

Resolución vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia

2828

Resolución vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia

• Rs = 0.8

• N = 7000

• α = 2.1

• .´~1

2929

Teória en práctica

• pico1 Tr=5.0

• pico2 Tr=6.2

• To=1.3

• W1=0.13

• W2=0.15

• L=25cm

• Calcular:.´, α, R, N y HETP

3030

Definiciones en Resumen

Eficiencia• Cuan estrechos son los picos

– Medida del desempeño de la columna/fase estacionaria

Factor de Capacidad• Cuan bien es retenido un compuesto

Selectividad• La retención relativa de 2 compuestos

Resolución• La separación relativa de 2 compuestos

• Evalua la separación en su totalidad

3131

Optimización de una Separación – Factor de Capacidad

Para optimizar el Factor de Capacidad:

Ajustar la fuerza del solvente

Cambiar la fase estacionaria (columna)

3232

Optimización de una Separación– Selectividad

Para optimizar la Selectividad (separación):

Cambiar la composición de la fase móvil

Usar aditivos en la fase móvil

Cambiar la fase estacionaria

Cambiar el pH y/o la temperatura

3333

Optimización de una Separación– Eficiencia

Para optimizar la eficiencia de la columna :Disminuir el tamaño de partícula

Emplear el flujo acorde al mínimo de la grafica HETP

Emplear un solvente menos viscoso

Incrementar la temperatura de la columna

Incrementar la uniformidad de la partícula

3434

II. Instrumentación

2.1 Fase móvil

2.2 Sistema de bombeo

2.3 Inyectores

2.4 Columnas

2.5 Detectores

3535

FASE MÓVIL

BOMBAINYECTOR

CO

LU

MN

A


SISTEMA CROMATOGRAFICO

3636

Preparación de la Fase Móvil

Seleccionando la Fase móvil correcta• La consideración principal al elegir un sistema de

solventes es seleccionar uno que separe adecuadamente los analitos. Además de la calidad en la separación, la fase móvil debe:

• No alterar la columna ni sus características

• Ser compatible con el detector

• Disolver la muestra

• Tener una viscosidad baja

• Permitir la recuperación fácil de la muestra, si es necesario.

• Ser de pureza elevada y no tóxico

• Ser comercialmente disponible a un precio razonable

2.1 Fase Móvil - Caracteristicas

3737

A) FILTRACIÓN

MEMBRANAS

Material

Tamaño de Poro

2.1 Fase Móvil - Preparación

3838

B) DESGASIFICACIÓN

Gas Inerte


He

Ultrasonido

Agitación y vacío

3939

B) DEGASIFICACIÓN


4040

C) PREMEZCLADO


Es recomendable medir los volumenes individuales y mezclarlos en un reservorio comun.

Cuando se mezclan solventes orgánicos con agua siempre se obtiene un V de mezcla negativo.

Para preparar MeOH/Agua 50/50, no se debe colocar 500 ml de metanol en el matraz aforado y añadir 500 ml de agua porque no serian suficientes para llevar al aforo.

4141

D) BUFFERS


Los buffers seran necesarios cuando se analicen muestras que contengan analitos ácidos o básicos.

Las concentraciones recomendadas son del orden de 10 a 20 mM; de ser necesaria una mayor concentración asegurarse que no se presente precipitación.

Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).

El pH debera ajustarse en el buffer acuoso (teniendo considerado la modificación del pH por el solvente orgánico).

4242

D) BUFFERS


Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).

4343

D) BUFFERS


4444

ACERO INOXIDABLE

PEEK

2.1 Fase Móvil – Mantenimiento Preventivo

P/N: 28-211524-00 SOLVENT BOTTLE FILTER 10 µM, TITANIUM

P/N: 27-180387-00 SOLVENT RESERVOIR FILTER, 10 UM, SS

4545

Pureza de disolventes

Verifique con los proveedores el rango apropiado de trabajo en UV de los disolventes

•El oxígeno disuelto incrementa la abs en la región del UV lejano.Esnecesario desgasificar para lograr alta sensibilidad en esta región.•La absorción del oxígeno causará drift y ruido. Depende de la temperatura

•Las sales de par iónico (TMA) pueden contener impurezas que absorben en la región UV. Usar de la más alta pureza

4646

Cuidados con disolventes

•Checar la compatibilidad de la columna con el disolvente.

•Dioxano y THF fácilmente se oxidan. Utilice antioxidantes (BHT) o purga continua con helio.

•Disolventes recién preparados. No almacene el agua en plásticos. Los aditivos pueden contaminar el agua.

