Coqueta Roja

Ars Pharmaceutica, 44:1; 43-58, 2003

43VALOR NUTRITIVO DE LA HARINA DE LOMBRIZ (EISENIA FOETIDA) COMO FUENTE DE AMINOCIDOS...

Valor nutritivo de la harina de lombriz (Eiseniafoetida) como fuente de aminocidos y su

estimacin cuantitativa mediante cromatografaen fase reversa (HPLC) y derivatizacin

precolumna con o-ftalaldehdo (OPA)Nutritional value of earthworm flour (Eisenia foetida) as a source of amino

acids and its quantitative estimation through reversed phaseChromatography (HPLC) and pre-column derivation with o-phthalaldehyde

(OPA)

VIELMA-RONDN R1, OVALLES-DURN JF2, LEN-LEAL A2 Y MEDINA A1

1 Dpto. de Ciencias de los Alimentos. 2 Dpto. de Anlisis y Control. Facultad de Farmacia. Universidad de LosAndes. Mrida 2P 5101. Repblica Bolivariana de Venezuela. E-mail: [email protected].

RESUMEN

Las lombrices terrestres del gnero Eisenia foetida, son de inters nutricional ya que son una fuente rica en protenas(> 60% p/p, base seca). El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de aminocidos proteicos en muestrasde lombrices convertidas previamente en harina. La determinacin analtica requiri el diseo y validacin de unmtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa y derivatizacin precolumna con o-ftalaldehdo. El mtodo result ser preciso, lineal y reproducible con una exactitud satisfactoria, en el intervalo deconcentracin ensayado (2 32 M). La harina de lombriz se caracteriz por un contenido representativo de algunosaminocidos esenciales, tales como: fenilalanina, leucina, lisina, isoleucina, metionina y valina (> 3% p/p). La lom-briz roja californiana podra constituir una solucin a los problemas nutricionales y ecolgicos de algunos pases envas de desarrollo. Los resultados obtenidos concuerdan significativamente con los reportados por otros autores,razn por la cual se propone el mtodo analtico descrito.PALABRAS CLAVE: Lombriz de tierra. Eisenia foetida. Aminocidos. Cromatografa lquida. CLAR. O-ftalaldehdo.OPA.

ABSTRACT

Earthworms (Eisenia foetida) are of nutritional interest since they are a rich source of protein (> 60% w/w). The aimof this work was to determine amino acid content in proteins from samples of earthworm flour. The amino acids wereseparated by reversed phase high performance liquid chromatography and detected through molecular fluorescencesubsequent to derivatization with o-phthalaldehyde. The accuracy and precision of the method developed were satisfactory,and a linear response within the concentration range of 2 - 32 M was observed. The earthworm flour was characterizedby evaluating the content of some essential amino acids, such as: phenylalanine, leucine, lysine, isoleucine, methionineand valine (> 3% w/w). The findings from this work are in agreement with those from earlier studies indicating thatthe analytical method described in this paper may be adopted for amino acid analysis of earthworm flour samples. Thisspecies could provide an answer to the nutritional and ecological problems of some developing countries.KEY WORDS: Earthworm. Eisenia foetida. Amino acids. HPLC. O-phthaldehyde (OPA).

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VIELMA RONDN R, OVALLES DURN JF, LEN LEAL A y MEDINA A.

INTRODUCCINActualmente se reconoce que la lombricultu-

ra es un recurso biotecnolgico de elevado inte-rs ecolgico y nutricional. Esta biotecnologautiliza una especie de lombriz domesticada de-nominada Eisenia foetida (Lumbricidiae), con dosobjetivos principales, primero como una alterna-tiva de reciclaje de desechos orgnicos de dife-rentes fuentes, y segundo como una fuente deprotena no convencional de bajo costo. La hari-na de lombriz se caracteriza por un elevado con-tenido de protenas (> 60% p/p, base seca) deinters nutricional ya que proporciona aminoci-dos esenciales para la dieta humana1. La obten-cin a un bajo costo de la harina de lombriz ricaen protenas se debe a que las lombrices se ali-mentan de desechos orgnicos, crecen a una altavelocidad y se multiplican rpidamente. Es im-portante resaltar, que el prejuicio cultural y lafalta de informacin de los beneficios que pre-senta esta lombriz, son los que no han permitidosu utilizacin oficial en el campo alimenticiohumano. Sin embargo, algunos pases orientalestales como China, Japn, Filipinas, Taiwn, etc.,la han incorporado al consumo humano1. De lalombriz roja californiana, no slo se obtiene carnerica en protenas, sino tambin los aminocidosesenciales, entre ellos es importante mencionar ala lisina, aminocido que suele estar ausente enlos alimentos bsicos2. El contenido de esteaminocido en la harina de lombriz es signifi-cativo (5,9% p/p), ya que satisface los requeri-mientos para nios entre 2-5 aos exigidos porla FAO/OMS3.

