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RODRIGO ROCHA LATADO
*PRINCIPAIS TCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
*MICROPROPAGAO DE PLANTAS
* PROPAGAO DE PLANTAS
Semente (via sexuada): espcies com poucas sementesespcies sem sementesperda da germinaoprognie heterognea
Vegetativa (via assexual)in vivo: estaca, enxertia, borbulhaprocesso lentopropagao de doenassazonalidadeespao fsico
in vitro: meristema apicalsegmento nodal estmulo a gemas axilares
*MICROPROPAGAO: propagao clonal de gentipos selecionados, utilizando tcnicas de cultura de tecidos, visando a produo de plantas em massa, a um preo competitivo uso de explantes com meristemas pr-existentes
meristema apical: dome com clulas totipotentes diviso constante no tem conexo com xilema e floema
pice meristemtico: dome meristemtico + primrdios foliares
Vantagens: > nmero de mudasrapidezrejuvenescimentolivre de doenasespao fsico reduzidosazonalidadeDesvantagens: variao somaclonalcontaminaoaclimatizaocustoprotocolo
*
meristema x pice meristemtico
*MICROPROPAGAO: descoberta das citocininas descrio do meio MS
EXPLANTES
pice meristemtico
segmento nodal: alongamento de ramo com vrios ns
proliferao de gemas axilares: quebra de dominncia apical brotos axilares so explantes secundrios para prximos ciclos
Principais culturas: Banana, Cana-de-acar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais
*ETAPAS DA MICROPROPAGAO Introduo do explanteInduo de brotaesAclimatizaodas plantasAlongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro
*Micropropagao de baunilhaMicropropagao de mandioca
* MICROPROPAGAO
Estdio 0: seleo da planta matrizsanidadeestdio fisiolgicoestado nutricional
Estdio 1: estabelecimento da cultura assptica e vivelpoca de retirada do explanteposio do explante na planta matrizbaixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina
Estdio 2: multiplicaoalta [ ] de citocininanmeros de subcultivosEstdio 3: alongamento e enraizamentocido giberlico, auxinas (IBA, NAA)
Estdio 4: aclimatizaocontrole de umidade e luz
*MICROPROPAGAO
Meio de Cultura Slido: gar, gelmelhor aeraoabsoro de nutrientes deficiente
Meio de Cultura Lquido: estacionrio, agitaomaior disponibilidade de nutrientesmaior disponibilidade de guaoxigenaosuporte: papel de filtro, espuma
Imerso Temporria: alternncia de meio de cultura lquido com ausncia de meio de cultura melhor aerao maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)
*CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VRUS
* LIMPEZA DE VRUS
Doenas de Plantas: fungos, bactrias, vrustransmitidas na propagao vegetativa
White (1934): vrus esto distribudos de maneira desuniforme em raiz de fumoreduo da concentrao em direo extremidadepice radicular livre de vrus
Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentrao de vrus na parte area
Morel & Martin (1952): plantas de dlia livres de vrus
*LIMPEZA DE VRUS - SequnciaPrincipais culturas: Cana-de-acar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais
*LIMPEZA DE VRUS - Sequncia
* LIMPEZA DE VRUS
termoterapia + cultura do pice meristemtico
ex: vrus do mosaico da cana-de acarcultura de meristema: explante 0,3 mmcultura pice meristemtico (1 2,5 cm) + termoterapia (45oC / 8 horas)
quimioterapia + cultura do pice meristemticoincorporao de antivirais no meio de cultura
Indexao: avaliao da presena do vrusensaios biolgicosmicroscopia eletrnicaserologia (ELISA)hibridao com cido nucleico
*CULTURA DE CALOS
*CULTURA DE CALOS
FASES 1. ASSEPSIA
2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...)
3. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO - INDUO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas)Calos em citros (meio contendo BAP)
4. DESDIFERENCIAO CELULAR - retorno das clulas ao estado meristemtico
Depende de: competncia e habilidade para responder ao estmulo
*CULTURA DE CALOS5. SUBCULTIVOS MENSAIS
- mesmo meio de induo
- outros meios
6. DIFERENCIAO CELULAR- utilizando uma das duas vias,
- Organognese somtica
- Embriognese somtica
7. REGENERAO DE PLANTAS
8. ACLIMATIZAO AO MEIO AMBIENTE
*CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO
*CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO
FASES
1. EXPLANTES (calos - clulas meristemticas, alta taxa de diviso celular)
2. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO LQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos
3. AGITAO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenao do meio
4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias
*CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO
SELEO in vitro - adio de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumnio, PEG (seca) e outros
5. ALTA TAXA DE CONTAMINAO - motivo: meio lquido
6. TRANSFERNCIA PARA MEIO SLIDO - obteno de calos
7. REGENERAO DE PLANTAS
8. ACLIMATIZAO AO MEIO AMBIENTE
*CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSOClulasClulas em meio contendoalta osmolaridadeClulas em suspensoAgitador orbital
*CULTURA DE CLULAS HAPLIDES
*CULTURA DE CLULAS HAPLIDES
FASES 1. ASSEPSIA
2. EXPLANTES (anteras (micrsporo), plen, vulos, ovrios vegetais)
3. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO (pr-tratamento)
4. INDUO DE ORGANOGNESE OU MBRIOGNESE - direta (sem passar pela fase de calos)
- indireta (com passagem pela fase de calos)
Depende de: competncia e habilidade para responder ao estmulo
*CULTURA DE PLANTAS HAPLIDES
FASES
5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro
- alongamento das plantas - enraizamento - aclimatizao
6. OBTENO DE PLANTAS HAPLIDES OU DUPLO-HAPLIDES
- duplicao cromossmica natural ou com utilizao de drogas antimitticas
- drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )
*CULTURA DE PLANTAS HAPLIDESFlorAnterasMicrsporogerminandoEmbriognesesomticaMultiplicaoAclimatizao
*CULTURA DE PLANTAS HAPLIDESFlor - OvriovulosCalosOrganognesesomticaObteno de plantasMultiplicao
*CULTURA DE PROTOPLASTOSVEGETAIS
*CULTURA DE PROTOPLASTOS
- Clulas vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas)
Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases - digerem celulose Pectinases - digerem pectinas
- sensveis a modificao na osmolaridade do meio e a luz
- meio mais concentrado protoplastos perdem gua para o meio
- meio mais diludo protoplastos absorvem gua do meio
meios geralmente entre 0,4 e 0,8M
*CULTURA DE PROTOPLASTOS
- usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio
- A ausncia de parede celular possibilita a fuso de protoplastos
- Isolamento, purificao e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade
MEIOSMeios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X)
Soluo de enzimas 0,4M
Soluo de Polietileno glicol a 50%
Agarose tipoVII (baixo ponto de fuso) - 1,2%
* MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989)Composio mg/L
1. CaCl2*2H2O 1.4802. MgSO4*7H2O 2463. KNO3 1014. KH2PO4 27,25. KI 0,16
- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M)- ajustar o pH 6,0- esterilizar
SOLUES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L
A. CaCl2*2H2O 50x 20 mL/L
B. OUTROS SAIS 100x 10 mL/L
*CULTURA DE PROTOPLASTOS
Material esterilizado
- placas de Petri
- peneiras com poros de 50 m
- tubos 8 ml com tampa
- pipetas Pasteur
*CULTURA DE PROTOPLASTOS
FASES1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspenso celular, ptalas, anteras)
2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitao 50 rpm, escuro, 27o C, durante 8 a 16 h.
3. PURIFICAO - peneiramento, centrifugao, retirada da soluo, lavagem com CPW
4. FUSO - adio de PEG ou eletrofuso
5. RETIRADA DO PEG
6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSO - meio MS 0,4M(2X) e agarose
*CULTURA DE PROTOPLASTOSExplanteProtoplastosViabilidade deprotoplastosFusoFusoFuso mltipla
*CULTURA DE PROTOPLASTOSPrimeira divisoMicrocaloMicrocolniaCalos e embries somticosEmbrio somticoEmbriogerminando
*CULTURA DE PROTOPLASTOSPlantasin vitroPlaca com embries germinandoDesenvolvimento das plantase enraizamentoAclimatizao ao meio ambiente