•El agua debe ser esterilizada (¿?) y checar crecimiento microbiano

•Disolventes filtrados y desgasificados.

•THF, DMSO, DMF y CH2Cl2 se recomienda consultar guias OSHA.

4747


Filtración• Mantener los reservorios tapados.

Cuidados con disolventes

4848


Solventes para fase inversa• La mayoría de la LC por fase reversa utiliza agua

como el componente principal de la fase móvil

• El agua es el líquido polar más común

• Casi todos todos los compuestos, excepto los más polares o más iónicos, experimentan una fuerza hidrofóbica fuerte que los conduce a la fase estacionaria y causa su retención

• Se debe utilizar siempre agua grado hplc

Solventes

4949


Solventes para fase inversa• El ajuste de la concentración orgánica del modificador

B es el medio primario de cambiar la retención

• Los tres más comunes son acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano

Solventes

5050


Solventes para cromatografia de iones• La cromatografía en fase normal utiliza mezclas.

• utiliza un buffer acuoso a un pH que mantenga a los analitos con carga.

• Para los ácidos, el pH debe ser mayor a 5

• Para las bases, el pH debe ser menor a 5

• Mientras que la concentración del buffer aumenta, aumenta la fuerza solvente y la retención disminuye

• Se puede agregar solvente orgánico para cambiar la retención y la selectividad

• El metanol se elige generalmente porque proporciona una mejor solubilidad

Solventes

5151


Solventes para cromatografia de iones• El reactivo de par iónico es generalmente un ion de

cadena corta

• Para la separación de bases protonadas se utiliza el pentan sulfonato, hexan sulfonato, o el heptan sulfonato

• Para la separación de ácidos ionizados, se emplea el tetraetil-amonio o el tetrabutil-amonio

Solventes

5252


Programación de Solventes• Las condiciones a considerar cuando se elige la fuerza

óptima de fase móvil son resolución, duración del análisis y el factor de la capacidad

• La resolución debe siempre ser por lo menos 1.5 para análisis de cuantificación

• Tiempos de análisis más cortos pueden ser alcanzadas usando un solvente más fuerte para los picos suficientemente resueltos

• Una buena referencia es hacer que todos los picos se eluyan con con valores de k ' entre 1-20

Solventes

5353

SISTEMA CROMATOGRAFICO

FASE MÓVIL

BOMBAINYECTOR

CO

LU

MN

A


5454

2.1 Bombas

5555

Operar a presiones elevadas

Libre de pulsaciones

Inerte

Operar con gradiente de solventes

2.1 Bombas - Caracteristicas

5656

Acero inoxidable

Titanio

Safiro y rubí

Peek (poli eter eter cetona)

2.1 Bombas– Materiales de Construcción

5757

Objetivo de la Bomba

En la cromatografía clásica, la separación se realiza por efecto de la gravedad (Tamaño de partícula 50-100 micrometros, tiempo de separación de una a varias horas)

La disminución de tamaño de partícula como soporte de la fase estacionaria (3, 5 o10 micras) exige forzar al líquido a cruzar a través de la columna por medio de una bomba.

Las bombas comerciales basan su diseño en pistones reciprocantes

5858

Funcionamiento de la Bomba

Las bombas comerciales basan su diseño en pistones reciprocantes.

Succión de Solvente Entrega de Solvente

5959

FASE MÓVIL

FASE MÓVIL


6060

PISTÓN

SELLO DEL PISTÓN

VÁLVULA CHECK DE ENTRADA

VÁLVULA CHECK DE SALIDA


6161


6262

•El disolvente es entregado por la bomba con el pistón reciprocante.(10 μL/min -10 mL/min)

•El diseño del pistón con un control electrónico de su movimiento (stroke) proporciona un flujo ligeramente pulsante.

•Un damper reduce la pulsación del flujo.

•Una cámara de mezclado proporciona una homogenización de los disolventes atras del punto de inyeccion de la muestra.

•Un transductor de presión convierte la presión del sistema en una salida eléctrica que se despliega en la pantalla


6363


•El movimiento del pistón es controlado por la rotación de la leva (cam).

•Un ciclo completo en la bomba consiste del movimiento del pistón para llenar el cabezal, en el cual el pistón viaja en reversa (alejandose del cabezal de la bomba) y un movimiento de entrega , en la cual el pistón viaja en el sentido del cabezal de la bomba.

•Durante el movimiento de entrega, el disolvente es descargado a través de la vávula check.

•La rotación de la leva (cam) es determinado por un software de control del motor.