El Departamento de Ciencias de los Alimen-tos de la Facultad de Farmacia de la Universidadde Los Andes de Venezuela, est estudiando lafactibilidad de incluir este alimento no conven-cional en los comedores escolares y universita-rios, razn por la cual se emprendi un estudiopreliminar para determinar el contenido de pro-tenas y aminocidos de la harina de lombrizobtenida a partir de un lombricultivo de la re-gin. Por otra parte la Universidad de Los Andesintenta demostrar que s es posible solucionar elproblema de la disposicin final de la basuraorgnica, convirtindola en algo til para la agri-cultura4, a travs de la Estacin piloto de Com-postaje y Lombricultura para el Manejo Integralde los Desechos (Ciulamide).

INTRODUCTION

Earthworm culturing is currently a recogni-sed biotechnological source of ecological andnutritional interest. This form of biotechnologyuses a species of domesticated earthworm knownas Eisenia foetida (Lumbricidiae), with two mainobjectives, firstly as an alternative to the recyclingof organic waste products from differing sour-ces, and secondly as a source of low cost, un-conventional protein. Earthworm flour is charac-terised by its high content in proteins (> 60% w/w, dry base). It is of nutritional interest due tothe essential amino acids that it provides for thehuman diet1. Protein rich earthworm flour can beproduced at a low cost, given that earthwormsare fed from organic waste, and grow and mul-tiply at a rapid rate. It is important to point outthat it is cultural prejudice and a general unaware-ness of the benefits that this earthworm mayprovide that have prevented their official use inhuman diet. However, in some Asian countriessuch as China, Japan, the Philipines, Taiwan, etc.,these worms are consumed by humans1. FromCalifornian red earthworms, not only is it possi-ble to obtain a protein rich source of meat, butalso a source of essential amino acids, amongwhich lysine should be mentioned, given thatthis amino acid is often absent in basic foodstu-ffs2. The content of this amino acid in earthwormflour is significant (5.9% w/w), representing ac-cording to WHO/FAO, the daily requirement forchildren between two and five3.

The Department of Foodstuff Sciences at theFaculty of Pharmacy, University of the Andes ofVenezuela, is studying the feasibility of inclu-ding this non-conventional foodstuff in schooland university canteens. For this reason a pre-liminary study was carried out in order to deter-mine the protein and amino acid content of ear-thworm flour obtained from a culture in the region.Additionally, the University of the Andes hasmade an attempt to demonstrate that it is indeedpossible to solve organic rubbish disposal pro-blems by transforming this waste into a usefulproduct for agricultural purposes in accordance4.The work was carried out at a pilot compost andearthworm culturing station for the managementof waste products (Ciulamide).

The objective of the present work is to applyHigh resolution liquid chromatography (rever-sed phase HPLC), pre-column derivatization with


45NUTRITIONAL VALUE OF EARTHWORM FLOUR (EISENIA FOETIDA) AS A SOURCE OF AMINO ACIDS...

El objetivo del presente trabajo es aplicar lacromatografa lquida de alta resolucin (CLAR,en fase reversa) y la derivatizacin precolumnacon orto-ftalaldehdo (OPA) seguida de detec-cin fluorescente, a la determinacin de los ni-veles de aminocidos proteicos en harina de lom-briz (Eisenia foetida). Aunado a la optimizaciny aplicabilidad del mtodo se exponen algunosargumentos relacionados con la utilidad de laharina de lombriz como un recurso nutricionalno convencional.