6464

Funcionamiento de la Bomba. Válvulas proporcionadoras

•El cabezal de la bomba soporta tres válvulas proporcionadoras.El módulo puede seleccionar cualquier combinación de las tres entradas.

•Las válvulas proporcionadoras admiten disolventes de los reservorios especificados durante la entrega de disolvente (fill stroke).

•Cada válvula es abierta por un electroiman energizado por un circuito lógico de acuerdo a la programación del disolvente.

6565

Funcionamiento de la Bomba. Válvula check de Entrada

•Consiste de válvula de disco con movimiento axial activado por un resorte, atornillada al centro del cabezal.•La válvula se mantiene cerrada por la presión hidróstatica interna en el cabezal y por el resorte del otro extremo de la válvula.•Cuando el eje es presionado por el actuador, la válvula se abre (200 msecs) y el líquido fluye al interior de la cámara (75 uL).

6666

Funcionamiento de la Bomba. Válvula check de Salida

•Consiste de un balin y asiento activado por un resorte, atornillada en la parte superior del cabezal.•La válvula se mantiene cerrada durante la succión de solvente por la fuerza del resorte.•La válvula se abre por el movimiento de entrega de solvente del pistón al presurizar a la cámara del cabezal.•La válvula contiene un filtro de metal poroso de 20 um.

6767

Desgasificación de la fase móvil Purga adecuada

He

Mantenimiento Preventivo en Bomba

6868

Mala repetibilidad de tiempos de reten-ción:

- Fugas (visibles o no visibles)

- Presión elevada o presión baja (bitácoras)

- Presión Fluctuante (bitácoras)


6969



SELLOS

PISTÓN


Válvulas check

Solución: Cambio de pieza dañada

7070



- Presión elevada o presión baja (bitácoras)

- Presión Fluctuante (bitácoras)


7171

Co

mp

osi

ció

n

Tiempo

% B

Isocrática

Gradiente

2.1 Bombas– Tipos de Bombas

7272

Estabilidad en la línea base

Tiempo de análisis largo

Presión Constante

Resolución limitada

2.1 Bombas– Análisis Isocratico

7373


Separación isocratica o por gradiente• La fase móvil isócratica no puede resolver todas las

separaciones

• Algunas muestras son demasiado complejas

• Resolución pobre de picos tempranos

• Ensanchamiento de picos y coleo de los picos finales

• En la elución por gradiente de solventes, la fuerza de la fase móvil se incrementa por cambio de la composición de los solventes en un cierto tiempo

• Elegido para una amplia gama de muestras o de biopolímeros

• Limpia la columna durante cada corrida

• Empleada para estimar condiciones isocraticas óptimas

Solventes

7474

Resolución de Mezclas Complejas

Tiempo de Análisis Corto

Variación de la Presión

Inestabilidad de Línea Base

Vida útil de la Columna Limitada

2.1 Bombas– Análisis con Gradiente

7575

2.1 Bombas– Análisis con Gradiente

Tiempo

% B

Co

mp

osi

ció

n

7676

Cond. InicialGra

diente

Equilibrio

2.1 Bombas– Desarrollo de un Gradiente

Tiempo (min)

%A %B

0 100 0

20 80 20

30 80 20

35 100 0

40 100 0

Etapa

Prerun

Gradiente

Isocratico

Cond. Inicial

Equilibrio

Isocratico

7777

2.1 Bombas– Desarrollo de un Gradiente

7878

2.3 Inyectores

Inyector manual

Inyector Automático

7979

2.3 Inyector Manual - Caracteristicas

Válvula de 6 puertos

2 posiciones: carga e inyección

Utiliza un loop / requiere cambio de loop para inyectar diferentes volumenes

Jeringa para introducir la muestra

Limpieza manual de línea de inyección

8080

loopPuerto de inyección (entrada de muestra)

Paso de muestra

Sello del rotor

2.3 Inyector Manual - Caracteristicas

8181

2.3 Inyector Manual - Funcionamiento

8282

Filtración de la Muestra

Jeringa (aguja) apropiada

Loop correcto

Limpieza correcta del inyector

2.3 Inyector Manual - Mantenimiento Preventivo

8383

2.3 Inyector Automatico

AUTOMATIZACIÓN

PRODUCTIVIDAD

LAVADO AUTOMÁTICO DEL AGUJA

MAYOR REPETIBILIDAD Y PRECISIÓN

8484

2.3 Inyector Automatico – características

Válvula de 6 puertos / 2 posiciones

Utiliza un loop / no requiere de cambio de loop para volumenes menores

2 posiciones: carga e inyección

Aguja / Jeringa para introducir muestra en forma programada

Limpieza automática de la línea de inyección.

8585

Desechos

loop

jeringa

disolvente de lavado

de la bombaHacia la columna

2.3 Inyector Automatico – Funcionamiento

8686

Toma de muestra Perforación del vial


8787

Inyección de la muestra


8888

Lavado de la jeringa y aguja


8989

Solvente de Lavado

Debe disolver perfectamente a la muestra.

Regularmente es un solvente orgánico o mezcla de organico/agua.

Perfectamente filtrado (partículas pueden taponar la aguja o la tuberia) y perfectamente degasificado (burbujas en la tuberia de inyección perjudican la repetibilidad de la inyección)

Debe purgarse la línea de inyección previo al uso del inyector (Función WASH)

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de

Operación

9090


Operación

Aguja de Inyección

La aguja de inyección es una aguja insertada en una aguja más gruesa.

Su finalidad es introducir aire al interior del vial (presurizarlo) durante la succión de muestra.

Es necesario habilitar la función HeadSpace Pressure en el inyector

Es de utilidad cuando:

Se utilizan septas nuevas.

NO es utíl cuando:

Se reciclan las septas.

Su finalidad es mejorar la repetibilidad de la inyección.

9191


Operación

Jeringa

El vólumen de muestra es medido con una jeringa de 250 uL.

El interior de la jeringa debe estar libre de burbujas.

De observarse burbujas:

Verificar la degasificación del solvente de enjuague.

Verificar el buen estado de la punta del émbolo.

Verificar que la aguja no este tapada.

Es necesario verificar que no se presenten fugas provenientes del émbolo de la jeringa.

9292


Operación

Válvula de Inyección

La muestra es introducida por una válvula automática de seis puertos.

Emplea tambien un sello/rotor que puede rallarse. (mala repetibilidad de áreas)

La falla se evidencia cuando se observan gotas de líquido en la punta de la aguja, crecen y se desprenden.

Y además, un incremento en la presión tambien incrementa la intensidad del goteo.

9393

2.3 Inyector Automatico- Resumen de

funcionamiento

Importante

Jeringa y tuberia libre de burbujas.

No fugas en jeringa.

Presurización de vial solo funciona si HeadSpace Pressure esta habilitado.

Recomendado solo con septas nuevas.

La aguja de aire es insertada hasta la parte superior del vial, por lo que los viales solo llenarlos hasta 2/3 de alto (Contaminación Cruzada). 2/3 máximo

9494

Factores que afectan la Repetibilidad de Areas

A. MUESTRA

B. MODOS DE INYECCIÓN

C. LOOP

D. EFECTO MEMORIA (Contaminación cruzada)

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo

9595

A) CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA

Compatible (soluble) con la fase móvil.

Disuelta en un solvente de la misma polaridad (o más debil que la fase móvil).

Libre de partículas suspendidas (Filtrada)


9696

Modo ParcialHasta el 50 % del volumen del loop

Toma de 3 a 2 veces el volumen del loop

B) MODOS DE INYECCIÓN

Modo Total


9797

C) Material y tamaño del LOOP

Tamaño:

5, 10, 20, 50, 100,200, 500 (l),1, 2,5 (ml)

Material:

Acero Inoxidable, Titanio,PEEK


9898

D) EFECTO MEMORIA Contaminación cruzada


Son residuos de muestra (o estándar) de la inyección anterior.

Se evidencia en la inyección de un blanco inmediato posterior.

9999

2.4 Columnas para HPLC

100100

Diagrama


101101

¿Cómo funcionan?


La fase estacionaria esta empacada dentro la columna no se mueve.

La fase móvil esta circulando dentro la columna a una velocidad regulada (flujo constante) arrastrando a la muestra.

102102

¿Cómo funcionan?


Si el analito es más soluble en la fase móvil que en la fase estacionaria, el analito migrará dentro de la columna con poca interacción con la fase estacionaria.

103103

¿Cómo funcionan?


Si el analito es más soluble en la fase estacionaria, migrará más lentamente dentro de la columna, y dependiendo de la magnitud de la interacción, el tiempo invertido será más o menos grande.

104104

Clasificación por Dimensiones

Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006


105105

Efecto del cambio en la longitud de la columna



106106

Longitud 3, 5, 10, 15, 25 cm)

Diámetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)

•Tipo de soporte• Silica, polimero.