MATERIAL Y MTODOSREACTIVOS: Agente derivatizante o-ftalal-

dehdo (OPA), especialmente formulado para usarsin preparacin previa (contiene Brij 35, meta-nol, 2-mercaptoetanol, hidrxido de potasio y cidobrico, pH 10,4) lote N P-0532 (Sigma, St. Louis,MO, EE UU). 2-mercaptoetanol, M-6250 (Sig-ma, St. Louis, MO, EE UU). Solucin estndarde aminocidos y aminocidos individuales (Sig-ma, St. Louis, MO, EE UU). Reactivos secunda-rios (Riedel-deHan, Alemania). Metanol gradoHPLC (Mallinckrodt, St. Louis, MO, EE UU).Agua destilada Milli-Q.

EQUIPOS: Cromatgrafo para fase lquidade alta eficiencia (HPLC) con detector de fluo-rescencia modelo 470 (Water, EE UU). Colum-na cromatogrfica de 100 x 4,6 mm, Adsorbos-phere OPA-SH, 5 , Lote N 2521 (AlltechAssociates Inc, EE UU). Columna C18, Bonda-pak TM 3,9 x 300 mm (Water P/N 27324).Liofilizador (Labconco, EE UU).

MUESTRAS: Muestra de lombrices sintratamiento: Las muestras fueron obtenidas dela lombriz Eisenia foetida en estado adulto (3meses), con una longitud y peso promedio de8,5 cm y 0,45 gramos respectivamente (Lombri-cultivo del herbario Luis Ruiz Tern de laFacultad de Farmacia de la Universidad de LosAndes, Mrida-Venezuela). Las lombrices fue-ron alimentadas a base de un compostaje dedesechos orgnicos obtenidos del comedor uni-versitario de la regin. A este compostaje se lecontrol la temperatura, humedad y pH, paragarantizar el optimo crecimiento de las lombri-ces. Muestra de harina de lombriz obtenidapor liofilizacin (HL): Las lombrices (n = 300)

orto-phthataldehyde (OPA), followed by flores-cent detection, and the determination of aminoacid protein levels in earthworm (Eisenia foeti-da) flour. After combining the optimisation andapplicability of the method, the utility of ear-thworm flour as a non-conventional source ofnutrition is discussed.

MATERIALS AND METHODS

REAGENTS: The derivatizing agent o-phtha-ladehyde (OPA) was specially formulated to beused without previous preparation (containing Brij35, methanol, 2-mercapthoethanol, potassiumhydroxide and boric acid, pH 10.4) batch N P-0532 (Sigma, st Louis, MO, USA). 2-mercap-thoethanol, M-6250 (Sigma, St. Louis st, MO,USA). Standard amino acid solution and indivi-dual amino acids (sigma, st Louis, MO, USA).Secondary reactives (Riedel-deHan, Alemania).Methanol HPLC grade (Mallinckrodt, St. Louis,MO, USA). Distilled water Milli-Q.

EQUIPMENT: High performance liquidChromatograph (HPLC) with fluorescence detec-tor, model 470 (water, USA). Chromatographiccolumn 100 x 4,6 mm, Adsorbosphere OPA-SH,5 , batch N 2521 (Alltech Associates Inc, USA).Column C18, Bondapak TM 3,9 x 300 mm(Water P/N 27324). Liophylizer (labconco USA).

SAMPLES: Untreated earthworm sample:The samples were obtained from the speciesEisenia foetida at an adult stage of development(3 months), with an average length and weightof 8.5 cm and 0.45 grms respectively, (earthwormcultures from Luis Ruiz Tern Herbarium atthe Faculty of Pharmacy, University of the An-des, Merida-Venezuela). The earthworms werefed on a diet of organic waste compost, obtainedfrom a university canteen in the region. In orderto guarantee optimum growth conditions, thetemperature, moisture and pH of the compostwere kept under control. Samples of the ear-thworm flour obtained from liophylization (FL):The earthworms (n=300) were thoroughly was-hed and were subsequently stored for 24 hoursin an air insufflated water container. On com-pleting this process, the worms were frozen (li-quid nitrogen) and lyophilised, degreased usingthe Soxhlet method5, and finally ground to a