•Grupo químico enlazado• C18, C8, C4, CN, NH2, Si

•Tamaño de partícula• 2, 3, 5, 10 um

•Tamaño de poro y Area Superficial(60 ~ 200 A) (100 ~ 500 m2/g)

•Densidad de ligando• 2 ~ 4 mol /m2

Clasificación por Características


107107

•Tipo de soporte

• Silica (SiO2) es el material dominante. Posee una alta resistencia mecánica y permite fabricar partículas uniformes.



108108

•Tipo de soporte

• Silica (SiO2) posee una superficie polar que permite ser modificada para darle propiedades no polares por tratamiento químico.

• Tiene como limitante el que se degrada fuera del intervalo de pH de 2 a 8.



109109

•Tipo de soporte

La Silica (SiO2) tiene como limitante el degradarse fuera del intervalo de pH de 2 a 8.



110110

•Tipo de soporte

• Polímero. Poliestireno divinil benceno entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los más comunes.

• Tienen como desventaja que regularmente poseen menos eficiencia comparadas con las columnas de Si.

• Tienen como ventaja la operación en el intervalo de pH de 1 a 14.

• Existen nuevos materiales como son la Zirconia que permiten operar a temperaturas elevadas.



111111

Grupo químico enlazado• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si



No Polar Polar

Fase Reversa Fase Normal

112112

Grupo químico enlazado

• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si



C18: Muy hidrofobica, estable y primer elección.C8: Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgánico.CN: La menos hidrofobica, no muy estable.Ph: Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada para aromáticos.C4: Recomendadas para análisis de proteinas.NH2: Recomendada para carbohidratos.Si: Adecuada para compuestos orgánicos de polaridad media

113113

Grupo químico enlazado

• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si



114114

•Tamaño de partícula (y distribución)• 10, 5, 3, 2 um: Eficiencia y Presión en HPLC.



115115

Tamaño de poro y Area Superficial• 200 ~ 60 A Area Superficial (100 a 500 m2)• Mayor densidad en fase

enlazada • Mayor retención (más

hidrofóbica)• No recomendado para

biomoleculas.



116116

2.4 Columnas para HPLC Tamaño de poro

Cadenas alquilicas entre-cruzadas en la superficie de silica


117117

Densidad de ligando (Carga de carbono [peso Fase Enlas/peso Silica])• 2 ~ 4 mol/m2



118118


(Resumen)


119119

Clasificación por tecnologia (Pureza de SiO2)



120120

Clasificación por tecnologia(Pureza de SiO2)



121121

Clasificación por tecnología(Fase estacionaria modificada)


122122

Clasificación por Tecnología

(Resumen 1)


123123

Clasificación por Tecnología

(Resumen 2)


124124

Resumen


125125INTERCAMBIO IÓNICO

EXCLUSIÓN

PARTICIÓN

ADSORCION

2.4 Columna – Mecanismos de Separación

126126

2.4 Columna – Mecanismos de Separación Tipo de interacciones

No polares - fuerzas de van der Walls

covalentes – Formación de puentes moleculares

Polar - dipolares y puentes de hidrógeno

Ionicas - cationicas y anionicas

127127

SELECCIONAR LA COLUMNA ESPECIFICA

METODO EXISTENTE SATISFACTORIO

SELECCIONAR COLUMNA NUEVA

MUESTRA

PESO MOLECULAR > 2000

SOLUBLE EN ORGÁNICO

SOLUBLE EN AGUA

EXCLUSIÓN

PERMEACIÓN

EXCLUSIÓN

FILTRACIÓN

PESO MOLECULAR < 2000

SOLUBLE EN ORGÁNICO

SOLUBLE EN

HEXANO

SOLUBLE EN METANOL

ADSORCIÓN FASE ENLAZADA NORMAL

FASE ENLAZADA REVERSA

SOLUBLE EN AGUA

INTERCAMBIO IÓNICO

2.4 Columna – Selección de Columnas

128128

Competencia por Sitios Activos

Si

OSi Si Si

O O

OH

O

Si

OH OHOH OH

m s

2.4 Columna – Adsorción

129129

Mercanismos de adsorción

Dependiente de la concentración de soluto y la temperatura (Isotermas de adsorción)

Retención de Compuestos polares

Orden de elución: menor polaridad más rápido

Columnas: sílica & alumina

130130

2.4 Columna – Adsorción

131131

K = Cs Cm

S

m

Fase enlazada

Normal

Reversa

2.4 Columna – Partición

132132

2.4 Columna – Fase Normal enlazada

133133

Características del mecanismo

Interacciones:

Polares (puentes de H2, fuerzas de van Der Walls).

Retención:

Favorecida por disolventes no polares.

Elución:

Fuerza de disolvente aumenta con la polaridad

(hasta disolvente medianamente polares)

Columnas : Ciano y amino

134134

2.4 Columna – Fase Normal

135135

2.4 Columna – Fase Reversa

136136

Caracteristicas del mecanismo

Interacciones:

No polares (inducción de dipolo, dipolo-dipolo)

Retención:

Favorecida con disolventes polares

Elución.

Fuerza de disolvente aumenta disminuyendo polaridad

137137


Es la técnica de HPLC más popular:• Las columnas son estables y de rápido equilibrio.• El orden de elución es predecible: Si más

hidrofobico el soluto -> mayor retención.• Agua es uno de los solventes más importantes• Permite cambios en la selectividad por la adición

de modificadores• Fase reversa incluye algunas variantes: • Regular, supresión de iones, ionización

controlada, par iónico y formación de quelatos metálicos.

138138


139139

Mecanismos de fase reversa: Fase reversa clásica

Los solutos no polares son retenidos por la fase

estacionaria .

La elución se logra por cambio en la polaridad de la

fase móvil (disminución de polaridad)

Fase reversa clásica

140140

2.4 Columna – Fase Reversa Fase reversa clásica

141141

2.4 Columna – Fase Reversa Fase reversa clásica

142142

Mecanismos de fase reversa: Control de la ionización

•Algunos solutos presentan ionización a un valor determinado de pH.•Los solutos en forma no ionizable son retenidos por la fase estacionaria. Al cambiar a su forma ionizable eluyen de la columna.•Se emplean soluciones de fosfatos, boratos, citratos.•Concentración máxima (recomendada) 0.01M•Compatibilidad de solubilidad con la fase orgánica•Compatibilidad con el detector

143143

2.4 Columna – Fase Reversa Control de la ionización

144144

carga fijaIón de la muestra

resina

+

+-

contraión

Catiónico

Aniónico

2.4 Columna – Intercambio Ionico

145145


146146

Base sílica

Base polímero


147147


148148

SOLUBILIDAD ENAGUA (GFC)

SOLUBILIDAD EN ORGÁNICO (GPC)

2.4 Columna – Exclusión

149149

Fase móvilBomba

Detector

Sistema de datos

Banco de columnas


150150


151151

Uso:

• Almacenar la columna en un solvente recomendado por el fabricante.

• Colocar tapones durante no-uso.

• Siempre “lavar” columna con un solvente fuerte.

• Siempre utilizar guardacolumna o filtro en línea

2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados

152152

Precauciones:

• No exceder rango de pH de la columna.

• No exceder rango de temperatura de la columna.

• Nunca guardar la columna con sales o buffer dentro de ella.

• Permitir que la columna se enfrie antes de detener el flujo.


153153

Conexiones:

• Tuercas y ferrulas son intercambiables entre fabricantes, excepto Waters.


154154

Conexiones:

• Emplear trozos cortos de tuberia 1/16” y 0.010” de SS o PEEK entre inyector y

columna y entre columna y detector.

• La tuberia debe cortarse en forma perpendicular.

• Introducir tuberia hasta el “fondo” de la columna.

• Conectores de PEEK son faciles de usar pero no sellan bien a altas presiones.

• Tuberia PEEK no es compatible con DMSO, THF y CH2Cl2.


155155

Mantenimiento y Regeneración:

• Tiempo de vida desde 3 hasta 24 meses o de 1000 a 3000 inyecciones.

• El desempeño disminuye con el uso (incremento en la presión y coleo de picos).

• Monitorear presión (¡¡bitacoras!!), probar invertir columna.

• Regenerar la columna con una serie de solventes de débil a fuerte y

viceversa en forma gradual.


156156

SILICA

50 ml de hexano

50 ml de cloruro de metileno 50 ml de isopropanol 30 ml de cloruro de metileno 25 ml de fase móvil Probar la columna

FASE NORMAL

50 ml de cloroformo50 ml de cloruro de metileno50 ml de isopropanol30 ml de cloruro de metileno25 ml de fase móvil Probar la columna

2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento, Cuidados y Regeneración

Consultar siempre folleto del fabricante

157157

FASE REVERSA

50 ml agua caliente

( 55 ºC) 50 ml de metanol 50 ml de acetonitrilo 30 ml de THF 25 ml de metanol 25 ml de fase móvil

50 ml de agua caliente

(55 ºC)50 ml de metanol50 ml de acetonitrilo25 ml de cloruro de metileno25 ml de metanol25 ml de fase móvil