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se lavaron profusamente y luego se conservarondurante 24 horas en un recipiente contentivo deagua e insuflacin de aire. Finalizado este pro-ceso, se congelaron (nitrgeno lquido) y se co-locaron en un liofilizador. Despus se desgrasa-ron por el mtodo de Soxhlet5 y finalmente sesometieron a una molienda hasta el grado de unproducto harinoso homogneo. Muestra de ha-rina de lombriz obtenida por secado en estufa(HSE): Se sigui la misma metodologa descritapara obtener HL hasta el proceso de insuflacinde aire. Las lombrices previamente lavadas, fue-ron tratadas con una solucin de cloruro de so-dio al 4%1. Despus del beneficio se lavaron conabundante agua hasta eliminar totalmente la saly luego se colocaron en una estufa a 60C du-rante 9 horas. Finalmente se aplic el mismoproceso de desgrasado y molienda. Muestras dehidrolizados proteicos: Se pes por duplicado0,0200 g de HL y 0,0202 g de HSE. Cada una delas muestras se transfiri a una ampolla (de co-lor mbar) junto con 2 mL de cido clorhdrico12 M6,7. La hidrlisis se realiz a 110 C durante24 horas. Las ampollas se conservaron a 20Chasta el momento de preparar las soluciones detrabajo (1 a 2 semanas). El producto de la hidr-lisis cida se transfiri a un baln de 25 mL decapacidad y se llev a volumen con agua milli-Q. Esta solucin se filtr utilizando una mem-brana filtrante de 0,45 mm. Se midi 1 mL delfiltrado, se transfiri a un baln de 10 mL juntocon 6 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y final-mente se enras con cido actico 30 mM (mues-tras HL-1 y HSE-1). A partir de estas muestrasse prepararon las soluciones muestra HL-2 y HSE-2 mediante diluciones 2:10 (v/v) con cido ac-tico 30 mM. Las disoluciones a ser ensayadas seprepararon inmediatamente antes de la derivati-zacin de los aminocidos.

PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES:Solucin patrn de aminocidos individuales(SP1): se pes por separado una muestra de cadaaminocido equivalente a 2 M, y luego se pre-pararon soluciones de trabajo equivalentes a 20mM utilizando solucin de cido actico 30 mMcomo disolvente. Todas las soluciones fuerontransferidas a viales de color mbar y selladosbajo atmsfera de nitrgeno y conservadas a 20C (1 a 2 semanas). Solucin patrn de tra-bajo de una mezcla de aminocidos (SP2): seprepar una serie de soluciones de una mezcla

homogeneous flour. Samples of earthworm flo-ur obtained from oven drying (ODF): Up untilthe air insuflation process, the same methodolo-gy for obtaining FL was applied. The previous-ly washed earthworms, were treated with a 4%solution of sodium chloride1. After washing withabundant water in order to totally eliminate thesalt, the worms were heated in an oven at 60Cfor nine hours, followed by the same degreasingand grinding process as before. Hydrolysedprotein samples: The samples obtained from bothprocesses were weighed with 0.0200 g and 0.0202g obtained from FL and ODF respectively. Eachof the samples were transferred to a amber colo-ured ampoule with 2 mL of hydrochloric acid(12 M)6,7. Hydrolysis was carried out at 110 Cfor 24 hours. The ampoules were stored at 20C until preparation of the working solutions(one to two weeks). The product obtained fromacid hydrolysis was transferred to a cylinder ofa capacity of 25 mL and milli-Q water to makeup volume, together with 6mL of sodium hydroxi-de 0.1 M, were added. Finally, acetic acid 30mM was used to bring the solution to full volu-me (samples FL-1 & ODF-1). From these sam-ples, the sample solutions FL-2 and ODF-2 wereprepared through dissolution 2:10 (v/v) with aceticacid 30 mM. The dissolutions to be tested wereprepared immediately before amino acid deriva-tization.

SOLUTION PREPARATION: Individualamino acid solution patterns (SP1): The equi-valent of a 2 mM sample of each amino acidwere prepared separately, followed by the prepa-ration of solutions equivalent to 20 M, using30 mM acetic acid solution as solvent. All solu-tions were transferred to amber coloured vialsand were sealed in a nitrogen environment andstored at 20C for one to two weeks. Mixedamino acid solution working patterns (SP2):A series of solutions of a mixture of individualamino acids equivalent to a concentration of 0,2, 4, 8, 12, 16, & 32 M for each amino acidwere prepared, using the previously mentionedmethodology.