INTERCAMBIO IÓNICO

2.4 Columna – Regeneración

Consultar siempre folleto del fabricante

158158

Fase móvil

GuardaColumna

DetectorSistema de datos

Bomba

Inyector

Co

lum

na2.4 Columna – Guardacolumna

159159

2.4 Columna – Guardacolumna

160160

2.4 Columna – Horno

Objetivos

Aumentar la solubilidad de la

muestra Disminuir la presión de la

columna Disminuir la selectividad Disminuir el tiempo de análisis

161161

2.5 Detectores

Uv-vis ( fija)

Uv-vis (Arreglo de diodos)

Fluorescencia

Indice de Refracción

ELSD

162162

Indice de Refracción

a) Universal

b) Mide el cambio de índice de refracción entre la celda de muestra y la celda de referencia.

c) No destructivo de la muestra

d) Baja sensibilidad : %w

e) No compatible con gradiente

f) Sensible a la temperatura ambiente

2.5 Detectores - ProStar 350 Características

163163

16

M otorUnit

14 15

121110

M otor

9Recorder

8 13

6

4

5

3

7

1 2

Integrator O ut

Heat Exchange Block

Heat Exchange Block

Recorder Out

O ptics M odule

9 A m plif ie r10 A utozero circu it11 S ensitiv ity selection12 P olarity se lection (recorder)13 P olarity se lection (in tegrator)14 F ine zero ad just15 M arker signa l16 P ower supply

1 Light source2 F low cell3 M irror4 R ough adjustm ent lens5 O ptica l ba lance lens6 P hotodiode7 S oleno id Valv e8 In itia l c ircu it

PURG E

NO RM AL

2.5 Detectores - Indice de Refracción ProStar 350 - Diagrama Optico

164164

No recomendados • Haluros , Formato de Amonio, CCl4

Utilizables abajo del 10%• Acido Bórico, Anhidro Acetico, KOH• Sales de Formato de Amonio, perclorato, HPO4

2-

• Sales de bicarbonato, clorato y nitratoUtilizables abajo de 30%

• Acido Citrico, NaOH, Sales de Citrato de Amonio, oxalato, sulfato, H2PO4

-

Utilizables abajo de 50%• Acido Acetico, Acido lactico, Hidrazina,

Nitrato de Amonio, K2CO3, Formato de Sodio

2.5 Detectores - Indice de Refracción ProStar 350 -Restricciones de Solventes

165165

Control de temperatura en la celda (Off, 30 - 50 en incrementos de 5oC)

La celda es de baja presión - 100 psi max• Nunca utilice restrictor de presión

No instalarlo en cercania de disipadores de aire

2.5 Detectores - Indice de Refracción ProStar 350–Recomendaciones de Operación

166166

2.5 Detectores - Indice de Refracción ProStar 350–Aplicaciones

167167

Ultravioleta Visible

a) Alta sensibilidad

b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC.


d) Selectivo

e) Rango 190-900 nm

f) Compatible con gradiente

2.5 Detectores- Ultravioleta Visible PS-325 Características

168168

2.5 Detectores- Ultravioleta Visible PS-325 Diagrama Optico

169169

2.5 Detectores-Ultravioleta Visible PS-325 Recomendaciones de Operación

• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos antes del análisis.

• Configurar longitud de onda y tiempo de respuesta.• La duración de las lámparas es de aprox 2000 hrs, pero pueden fallar antes o después.

170170

2.5 Detectores- Ultravioleta Visible Resultados

171171

2.5 Detectores- Arreglo de Diodos PS-335 Características

a) Sensibilidad similar a UV-VIS

b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC.


d) Selectivo

e) Rango 190-900 nm

f) Compatible con gradiente

172172

2.5 Detectores- Arreglo de Diodos PS-335 Diagrama Optico

173173

• Espectro de cada Compuesto, comparación de Espectros

• Parámetro de Pureza

• Biblioteca de Espectros

• Cromatogramas a diferentes .

Arreglo de diodos

2.5 Detectores- PS-335 Resultados

174174

2.5 Detectores- Detector de Diodos PS-335 Excelente Resolución

175175

2.5 Detectores - Arreglo de Diodos PS-335 Recomendaciones de Operación

• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos antes del análisis.

• Configurar longitud de onda y tiempo de respuesta.• Configurar rango de longitudes de onda para desarrollo de métodos, y porque sea necesario en trabajo de rutina. Los archivos son muy grandes.• La duración de las lámparas es de aprox 2000 hrs, pero pueden fallar antes o después.