DERIVATIZATION: 100 mL of the solu-tion to be tested (standard or sample) were trans-ferred to a vial in a nitrogen atmosphere with200 L of derivatizing reactive (OPA). Afterexactly 60 seconds, 500 L of potassium borate


47VALOR NUTRITIVO DE LA HARINA DE LOMBRIZ (EISENIA FOETIDA) COMO FUENTE DE AMINOCIDOS...

de aminocidos individuales equivalentes a unaconcentracin de 0, 2, 4, 8, 12, 16 y 32 M paracada aminocido, usando la metodologa yamencionada.

DERIVATIZACIN: Se transfiri 100 mLde la solucin a ensayar (patrn o muestra) a unvial bajo atmsfera de nitrgeno y 200 L delreactivo derivatizante (OPA). Exactamente des-pus de 60 segundos se agreg 500 L de unasolucin buffer 0,4 M de borato de potasio (pH10) y seguidamente se sell y agit. Dado quelos aminocidos derivatizados con OPA slo sonestables por un corto periodo de tiempo, las in-yecciones en el cromatgrafo de los OPA-deri-vados se realizaron dentro de los dos minutossiguientes a la derivatizacin tal como lo reco-mienda el fabricante8.

PARAMETROS CROMATOGRFICOS:Fase mvil A: 50 mM de fosfato monosdicoajustado a pH 7,2. Fase mvil B: metanol-bufferfosfato (70:30, v/v). Flujo: 2 mL/min. Tempe-ratura de la columna: ambiente ( 20C). Vo-lumen de inyeccin: 10 L. Detector: Fluores-cencia, filtro 1,5 y atenuacin 16 x 100.Deteccin: excitacin 340 nm y emisin 455 nm.Gradiente (T-%B-curva): (0-10-cncava); (35-65-cncava); (45-90-convexa).

ANLISIS CUALITATIVODE AMINOCIDOS

Las muestras de harina de lombriz fueron hi-drolizadas con cido clorhdrico 6 M durante 20horas. El pH del hidrolizado fue ajustado a 2,20con una solucin tampn Beckman System 6300.Los aminocidos fueron separados utilizando unanalizador automtico de aminocidos tipo Beck-man (System 126 AA) y derivatizados con nin-hidrina para su deteccin a 570 nm y 440 nm.

ANALISIS DE PROTENASEl contenido de protenas de la harina de lom-

briz fue determinado por el mtodo de microKjeldahl5.

VALIDACIN DEL MTODO

Ensayo de conveniencia del sistema croma-togrfico. Se inyect la solucin SP2 (n = 10)

buffer solution 0.4 M (pH 10) was added, andthe solution was subsequently sealed and shaken.Given that derivatized amino acids with OPAare only stable for a short period of time, theinjections of OPA-derivatives into the chroma-tograph were performed within two minutes,immediately after derivatization, as recommen-ded by the manufacturer8.

CHROMATOGRAPHIC PARAMETERS:Mobile phase A: 50 mM of monosodium phos-phate adjusted to pH 7.2. Mobile phase B:Methanol-buffer phosphate (70:30, v/v). Flow: 2mL/min. Column temperature: ambient ( 20C).Injection volume: 10 L. Detector: Fluorescence,filter 1.5 and attenuation 16 x 100. Detection:excitation 340 nm and emission 455 nm. Gra-dient (T-%B-curve): (0-10-concave); (35-65-con-cave); (45-90-convex).

QUALITATIVE ANALYSIS OF AMINOACIDS

Earthworm flour samples were hydrolysed withhydrochloric acid (6 M) for 20 hours. The pH ofthe hydrolysed product was adjusted to 2.20 witha Beckman System 6300 buffer solution. Theamino acids were separated using an automaticBeckman amino acid analyser (System 126 AA)and were derivatized with ninhydrin for detec-tion purposes at 570 nm & 440 nm.

ANALYSIS OF PROTEINSThe protein content of the earthworm flour

was determined using the micro Kjeldahl me-thod5.

METHOD VALIDATION

SUITABILITY TEST OF THE CHROMA-TOGRAPHIC SYSTEM. The SP2 solution(n=10) was injected until peaks of a height ofbetween 10 & 100% were obtained with regardto the fluorometric signal response. The concen-tration of amino acids with a lower signal wereadjusted in order to prepare the calibration cur-ve. A range of concentrations of between nM &mM were examined. In order to determine theportion of sample and a concentration of aminoacids within the calibration curve, a study simi-lar to that mentioned for SP2 was carried out.

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hasta obtener picos de altura entre 10 % y 100%con respecto a la respuesta de la seal fluorom-trica. La concentracin de los aminocidos conmenor seal se ajust para preparar la curva decalibracin. Se examin un rango de concentra-ciones entre nM y mM. Para determinar la por-cin de muestra y una concentracin de amino-cidos dentro de la curva de calibrado, se efectuun estudio similar al mencionado para la solu-cin SP2. Identificacin de los aminocidos. Seobtuvo mediante ensayos individuales duplica-dos de materiales de referencia (SP1) y un ensa-yo duplicado de la mezcla de aminocidos (SP2).La identificacin de los aminocidos fue com-probada utilizando cromatografa de intercambioinico y derivatizacin postcolumna con ninhi-drina. Repetitividad. La precisin dentro de se-ries se examin mediante inyecciones cudru-ples de una solucin intermedia de la serie depatrones de la mezcla de aminocidos (SP2). Lacurva de calibracin se obtuvo mediante inyec-ciones por duplicado. Exactitud. A una solucinintermedia de la serie de patrones de la mezclade aminocidos (SP2) se le adicion una solu-cin muestra HL-2 1:1, v/v (n=2). Robustez. Laidentificacin y cuantificacin de los aminoci-dos certificados fue evaluada utilizando una co-lumna BondapaK C18 bajo las condiciones des-critas en materiales y mtodos. La repetitividaddentro de series y entre series en relacin a lostiempos de retencin y las reas de los picos fuedeterminada utilizando ambas columnas. El an-lisis final de las muestras se llev a cabo utili-zando la columna OPA-HS. Linealidad. La li-nealidad del mtodo se determin en el intervalode concentracin de 2 16 M para cada uno delos aminocidos (SP2). Estabilidad. No se reali-zaron ensayos de estabilidad ya que despus deoptimizado el mtodo las muestras se prepara-ron, conservaron a 20C bajo atmsfera de ni-trgeno y luego se analizaron dentro de las dossemanas siguientes. Durante el ensayo diario lassoluciones de trabajo se conservaron a 0C. Laestabilidad de los aminocidos derivatizados senormaliz mediante un seguimiento riguroso deltiempo de derivatizacin previo a la separacincromatogrfica8. El reactivo OPA se conserv a4C bajo atmsfera de nitrgeno y se reconstitu-y cada semana mediante la adicin de 5 L de2-mercaptoetanol a 1 mL del reactivo OPA sindiluir. Durante los ensayos, el reactivo OPA semanipul conservndolo en un bao de hielo y

Identification of amino acids. Identification wascarried out through individual duplicated tests ofreference materials (SP1) and a duplicated testof the mixture of amino acids (SP2). The pro-cess was checked using ionic interchange chro-matography and postcolumn derivatization withninhydrin. Repetitivity. Precision within the serieswas examined through quadruple injections ofan intermediate solution of the series of standardamino acid mixtures (SP2). The calibration curvewas obtained through duplicated injections.Accuracy. An intermediate solution from the se-ries of standard amino acid mixtures (SP2) wereadded to a sample solution FL-2 1:1, v/v (n=2).Robustness. The identification and quantifica-tion of the certified amino acids were evaluatedusing a BondapaK C18 column, under the con-ditions described in materials and methods. Therepetivity within and among series, with regardto retention times and areas of peaks, was deter-mined using both columns. The final analysis ofthe samples was carried out using the OPA-HScolumn. Linearity. Method linearity was deter-mined within concentration interval 2-16 M foreach amino acid (SP2). Stability. Stability testswere not carried out given that after optimisingthe method, the samples were prepared, conser-ved at 20C in an atmosphere of nitrogen, andsubsequently analysed within a period of twoweeks. During the daily testing period, the wor-king solutions were stored at 0C. The stabi-lity of the derivatized amino acids was normali-sed through a rigorous adherence to derivatizationtimes prior to chromatographic separation8. Thereactive OPA was conserved at 4C in nitrogenatmosphere and was reconstituted every weekthrough the addition of 5 L of 2-mercapthoethanolto 1 mL of undiluted OPA reactive. During thetests, the OPA reactive was manipulated in icebath storage and the recipient was opened in anitrogen atmosphere. Determination of the quan-tity of solution sampled to be tested. 100 L ofsamples HL-1 and HSE-1 and 100 L of dilutedsample HL-2 and HSE-2 were derivatized. Sta-tistical analysis of the data. The program Mi-crocal Origin 5.0 was used.