176176

• Alta sensibilidad (100 a 1000x)

• Compatible con gradiente

• Selectivo: excitación, emisión

• Rango de s: Ex: 200-850nm y Em:200-900 nm

• Formación de derivados: Precolumna y Post

columna

• Puede trabajar con la lámpara apagada (Chemiluminescencia, Bioluminescencia)

• GLP integradas (horas de la lampara)

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Características

177177

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Diagrama Optico

178178

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 – Lámpara de Xe.

• Duración aprox de 500 hrs

• Contiene gas Xe presurizado. Manejese con cuidado.

• La radiación emitida es muy intensa.

179179

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Areas de aplicación

Mercado Farmaceutico / Bioquimico

– Catecholes e Indoles– Vitaminas– Derivados OPA de amino ácidos – Derivados FMOC de amino ácidos – Marcadores Fluorescentes

Mercado Ambiental – Carbamatos, Glifosatos– PNAs

180180

2.5 Detectores- Fluorescencia 2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Aplicaciones

181181

3.1 Por ciento área

3.2 Área Normalizada

3.3 Estándar Externo

3.4 Estándar Interno

3.0 Analisis Cuantitativo

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

Area

Co

nc

entr

ació

n

182182

1. Inyectar la Muestra ProblemaDatos

A2

A1

A3

A4

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

3.0 Analisis Cuantitativo- Por ciento Area

2. Calcular el % A:

%A = Ai x 100 Ai

183183

3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento

Area Normalizada1. Preparar una mezcla estándar de

concentración

conocida

2. Inyectar la mezcla estándar de calibración

3. Obtener el cromatograma , así como las áreas:

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

pico de referencia

Datos

A2

A1

A3

A4

C1

C2

C3

C4

184184

4. Calcular los Factores de respuesta Fr:

a) Seleccionar un pico de referencia y asignarle un valor de Fr = 1

b) Calcular los Fr de los demas Picos:

Fri = A ref x Ci

C ref x Ai

Fr i = Factor de respuesta del pico de interésA ref = Area del pico de referencia

Ci = Concentración del pico de interésAi = Area del pico de interés

C ref = Concentración del pico de referencia


Area Normalizada

185185

5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma, asi como sus áreas:

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

Datos

A2

A1

A3

A4

6. Calcular las concentraciones de cada uno de los componentes, en unidades relativas: %w, %v,

% mol


Area Normalizada

186186

%Ci = Ai x Fri x 100

(Ai Fri)

Ci = Concentración del pico de interés en la muestra

Ai = Área del pico de interés en la muestra

Fri = Factor de respuesta del pico de interés


Area Normalizada

187187

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo1. Preparar una mezcla de estándares de

concentración conocida con los componentes de

interés

2. Inyectar la mezcla de estándares

3. Obtener el cromatograma, así como sus

respectivas áreas

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

Datos

A2

A1

A3

A4

C1

C2

C3

C4

188188

4. Calcular los factores de respuesta de cada uno de los picos:

Fri = Ci

Ai

5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma , así como las áreas:

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo

189189

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

Datos

A2

A1

A3

A4

6. Calcular la concentración de cada uno de los componentes:

Ci = Ai Fri

Ci = Concentración del pico de interés en la muestra

Ai = Área del pico de interés en la muestra


3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo

190190

• Alta pureza

• Estable químicamente y térmicamente

• Estructura química semejante a los componentes de interés

• Separado e identificado de los componentes de la muestra

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno

Requisitos del Estándar Interno

191191

1. Preparar una mezcla de calibración que contenga los componentes de interés, asi como

el componente que servirá como estándar interno

2. Inyectar la mezcla de calibración, obtener el cromatograma y las áreas

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

Datos

A2

A1

A3

A4

C1

C2

C3

C4

Est. Interno


192192

3. Calcular los Fr tomando como referencia el pico del estándar interno, es decir asignarle un Fr = 1

Fri = Ci X A std int

Ai X C std int


Ci = Concentración del pico de interes

Astd int = Área del estándar interno

Ai = Área del pico de interés

C std int = Concentración del estándar interno


193193

4. Inyectar la muestra problema y obtener las áreas:

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4

A3

Datos

A2

A1

A3

A4

C2

5. Calcular la concentración de cada uno de los componentes tomando como referencia el pico del estándar

interno


194194

Ci= Ai Fri C std int

A std int

Ci = Concentración del pico de interés

Ai = Área del pico de interés

Fri = Factor del pico de interés

Cstd int = Concentración del estándar interno

Astd int = Área del estándar interno


Documents

Curso Basico Hplc v.08