RESULTS AND DISCUSSION

Liophylized (FL) and oven dried earthwormflour (ODF) were characterised by their high


49NUTRITIONAL VALUE OF EARTHWORM FLOUR (EISENIA FOETIDA) AS A SOURCE OF AMINO ACIDS...

se destap el envase bajo una atmsfera de ni-trgeno. Determinacin de la cantidad de solu-cin muestra a ensayar. Se derivatiz 100 Lde las muestras HL-1 y HSE-1 y 100 L de lasmuestras diluidas HL-2 y HSE-2. Anlisis esta-dstico de los datos. Se utiliz el programa Mi-crocal Origin 5.0

RESULTADOS Y DISCUSINLa harina de lombriz obtenida por liofiliza-

cin (HL) y secado en estufa (HSE) se caracte-riz por un elevado contenido en protenas (62,28y 61,81% p/p, respectivamente) como era deesperarse segn otros autores1,9,10.

Un total de 15 aminocidos fueron identifica-dos por cromatografa lquida de alta resolucin(Fig.1 y 2) y validados por cromatografa deintercambio inico (Fig. 3) utilizando materialesde referencia. Sin embargo, slo 12 aminocidosfueron cuantificados por CLAR. La resolucinobtenida para la mayora de los aminocidosprimarios derivatizados fue satisfactoria tanto parael patrn como para la muestra. Los derivadosisoindlicos de histidina, glicina y treonina, quenormalmente coeluyen11, fueron separados usan-do las condiciones descritas en la seccin demateriales y mtodos. Los aminocidos metioni-na y valina coeluyeron bajo las condiciones des-critas (Fig. 1 y 2). La falta de resolucin de estepar de aminocidos es propia de la metodologautilizada8. Los tiempos de retencin, entre corri-das, para la curva patrn (inyecciones por dupli-cado), no vari representativamente (< 0,1 min),manteniendo en cada caso la resolucin espera-da. A pesar de que no se us un patrn interno,la variacin de los tiempos de retencin diario einterdiario fue inferior a 0,1 min. La precisindentro de corridas, expresada como coeficientede variacin porcentual (CV), para una solucinSP2 ensayada 4 veces de manera consecutiva fueen todos los casos < 5% (Tabla 1). Un intervalolineal entre 4 y 16 mM result adecuado para lamayora de los aminocidos derivatizados, noobstante, la concentracin final de algunos ami-nocidos se ajust entre 2 y 32 mM. El coefi-ciente de correlacin (r) fluctu entre 0,998 y1,000 (Tabla 1). La exactitud expresada comoporcentaje recuperado oscil entre 97 y 102 paralos 12 aminocidos finalmente cuantificados. Lacantidad de solucin muestra ptima para lograr

protein content (62.28 y 61.81% w/w, respecti-vely), as expected in the light of the work ofother authors 1,9,10.

A total of 15 amino acids were identifiedthrough high resolution liquid chromatography(Fig.1 & 2) and validated by ionic interchangechromatography (Fig. 3) using reference mate-rials. However, only 12 amino acids were quan-tified by HPLC. The resolution obtained for mostof the primary derivatized amino acids was sa-tisfactory both for standard as well as for thesample. The isoindol derivatives of histidine,glycine and threonine, that normally co-eluate11,were separated under the conditions described inthe materials and methods section. The aminoacids methionine and valine co-eluated under theconditions described (Fig. 1 & 2). The lack ofresolution from this pair of amino acids is cha-racteristic of the methodology used8. Retentiontimes, between runs, for the standard curve (du-plicated injections), did not vary significantly (

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